เซลล์ไตหนูแฮมสเตอร์ที่เกาะติดกันและแขวนลอยมีโครงร่างโครงร่างและตัวรับพื้นผิวที่แตกต่างกัน

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เวโรนิก้า ดิลล์¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², มาร์ติน เบียร์¹, Michael EschbaumerID^1*

เชิงนามธรรม

การเพาะเลี้ยงเซลล์สัตว์ด้วยเซลล์เดี่ยวที่เติบโตในระงับตามอุดมคติแล้วในสภาพแวดล้อมที่กำหนดทางเคมีเป็นแกนนำของการผลิตชีวเภสัชภัณฑ์ สภาพแวดล้อมสังเคราะห์ไม่มีปัจจัยการเจริญเติบโตจากภายนอก และมักจะต้องใช้กระบวนการปรับตัวที่ใช้เวลานานเพื่อเลือกโคลนของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนขึ้นระงับไปจนถึงจำนวนเซลล์ที่สูง กลไกระดับโมเลกุลที่เอื้อต่อการปรับตัวและที่เกิดขึ้นภายในเซลล์นั้นส่วนใหญ่ไม่ทราบ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสายเซลล์ที่ใช้สำหรับการผลิตแอนติเจนของไวรัส เช่น เซลล์ไตของหนูแฮมสเตอร์ในทารก (BHK) การจำกัดการเติบโตของไวรัสผ่านการวิวัฒนาการของลักษณะเฉพาะของเซลล์ที่ไม่ต้องการนั้นเป็นสิ่งที่ไม่พึงปรารถนาอย่างยิ่ง การเปรียบเทียบระหว่างเซลล์ BHK ที่เติบโตอย่างเกาะติดและเซลล์แขวนลอยที่ต่างกันความอ่อนไหวไวรัสโรคปากและเท้าเปื่อยเปิดเผยความแตกต่างในการแสดงออกของตัวรับเซลล์เช่นอินทีกรินและเฮปาแรนซัลเฟตและในการจัดโครงสร้างโครงร่างโครงร่างของแอคติน การวิเคราะห์ Transcriptome และการเติบโตจลนศาสตร์แสดงให้เห็นถึงความหลากหลายของสายเซลล์ BHK และยืนยันถึงความสำคัญของสำเนาพันธุ์ของเซลล์ต้นกำเนิดที่มีลักษณะเด่นและการคัดกรองอย่างมีสติ เพื่อให้แน่ใจว่าคุณสมบัติของเซลล์ที่สำคัญจะไม่สูญหายไประหว่างการปรับตัว

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

1. บทนำ

เทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเซลล์สัตว์ถูกใช้ครั้งแรกสำหรับการผลิตแอนติเจนของไวรัสในการผลิตวัคซีน แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้แพลตฟอร์มการผลิตแบคทีเรียหรือยีสต์สำหรับโปรตีนลูกผสมได้เปลี่ยนไปเป็นระบบเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเช่นกัน [1, 2] สิ่งสำคัญในทั้งสองบริบทคือเซลล์ไตของหนูแฮมสเตอร์ทารก (BHK) ที่ได้มาจากหนูแฮมสเตอร์สีทองซีเรีย (Mesocicetus auratus) ในขั้นต้น เซลล์ BHK เป็นสายเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่อาศัยสมอที่เติบโตอย่างเกาะติดที่มีรูปแบบการเจริญของไฟโบรบลาสต์ในสภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์มาตรฐานซึ่งรวมถึงซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ (FBS) [3, 4] การปรับตัวของเซลล์ BHK ที่ยึดติดเป็นระงับการเจริญเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัมรวมกับสภาวะการเพาะเลี้ยงในวงกว้างเป็นเรื่องราวความสำเร็จสำหรับการผลิตโปรตีนลูกผสม (เช่น ปัจจัย VIII) ที่ให้ผลผลิตสูง [1, 2] นอกจากนี้ เซลล์ BHK ยังไวต่อไวรัสหลายชนิด รวมทั้งไวรัสโรคปากเท้าเปื่อย (FMD) [5] เพื่อตอบสนองความต้องการวัคซีน FMD ที่เพิ่มขึ้นในหลายส่วนของโลก จะต้องมีการผลิตแอนติเจนจำนวนมากในราคาถูกที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ซึ่งทำได้โดยการเพิ่มความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิตในด้านเซลล์และลดต้นทุนด้วยการลดความซับซ้อนของการประมวลผลต้นน้ำและปลายน้ำ ของแอนติเจนในด้านการผลิต [6] สื่อที่ปราศจากสัตว์ (ACFM) ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนจากสารที่บังเอิญและทำให้กระบวนการง่ายขึ้นเมื่อไม่ต้องเสริมซีรั่ม [6, 7] อย่างไรก็ตาม การปรับตัวของเซลล์ให้เติบโตในสารแขวนลอยที่ไม่มีซีรัมและใน ACFM เป็นกระบวนการที่ใช้เวลานานและค่อยเป็นค่อยไป [6, 8] เซลล์ BHK เข้าถึงความหนาแน่นของเซลล์ 3.5 × 106 เซลล์/มล. ในการแขวนลอยได้อย่างง่ายดาย แต่การปรับตัวมักมีความเสี่ยงที่จะพัฒนาคุณสมบัติของเซลล์ที่ไม่ต้องการเมื่อเปรียบเทียบกับประชากรเริ่มต้นที่อาจส่งผลให้ประสิทธิภาพในการเติบโตต่ำ ผลผลิตจำเพาะเซลล์ไม่เพียงพอ หรือสินทรัพย์ที่ก่อให้เกิดเนื้องอก [5, 7]. ในทางกลับกัน การเปลี่ยนแปลงของเซลล์สามารถนำไปสู่ความหลากหลายของไวรัสที่ไม่คาดคิดในระหว่างกระบวนการปรับตัวทางวัฒนธรรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการผลิตแอนติเจนในวัคซีน การเปลี่ยนแปลงในลักษณะของไวรัสและแอนติเจนเป็นสิ่งที่ไม่พึงปรารถนาอย่างยิ่ง เซลล์ BHK มีความแตกต่างกันในด้านความไวและความเป็นไปได้ในการแพร่กระจายไวรัสบางสายพันธุ์ของ FMDV [9] เห็นได้ชัดว่าการเปลี่ยนแปลงจากการเจริญของไฟโบรบลาสติกที่ขึ้นกับจุดยึดผ่านการรวมตัวกันและการก่อตัวของสเฟียรอยด์ไปเป็นเซลล์ที่เติบโตอย่างอิสระในสารแขวนลอยจะมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในตัวเซลล์เอง [4, 6] การสูญเสียสัญญาณอินทิกรินเนื่องจากการหยุดชะงักของการสัมผัสเซลล์เมทริกซ์นอกเซลล์ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของโปรตีนเมมเบรนและในการจัดโครงสร้างโครงร่างโครงร่างโครงร่างของแอกตินซึ่งเป็นผู้รับที่สำคัญของการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางด้วยอินทิกริน [6, 10] ในเวลาเดียวกัน อินทิกรินเหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการติดเชื้อ FMDV เนื่องจากเป็นตัวรับสำหรับ FMDV ในโฮสต์ตามธรรมชาติและตัวรับหลักในการเพาะเลี้ยงเซลล์ [11]

ความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับความแตกต่างของเซลล์ระหว่างเซลล์ HK ที่เติบโตอย่างมั่นคงและเซลล์ในระงับจะเปิดโอกาสใหม่ๆ สำหรับวิศวกรรมเซลล์ และลดความซับซ้อนในการเลือกเซลล์โคลนที่เหมาะสมสำหรับการผลิตแอนติเจนในวัคซีน

