ผลของ Cistanche ยาสมุนไพรจีนต่อพัฒนาการของตัวอ่อนและทารกในครรภ์

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*

[เชิงนามธรรม]ใช้หมูตัวอ่อนจากการปฏิสนธินอกร่างกายเพื่อการวิจัยและเปรียบเทียบ ผลของการเพิ่มชาวจีนยาส่วนผสมCistancheและ Astragalus ในการพัฒนาตัวอ่อนระยะแรกในตัวกลาง NCSU{{0}} ได้รับการพิสูจน์แล้ว การทดลองพิสูจน์แล้วว่า (1) อัตราส่วนปริมาตร 0.10 เปอร์เซ็นต์Cistancheและ 0.10 เปอร์เซ็นต์ Astragalus ถูกเพิ่มลงในน้ำซุปวัฒนธรรมและCistancheกลุ่มเสริม อัตราบลาสโตซิสต์ (15.76 เปอร์เซ็นต์) สูงกว่ากลุ่มว่างอย่างมีนัยสำคัญ (ร้อยละ 9.26) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05) แสดงว่าCistancheทะเลทรายสามารถส่งเสริมอย่างมากตัวอ่อนตอนต้นการพัฒนา. (2) เมื่อความเข้มข้น (V/V) ของCistancheคือ {{0}}.05 เปอร์เซ็นต์ และ 0.10 เปอร์เซ็นต์ , อัตราบลาสโตซิสต์ (17.02 เปอร์เซ็นต์ และ 16.75 เปอร์เซ็นต์ ) สูงกว่ากลุ่มว่าง (0) อย่างมีนัยสำคัญ (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">ชาวจีนยาCistancheในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2-ระยะเซลล์ อัตราการพัฒนาบลาสโตซิสต์ (13.81 เปอร์เซ็นต์ ) สูงกว่าที่ 4-ระยะเซลล์ (7.53 เปอร์เซ็นต์ ) อย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).

เนื่องจากความแตกต่างในสภาพแวดล้อมการพัฒนา ในร่างกาย และ ในหลอดทดลองตัวอ่อนจะถูกทำลายโดยอนุมูลอิสระในช่วงเพาะเลี้ยงสุกรในหลอดทดลองตัวอ่อนทำให้เกิดความผิดปกติของการเผาผลาญของเซลล์หรือทำลาย DNA, RNA และโปรตีน [1] เพื่อปรับปรุงอัตราการพัฒนาของการปฏิสนธินอกร่างกายโดยน้ำอสุจิแช่แข็ง การทดลองนี้ได้สำรวจการเพิ่มความเข้มข้นบางอย่างของCistancheและ Astragalus เพื่อปรับปรุงตัวอ่อนสภาพแวดล้อมการพัฒนาในหลอดทดลอง

1. วัสดุและวิธีการ

1. 1 เงื่อนไขทางวัฒนธรรม:

การสุกในหลอดทดลองของโอโอไซต์สุกร การปฏิสนธิในหลอดทดลอง และการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองของตัวอ่อนระยะแรกได้ดำเนินการในตู้ฟักที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ร้อยละ 5 และความชื้นอิ่มตัวสูงสุด 39 องศา

1.2 รีเอเจนต์และสื่อเพาะเลี้ยง:

ของเหลวพื้นฐานในการทำให้ไข่สุกคือ NCSU{{0}} น้ำยาล้างไข่คือของเหลว PVA-TL-HEPES ของเหลวสำหรับการปฏิสนธิคือ Tris buffer (mTBM) ที่มี 0.1 เปอร์เซ็นต์ BSA และ น้ำยาล้างสเปิร์มเป็นของ Dubecco ที่มี 0.1 เปอร์เซ็นต์ BSA น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (DPBS), ของเหลวละลายอสุจิคือ BTS, ของเหลวคิวมูลัสคือไฮยาลูโรนิเดส PBS 1 มก./มล., ของเหลวในการทำงานของไข่คือ HEPES บัฟเฟอร์ NCSU-23 และของเหลวสำหรับการเพาะเลี้ยงตัวอ่อนระยะแรกได้รับการเสริมด้วย 0 0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA NCSU-23 เพิ่ม (V/V) 0.05 เปอร์เซ็นต์ ~0.15 เปอร์เซ็นต์ Cistanche ตามต้องการ ใช้ BTS ในการละลายน้ำอสุจิ ก่อนใช้งาน ให้อุ่นและปรับสมดุลนานกว่า 4 ชั่วโมงในตู้อบที่มีอากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ และความชื้นอิ่มตัวสูงสุด 39 องศา [2]

