นาฬิกา Circadian ควบคุมการแสดงออกของ Erythropoietin จังหวะในไต Murine

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Siesielsk et al

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับผลิตภัณฑ์และ Cistanches

การสร้างจังหวะของ circadian เป็นเซลล์อิสระและอาศัยลูปตอบกลับการถอดความ/การแปลที่ควบคุมโดยตระกูลของตัวกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัสนาฬิกา circadian ซึ่งรวมถึง CLOCK, BMAL1 และตัวกดเช่น CRY1 และ CRY2 จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อศึกษาทั้งกลไกระดับโมเลกุลและความหมายของเม็ดเลือดของการแสดงออกของ circadian erythropoietin หนูกลายพันธุ์ที่มีการลบ homozygous ของยีนนาฬิกาชีวิตหลัก cryptochromes 1 และ 2 (Cry-null) ถูกนำมาใช้เพื่อชี้แจงกฎระเบียบของ erythropoietin circadian หนูควบคุมแบบไวด์มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในไตการแสดงออกของ erythropoietin mRNA ระหว่างเวลาประมาณ 06 ถึง 18 ขนานกัน จำนวนเซลล์ที่ผลิตอีริโทรพอยอิตินในไต(byRNAscope ) และระดับที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของโปรตีน erythropoietin หมุนเวียน (โดย ELISA) ถูกตรวจพบเวลาประมาณ 18 การเปลี่ยนแปลงดังกล่าวถูกยกเลิกในหนู Cry-null และไม่ขึ้นกับความตึงเครียดของออกซิเจน ความอิ่มตัวของออกซิเจน หรือการแสดงออกของปัจจัย 2alpha ที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน การแสดงออกของ erythropoietin circadian นั้นควบคุมการถอดรหัสโดย CRY1 และ CRY2 การทดสอบยีนของนักข่าวแสดงให้เห็นว่าเฮเทอโรไดเมอร์ CLOCK/BMAL1 กระตุ้นองค์ประกอบ E-box ในโปรโมเตอร์อีริโทรพอยอิตินขนาด 5' RNAscope in situ hybridization ยืนยันการมีอยู่ของ Bmal1 ในเซลล์ที่สร้างอีริโทรพอยอิตินของไต. ในหนู Cry-null พบจำนวน reticulocytes ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่จำนวนเม็ดเลือดแดงและ hematocrit ไม่เปลี่ยนแปลง ดังนั้น ระเบียบ erythropoietin ของ circadian ใน murine ตัวเต็มวัยปกติไตถูกควบคุมโดยการถอดรหัสโดยตัวกระตุ้นวงจรชีวิตหลักCLOCK/BMAL1 และตัวยับยั้ง CRY1/CRY2 การค้นพบนี้อาจมีความหมายสำหรับสรีรวิทยาของไตและโรค การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ และการรักษาโรคโลหิตจาง

คีย์เวิร์ด:ตามลำดับเวลา; จังหวะ circadian; นาฬิกา; คริปโตโครม; erythropoietin; เม็ดเลือด; ปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน

คำชี้แจงการแปล นาฬิกาโมเลกุลในเซลล์เกือบทุกประเภทจะขับเคลื่อนการถอดรหัสยีนโดยร่วมมือกับปัจจัยเฉพาะของเนื้อเยื่อ จนถึงตอนนี้ กลไกการสั่นของ circadian oscillatory ในไตไม่ได้เชื่อมโยงกับชีววิทยาของ erythropoietin (Epo) ในที่นี้ ได้มีการชี้แจงแล้วว่าการแสดงออกของ Epo circadian ถูกควบคุมโดยมาสเตอร์คล็อกโปรตีน (cryptochromes 1 และ 2, Clock และ Bmal1) เนื่องจาก EPO ทำหน้าที่อย่างชัดเจนภายในเครือข่ายการกำกับดูแลที่ซับซ้อนของการสร้างเม็ดเลือดแดง การใช้ Epo ของมนุษย์ชนิดลูกผสมอย่างเหมาะสมในผู้ป่วยที่มีไตความไม่เพียงพออาจรวมถึงการประยุกต์ใช้ก่อนเวลาสูงสุดประมาณเที่ยงคืนทางสรีรวิทยา

จังหวะการเต้นของหัวใจในโรคไตส่วนใหญ่ยังไม่ได้สำรวจแต่มีความเกี่ยวข้องสูง เนื่องจากการทำงานเป็นกะ การเลือกรูปแบบการใช้ชีวิต และการชราภาพนั้นสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของโรคต่างๆ รวมถึงโรคหลอดเลือดหัวใจ^1–4แบบจำลองสัตว์ของนาฬิกาชีวิตที่ถูกรบกวนเป็นหลักฐานแรกเกี่ยวกับผลกระทบด้านลบของการควบคุมภาวะชีวิตผิดปกติต่อระบบเม็ดเลือด (เช่น โดยการเพิ่มจำนวนเม็ดเลือดแดงในวัยชรา)^5,6