ในการศึกษานี้ เซลล์ BHK ที่เติบโตอย่างต่อเนื่องและที่ปรับให้เข้ากับ ACFMระงับเซลล์ BHK ได้รับการตรวจสอบโดยคำนึงถึงการแสดงออกของตัวรับเซลล์ เช่น อินทีกรินและเฮปาแรนซัลเฟต (HS) ความสามารถในการนำเสนอโปรตีนบนผิวเซลล์ และการจัดระเบียบของโครงกระดูกแอคตินในเซลล์ การวิเคราะห์การถอดเสียงและจลนพลศาสตร์ของการเจริญเติบโตให้ข้อมูลเกี่ยวกับความหลากหลายของสายพันธุ์เซลล์ BHK ที่ทดสอบ

cistanche สามารถบำรุงไตและปรับปรุงการทำงานของไต

2. วัสดุและวิธีการ

2.1 สายเซลล์และการเพาะเลี้ยงเซลล์

สายพันธุ์ของเซลล์หลักที่ใช้คืออนุพันธ์ BHK-21 โคลน 13 ตัวที่ยึดติดกันสองตัว (จาก American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10 ซึ่งจัดเป็น CCLV-RIE 164 และ 179 ในกลุ่ม Cell Lines in Veterinary Medicine , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald ประเทศเยอรมนี กล่าวโดยย่อ: BHK164 หรือ BHK179) และระงับสายเซลล์ BHK21C13-2P (BHK-2P) จัดทำโดย European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) และ BHK-InVitrus (BHK-InV หรือที่เรียกว่า "line #8" เช่นเดียวกับในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)

สำหรับจลนพลศาสตร์ของการเติบโต มีการใช้สายเซลล์ต่อไปนี้เพิ่มเติม: BHK-2P คงอยู่ใน Minimal Essential Medium (GMEM) ของกลาสโกว์ด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ ("บรรทัดที่ 2") หรือปรับให้เข้ากับ ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) ในสองกระบวนการที่แตกต่างกัน (บรรทัด #4 และ #5) และอีกสี่กระบวนการระงับสายเซลล์: BHK21C13 ปรับให้เข้ากับการเจริญเติบโตในระงับโดยค่อย ๆ ถอนเซรั่ม (บรรทัด #3), BHK21-C (บรรทัด #6), BHK21-Hektor (บรรทัด #7) และการผลิต BHK (บรรทัด #9) [12] เซลล์ทั้งหมดเหล่านี้ถูกจัดเตรียมโดย Merck KGaA

เซลล์ BHK-21 ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษาได้มาจากเซลล์ BHK-21 โคลน 13 เซลล์ของ Macpherson และ Stoker [13] คำว่า "เซลล์ไลน์" ถูกใช้อย่างหลวมๆ ไม่ใช่สาย BHK-21 สิบเอ็ดทั้งหมดที่อธิบายในการศึกษานี้ว่าเป็นสายพันธุ์ของเซลล์ที่แตกต่างกันอย่างแท้จริง มากกว่าที่จะเป็นอนุพันธ์ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่ต่างกัน เพื่อการอ้างอิงที่ง่ายขึ้น การกำหนดหมายเลขของบรรทัดจะสอดคล้องกับการนับในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา [12]

สายเซลล์ #1 จากสิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้ไม่รวมอยู่ในการศึกษาปัจจุบัน และดังนั้นจึงไม่ใช้หมายเลขนี้ การอ้างอิงใดๆ ไปยังเซลล์ BHK-2P ที่ไม่ได้กล่าวถึงหมายเลขบรรทัด #2, #4 หรือ #5 จะเป็นการอ้างอิงถึงหลักการระงับเซลล์ BHK21C13-2P (ECACC84111301) แนะนำที่จุดเริ่มต้นของส่วนนี้

หนูแฮมสเตอร์จีนที่ยึดติด (Cricetulus griseus) ของรังไข่ (CHO) สายพันธุ์ของเซลล์ CHO-K1 (ATCCCCL-61 จับเป็น CCLV-RIE 134) และ CHO677 (CRL 2244 จับเป็น CCLV-RIE 1524) รวมทั้ง IB-RS ใช้เซลล์ -2 เซลล์ (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2 ที่ CCLV-RIE 103) และเซลล์ไตวัว Madin-Darby (เรียกสั้นๆ ว่า MDBK ที่ถือในชื่อ CCLV-RIE261) เป็นตัวควบคุมในการทดลองโฟลว์ไซโตเมทรี

สภาพการเพาะเลี้ยงคือ 37 ˚C, 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 และสำหรับระงับเซลล์ 320 รอบต่อนาทีในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) ที่ความชื้นสัมพัทธ์ 80 เปอร์เซ็นต์ สายพันธุ์ของเซลล์ที่ยึดติดทั้งหมดได้รับการเพาะเลี้ยงในขั้นต่ำ Essential Medium Eagle (MEM) เสริมด้วยเกลือของ Hanks และ Earle (Sigma-Aldrich) ด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ สายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอยทั้งหมดถูกปรับให้เติบโตในตัวกลาง Cellvento™ BHK200 (เมอร์ค KGaA) ยกเว้นสายเซลล์ #2 ซึ่งถูกเพาะเลี้ยงตามที่บรรยายไว้ข้างต้น

การวัดความหนาแน่นของเซลล์และความมีชีวิตได้ดำเนินการโดยใช้ trypan blue (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) และตัวนับเซลล์อัตโนมัติ (รุ่น TC20, Bio-Rad)

2.2 การวิเคราะห์กราฟการเติบโตของเซลล์แขวนลอย

การวิเคราะห์กราฟการเจริญเติบโตถูกดำเนินการเป็นการทดลองแบบแบทช์ ดำเนินการซ้ำกันสองครั้ง โดยมีความหนาแน่นของการเพาะเป็น 0.6×106 เซลล์/มล. ความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิต (VCD) และความมีชีวิตเป็นเปอร์เซ็นต์ถูกวัดทุกวันจนถึงหกวันหลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์

การคำนวณเฉพาะเซลล์ดำเนินการตามสมการที่กำหนดโดย [14]:

X: VCD (ต่อมล.); t: จุดเวลาของการสุ่มตัวอย่าง (ชั่วโมง); n และ n-1: จุดสุ่มตัวอย่างสองจุดต่อเนื่องกัน

หมายเลขการแบ่งเซลล์ (cd):

2.3 โฟลว์ไซโตเมทรี

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกดำเนินการโดยใช้เครื่องมือโฟลว์ไซโตเมทรี FACSCanto II(BD Biosciences, Oxford, UK) เศษเซลล์ถูกปิดกั้นตามรูปแบบการกระจายไปข้างหน้าและด้านข้าง สำหรับการย้อมสีแอคติน ค่ามัธยฐานของแสงเรืองแสงในช่อง Alexa 488 ถูกวัดโดยตรง สำหรับคราบแอนติบอดีทั้งหมด เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ Alexa 488 หรือเซลล์บวก PE ถูกกำหนดด้วยช่วงเกตที่มีการกำหนดขอบเขตล่างตามการควบคุมไอโซไทป์ การทดลองทั้งหมดดำเนินการสามครั้งอย่างอิสระ

2.3.1 การย้อมสีแอนติบอดีของตัวรับที่พื้นผิวเซลล์

พื้นผิว. เซลล์ MDBK ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกสำหรับการแสดงออกของเซลล์ v 3, IB-RS-2 ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกสำหรับการแสดงออกของ v 8 และเซลล์ CHO-K1 ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกสำหรับการแสดงออกของ HS . เซลล์ CHO677 ไม่แสดงออกอินทีกรินหรือ HS ที่ทดสอบใดๆ และดังนั้นจึงทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบในการทดลองทั้งหมด แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกใช้: สำหรับ v 3, LM609 โคลนที่คอนจูเกตด้วย PE (การเจือจาง 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); สำหรับ v 8, แอนติบอดีปฐมภูมิ 11E8, โคลน 68, IgG2a ของเมาส์ (การเจือจาง 1:100) (กรุณาให้โดย Dr. StephenNishimura) ที่มีแอนติบอดีต่อ IgG2a ของเมาส์แพะ (การเจือจาง 1:1000) ที่คอนจูเกตด้วย Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); สำหรับ HS, โคลน 10E4, IgM ของเมาส์ (เจือจาง 1:200) (Amsbio, Abingdon, สหราชอาณาจักร) ที่มีแอนติบอดีรองแพะต่อต้านเมาส์ IgM mu chain (เจือจาง 1:2000) ผสานกับ Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, UK) . แต่ละการทดลองใช้แอนติบอดีหลักเพียงตัวเดียว