1.3 วิธีต้มยาจีน Cistanche:

สารละลาย Cistanche: ใช้ 5 ก. และใส่ในบีกเกอร์ขนาด 100 มล. เติมน้ำบริสุทธิ์พิเศษและแช่ในน้ำบริสุทธิ์พิเศษ ต้มบนไฟแรง แล้วต้มต่อ 20 นาที จากนั้นเก็บ ซุป; ทำซ้ำขั้นตอนข้างต้น รวบรวม 3 ครั้งติดต่อกัน ปริมาตรคงที่ 100 มล. และอะไหล่ตัวกรอง 0.22 ไมโครเมตร สารละลายตาตุ่ม: ใช้ 5 กรัมและใส่ในบีกเกอร์ขนาด 100 มล. เติมน้ำบริสุทธิ์พิเศษแล้วนำไปแช่ ต้มบนไฟแรง แล้วต้มต่อไป 20 นาที จากนั้นเก็บซุปสมุนไพร ทำซ้ำขั้นตอนข้างต้น รวบรวม 3 ครั้งติดต่อกัน ตั้งปริมาตรเป็น 100 มล. กรอง 0.22 ไมโครเมตรสำรอง

ยาจีนสมุนไพร:Cistanche

1.4 การสุกในหลอดทดลองของไข่สุกร:

เก็บรังไข่ของแม่สุกรจากโรงฆ่าสัตว์ปักกิ่งเผิงเฉิง ใส่ในน้ำเกลือปกติ 0.9 เปอร์เซ็นต์ที่มียาปฏิชีวนะที่ประมาณ 38 องศา ขนส่งกลับไปที่ห้องปฏิบัติการภายใน 4 ชั่วโมง และล้างด้วยน้ำเกลือปกติสามครั้ง ใช้หลอดฉีดยาขนาด 10 มล. กับ 12-เข็มวัดเพื่อสกัดเซลล์ไข่ที่มีรูขุมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 2-6 มม. บนพื้นผิวของรังไข่ ล้าง 3~4 ครั้งในสารละลาย TL-HEPES และ 3~4 ครั้งใน NCSU-23 ที่ได้รับการปรับสมดุลในตู้อบคาร์บอนไดออกไซด์นานกว่า 4 ชั่วโมง ถ่ายโอโอไซต์ 20~30 ตัวเป็นกลุ่มเป็น 100 ไมโครลิตร, เพิ่ม 10 เปอร์เซ็นต์ PFF, 10 IU/mL HCG, 10 IU/มล. PMSG, 10 ng/mL EGF NCSU-23 หยดและการเพาะเลี้ยงเป็นเวลาประมาณ 22 ชั่วโมง , เปลี่ยน สื่อถึง NCSU-23 หยดที่มี 10 เปอร์เซ็นต์ PFF, 10 ng/mL EGF และเพาะเลี้ยงต่อไปเป็นเวลา 44~46 ชั่วโมง[3]

1.5 ความจุของอสุจิและการปฏิสนธินอกร่างกาย:

เตรียมสารละลาย mTBM ที่ไม่มีคาเฟอีนและ BSA และปรับสมดุลเป็นเวลา 48 ชั่วโมงในตู้ฟักที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ และความชื้นอิ่มตัวสูงสุด 39 องศา ปรับค่า pH ภายในช่วง 7.2~7.8 เพิ่มคาเฟอีนและ BSA 44 ชั่วโมงก่อนใช้และยังคงสมดุล น้ำอสุจิถูกทดสอบคุณภาพ และ 10 มล. ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 900 รอบ/นาที เป็นเวลา 3 นาที, 10 มล. ของสารละลาย DPBS ที่มี BSA 0.1 เปอร์เซ็นต์ถูกเติมสำหรับสารแขวนลอย และหมุนเหวี่ยงที่ 900 รอบ/นาที เป็นเวลา 3 นาที [3]; หลังจาก 1 มล. ของสารละลาย TBM ถูกระงับ มันถูกเอียง 60 องศา การบำบัดด้วยการเก็บเกี่ยวพลังงานต้นน้ำจะดำเนินการในตู้อบที่มีอากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ และความชื้นอิ่มตัวสูงสุด 39 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง[3~5] คอมเพล็กซ์เซลล์โอโอไซต์-คิวมูลัสที่เติบโตเต็มที่ถึง 44~46 จะถูกวางในสารละลายล้างไข่ที่มีไฮยาลูโรนิเดส 0.1 เปอร์เซ็นต์ และเซลล์คิวมูลัสจะถูกลบออกโดยการปิเปต จากนั้นโอโอไซต์ก็จะถูกเปิดเผย ล้าง 3 ครั้งใน TBM ที่สมดุล และสุดท้ายใส่แต่ละ 10-15 ชิ้นในกลุ่ม 50 μL TBM แล้วรอสเปิร์ม [6, 7] ฉีดน้ำอสุจิต้นน้ำ 50 ไมโครลิตรจากการเก็บประจุลงในหยดของโอโอไซต์ที่ประกอบด้วย TBM และทำการปฏิสนธิเป็นเวลา 6 ชั่วโมงในตู้ฟักที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ และความชื้นอิ่มตัวสูงสุด 39 องศา

1.6 การพัฒนาและการตรวจหาไข่ที่ปฏิสนธิในระยะแรก:

หลังจากการปฏิสนธิ 6 ชั่วโมง โอโอไซต์ถูกบำบัดด้วย NCSU-23 ที่บัฟเฟอร์ด้วยของไหลปฏิบัติการ HEPES หรือ NCSU- 23 ด้วย 0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA ในน้ำเพาะเลี้ยงตัวอ่อน 23 ล้าง 3 ครั้ง เปลี่ยนสื่อเป็นหยด 0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA NCSU-23 ที่สมดุลและฟักไข่นานกว่า 8 วัน ตรวจสอบอัตราการแยกไข่ที่ปฏิสนธิสมมติในวันที่ 2 ตรวจสอบอัตราโมรูลา (บวกอัตราบลาสโตซิสต์) ในวันที่ 6 และตรวจสอบอัตราบลาสโตซิสต์ในวันที่ 8 [8] ทั้งหมดถูกตรวจสอบและบันทึกไว้ใต้กระจกหน้ารถ

1.7 การออกแบบทดลอง:

1.7.1 ผลของส่วนผสมยาจีนโบราณ Cistanche ต่อพัฒนาการของตัวอ่อนระยะแรก

หมูหวูจซาน[8] หลังจากการใส่ประจุไฟฟ้า การปฏิสนธิในหลอดทดลอง การปฏิสนธิจะเสร็จสิ้น และหลังจากการแตกแยก ตัวอ่อนจะถูกแลกเปลี่ยนจนกระทั่งเพิ่มเข้าไปใน 0.1 เปอร์เซ็นต์ (V/V) Cistanche, 0.1 เปอร์เซ็นต์ astragalus และ NCSU-23 (0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA) ที่ไม่มีส่วนผสมที่สำคัญ (กลุ่มเปล่า) ได้รับการปลูกฝังเพื่อสังเกตการพัฒนาของไข่ที่ปฏิสนธิและตัวอ่อนระยะแรก และตัดสินผลกระทบของสององค์ประกอบยาจีนโบราณที่มีอิทธิพลต่อการพัฒนาตัวอ่อนในหลอดทดลองในระยะเริ่มต้น