เกี่ยวกับการสร้างเม็ดเลือดแดง ไม่เพียงแต่ผลกระทบต่อเซลล์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงจังหวะของตัวควบคุมหลักด้วย erythropoietin (Epo) เป็นที่สนใจเป็นพิเศษเนื่องจากนักกีฬาถูกกล่าวหาซ้ำๆ ว่าใช้ยาสลบในเลือดกับ Epo ของมนุษย์ที่เป็นลูกผสม (ใคร) เนื่องจากความแตกต่างตามเวลาของวันใน ความเข้มข้นของ Epo หมุนเวียนและพารามิเตอร์ทางโลหิตวิทยา 7,8 การเปลี่ยนแปลงในแต่ละวันในระดับ Epo ในซีรัมของมนุษย์ (S-Epo) ของมนุษย์ได้รับการอธิบายครั้งแรกในปี 1981 ในผู้ป่วยโรคปอดเรื้อรังและโรคระบบทางเดินหายใจของคนงานถ่านหิน⁹และต่อมาในวิชาที่มีสุขภาพดี^10,11ในปัจจุบัน รายงานหลายฉบับระบุว่ามีระดับ S-Epo สูงในตอนกลางคืน (20:00 น. ถึง 04:00 น.) และระดับ S-Epo ต่ำในตอนเช้า (4:00 น. ถึง 8.00 น.) เฟสและแอมพลิจูดของการแกว่งของ S-Epo หากมีเลย เป็นตัวแปรระหว่างบุคคล^9,10,12,13โดยเฉลี่ย ระดับ S-Epo เปลี่ยนแปลงประมาณ 1.5-เท่าเมื่อเทียบกับระดับต่ำสุด^14–22จังหวะเวลากลางวันนี้ไม่ได้รับผลกระทบจากอายุ 20 การฝึก 16 หรือการสัมผัสกับความสูง 17 ในทางตรงกันข้าม การสั่นของ S-Epo ในแต่ละวันจะถูกยกเลิกในผู้ป่วยที่เป็นโรคปอดอุดกั้นเรื้อรังที่มีภาวะขาดออกซิเจนในเลือดต่ำในตอนกลางวัน ในมะเร็งต่อมน้ำเหลืองที่มีภาวะไตวาย และใน myelodysplasia^15,21,23

ในปี 2009 เราได้อธิบายการแสดงออกของ Epo mRNA แบบ circadian ในไตของหนูในการวิเคราะห์ขนาดใหญ่ของโปรโมเตอร์ของยีนที่ควบคุมด้วยนาฬิกา แต่ไม่สามารถระบุองค์ประกอบทางพันธุกรรมที่แตกต่างกันในยีน EPO หรือปัจจัยทรานส์แอคทีฟที่รับผิดชอบต่อการสั่นของ circadian ได้ ไม่นานมานี้ แบบจำลองหนูที่มีภาวะช็อกตกเลือดแนะนำ ตามรูปแบบการแสดงออกคู่ขนานว่า ยีนนาฬิกา (Bmal1 และ Per2) มีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการหลั่ง EPO ระหว่างภาวะขาดออกซิเจน/ขาดเลือด²⁵

การสร้างจังหวะของ circadian เป็นเซลล์อิสระและอาศัยลูปการตอบกลับการแปลการถอดความที่ควบคุมโดยกลุ่มของปัจจัยการถอดรหัสนาฬิกา circadian ซึ่งรวมถึง CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 และ CRY2.26 CLOCK/BMAL1 heterodimer เปิดใช้งานการถอดรหัส ของยีนนาฬิกาชีวิต PER1/2 และ CRY1/2 ผ่านการผูกกับองค์ประกอบกล่อง E ในโปรโมเตอร์ อย่างไรก็ตาม โปรตีน PER และ CRY ให้ผลป้อนกลับเชิงลบโดยการยับยั้งการทำงานของ CLOCK/ BMAL1 ซึ่งจะช่วยลดการแสดงออกของพวกมันเอง ผลลัพธ์สุทธินำไปสู่รูปแบบการสั่นของการแสดงออกของยีน circadian และการเปลี่ยนแปลงจังหวะในสรีรวิทยาของเซลล์และอวัยวะ²⁷

เพื่อให้เข้าใจถึงความหมายของนาฬิกาชีวภาพ จนถึงตอนนี้ เราได้ทำการศึกษาหนูกลายพันธุ์ประเภทต่างๆ ที่มีปัจจัยการถอดรหัสสัญญาณนาฬิกาแบบคอร์เดียวที่หยุดชะงักหรือหยุดชะงักแล้ว 28,29 ในที่นี้ เราใช้ประโยชน์จาก Cry1–/–/Cry2–/– double mutant หนู (Cry-null) ซึ่งขาดความสามารถในการแสดงจังหวะชีวิตภายนอก^26,30เมื่อรวมข้อมูล ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง แสดงให้เห็นว่า Cry1/2 ควบคุมการแสดงออก Epo ของ circadian ผ่าน CLOCK/BMAL1-การถอดรหัสที่เหนี่ยวนำให้เกิดในไตปกติ

วิธีการ

การทดลองกับสัตว์

Homozygous Cry1–/– /Cry2–/– สัตว์ (Cry-null; ตัวผู้และตัวเมีย; C57BL/6J-based)31 และกลุ่มควบคุม wild-type (WT) ได้รับการผสมพันธุ์ (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) และเลี้ยงเป็นเวลา 5 ถึง 7 เดือน หนู WT มาจากการผสมพันธุ์ของอาณานิคม Cry-null

จีโนไทป์ Cry-null ได้รับการยืนยันโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (ตารางเสริม S1) สำหรับการกักขัง หนูเมาส์ถูกจัดเป็นกลุ่มและมีอาหารและน้ำโดยจำกัดที่ 12-ชั่วโมง:12-รอบแสง/ความมืดเป็นเวลา 12-ชั่วโมง:12-ชั่วโมงเป็นเวลา 14 วัน ในวันที่ 2 หลังจากปล่อยสู่ความมืดอย่างต่อเนื่อง สัตว์ถูกสังเวยในเวลากลางวัน (CT) 06 หรือ 18 (n ¼ 13–15 สำหรับแต่ละกลุ่มและจุดเวลา) เนื้อเยื่อ (ตับและไต) ได้มาอย่างรวดเร็วและแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว กลุ่มย่อยของ WT เพศผู้และเพศเมียและสัตว์ Cry-null ถูกวิเคราะห์โดยละเอียดสำหรับน้ำหนักตัวและค่าความแตกต่างของค่าฮีโมแกรม