เซลล์แขวนลอยถูกล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เซลล์เกาะติดกันถูกแยกออกโดยใช้ EDTA 10 มิลลิโมลาร์ใน PBS แล้วล้างด้วย PBS หลังการล้าง เซลล์ถูกกรองผ่านตัวกรองเซลล์ (ตาข่ายไนลอน, เส้นผ่านศูนย์กลางรูพรุน 70 μm, VWR, Radnor, USA) เพื่อขจัดกลุ่มเซลล์และถูกปรับเป็น 1×106 เซลล์/มล. ก่อน 1 ไมโครลิตรของ LIVE/ DEAD FixableViolet dead cell stain (Thermo Fisher Scientific) ถูกเติมไปยังสารแขวนลอยของเซลล์ 1 มล. เป็นเวลา 30 นาที ขั้นตอนนี้และขั้นตอนที่ตามมาทั้งหมดได้รับการป้องกันจากแสงและที่อุณหภูมิ 4 ˚C แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาที และแอนติบอดีทุติยภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 20–30 นาที ขั้นตอนการล้างที่มีบัฟเฟอร์ FACS 2 มล. (PBS, โซเดียม เอไซด์ 0.1 เปอร์เซ็นต์, BSA 0.1 เปอร์เซ็นต์) และการหมุนเหวี่ยงที่ 300 × g, 5 นาที, 4 ˚C ถูกดำเนินการหลังจากขั้นตอนทั้งหมด สุดท้าย เซลล์ที่ย้อมถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ FACS 300 ไมโครลิตร

2.3.2 การย้อมสีแอคติน

แอคตินที่เป็นเส้นใยถูกย้อมโดยใช้ Phalloidin-iFluor 488 Reagent(ab176753, Abcam) ที่เตรียมตามเอกสารข้อมูล BHK179, BHK-2P และ BHK-InVcells ถูกแยกออกตามที่บรรยายไว้ข้างต้นและตรึงด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และเซลล์คงที่ 1×106 เซลล์ถูกซึมผ่านด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ใน PBS ตามด้วยการฟักตัวที่ RT เป็นเวลา 3 นาที เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS (การหมุนเหวี่ยงที่ 300 × g, 5 นาที) ก่อนเติมสารละลายสต็อกลอยด์ที่เตรียมไว้, เจือจาง 1:1000 ในบัฟเฟอร์ FACS และบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่ RT สุดท้ายนี้ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ FACS และถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ FACS ขนาด 300 ไมโครลิตร เซลล์ที่ย้อมสีถูกวิเคราะห์โดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง และใช้สำหรับการวิเคราะห์ FACS

2.3.3 การทดลองแปลงร่าง

BHK164 และ BHK-2เซลล์ P ถูกทรานส์เฟกด้วย EGFP-N1 อย่างใดอย่างหนึ่ง ซึ่งเป็นพลาสมิดที่แสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่เพิ่มขึ้น (EGFP) (Clontech) หรือในการทดลองอีกชุดหนึ่งกับ pVSV-G ซึ่งเป็นพลาสมิดที่แสดงโปรตีน G ของตุ่ม stomatitis Indiana virus (VSV) โดยใช้ Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุป พลาสมิด DNA 2 ไมโครกรัมและไลโปเฟคตามีน 1.875 ไมโครลิตรหรือ 3.75 ไมโครลิตรที่เจือจางในตัวกลาง Cellvento™ BHK200 ถูกผสมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาทีเพื่อให้เกิดการก่อตัวที่ซับซ้อน หลังจากนั้น ของผสมเหล่านี้ถูกถ่ายโอนไปยังเซลล์ในเพลต12-หลุม (ประมาณ 4×105 เซลล์/มล.) และตัวกลางถูกเติมจนถึง 200 ไมโครลิตร เซลล์ถูกบ่มที่ 37 ˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

สำหรับการวิเคราะห์ FACS เนื้อหาทั้งหมดของบ่อน้ำถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ทรานส์เฟก pEGFP ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS และถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ FACS 300 ไมโครลิตร เซลล์ที่ทรานส์เฟก pVSV-G ที่ซ้ำกันหนึ่งเซลล์ถูกซึมผ่านด้วย PBS ด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) TritonX-100 เป็นเวลา 5 นาทีที่ RT ก่อนการย้อมสีแอนติบอดี ในขณะที่อีกเซลล์หนึ่งยังคงไม่ผ่านการซึมผ่าน การย้อมสีแอนติบอดีได้ดำเนินการตามที่บรรยายไว้ข้างต้นด้วยพอลิโคลนัลแรบบิทเซรั่ม VSV 274/E (เจือจาง 1:500 อย่างกรุณาโดย Dr. Stefan Finke) และแอนติบอดีต้านกระต่ายทุติยภูมิทุติยภูมิ (H บวก L) ที่คอนจูเกตด้วย Alexa Fluor 488 (เจือจาง 1: 1000; วิทยาศาสตร์เทอร์โมฟิชเชอร์).

2.4 การวิเคราะห์ทางสถิติ

วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ GraphPad Prism เวอร์ชัน 07.04 สำหรับ Windows (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, USA) การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวแบบธรรมดาทำร่วมกับการวิเคราะห์หลังสุดของ Tukey เพื่อประเมินความแตกต่างระหว่างกลุ่มการรักษา เกณฑ์สำหรับนัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดไว้ที่ค่า p ที่ 0.001

2.5 การวิเคราะห์การถอดเสียง

2.5.1 การแยกอาร์เอ็นเอ การเตรียมห้องสมุด และการจัดลำดับ

สามแบทช์ที่เป็นอิสระของแต่ละสายพันธุ์ของเซลล์ BHK179 ที่ยึดติดและสายเซลล์แขวนลอย BHK-2P และ BHK-InV ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์การถอดรหัส โดยเฉลี่ย เซลล์ 8.3×105 BHK179, 1.6×107 BHK-2Pcells และเซลล์ 1.4×107 BHK-InV ถูกสลายใน TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific) หลังจากเติมไตรคลอโรมีเทน 0.2 ปริมาตรลงในเซลล์ไลเซต การฟักตัว และการหมุนเหวี่ยง เฟสที่เป็นน้ำถูกรวบรวมและผสมกับเอธานอล 100 เปอร์เซ็นต์หนึ่งปริมาตร จากนี้ RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ที่มีการย่อย DNase ในคอลัมน์ด้วย RNase-Free DNase Set (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เพิ่ม ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) และใช้เป็นตัวควบคุมภายในสำหรับขั้นตอนต่อไปนี้ทั้งหมด ต่อไป mRNA โพลีอะดีนิเลตถูกแยกจาก RNA ทั้งหมดคุณภาพสูง 1–3 ไมโครกรัมโดยใช้ Dynabeads mRNA DIRECT Micro kit (ThermoFisher Scientific) ต่อมา mRNA ถูกแยกส่วนและใช้สำหรับสังเคราะห์ cDNA และการเตรียมห้องสมุดโดยใช้ชุดเตรียมตัวอย่าง TruSeq Stranded mRNA LT (อิลลูมินา ซานดิเอโก สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การจัดลำดับดำเนินการที่Heinrich-Pette-Institut เมืองฮัมบูร์ก โดยใช้อุปกรณ์ NextSeq 500 (2x75 bp) และ HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina)

2.5.2 การวิเคราะห์ทางสถิติของการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน

การตรวจสอบคุณภาพของการอ่านข้อมูลดิบจากไลบรารีการจัดลำดับแต่ละรายการดำเนินการโดยใช้ FastQC (เวอร์ชัน {0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) โดยเน้นที่การกระจายความยาวในการอ่านและการปนเปื้อนของอะแดปเตอร์ก่อนและหลังอะแดปเตอร์ การตัดแต่งโดยใช้ Trim Galore (เวอร์ชัน 0.6.4_dev, Babraham Institute) และ Cutadapt (เวอร์ชัน 2.10) [15] เมื่อใช้ปลาแซลมอน [16] การอ่านข้อมูลดิบที่ตัดแต่งแล้วจะถูกจับคู่เสมือนกับจีโนมของหนูแฮมสเตอร์สีทองของซีเรีย