1.7.2 ผลของความเข้มข้นของ Cistanche ต่อการพัฒนาในระยะเริ่มต้นของตัวอ่อน

น้ำเชื้อสุกร Wuzishan ถูกกักเก็บประจุและผ่านการปฏิสนธินอกร่างกาย หลังจากการปฏิสนธิเสร็จสิ้น ของเหลวจะเปลี่ยนเป็น {{0}} เปอร์เซ็นต์ (กลุ่มว่าง) 0.05 เปอร์เซ็นต์ , 0.1 เปอร์เซ็นต์ และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ใน 15 เปอร์เซ็นต์ Cistanche NCSU-23 (0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA) สังเกตการพัฒนาของไข่ที่ปฏิสนธิและตัดสินอิทธิพลของความเข้มข้นต่างๆ ของส่วนประกอบยาจีน Cistanche ต่อการพัฒนาตัวอ่อนในหลอดทดลองในระยะเริ่มต้น

1.7.3 ผลของระยะเวลาการเพิ่ม Cistanche ต่อการพัฒนาของตัวอ่อนระยะแรก

น้ำเชื้อสุกร Wuzishan ถูกกักเก็บประจุและผ่านการปฏิสนธินอกร่างกาย หลังจากสิ้นสุดการปฏิสนธิ ไข่ที่ปฏิสนธิจะแยกไปยังระยะเซลล์ {{0}} และไข่ที่ปฏิสนธิจะแยกไปยังระยะเซลล์ 4- ของเหลวจะถูกแลกเปลี่ยนและเพิ่มแยกกัน 0.1 เปอร์เซ็นต์ Cistanche NCSU-23 (0.4 เปอร์เซ็นต์ BSA) สังเกตการพัฒนาของไข่ที่ปฏิสนธิและตัดสินผลของการเพิ่ม cistanche ต่อการพัฒนาของตัวอ่อนในหลอดทดลองในระยะต่างๆ

1.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ:

ใช้ SPSS13.0 การทดสอบไคสแควร์ (χ2) และการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว

ผลของสารสกัดจากชะเอมเทศ

2. ผลการวิเคราะห์

2. 1 อิทธิพลของส่วนผสมยาจีนโบราณที่มีต่อพัฒนาการของตัวอ่อนในระยะแรก

As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05) อัตราบลาสโตซิสต์ของทั้งสองกลุ่มสูงกว่ากลุ่มว่าง และอัตราบลาสโตซิสต์ของกลุ่ม Cistanche แตกต่างจากกลุ่มว่าง สำคัญ (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">

2.2 อิทธิพลของความเข้มข้นของส่วนผสมยาจีน Cistanche ต่อพัฒนาการของตัวอ่อนในระยะแรก

ตามที่แสดงในตารางที่ 2 การเพิ่ม Cistanche ที่ความเข้มข้นของปริมาตร 0.05 เปอร์เซ็นต์ ถึง 0.10 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเพาะเลี้ยงตัวอ่อนมีผลส่งเสริมที่ดีกว่าต่อของเหลวอสุจิแช่แข็ง WZSP ในตัวอ่อนที่ปฏิสนธิในหลอดทดลอง และอัตราการพัฒนาของบลาสโตซิสต์แตกต่างจากกลุ่มว่างอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">

2.3 ผลของการเพิ่มระยะเวลาของ Cistanche ส่วนผสมยาจีนต่อการพัฒนาของตัวอ่อนระยะแรก

As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05) อย่างไรก็ตาม มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการเพิ่ม 4 เซลล์ (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">