สำหรับการวิเคราะห์ก๊าซในเลือด สัตว์ถูกทำให้หมดความรู้สึก (fentanyl, {{0}}.075 มก./กก., มิดาโซแลม, 1.5 มก./กก. และเมเดโทมิดีน, 0.75 มก./กก.), tracheotomized, ใส่ท่อช่วยหายใจ และระบายอากาศ (น้ำขึ้นน้ำลง ปริมาตร 9 มล./กก. อัตราการหายใจ 160 นาที- 1 ความดันหายใจออกปลายบวก 2 ซม. H2O) ตามที่อธิบายไว้ 32 นำสายสวนโพลีเอทิลีนเข้าไปในหลอดเลือดแดงด้านซ้าย หลังจากการรักษาเสถียรภาพเป็นเวลา 5 นาที การทดลองสิ้นสุดลงโดยการขับเลือดออกอย่างรวดเร็วผ่านทางสายสวนหลอดเลือด วิเคราะห์ก๊าซในเลือด (ABL-800;

ขั้นตอนทั้งหมดได้รับอนุญาตจาก Local Animal CareCommittee (T0307/08; G0100/17 พร้อมภาคผนวกตั้งแต่มกราคม 2021) และดำเนินการตามแนวทางและข้อบังคับของกฎหมายคุ้มครองสัตว์ของเยอรมนี

การเตรียม RNA และการวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณ

แยก RNA ทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ 33 RNA ทั้งหมด 1,000 ng ถูกคัดลอกย้อนกลับด้วย SuperScript III reverse transcriptase (Thermo Fisher; No. 18080085) และ hexamers สุ่ม (Thermo Fisher; No. SO142) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณถูกเรียกใช้บนวงจร StepOnePlus (Life Technologies) กับไพรเมอร์ที่ขยายช่วงอินตรอนหรือการสอบวิเคราะห์ TaqMan (ตารางเสริม S2) การหาปริมาณ mRNA สัมบูรณ์ทำได้โดยการเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐานจากการเจือจางแบบอนุกรมของแม่แบบปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

การตรวจจับการแสดงออกของ Epo mRNA ในไตโดยเทคนิค RNAscope

การทดสอบ RNAscope ดำเนินการตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (ACD; บันทึกทางเทคนิค 320536) ห้องแช่แข็งตามขวางกลางไต 10- มม. ถูกย้อมด้วยโพรบ C1 เทียบกับ DapB(กลุ่มควบคุมเชิงลบ; ACD; หมายเลข 310043) หรือ Epo (ACD; หมายเลข 315501) ขั้นตอนการผสมพันธุ์โดยใช้แอมป์ 4-6 และการตรวจจับสัญญาณสีแดงถูกละเว้น นักวิจัยตาบอดอิสระสองคนนับเซลล์ Epo positive ด้วยกำลังขยายเดิม 200 บนสัตว์แช่แข็ง 3 ถึง 8 ตัวที่ระบบการถ่ายภาพ Axioplan 2 (Zeiss)

รูปภาพการหาปริมาณ Epo ที่เป็นตัวแทนและการย้อมสีด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์คู่ได้ดำเนินการโดยใช้ RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit (ACD; No. 323110) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต พาราเซตามขวางกลางไตขนาด 1.5-มม. ถูกย้อมด้วยโพรบ C1 เทียบกับ Bmal1 (ACD; No.438741) และโพรบ C2 ต้าน Epo (ACD; No. 315501-C2) Opaleye 520 (Akoya BioSciences; No. FP1487001KT) ถูกใช้กับโพรบ C1 และใช้สีย้อมโอปอล 650 (Akoya BioSciences; No. FP1496001KT) กับโพรบ C2 ที่การขยายดั้งเดิม - 400 เซลล์ Epo positive ถูกถ่ายภาพสำหรับ Bmal1 colocalization ที่ระบบ Eclipse Ti2imaging (Nikon) ใช้สี 40,6-diamidino-2-phenylindole เป็นสีทาเคาน์เตอร์

ความเข้มข้นของซีรั่ม EPO

ตัวอย่างเลือดถูกปล่อยให้จับตัวเป็นก้อนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 20 นาทีที่ 2000 - กรัม เซรั่มถูกกำจัดออกและแช่แข็งทันทีที่ –80 C จนกระทั่งทำการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์สำหรับ Epo (Quantikine; R&D Systems; No. MEP006) ด้วยตัวอย่างที่ไม่เจือปน อ่านค่าการดูดกลืนแสงด้วย iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) ที่ 450 นาโนเมตร โดยมีการแก้ไขความยาวคลื่นที่ 570 นาโนเมตร และ 4-พารามิเตอร์พอดีกับเส้นโค้งมาตรฐานดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้³³

จำนวนเม็ดเลือด

Synlab วัดจำนวนเซลล์ทั้งหมดและจำนวนเซลล์ที่แยกจากเลือดที่ต้านการแข็งตัวของเลือด EDTA สัตวแพทย์เบอร์ลินด้วยเครื่องนับเซลล์อัตโนมัติ ADVIA2120i (ซีเมนส์) สำหรับเลือดของหนู