กล่าวโดยย่อ การอ้างอิงจีโนมและการถอดเสียงของ GCF{{0}}.1_MesAur1.0 ได้มาจากศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) และรวมกับลำดับอ้างอิงของ ERCC spike- ในการควบคุม ดัชนีทรานสคริปโทมที่รู้ตัวล่อ [17] ถูกสร้างขึ้นเพื่อให้เลือกแนวร่วมกับแซลมอน สำหรับการหาปริมาณ มีการใช้การจำลองบูตสแตรปสิบครั้งและการชดเชยสำหรับความเอนเอียงเฉพาะลำดับ ความเอนเอียง GC และอคติเชิงตำแหน่ง 5' หรือ 3' ถูกเปิดใช้งาน

ต่อจากนั้น ข้อมูลการหาปริมาณสำหรับกลุ่มควบคุมการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ ERCC มีความสัมพันธ์กับความเข้มข้นทางทฤษฎีของพวกมัน เพื่อตรวจหาปัญหาระหว่างการเตรียมตัวอย่าง

นอกจากนี้ ข้อมูลการหาปริมาณเฉพาะของยีนถูกกรองในขั้นต้น (เฉพาะยีนที่ปรากฏในการจำลองมากกว่าหนึ่งรายการโดยมีจำนวนมากกว่า 15 รายการ) ทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้การแปลงบันทึกที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (rlog) และใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลเชิงสำรวจ เช่น ด้วย PCA ยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างถูกระบุและต่อมาใช้สำหรับการวิเคราะห์วิถีโดยใช้ DESeq2 [18] ข้อมูลการแสดงออกถูกวิเคราะห์สำหรับยีนที่แสดงออกที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างคู่สายของเซลล์ BHK-2P และ BHK179, BHK-InV และ BHK-2P และ BHK-InV และ BHK179 ต่อจากนั้น การเปลี่ยนแปลงการพับลอการิทึมไบนารี (log2) ที่เป็นผลลัพธ์ถูกปรับโดยใช้ฟังก์ชัน "lfcShrink" และ "apglm" ใน DESeq2 เพื่อชดเชยจำนวนการอ่านที่ต่ำหรือตัวแปรที่อาจนำไปสู่การประมาณค่าความแปรปรวนสูงเกิน [19]

เกณฑ์สำหรับยีนที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญถูกกำหนดเป็นค่าที่ปรับปรุงสูงสุด {{0}}.05 และค่าสัมบูรณ์ต่ำสุดของการเปลี่ยนแปลง log2 ที่หดเล็กลงที่ 1 ทางเดินและเกณฑ์ สำหรับยีนที่แสดงออกที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญถูกกำหนดเป็นค่าที่ปรับแล้วสูงสุดที่ 0.05 และค่าสัมบูรณ์ต่ำสุดของการเปลี่ยนแปลงการหดตัว 2 เท่าของ 1 การวิเคราะห์เส้นทางและการตกแต่งดำเนินการโดยใช้ฟังก์ชัน "ทำให้สมบูรณ์" ในโปรไฟล์คลัสเตอร์ (เวอร์ชัน 3.16.0)

cistanche สามารถบำรุงไตและปรับปรุงการทำงานของไต

3. ผลลัพธ์

3.1 ความอ่อนไหวของสายเซลล์สำหรับ FMDV นั้นไม่ขึ้นกับอัตราการเติบโตและจำนวนการแบ่งเซลล์แต่ละเซลล์

การทดลองแบบแบทช์กับสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย BHK ที่แตกต่างกันเก้าชนิดถูกดำเนินการในช่วงหกวันและความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิต (VCD) และความอยู่รอดถูกวัดทุกวัน จากการสังเกตก่อนหน้านี้ว่าสายพันธุ์ของเซลล์มีความไวต่อการติดเชื้อ FMDV serotype Asia{{0}} [12] ที่แตกต่างกัน ได้มีการตรวจสอบว่าเมแทบอลิซึมของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นและอัตราการเจริญเติบโตเชื่อมโยงกับความไวต่อการติดเชื้อที่ลดลงหรือไม่ ไวรัส (ตารางที่ 1) สองในสามสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย BHK ที่อ่อนแอคือเซลล์ที่เติบโตอย่างช้าๆ โดยมีตัวเลขการแบ่งเซลล์ขนาดเล็ก (cd) เท่ากับ 0.60 (#3) และ 0.70 (#9) ในขณะที่สายพันธุ์ของเซลล์ที่อ่อนแอที่สาม (#8) มี อัตราการเติบโตสูงสุดและ cd (μ=0.035, cd=1.62) ในกลุ่มเซลล์ที่ทดสอบทั้งหมด

การถอนเซรั่มและการปรับตัวให้เข้ากับการเจริญเติบโตใน ACFM ไม่มีผลต่อความอ่อนไหวต่อ FMDV ในกลุ่มเซลล์ที่ตรวจสอบของเรา สายเซลล์ #2 เป็นสารตั้งต้นที่ขึ้นกับเซรั่มของ BHK-2P เซลล์ไลน์ที่เติบโตช้าและคงไว้ซึ่งสารแขวนลอยด้วย GMEM พร้อมด้วยเซรั่มจากวัวในครรภ์ ในระหว่างการปรับให้เข้ากับการเจริญเติบโตใน ACFM เซลล์ถูกเลือกสำหรับ VCD สูง ซึ่งเชื่อมโยงกับอัตราการเติบโตและซีดีที่สูง เช่นเดียวกับสายหลัก BHK-2P เซลล์ที่ใช้สำหรับการศึกษา สายเซลล์ #4 และ #5 ยังมาจากสายเซลล์ #2 แต่ต่างกันในโหมดของการปรับให้เข้ากับ ACFM เซลล์ BHK-2P ทั้งหมดที่คงอยู่ใน ACFM มีรูปแบบการเติบโตที่คล้ายคลึงกันมาก ความอ่อนไหวต่อ FMDV serotype Asia-1 ไม่ได้มาจากเซลล์เหล่านี้ในระหว่างการปรับให้เข้ากับ ACFM อาจเป็นเพราะสายผลิตภัณฑ์เดิม #2 มีความต้านทานอยู่แล้ว ในทำนองเดียวกัน ไม่พบการเปลี่ยนแปลงในความไวต่อสายเซลล์แขวนลอย #3 เมื่อเติบโตอย่างมั่นคง (เปรียบเทียบสายเซลล์ #1 ใน [12]) เซลล์มีความอ่อนไหวต่อ FMDV Asia-1 และยังคงคุณลักษณะนี้ไว้ในระหว่างการปรับให้เข้ากับการเจริญเติบโตในสารแขวนลอย ในเวลาเดียวกัน พวกมันไม่ได้เติบโตอย่างรวดเร็วของเซลล์แขวนลอยอื่นๆ

3.2 เซลล์แขวนลอยมีตัวรับหลักน้อยกว่า แต่มีตัวรับรองสำหรับ FMDV บนพื้นผิวมากกว่าเซลล์ BHK ที่ยึดติด

ขั้นตอนแรกสำหรับไวรัสที่จะทำให้เซลล์ติดเชื้อได้สำเร็จคือการจับอนุภาคไวรัสกับโมเลกุลของตัวรับบนผิวเซลล์ เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างเซลล์ BHK ที่เติบโตอย่างเหนียวแน่นและเซลล์ BHK ในสารแขวนลอย แอนติบอดีต่อตัวรับเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ของเมทริกซ์นอกเซลล์และทราบว่ามีบทบาทสำคัญในการติดเชื้อ FMDV Integrins v 3 และ v 8 ถูกตรวจสอบเป็นตัวรับเซลล์ที่เป็นตัวแทนซึ่งรับรู้ถึงโมทีฟการจับ RGD (Arg-Gly-Asp) และโต้ตอบกับส่วนประกอบในซีรัมและเมทริกซ์นอกเซลล์ แต่ยังถูกใช้โดย FMDV เป็นตัวรับหลักตามธรรมชาติ ไม่มีสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอยที่ทดสอบ (BHK-InV และ BHK-2P) ที่แสดงออกถึงจำนวนเต็ม v 3 หรือ v 8 บนพื้นผิวเซลล์ ในขณะที่ความแตกต่างระหว่างสารยึดเกาะ BHK และสารแขวนลอย BHK ไม่มีนัยสำคัญสำหรับจำนวนเต็ม v 8 (รูปที่ 1b) เปอร์เซ็นต์ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญของสารยึดเกาะ BHK179 แสดงจำนวนเต็ม v 3 เมื่อเทียบกับสายเซลล์แขวนลอย BHK-InV และ BHK-2P ( รูปที่ 1a)