3. อภิปราย

เมื่อเทียบกับการพัฒนาปกติตัวอ่อนในร่างกายสภาพแวดล้อมการพัฒนาของ IVF ปฏิสนธิตัวอ่อนมีความแตกต่างกันอย่างมาก ในระหว่างกระบวนการของตัวอ่อนการเจริญเติบโตและการแบ่งตัว มีการสร้าง No. อนุมูลอิสระจำนวนมาก และสารพิษบางชนิด ซึ่งไม่เอื้ออำนวยต่อการเจริญเติบโตของตัวอ่อน โดยปกติการพัฒนาตัวอ่อนในร่างกายสามารถกำจัดปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้ผ่านการเผาผลาญของสภาพแวดล้อมภายใน ปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้มักจะสะสมในสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโตของตัวอ่อนของการปฏิสนธินอกร่างกาย แบบดั้งเดิมชาวจีนยาวัตถุดิบCistancheอาจมีหน้าที่ในการลดความเข้มข้นและกำจัดอนุมูลอิสระบางชนิด เพื่อปรับปรุงอัตราการพัฒนาของการปฏิสนธินอกร่างกายด้วยน้ำอสุจิแช่แข็ง การทดลองสำรวจเพิ่มความเข้มข้นบางอย่างของCistancheและตาตุ่ม ผลการศึกษายืนยันว่า Astragalus ไม่มีผลต่อการปรับปรุงสภาพแวดล้อมการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง ความเข้มข้นที่เหมาะสมของCistancheมีผลส่งเสริมต่อตัวอ่อนระยะแรกการพัฒนา แต่เมื่อความเข้มข้นของCistancheเกินความเข้มข้นที่แน่นอนก็ยังมีผลยับยั้งต่อตัวอ่อนการพัฒนา.

เราได้สำรวจเพิ่มเติมถึงผลกระทบต่างๆ ของCistancheแบบดั้งเดิมชาวจีนยาองค์ประกอบในขั้นตอนต่างๆ และจากการทดลองพบว่าตัวอ่อนระยะแรกมีอัตราการพัฒนาที่สูงขึ้นในระยะหลังเมื่อcistancheถูกเพิ่มที่ระยะเซลล์ 2- สาเหตุที่เป็นไปได้เกิดจากสภาพแวดล้อมภายนอกของตัวรับ ไนตริกออกไซด์ (NO) เป็นโมเลกุลสัญญาณและปัจจัยที่เป็นพิษต่อเซลล์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่หลากหลาย ผลกระทบของ NO ต่อตัวอ่อนระยะแรกการพัฒนาควรสืบย้อนไปถึงตัวอ่อนตอนต้นระยะการพัฒนา ซึ่งอาจเกิดจากสาเหตุหนึ่งของ 2-cell block (2-cellblock) ในการเพาะเลี้ยงตัวอ่อนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และในหลอดทดลองของสุกรเกิดขึ้นที่ 4-ระยะเซลล์ [ 9]. การเพิ่มแบบดั้งเดิมชาวจีนยาส่วนผสมอาจกำจัดอนุมูลอิสระของ NO ได้ในระดับหนึ่งและบรรเทาปัจจัยที่ไม่เอื้ออำนวยของตัวอ่อนการเจริญเติบโต [10].

Cistanche

อ้างอิง

[1] Comport M. สามรูปแบบของการทำลายเซลล์ที่เกิดจากอนุมูลอิสระ[J] Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.

[2] ปานเด้งเก. ศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อการพัฒนาโซมาติกเซลล์สุกรโคลนตัวอ่อน[ด]. ปักกิ่ง: มหาวิทยาลัยเกษตรจีน พ.ศ. 2548

[3] จาง หยุนไห่. งานวิจัยการผลิตหมูโคลนตัวอ่อนโดยใช้เทคโนโลยีการถ่ายโอนนิวเคลียสเซลล์โซมาติก [D] ปักกิ่ง: มหาวิทยาลัยเกษตรจีน พ.ศ. 2548

[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun และอื่น ๆ ผลของการเพิ่มซีรัมของวัวและน้ำฟอลลิคูลาร์ของสุกรในระหว่างการสุกต่อการเจริญเติบโตของไข่สุกรด้วยนิวเคลียสและตัวอ่อนตอนต้นพัฒนาการหลังการปฏิสนธินอกร่างกาย [J] Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2002, (8):1- 3.