การตรวจยีนนักข่าว

เซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ 293 เซลล์ (DSMZ; No. ACC305; หมายเลขทาง 3–10; mycoplasma negative) ถูกปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815) ของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Merck; No. F7524) การถ่ายเซลล์ถูกดำเนินการในเพลต 12-หลุมที่มี 1.67 - 105 เซลล์/หลุม แต่ละหลุมถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิด DNA 333 ng (1 ใน 10 ตัวเป็นโครงสร้างวานิลลา) และรีเอเจนต์การถ่าย Fugene 6 1 มล. (Promega; No. E2691) ตามที่อธิบายไว้ 34 โครงสร้างทั้งหมดที่ใช้แสดงรายการในตารางเสริม S3 เซลล์ถูกสลาย 48 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชันด้วยบัฟเฟอร์ Passive Lysis (Promega; No. E1941) กิจกรรมของ Luciferase ถูกกำหนดด้วยชุด Beetle-Juice และ Renilla-Juice (ทั้ง pjk GmbH; Nos. 102511/102531 ตามลำดับ) ที่ลูมิโนมิเตอร์ Lumat LB9501 การทดสอบแต่ละครั้งดำเนินการซ้ำกันทางเทคนิค และมีการใช้ค่ากลางในการคำนวณ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-พับพิสัยพิสัยระหว่างควอไทล์) ใน 4 จาก 6 ยีนที่แสดงออกของ circadian ข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยใช้ IBM SPSS Statistics 27 และแสดงเป็นจุดแต่ละจุดด้วยค่ามัธยฐานหรือเป็นแท่งที่มีค่าเฉลี่ยและ SD การทดสอบ Mann-Whitney U หรือ Kruskal-Wallis กับ Bonferroni เมื่อทำการทดสอบหลังเฉพาะกิจ

ผลลัพธ์

การระเหยของการแสดงออก Epo circadian ในหนู Cry-null

เพื่ออธิบายกลไกระดับโมเลกุลของการควบคุม Epo แบบ circadian เราได้วิเคราะห์ Epo mRNA และการแสดงออกของโปรตีนในหนูกลายพันธุ์ WT และ Cry-null ในไต WT ยีนนาฬิกาตามรูปแบบบัญญัติแสดงนิพจน์ที่ขึ้นกับเวลาของวัน ในขณะที่สิ่งนี้ถูกยกเลิกในหนู Cry-null ตามที่คาดไว้ (รูปที่ S1) เสริม ก่อนหน้านี้ เรารายงานการสั่นของวงจรชีวิตของการแสดงออกของ Epo mRNA มากกว่า 24 ชั่วโมงสำหรับไตของหนู WT ของผู้ใหญ่ 24 โดยเน้นที่ค่าที่น้อยที่สุดและค่าสูงสุดในขณะนี้ เราสังเกตเห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง CT06 พับ 9- เท่า (ระยะเวลาการนอนหลับของเมาส์ ขั้นต่ำที่คาดไว้) ) และ CT18 (ระยะของกิจกรรม; ค่าสูงสุดที่คาดไว้; รูปที่ 1a) อย่างไรก็ตาม ในไตของหนู Cry-null ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของ Epo mRNA ของไต โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในหนูเมาส์ Cry-null จำนวนที่แน่นอนของระดับการถอดรหัส Epo ของไตที่ทั้งสองครั้งอยู่ระหว่างค่ามัธยฐานของระดับ WT Epo mRNA ที่ CT06 และ CT18 (รูปที่ 1a) EPO mRNA ในตับที่สอดคล้องกันต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับ (ไม่แสดงข้อมูล)

การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ Epo ในซีรัมในแต่ละวัน

ในการประมาณการแปลการแสดงออกของ Epo mRNA แบบ circadian ไปเป็นโปรตีน Epo แบบหมุนเวียน เราได้วิเคราะห์ตัวอย่างในซีรัมโดยการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ เก็บตัวอย่างเลือดก่อนตัวอย่างอวัยวะ Serum Epo เพิ่มขึ้น w2.3- เท่าระหว่าง CT06 และ CT18 ในหนูเมาส์ WT แต่ความแตกต่างนี้ถูกยกเลิกในหนูเมาส์ Cry-null (รูปที่ 1b) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความเข้มข้นของ S-Epo เฉลี่ยในช่วงเวลาหนึ่ง (CT06 และ CT18) มีความคล้ายคลึงกันในหนูเมาส์ WT และ Cry-null (22 mU/ml [ช่วง, 3-59 mU/ml] เทียบกับ 21 mU/ml [ช่วง, 7 –50 mU/มล.]).

การแสดงออกของ Circadian Epo ที่สัมพันธ์กับพารามิเตอร์ของก๊าซในเลือดแดงและการวัดระดับออกซิเจนในเลือด

เพื่อตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลงระดับออกซิเจนในเลือดและในเนื้อเยื่อในตอนกลางวันอาจทำให้เกิดการสั่นของการแสดงออกของ Epo หรือไม่ ได้เก็บตัวอย่างเลือดแดงและทำการวิเคราะห์ก๊าซในเลือดในหนู Cry-null และ WT ที่ให้ยาสลบ tracheotomized และระบายอากาศด้วยกลไกที่ CT06 หรือ CT18 ซึ่งสอดคล้องกับระดับ Epo mRNA ที่ต่ำที่สุดและสูงสุด ตามลำดับ (รูปที่ 1a) เราตรวจไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญใน pH ของหลอดเลือด ความดันบางส่วนของ CO2 หรือความดันบางส่วนของ O2 หรือในความเข้มข้นของเบสมาตรฐานเกินหรือแลคเตท (รูปที่ 2a–e) ระหว่าง CT06 และ CT18 หรือ WT และหนู Cry-null ระดับความอิ่มตัวของออกซิเจนที่วัดโดยการวัดค่าออกซิเจนในเลือดของชีพจร ก็ไม่แสดงความแตกต่างใดๆ เช่นกัน (รูปที่ 2f) การแสดงออกของยีนของ EPO master regulator hypoxia-inducible factor (HIF) 2a ไม่แตกต่างกันระหว่าง CT06 และ CT18 ทั้งใน WT หรือหนูเมาส์ Cry-null (รูปที่ 3) ดังนั้น ภายใต้สภาวะปกติ การควบคุม Epo circadian ไม่ได้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของความตึงเครียดของออกซิเจน

สวิตช์เปิด-ปิด Circadian ของการแสดงออก Epo ในเซลล์ที่สร้าง Epo ของไต

เพื่อศึกษาว่าการแสดงออกของ Epo mRNA แบบ circadian นั้นเป็นสื่อกลางโดยการเปิดใช้งานเซลล์ที่ผลิต Epo ของไตเพิ่มเติม (REPCs) หรือเพียงโดยการเพิ่มการแสดงออกของ Epo ต่อเซลล์ RNAscope in situ hybridization ถูกนำมาใช้ในส่วนขวางของไตกลาง (ตัวอย่างในรูปที่ S2) ในหนูเมาส์ WT จำนวน REPC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง CT06 (ค่ามัธยฐาน, 5; ช่วง, 0–25) และ CT18 (ค่ามัธยฐาน, 22; ช่วง, 5–82; 4.{{ 11}}พับ; P ¼ 0.010) ในทางตรงกันข้าม ไต Cry-null แสดงจำนวน REPCs ที่คล้ายกันที่ CT06 (ค่ามัธยฐาน 18; ช่วง 2-33) และ CT18 (ค่ามัธยฐาน, 15; ช่วง, 4-87; ไม่มีนัยสำคัญ; รูปที่ 1c) เราพิจารณาว่าหนู Cry-null มีข้อ จำกัด ในการเจริญเติบโตเนื่องจากการส่งสัญญาณบกพร่องของปัจจัยการเจริญเติบโตคล้ายอินซูลิน 1 (IGF1) ซึ่งส่งผลให้น้ำหนักตัวและขนาดอวัยวะแตกต่างกันเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องระหว่างหนู Cry-null และ WT.30 ตามที่เราใช้ สัตว์ที่อายุยังน้อย น้ำหนักไตที่แน่นอนของหนู Cry-null นั้นต่ำกว่าหนู WT เพียงเล็กน้อยเท่านั้น (–12 เปอร์เซ็นต์ในหนู Cry-null) แต่อัตราส่วนน้ำหนักไตต่อร่างกายไม่แตกต่างกัน (รูปที่ S3) . ดังนั้น การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ Epo mRNA ในรอบวันจึงดูเหมือนว่าจะถูกควบคุมโดยสวิตช์ของ REPC เพิ่มเติม

เปิดใช้งานโปรโมเตอร์ EPO ขั้นต่ำโดย CLOCK/BMAL1

เพื่อระบุลำดับการควบคุมที่รับผิดชอบสำหรับการแสดงออกของ Epo circadian (รูปที่ 4a) การทดสอบยีน luciferase reporter ถูกดำเนินการในเซลล์ไต 293 ของตัวอ่อนมนุษย์ เซลล์ไลน์เซลล์ไต 293 ของตัวอ่อนมนุษย์ไม่ได้ถูกเลือกเพราะมีต้นกำเนิดจากไต แต่เนื่องจากไม่มีนาฬิกาชีวิตภายนอก ดังนั้น ผลการกระตุ้นของ CLOCK/BMAL1 สามารถทดสอบได้ในพื้นหลัง CLOCK/BMAL1 ที่ไม่สั่นคลอนในระดับต่ำ การแสดงออกมากเกินไปของ CLOCK/BMAL1 กระตุ้นการทำงานของโปรโมเตอร์ EPO ขั้นต่ำของมนุษย์อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4b, I vs. II) หากบรรทัดฐาน E-box (–36 ถึง –31 bp สัมพันธ์กับไซต์เริ่มต้นการถอดความ) ถูกกลายพันธุ์35 เอฟเฟกต์นี้จะดูไม่ชัด (รูปที่ 4b, III)

เพื่อศึกษาว่ากฎระเบียบเกี่ยวกับชีวิตที่สังเกตได้นั้นขึ้นอยู่กับประเภทเซลล์หรือไม่ เราได้คัดกรองเซลล์ที่แสดงออก EPO หลายสายสำหรับกิจกรรมนาฬิกาภายในร่างกายโดยการตรวจสอบการสั่นที่อาศัยโปรโมเตอร์ Bmal1 ของผู้รายงานลูซิเฟอเรส เซลล์ที่มีจังหวะภายในร่างกายรวมถึงเซลล์ HEP3B ที่ได้มาจากตับของมนุษย์ เซลล์ KELLY ที่ได้มาจากนิวโรบลาสโตมาของมนุษย์ และเซลล์ไตของหนูเมาส์ PDGFRbþ (เดิมคือ EPO ซึ่งแสดงสายเซลล์ของหนูเมาส์ FAIK1-10) 36,37 ในบรรดา 3 สายพันธุ์ของเซลล์ เท่านั้น เซลล์ KELLY แสดงการสั่นของลูซิเฟอเรสที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์ EPO (รูปที่ S4A เพิ่มเติม) แม้ว่าเซลล์ PDGFRbþ จะแสดงจังหวะที่แข็งแรงของกิจกรรมโปรโมเตอร์ Bmal1 แต่เราไม่ได้ตรวจพบการสั่นแบบสื่อกลางของโปรโมเตอร์ EPO ซึ่งแนะนำแอมพลิจูดที่ต่ำกว่าของโครงสร้างนักข่าวที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์ EPO (รูปที่ S4B เพิ่มเติม)