HS จำนวนมากถูกนำเสนอบนพื้นผิวของสายเซลล์แขวนลอยทั้งสองสาย การแสดงออกของ HS มีความแตกต่างกันอย่างมากระหว่างวัฒนธรรมที่ทำซ้ำของเซลล์ BHK179 ที่ยึดติด เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย เซลล์จำนวนน้อยลงในวัฒนธรรม BHK179 มีค่า HS-positive แม้ว่าความแตกต่างไม่มีนัยสำคัญที่ระดับนัยสำคัญที่กำหนดไว้ล่วงหน้า (รูปที่ 2)

การย้อมสีและการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เผยให้เห็นความแตกต่างอย่างมากในการจัดเรียงของโครงร่างโครงร่างโครงร่างของแอคตินระหว่างเซลล์ยึดเกาะและเซลล์แขวนลอย (รูปที่ 3) ฟิลาเมนต์แอคตินในเซลล์ BHK179 ที่ยึดติดถูกกระจายอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งเซลล์ในรูปแบบไขว้กันเหมือนแหแบบละเอียด (รูปที่ 3a) ในขณะที่เซลล์ที่เติบโตในสารแขวนลอยมีการย้อมสีแอคตินแบบกระจาย (รูปที่ 3b) น่าสนใจ ปริมาณของแอคตินที่เป็นเส้นใยแตกต่างกันระหว่างสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย BHK-InV และ BHK-2P ค่ามัธยฐานของความเข้มเรืองแสง (MFI) หลังจากการย้อมด้วย phalloidin สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ BHK-InV เมื่อเทียบกับ BHK-2P ซึ่งบ่งชี้ถึงปริมาณแอคตินที่เป็นเส้นใยที่สูงขึ้นในเซลล์เหล่านี้ (รูปที่ 3c)

3.3 เซลล์แขวนลอยแตกต่างกันในด้านประสิทธิภาพการถ่าย แต่ไม่สามารถแสดงโปรตีนที่พื้นผิวได้

เนื่องจากความแตกต่างของโครงสร้างแอกตินระหว่างเซลล์ยึดเกาะและเซลล์แขวนลอย เซลล์จึงได้รับการตรวจสอบโดยคำนึงถึงความสามารถในการถ่ายโอนและความสามารถในการนำเสนอโปรตีนบนพื้นผิวของพวกมัน โดยทั่วไป ประสิทธิภาพการทรานส์เฟกชันที่วัดโดยการแสดงออกของ EGFP จะลดลงในเซลล์แขวนลอย (รูปที่ 4a) เมื่อใช้ขนาดยาต่ำของรีเอเจนต์การทรานส์เฟกชัน เปอร์เซ็นต์ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ที่ยึดเกาะแสดง EGFP เมื่อเทียบกับเซลล์แขวนลอย เมื่อใช้รีเอเจนต์การถ่ายเทปริมาณสูง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์แขวนลอยที่สูงขึ้นก็ถูกถ่ายสำเร็จ แม้ว่าความแตกต่างระหว่างขนาดยาสูงและต่ำไม่สำคัญ เพื่อตอบคำถามว่าเซลล์แขวนลอยยังคงสามารถนำเสนอโปรตีน เช่น ตัวรับเซลล์บนพื้นผิวของพวกมันได้หรือไม่ เซลล์ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดเข้ารหัสสำหรับโปรตีน VSV G (รูปที่ 4b) เซลล์ชุดหนึ่งถูกทำให้ซึมผ่านได้ก่อนการย้อมสีเพื่ออธิบายความเป็นไปได้ที่โปรตีน G ถูกแสดงออกแต่ไม่แสดงบนผิวเซลล์ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความสามารถในการแสดงออกและนำเสนอโปรตีน VSV G ระหว่างเซลล์ยึดติดและเซลล์แขวนลอย ทั้งเมื่อใช้รีเอเจนต์การถ่ายเทปริมาณต่ำหรือสูง

3.4 การวิเคราะห์ Transcriptome เผยให้เห็นความแตกต่างในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเมทริกซ์นอกเซลล์ระหว่างเซลล์แขวนลอย

การวิเคราะห์ทรานสคริปโทมถูกดำเนินการเพื่อตรวจสอบความแตกต่างระหว่างเซลล์ BHK ที่เติบโตอย่างยึดติดและเซลล์ BHK ในสารแขวนลอย และเพื่อชี้แจงว่าเหตุใดเซลล์แขวนลอยจึงแตกต่างกันในความไวต่อ FMDV ของพวกมัน สายเซลล์ BHK ที่ยึดติด (BHK179) ที่เพาะเลี้ยงใน MEM เสริมด้วย FBS เช่นเดียวกับสายเซลล์ที่ไวต่อสัญญาณ FMDV ที่เติบโตอย่างรวดเร็ว (BHK-InV) และสายเซลล์ต้านทานที่เติบโตอย่างรวดเร็ว (BHK-2P) ทั้งคู่ ปรับให้เข้ากับ ACFM ได้รับเลือกสำหรับการวิเคราะห์

การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) เน้นถึงความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดระหว่างการทำซ้ำทางชีววิทยาของแต่ละสายเซลล์ (รูปที่ 5a) การจำลองแบบทั้งหมดของสายเซลล์เดียวกันจะอยู่ชิดกันในโครงเรื่องโดยมีข้อบ่งชี้เพียงเล็กน้อยของผลกระทบของแบทช์ต่อแบทช์ องค์ประกอบหลักแรก (คิดเป็น 81 เปอร์เซ็นต์ของความแปรปรวนในชุดข้อมูลที่ทำให้เป็นมาตรฐาน) ถูกตีความว่าเป็นความแตกต่างของการถอดรหัสระหว่างเซลล์ที่เติบโตในสารแขวนลอยและเซลล์ที่เติบโตในการเกาะติด ในขณะที่องค์ประกอบหลักที่สอง (15 เปอร์เซ็นต์ของความแปรปรวน) แสดงถึงความแตกต่างระหว่าง เซลล์แขวนลอย BHK-2P และ BHK-InV อาจเกี่ยวข้องกับความไวต่อการติดเชื้อ FMDV เมื่อรวมกันแล้ว องค์ประกอบหลักสององค์ประกอบแรกสามารถอธิบาย 96 เปอร์เซ็นต์ของความแปรปรวนที่พบในชุดข้อมูล ซึ่งบ่งชี้ว่าการวิเคราะห์การถอดรหัสระบุความแตกต่างที่เกี่ยวข้องระหว่างสามสายเซลล์

พบยีนที่แสดงออกทางความแตกต่างจำนวนน้อยที่สุดเมื่อเปรียบเทียบ BHK-InV กับ BHK-2P (590 ควบคุมขึ้น; 304 ควบคุมลง) เห็นตัวเลขที่คล้ายกันในการเปรียบเทียบ BHK-2P หรือ BHK-InV ทีละรายการกับ BHK179 (1527 และ 1519 up-regular; 1308 และ 943 down-controlled ตามลำดับ) (รูปที่ 5b) เมื่อสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอยสองสายพันธุ์ (BHK-InV และ BHK-2P) ถูกรวมกันและเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ของเซลล์ BHK179 ที่ยึดติด ยีน 1814 ตัวถูกแสดงออกอย่างแตกต่าง แม้ว่ายีน 411 ตัวจะแสดงออกต่างกันอย่างเฉพาะเจาะจงเมื่อเปรียบเทียบ BHK179 กับ BHK-InV แต่เกือบสองเท่าของยีน (701 ยีน) นั้นแสดงออกต่างกันอย่างเฉพาะเจาะจงระหว่าง BHK179 และ BHK-2P ระหว่างเซลล์แขวนลอยทั้งสองสายพันธุ์ มียีนเพียง 104 ยีนที่แสดงออกต่างกันอย่างเฉพาะเจาะจง

เมื่อเปรียบเทียบชุดของยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างของสายเซลล์ที่ไวต่อ FMDV BHK179 และ BHK-InV กับสายเซลล์ที่ดื้อต่อ FMDV BHK-2P พบว่าชุดย่อยของยีน 553 ตัวถูกแสดงออกอย่างต่างกันในการเปรียบเทียบทั้งสอง ( รูปที่ 5c) เนื่องจากยีนเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับความอ่อนแอของ FMDV จึงมีการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะระยะ GO และเปิดเผยว่ายีนเหล่านี้จำนวนมากเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบเซลล์ของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) เยื่อหุ้มเซลล์ และรอยต่อระหว่างเซลล์และเซลล์ (รูปที่ 5d) .