Colocalization ของ Bmal1 และ Epo ในไตของ Cry-null กับหนู WT

เพื่ออธิบายเพิ่มเติม (i) การควบคุมการหมุนเวียนของการผลิต Epo ของไตโดยการสรรหาเซลล์ที่ผลิต Epo ของไตและ (ii) การ colocalization ของ Bmal1 และการแสดงออกของ Epo เราทำ RNAscope in situ hybridization Epo และ Bmal1 colocalized และกล้องจุลทรรศน์ในการขยายต่ำแสดงถึงความแตกต่างในการสรรหา REPC (รูปที่ 5) ตามปริมาณในรูปที่ 1c

การค้นพบทางโลหิตวิทยาในภาวะขาดสาร Cry1/Cry2 เพื่อประเมิน (i) ผลกระทบของเม็ดเลือดจากการขาดการแสดงออกของ Epo แบบ circadian และ (ii) ความผิดปกติทางโลหิตวิทยาอื่น ๆ ในหนูที่ไม่มีนาฬิกาทำงาน ได้มีการวิเคราะห์จำนวนเม็ดเลือด ความแตกต่างของเวลาในแต่ละวันของการแสดงออกของ Epo mRNA และความเข้มข้นของ S-Epo ไม่ได้สะท้อนโดยความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการนับเรติคูโลไซต์ส่วนปลายที่ CT06 เทียบกับ CT18 ในหนูเมาส์ WT อย่างไรก็ตาม จำนวนเรติคูโลไซต์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ทั้ง CT06 และ CT18 ในสัตว์ที่ปราศจากมลทินเมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ WT (รูปที่ 6a) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนเม็ดเลือดแดงหรือค่าฮีมาโตคริตใน WT เทียบกับหนู Cry-null อย่างไรก็ตาม พารามิเตอร์ทั้งสองไม่แปรผันระหว่าง CT06 และ CT18 ในทั้งสองสายพันธุ์ (รูปที่ 6b และ c) และไม่สอดคล้องกับหมายเลขเรติคูโลไซต์ส่วนปลายที่ต่ำกว่าในหนูเมาส์ Cry-null (รูปที่ 6a) เพื่อทดสอบว่าการขาดสารอาหาร (เช่น ธาตุเหล็กและโฟเลต) เนื่องจากการส่งสัญญาณ IGF1 บกพร่องนั้นเกี่ยวข้องกับความคลาดเคลื่อนของ reticulocyte ที่ลดลงแต่จำนวนเม็ดเลือดแดงปกติในหนู Cry-null ขนาดและรูปร่างของเซลล์เม็ดเลือดแดงได้รับการวิเคราะห์แต่ไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ ระหว่างหนู Cry-null และ WT (รูปที่ S5 เพิ่มเติม)

โดยเฉพาะอย่างยิ่ง จำนวนเกล็ดเลือดเฉลี่ยในหนูทดลอง Cry-null มีแนวโน้มที่จะสูงกว่าในหนูเมาส์ WT แต่จำนวนเกล็ดเลือดไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง CT06 และ CT18 ในทั้งสองสายพันธุ์ (รูปที่ 6d) ในทางตรงกันข้าม จำนวนเม็ดเลือดขาว (WBC) แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง CT06 และ CT18 ใน WT แต่ไม่ใช่ในหนู Cry-null จำนวน WBC มัธยฐานในหนูเมาส์ Cry-null นั้นสูงเช่นเดียวกัน เช่นเดียวกับในหนูเมาส์ WT ที่ CT06 (รูปที่ 6e)

อภิปรายผล

ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่านิพจน์ Epo ของ circadian ได้รับการควบคุมที่ระดับการถอดความ การวิเคราะห์ความเข้มข้นของ Epo mRNA และ S-Epo ในหนูที่มีภาวะผิดปกติของ Cry1 และ Cry2 ที่ผิดจังหวะได้เปลี่ยนเส้นทางการค้นหา "นาฬิกาของ Epo" ไปยังปัจจัยการถอดรหัสเป้าหมายดาวน์สตรีม CLOCK และ BMAL1 ซึ่งถูกระงับโดย CRY1 และ CRY2.26 การระเหยของสายนำ Cry1/Cry2 ต่อการสูญเสียการกดจังหวะของ CLOCK/BMAL1 ซึ่งส่งผลให้ระดับการถอดรหัส Epo คงที่ซึ่งอยู่ระหว่างระดับมัธยฐานที่ CT06 และ CT18 ในหนูเมาส์ WT (รูปที่ 1a) การผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดโดย RNAscope บ่งชี้ว่าการสั่นของ circadian ทำได้โดยการเปลี่ยนการแสดงออกของ Epo mRNA ในเซลล์คั่นระหว่างหน้า (รูปที่ 1c) และการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดโดย RNAscope ยังเผยให้เห็นการแสดงออกของ Bmal1 ใน REPC (รูปที่ 5)

ที่สำคัญกว่านั้น ระดับ S-Epo ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ CT18 ยืนยันว่าระเบียบ Epo แบบ circadian, transcriptional แปลเป็นความผันผวนของโปรตีน Epo หมุนเวียนภายใต้สภาวะปกติ (รูปที่ 1b) ระดับสูงสุดของ S-Epo ที่แท้จริงนั้นคาดว่าจะช้ากว่า CT18 เล็กน้อยเนื่องจากการสังเคราะห์โปรตีน EPO แบบ de novo ต้องใช้ w80 ถึง 120 นาที 38 และเวลา circadian ถูกเลือกโดยพิจารณาจากระดับ Epo mRNA สูงสุด 24 เราพบว่าการควบคุม Epo แบบ circadian มีแนวโน้มเป็นสื่อกลางโดยการกระตุ้นการถอดรหัสของบรรทัดฐาน E-box ในโปรโมเตอร์ EPO 5' โดย CLOCK/BMAL1 (รูปที่ 4 และรูปที่ S4) ซึ่งสอดคล้องกับความสัมพันธ์เชิงบวกที่อธิบายไว้ระหว่างโปรตีน BMAL1 และ ระดับ S-Epo ในรูปแบบการตกเลือดเฉียบพลันในหนู²⁵

มีหลักฐานสำหรับการควบคุมแบบสองทิศทางระหว่างเส้นทาง CLOCK/BMAL1 และเส้นทาง HIF ผ่านการปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนโดยตรง^39,40การควบคุม HIF2a ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นหลักของโปรโมเตอร์ EPO 41,42 ส่งผลให้ระดับการแสดงออกของยีนนาฬิกาเปลี่ยนแปลงไปในเซลล์มะเร็งตับของมนุษย์43 นอกจากนี้ BMAL1 ยังลดขนาดด้วยโปรตีน HIF1a และ HIF2a^44,45,และการควบคุมนาฬิกาชีวิตของกิจกรรม HIF ถูกควบคุมในลักษณะเฉพาะของเนื้อเยื่อ39 ในหนูที่ได้รับภาวะขาดออกซิเจนเฉียบพลัน (4 ชั่วโมงที่ร้อยละ 6 เทียบกับ O2 21 เปอร์เซ็นต์) EPO mRNA เพิ่มขึ้นมากเกินไปแต่ไม่แสดงความแตกต่างของวงจรชีวิตอีกต่อไป .46 ดังนั้น สภาวะปกติจึงน่าจะเหมาะสมที่สุดสำหรับการผ่ากลไกระดับโมเลกุลของระเบียบ Epo แบบหมุนเวียน อย่างไรก็ตาม ในสัตว์ฟันแทะ มีรายงานการเปลี่ยนแปลงของระดับออกซิเจนในเลือดและในเนื้อเยื่อในแต่ละวัน39,47 ในหนู การเปลี่ยนแปลงรายวันเป็นจังหวะในการให้ออกซิเจนในไตในระดับต่ำที่ zD3 เปอร์เซ็นต์ โดยมีค่าสูงสุดในความมืด (¼ กิจกรรมของหนู) .47 ความแตกต่างดังกล่าวไม่สามารถตรวจพบได้ในการทดลองของเรา ซึ่งจะทำการศึกษาเฉพาะหนูทดลองที่ได้รับยาสลบ ถ่ายหลอดอาหาร และระบายอากาศด้วยกลไกเท่านั้นด้วยเหตุผลด้านกฎระเบียบของสัตว์ อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ค่า pH ของหลอดเลือด ความดันบางส่วนของ CO2 และความดันบางส่วนของ O2 ส่วนเกินของเบสมาตรฐานหรือแลคเตท ตลอดจนความอิ่มตัวของออกซิเจนไม่ได้บ่งชี้ถึงความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง WT และหนูทดลอง Cry-null ที่ CT ทั้งสอง (รูปที่ 2) นอกจากนี้ ระดับการถอดรหัส Hif2a ในไตก็มีความคล้ายคลึงกันในทุกสภาวะ (รูปที่ 3) ดังนั้น ภายใต้สภาวะปกติ ระเบียบ Epo circadian ดูเหมือนว่าจะไม่ขึ้นกับการเปลี่ยนแปลงของความตึงเครียดของออกซิเจนในแต่ละวัน อย่างไรก็ตาม คำถามที่ระดับความสูงหรือภาวะขาดออกซิเจน (pO2 ต่ำ) ในระดับใดที่มีอิทธิพลต่อการสั่นของวงจรชีวิตในการผลิต Epo สมควรได้รับความสนใจเพิ่มเติม ระดับ S-Epo ของมนุษย์โดยทั่วไปจะสูงกว่าที่ระดับความสูง ในขณะที่เฟสและแอมพลิจูดไม่เปลี่ยนแปลง 17,22 และในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนในสภาวะปกติ ความเข้มข้นของ S-Epo จะแสดงการสั่นที่เด่นชัด⁴⁸

กฎระเบียบ Epo ของ Circadian อาจมีความเกี่ยวข้องมากที่สุดสำหรับโรคไตทางคลินิกและโลหิตวิทยา แต่ยังเกี่ยวกับการวินิจฉัยในห้องปฏิบัติการ เช่น การตรวจเลือดสำหรับยาสลบด้วยสารกระตุ้นการสร้างเม็ดเลือดแดง สำหรับการประเมินความเข้มข้นของ Epo หมุนเวียนในการวิเคราะห์ยาสลบ จะต้องพิจารณาช่วงเวลาของวัน (เวลาภายนอก) ที่การเก็บเลือดและลำดับเหตุการณ์ของบุคคล (เวลาภายใน) 49,50