เนื่องจากเราสังเกตเห็นความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาของ ECM ทรานสคริปโทมจึงถูกวิเคราะห์ใหม่โดยเน้นที่การแสดงออกของอินทิกริน v 1, v 3, v 6, v 8 รวมถึงแอคติน ทั้งหมดนั้นอาจเกี่ยวข้องกับความไวต่อการติดเชื้อ FMDV (รูปที่ 5e). ยกเว้น ACTA2 ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับแอคตินระหว่างเซลล์ BHK-InV และ BHK-2P ที่ระดับ mRNA จำนวนยีนที่ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับยีนที่เกี่ยวข้องกับแอคตินที่ตรวจสอบทั้งหมดนั้นสูงกว่าในสายเซลล์ที่ยึดติด BHK179 อย่างมีนัยสำคัญสูงกว่าในสายเซลล์แขวนลอย (S1 รูปที่)

เซลล์ทั้งสามสายพันธุ์แสดงปริมาณการถอดเสียง ITGAV ที่คล้ายคลึงกัน โดยเข้ารหัสสำหรับหน่วยย่อย integrin v แต่แสดงการแสดงออกเชิงอนุพันธ์สำหรับหน่วยย่อยของ integrin ในรายละเอียด สายเซลล์แขวนลอย BHK-2P และ BHK-InV แสดง ITGB1, ITGB3 และ ITGB6 ที่น้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับสายเซลล์ที่ยึดติด BHK179 ITGB3 และ ITGB8 ถูกแสดงออกอย่างแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย BHK-2P และ BHK-InV ที่น่าสนใจ ITGB8 เป็นยีนเข้ารหัสหน่วยย่อยของอินทิกรินเพียงยีนเดียวที่มีการแสดงออกมากเกินไปในทั้งสายเซลล์ที่อ่อนแอต่อ FMDV BHK179 และ BHK-InV เมื่อเปรียบเทียบกับสายเซลล์ที่ดื้อต่อ FMDV BHK-2P (รูปที่ 5e)

cistanche สามารถบำรุงไตและปรับปรุงการทำงานของไต

4. การอภิปราย

การปรับตัวของเซลล์ให้เติบโตในสารแขวนลอยและในสื่อที่ปราศจากซีรัมเป็นกระบวนการที่ต้องใช้เวลาและค่อยเป็นค่อยไป แต่จำเป็นในด้านเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อสร้างสายเซลล์ที่ให้ผลผลิตสูงที่ใช้ในการผลิตแอนติบอดี แอนติเจนของวัคซีน หรือโปรตีนอื่นๆ [1, 8 ]. อันที่จริง กระบวนการนี้มักจะเต็มไปด้วยความเสี่ยงที่เซลล์จะได้รับคุณสมบัติที่ไม่ต้องการเมื่อเปรียบเทียบกับวัสดุของเซลล์ดั้งเดิม [7] ในกรณีของการผลิตแอนติเจนในวัคซีน ความอ่อนไหวของเซลล์ไลน์สำหรับไวรัสเป้าหมายมีความสำคัญอย่างยิ่ง สำหรับไวรัสโรคปากและเท้าเปื่อย (FMDV) เป็นปรากฏการณ์ที่ทราบกันดีว่าเซลล์ BHK บางสายพันธุ์มีความทนทานต่อการติดเชื้อหรือสูญเสียความไวต่อการเพาะเลี้ยงย่อยซ้ำๆ [20-22] นอกจากนี้ คุณสมบัติของแอนติเจนของไวรัสสามารถเปลี่ยนแปลงได้ขึ้นอยู่กับเซลล์เจ้าบ้าน [9]

เซลล์แขวนลอยเติบโตอย่างอิสระจากพื้นผิวและถูกกลืนโดยสารอาหารที่อุดมด้วยออกซิเจน ทำให้พวกมันเติบโตอย่างรวดเร็ว การเพิ่มจำนวนอย่างรวดเร็วของเซลล์เป็นคุณลักษณะที่จำเป็นในการขยายขนาดการเพาะเลี้ยงเป็นปริมาณมากอย่างง่ายดายและในเวลาอันสั้น การกำจัดซีรั่มออกจากสื่อมีความจำเป็นเพื่อลดต้นทุน ความเสี่ยงของการปนเปื้อน และทำให้กระบวนการลดขนาดง่ายขึ้น [23, 24]

การวิเคราะห์การเจริญเติบโตแบบกลุ่มของสายพันธุ์เซลล์แขวนลอย BHK ต่างๆ มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบว่าการเลือกไปยังประชากรเซลล์ที่เติบโตอย่างรวดเร็วในสภาวะที่ปราศจากซีรัมเป็นอันตรายต่อการแพร่กระจายของ FMDV หรือไม่ อันที่จริง สองในสามสายพันธุ์ของเซลล์ที่อ่อนแอเติบโตอย่างช้าๆ แต่ความอ่อนไหวต่อ FMDV พบว่าไม่ขึ้นกับเมแทบอลิซึมของการเจริญเติบโต มีแนวโน้มมากขึ้นที่ความอ่อนแอของ FMDV จะหายไป (หรือคงอยู่) ในระหว่างการปรับตัวในขั้นต้นกับการเติบโตของการระงับ การแยกเซลล์ออกจากพื้นผิวและการถอนเซรั่มในขั้นตอนต่อไปนี้ของการปรับตัวให้เข้ากับการเติบโตของสารแขวนลอยนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในระดับการแสดงออกของโปรตีนพื้นผิวและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโครงร่างโครงร่าง [7]

อินทิกรินเป็นตระกูลที่สำคัญของตัวรับที่ผิวเซลล์ซึ่งถูกรวมเข้ากับเยื่อหุ้มเซลล์และเป็นตัวกลางในการส่งสัญญาณระหว่างเซลล์กับเซลล์ เช่นเดียวกับการเชื่อมต่อที่แน่นแฟ้นระหว่างเซลล์และพื้นผิวผ่านการผูกมัดของส่วนประกอบเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) [10, 25 ]. การควบคุมวัฏจักรเซลล์ การจัดระเบียบโครงร่างโครงร่าง และการเคลื่อนย้ายโมเลกุลรีเซพเตอร์ที่พึ่งเกิดไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ขึ้นอยู่กับจำนวนเต็ม [25] ส เซลล์เปลี่ยนจากการยึดติดเป็นการเจริญเติบโตของสารแขวนลอย FMDV ยังใช้การจดจำบรรทัดฐาน RGD โดยอินทิกรินเพื่อเริ่มต้นเอนโดไซโทซิสที่รับสื่อกลางของอนุภาคไวรัส [26] บรรทัดฐาน RGD ใน VP1 ของ FMDV ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดี [27] และ integrins v 1, v 3, v 6 และ v 8 เป็นที่รู้จักซึ่งใช้โดย FMDV ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง [28–31] เนื่องจากความแตกต่างที่น่าสงสัยในโปรตีโอมผิวเซลล์ระหว่างเซลล์ที่ยึดติดและเซลล์แขวนลอยอาจมีความสำคัญสำหรับความแตกต่างในความไวต่อการติดเชื้อ FMDV แอนติบอดีที่จับกับอินทิกริน v 3 และ v 8 ถูกใช้เพื่อย้อมสายเซลล์ BHK ที่ยึดติดและ กลุ่มเซลล์ BHK ที่อ่อนแอและทนต่อการระงับ ไม่มีการย้อมสี v 6 เนื่องจากก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าจำนวนเต็มนี้ไม่ได้แสดงออกบนพื้นผิวของเซลล์ BHK [32] แม้ว่าจะสามารถตรวจพบ ITGB6 mRNA ได้ ในทำนองเดียวกัน แม้ว่าการแสดงออกของ ITGB8 mRNA ในระดับสูงจะตรวจพบในเซลล์ BHK179 และ BHK-InV แต่ดูเหมือนว่า integrin v 8 จะไม่ปรากฏบนพื้นผิวของเซลล์ BHK โดยทั่วไป พบอินทิกริน v 3 ในระดับเล็กน้อยบนสายเซลล์ที่ยึดติด แต่ไม่พบในสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย

นอกเหนือจากอินทิกริน การจับลิแกนด์ เหตุการณ์ภายใน และการส่งสัญญาณภายในเซลล์สามารถไกล่เกลี่ยโดยโปรตีโอไกลแคนเฮปาแรนซัลเฟต (HS) [33] และการรับ HS เป็นตัวรับรองมักจะสังเกตได้หลังจากผ่าน FMDV ซ้ำในวัฒนธรรม [34] การย้อมสีแอนติบอดีจำเพาะเผยให้เห็น HS จำนวนมากบนทั้งสายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอยและในระดับที่น้อยกว่านั้นบนเซลล์ BHK ที่ยึดติดด้วย การกลายพันธุ์ในจีโนมของ FMDV ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในโปรตีน capsid ของไวรัสเพื่อให้สามารถใช้ HS เป็นตัวรับ เป็นที่ทราบกันดีว่าลดทอนไวรัสในโฮสต์ตามธรรมชาติ [35] ความพร้อมใช้งานของ HS อาจเป็นปัจจัยสำคัญสำหรับการเปลี่ยนแปลงแอนติเจนของความเป็นอิสระของ FMDV ของสายเซลล์ที่ไวรัสได้รับการปรับให้เข้ากับ

เนื่องจากการแยกตัวของเซลล์เชื่อมโยงกับการเปลี่ยนแปลงในกลไกการหดตัวของแอคติน-ไมโอซิน [7] และการเพาะเลี้ยงเซลล์ในสารแขวนลอยทำให้เกิดความต้องการที่แตกต่างกันสำหรับการอยู่รอด เช่น การต้านทานแรงเฉือนสูงเนื่องจากการกวนของของเหลวเพาะเลี้ยง [6] โครงกระดูกของแอคตินได้รับ ที่น่าสนใจในการศึกษาครั้งนี้ การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เผยให้เห็นการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ของโครงร่างโครงร่างจากการกระจายแบบไขว้กันเหมือนแหในเซลล์ที่กำลังเติบโตที่ยึดติดกันเป็นโครงสร้างทรงกลมที่หนาแน่นในสภาวะแขวนลอย นี่อาจเป็นกลไกการปรับความเค้นเฉือนสูงที่กล่าวถึงข้างต้น และเป็นที่ทราบกันดีว่าเกิดขึ้นในเซลล์ CHO ในสภาวะเดียวกัน [6] แต่เป็นที่น่าสังเกตว่าในขณะที่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของยีนแอคตินส่วนใหญ่ระหว่างเซลล์ BHK-InV และ BHK-2P ที่ระดับ mRNA แต่ตรวจพบโปรตีนแอคตินที่มีเส้นใยมากกว่าใน BHK ที่ไวต่อ FMDV -InV มากกว่าใน BHK ที่ทนต่อ FMDV-2P สิ่งนี้อาจเชื่อมโยงกับอัตราการเกิดพอลิเมอไรเซชันที่แตกต่างกันของแอคตินทรงกลมไปเป็นแอคตินแบบใย

อย่างน้อยก็ในเซลล์ที่ยึดติด การป้อน FMDV ขึ้นอยู่กับไดนามิกของแอคติน การเข้ามาของไวรัสทำให้เกิดแอคตินรัฟเฟิลและการหยุดชะงักของเครือข่ายฟิลาเมนต์แอคตินผ่านการเปลี่ยนแอคตินจากเส้นใยไปเป็นแอคตินทรงกลมได้รับการอธิบายไว้ในระยะแรกของการติดเชื้อ [36–38] ตัดสินจากผล cytopathic (CPE) ที่เห็นในเซลล์ BHK ที่ยึดติดเมื่อติดเชื้อ FMDV โครงร่างโครงร่างของเซลล์จะต้องผ่านการจัดเรียงใหม่อย่างเข้มข้นในส่วนประกอบหลายอย่าง [38] CPE ดังกล่าวไม่พบในเซลล์แขวนลอยเนื่องจากรูปร่างเป็นทรงกลมอยู่แล้ว แต่ปริมาณแอคตินที่เพิ่มสูงขึ้นอาจให้ประโยชน์กับไวรัสอยู่บ้าง เนื่องจากความแตกต่างในโครงร่างโครงกระดูกของแอกติน จึงมีการทดลองการถ่ายเพื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการถ่ายระหว่างสารแขวนลอยและ BHK ที่ยึดติด และเพื่อตรวจสอบว่าโครงร่างเซลล์หนาแน่นของเซลล์แขวนลอยขัดขวางการนำเสนอของโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์หรือไม่ เป็นที่ทราบกันทั่วไปว่าสายเซลล์แขวนลอยนั้นยากต่อการเปลี่ยนถ่าย ซึ่งเกิดจากการยึดติดของสารเชิงซ้อนที่ลดลงกับเยื่อหุ้มเซลล์และการรับน้ำหนักของ DNA ลดลงในเวลาต่อมา [39] สิ่งนี้ได้รับการยืนยันจากการทดลองของเราด้วย แต่ถึงแม้ว่าประสิทธิภาพการทรานส์เฟกชันจะลดลงในเซลล์ BHK-2P เมื่อเปรียบเทียบกับสายเซลล์ BHK ที่ยึดติด แต่ก็ไม่มีความแตกต่างในความสามารถในการแสดงโปรตีน VSV G ที่ทรานส์เฟกบนผิวเซลล์ ความแตกต่างในเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่ย้อมถูกสังเกตพบระหว่างพลาสมิดการแสดงออก pEGFP-N1 และ pVSV-G ในเซลล์ BHK-2P สิ่งนี้ไม่ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม แต่อาจเกิดจากขีดจำกัดการตรวจจับที่แตกต่างกันระหว่างการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้ในการแสดงภาพ VSV-G และการเรืองแสงโดยธรรมชาติของ EGFP

สุดท้าย การวิเคราะห์ทรานสคริปโทมได้ดำเนินการเพื่อให้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับความแตกต่างของการถอดรหัสระหว่างเซลล์ BHK ที่ยึดติดและสารแขวนลอยบนมือข้างหนึ่ง และระหว่างเซลล์ BHK ที่ดื้อต่อ FMDV และสายเซลล์ BHK ที่ดื้อต่อ FMDV ผลลัพธ์ของเราสอดคล้องกับการศึกษาอื่นๆ เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสในเซลล์ CHO, MDCK หรือ HEK ระหว่างการเปลี่ยนแปลงจากการยึดติดเป็นการเติบโตของสารแขวนลอย โดยทั่วไป การเปลี่ยนแปลงส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างโครงร่างโครงร่าง เมตาบอลิซึมของเซลล์ และปฏิสัมพันธ์ของส่วนประกอบ ECM และได้รับการควบคุมสำหรับเซลล์แขวนลอย [7, 40, 41] น่าแปลกที่เซลล์แขวนลอย BHK-2P ที่ดื้อต่อ FMDV แสดงการปรับลดชุดยีนเหล่านี้ ซึ่งอาจอธิบายระดับที่ลดลงของแอคตินใน BHK-2P เมื่อเทียบกับเซลล์ BHK-InV การวิเคราะห์เฉพาะของการแสดงออกของหน่วยย่อย integrin เผยให้เห็นระดับการถอดรหัสหน่วยย่อย integrin ที่คล้ายคลึงกันในทั้งสามสายเซลล์ พบการแสดงออกสูงสุดในทุกสายเซลล์สำหรับหน่วยย่อยอินทิกริน 1 สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าอินทีกริน 1 สามารถสร้างเฮเทอโรไดเมอร์ที่มีสายโซ่ต่างกันสิบสาย และแสดงออกโดยเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมส่วนใหญ่ [6, 42] ในทำนองเดียวกัน ยูนิตย่อย V สามารถสร้างเฮเทอโรไดเมอร์ที่มีสายโซ่ที่แตกต่างกันห้าสาย แต่ 6 และ 8 ถูกนำเสนอบนผิวเซลล์ร่วมกับ V [42] เท่านั้น สิ่งนี้สะท้อนให้เห็นอย่างแม่นยำจากการถอดเสียงที่สังเกตได้ของหน่วยย่อยจำนวนเต็มจำนวนเดียวที่สังเกตได้ การถอดรหัสที่เพิ่มขึ้นของ 3 ในเซลล์ที่ยึดติดยังมีความสัมพันธ์ที่ดีกับสัญญาณที่สูงกว่าสำหรับอินทิกริน v 3 ในการทดลองการย้อมสีแอนติบอดี ในทางกลับกัน ความแตกต่างที่สังเกตได้ในระดับ ITGB3 และ ITGB8 mRNA ระหว่าง BHK-2P และ BHK-InV ไม่ได้สะท้อนให้เห็นในการย้อมสีที่พื้นผิว เราไม่สามารถแก้ไขได้ว่านี่เป็นเพียงเพราะความไวที่ต่างกันระหว่าง mRNA กับวิธีการหาปริมาณโปรตีน หรือสิ่งบ่งชี้ของบล็อกหลังการถอดเสียงของการแสดงออกของโปรตีนหรือการนำเสนอบนพื้นผิว [43] โดยรวม สายพันธุ์ของเซลล์แขวนลอย BHK-2P และ BHK-InV แสดง ITGB1, ITGB3 และ ITGB6 mRNA ที่น้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับสายเซลล์ที่ยึดติด

5. บทสรุปใน

โดยสรุป มีความสำคัญอย่างยิ่งในการเตรียมเซลล์แขวนลอยเพื่อใช้โคลนของเซลล์ต้นกำเนิดที่มีลักษณะที่เป็นที่รู้จักกันดี และเพื่อคัดกรองจำนวนเซลล์ที่เป็นผลลัพธ์อย่างระมัดระวังในระหว่างกระบวนการปรับตัว เพื่อให้แน่ใจว่าสายเซลล์ยังคงคุณลักษณะที่จำเป็น ในกรณีนี้ ความอ่อนไหวต่อ FMDV นอกจากนี้ ควรใช้วิธีการที่ทันสมัย ​​เช่น การวิเคราะห์ FACS และ transcriptomics เพื่อกำหนดคุณลักษณะเพิ่มเติมของไลน์การผลิต

cistanche สามารถบำรุงไตและปรับปรุงการทำงานของไต

รับทราบ

เราขอขอบคุณ Patrick Zitzow สำหรับการสนับสนุนทางเทคนิคที่ยอดเยี่ยมของเขา

ผลงานของผู้เขียน

แนวความคิด:เวโรนิก้า ดิลล์, ไมเคิล เอสชบาวเมอร์.

การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ:เวโรนิก้า ดิลล์, ฟลอเรียน พฟาฟฟ์.

การจัดหาเงินทุน:อลีน ซิมเมอร์, มาร์ติน เบียร์.

ตรวจสอบ:เวโรนิก้า ดิลล์.

วิธีการ:เวโรนิก้า ดิลล์, ฟลอเรียน พฟาฟฟ์, ไมเคิล เอสชบาวเมอร์

การบริหารโครงการ:Martin Beer แหล่งข้อมูล: Aline Zimmer

การกำกับดูแล:ไมเคิล เอสชบาวเมอร์

การแสดงภาพ:เวโรนิก้า ดิลล์, ฟลอเรียน พฟาฟฟ์, ไมเคิล เอสชบาวเมอร์

การเขียน – ร่างต้นฉบับ:เวโรนิก้า ดิลล์.

การเขียน – ทบทวนและแก้ไข:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer

อ้างอิง

1. Merten OW. ความก้าวหน้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์: การพึ่งพาอาศัยสมอ Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Recombinant โปรตีนบำบัด: แพลตฟอร์มการผลิตและความท้าทาย เทคโนโลยีชีวภาพ J.2008; 3(1):90–7.

3. เฮอร์นันเดซ อาร์ บราวน์ ดีที การเจริญเติบโตและการบำรุงรักษาเซลล์ไตของหนูแฮมสเตอร์ (BHK) Curr Protocไมโครไบโอล. 2010; บทที่ 4:ภาคผนวก 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D และอื่น ๆ การปรับตัวของเซลล์ BHK ที่ผลิตโปรตีนลูกผสมให้เป็นสื่อที่ปราศจากซีรัมและตัวกลางที่ปราศจากโปรตีน ไซโตเทคโนโลยี 1998; 26(1):59– 64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. การปรับตัวของเซลล์ BHK-21 ให้เข้ากับการเติบโตของวัฒนธรรมเชคเกอร์และความท้าทายที่ตามมาโดยไวรัสไข้สมองอักเสบญี่ปุ่น Appl ไมโครไบโอล 2518; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, เจมส์ ดี.ซี. ความสำคัญของปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Integrin และ Actin Cytoskeleton ในการปรับสารแขวนลอยของเซลล์ CHO Appl ไบโอเคม ไบโอเทคโนล 2559; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. การตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของโปรตีโอมระหว่างการปรับเซลล์ MDCK แบบเป็นขั้นตอนจากการเกาะติดการเจริญเติบโตของสารแขวนลอย วัคซีน. 2558; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, และคณะ ผลกระทบของการปรับเซลล์ให้เข้ากับสภาวะที่ปราศจากซีรัมต่อโปรไฟล์ไกลโคซิเลชันของโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ผลิตโดยเซลล์รังไข่หนูแฮมสเตอร์จีน เอ็น ไบโอเทค 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. การคัดเลือกเซลล์โฮสต์ของตัวแปรแอนติเจนของไวรัสโรคปากและเท้าเปื่อย เจ เจน ไวโรล. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Integrin-actin เซลล์โมลชีวิตวิทย์. 2548; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. การวิเคราะห์การแสดงออกของตัวรับเชื้อไวรัสในช่องปากและปากในเนื้อเยื่อจากโคที่ไร้เดียงสาและติดเชื้อ เจ คอมพ์ ปทุม. 2552; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. การปรับตัวของ FMDV Asia-1 สู่การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอย: การต่อต้านของเซลล์สามารถเอาชนะได้ด้วยการเปลี่ยนแปลงของไวรัสแคปซิด ไวรัส. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Polyoma การเปลี่ยนแปลงของโคลนเซลล์หนูแฮมสเตอร์—การตรวจสอบปัจจัยทางพันธุกรรมที่ส่งผลต่อความสามารถของเซลล์ ไวรัสวิทยา 2505; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. กระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ microcarrier สำหรับการแพร่กระจายไวรัสพิษสุนัขบ้าในเซลล์ Vero ที่ปลูกในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบกวนภายใต้สภาวะที่ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ วัคซีน. 2550; 25(19):3879–89.

15. Martin M. Cutadapt ลบลำดับของอะแดปเตอร์ออกจากการอ่านลำดับที่มีปริมาณงานสูง วารสาร EMBnetjournal 2554; 17:10–2.

16 Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon ให้ปริมาณการแสดงออกของการถอดเสียงที่รวดเร็วและมีความลำเอียง วิธีการของแนท 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, และคณะ การจัดตำแหน่งและวิธีการทำแผนที่มีอิทธิพลต่อการประมาณค่าความอุดมสมบูรณ์ของการถอดเสียง จีโนม ไบโอล. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. การประเมินการเปลี่ยนแปลงการพับและการกระจายตัวของข้อมูล RNA-seq ด้วย DESeq2 จีโนม ไบโอล. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. การแจกแจงแบบ Heavy-tailed ก่อนหน้าสำหรับข้อมูลการนับลำดับ: ขจัดสัญญาณรบกวนและคงไว้ซึ่งความแตกต่างอย่างมาก ชีวสารสนเทศศาสตร์ 2019; 35(12):2084–92.

20. คลาร์ก เจบี, สเปียร์ รี ความแปรปรวนในความไวของประชากร BHK และเซลล์ที่ลอกแบบมาจากไวรัสโรคปากและเท้าเปื่อยสามสายพันธุ์ อาร์ค ไวรอล. 1980; 63(1):1–9.