ในการเกิดเม็ดเลือดแดง หน่วยที่ก่อตัวเป็นระเบิด – erythroid เป็นเซลล์ที่จำเพาะต่อสายเลือดแรก ตามด้วยหน่วยที่ก่อตัวเป็นอาณานิคม – erythroid ซึ่งแสดงการแสดงออกอย่างมากมายของตัวรับ Epo หลังจาก 2 วันในวัฒนธรรมกับ Epo หน่วยที่สร้างอาณานิคมของ murine – erythroid จะผลิตอาณานิคมของเม็ดเลือดแดง เมื่อถึงระยะของ orthochromatic erythroblasts หลังจากผ่านไป 7 วัน เซลล์จะขับนิวเคลียสของพวกมันเพื่อให้กลายเป็น reticulocytes ที่ไม่มีการแสดงออกของ Epo receptor51 เมื่อพิจารณาถึงเวลาที่ใช้สำหรับหน่วยที่ก่อตัวเป็นอาณานิคม – อีรีทรอยด์เพื่อเติบโตเป็นเรติคูโลไซต์หรือแม้แต่เม็ดเลือดแดงที่โตเต็มที่ คงไม่น่าแปลกใจที่ไม่มีการสังเกตความแตกต่างระหว่าง CT06 และ CT18 ในหนูเมาส์ WT (รูปที่ 6a–c) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง จำนวน reticulocyte โดยรวมมีค่า WT สูงกว่าในหนู Cry-null อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6a) ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างใน reticulocytes นั้นบกพร่องในหนู Cry-null ข้อมูลก่อนหน้านี้ระบุว่าเซลล์ต้นกำเนิดของอีรีทรอยด์ในช่วงเริ่มต้นยังแสดงรูปแบบการสังเคราะห์ DNA แบบ circadian การบริหารร่างกายของ rhEpo ช่วยเพิ่มจังหวะการเต้นของตัวเลขกลุ่มอีริทรอยด์ 52 จำนวนเรติคูโลไซต์ที่ต่ำกว่า แม้ว่าจะมีความเข้มข้นของ S-Epo โดยรวมค่อนข้างสูงในหนู Cry-null อาจเป็นผลมาจากการยกเลิกการสังเคราะห์ DNA circadian ในระดับต้นกำเนิดของอีรีทรอยด์ กลุ่มดาวที่มี S-Epo สูงและการสร้างเม็ดเลือดแดงที่ลดลงดังกล่าวได้รับการสังเกตในหนูทดลองที่มีการระเหยทางพันธุกรรมของการผลิตเมลาโทนินในไพเนียล (หนู C3H/HeN ที่ไม่มี N-acetyl transferase ที่จำกัดอัตรา) 53 การโต้เถียงสำหรับกิจกรรมภายในร่างกายในเซลล์ต้นกำเนิดของเม็ดเลือดแดง ระดับ.

โดยเฉพาะอย่างยิ่งหนู Cry-null แสดงระดับ IGF1 ลดลงประมาณ 80 เปอร์เซ็นต์ นำไปสู่การส่งสัญญาณ IGF1 ที่ลดลง และลดน้ำหนักตัวและขนาดอวัยวะลง 30 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ WT ซึ่งเป็นผลกระทบที่รุนแรงขึ้นตลอดอายุการใช้งาน.30 แม้ว่าสัตว์จะถูกนำมาใช้ใน การทดลองยังค่อนข้างเล็ก (อายุมัธยฐาน^21–29 สัปดาห์) พวกมันแสดงผลปานกลางต่อร่างกายโดยรวมและน้ำหนักไตสัมบูรณ์ในหนู Cry-null แต่อัตราส่วนน้ำหนักไตต่อร่างกายเป็นปกติ (รูปที่ S3) ข้อเท็จจริงประการหลังอาจเกี่ยวข้องกับความสามารถในการสังเคราะห์โปรตีน Epo (รูปที่ 1b)

อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ขนาดหรือรูปร่างของเซลล์เม็ดเลือดแดง (MCV, MCH และ MCHC; รูปที่ S5 เสริม) ไม่ได้ชี้ให้เห็นถึงภาวะขาดสารอาหาร (เช่น ธาตุเหล็กและโฟเลต) เป็นคำอธิบายสำหรับความคลาดเคลื่อนระหว่างเรติคูโลไซต์ที่ลดลงและจำนวนเม็ดเลือดแดงปกติใน Cry- หนูที่เป็นโมฆะ (รูปที่ 6a และ b) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การส่งสัญญาณ Epo และ IGF1 จะประสานการเพิ่มจำนวนเซลล์และการสร้างความแตกต่างระหว่างการสร้างเม็ดเลือดแดงผ่านการโต้ตอบกับ GATA-1/เพื่อนของ GATA-1 การถอดรหัสที่ซับซ้อน54 ในกระบวนการนี้ Epo เปิดใช้งานเส้นทาง AKT ของเซลลูลาร์และด้วยเหตุนี้จึงเพิ่มขึ้น ความสัมพันธ์ของ GATA-1 ซึ่งเป็นตัวควบคุมการถอดรหัสที่สำคัญของการสร้างเม็ดเลือดแดง กับเพื่อนปัจจัยร่วมของ GATA-1 กลไกนี้ถูกยับยั้ง อย่างไรก็ตาม หากการส่งสัญญาณ IGF1 ถูกยกเลิก54 ดังนั้น ผลในเชิงบวกของ Epo ที่ค่อนข้างสูงในหนู Cry-null ต่อการสร้างความแตกต่างของเซลล์เม็ดเลือดแดงอาจมีค่ามากกว่ากิจกรรม IGF1 ที่ลดลงในหนู Cry-null ที่ค่อนข้างอายุน้อยที่ศึกษาในที่นี้

ความหมายทั่วไปของภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะในวงจรชีวิตที่สมบูรณ์ต่อเม็ดเลือดนั้นถูกอธิบายเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์หมายเลขเกล็ดเลือดและ WBC ของเรา ผลลัพธ์ก่อนหน้านี้จากหนูที่แสดงรูปแบบ Clock (ClockD19/D19) ที่เป็นลบที่โดดเด่นแสดงให้เห็นว่าการหยุดชะงักของการแสดงออกของ thrombopoietin (ตัวควบคุมหลักของ megakaryopoiesis) และตัวรับ Mpl ส่งผลให้จำนวน megakaryocytes ของไขกระดูกที่เจริญเต็มที่เพิ่มขึ้นและจำนวนเกล็ดเลือดหมุนเวียน 55 การแกว่งตัวของตัวเลขเกล็ดเลือดในรอบวันที่มีนัยสำคัญด้วยที่จุดสูงสุดที่เวลา zeitgeber (ZT) 20 ในหนูเมาส์ WT และจำนวนเกล็ดเลือดที่สูงขึ้นที่ ZT08 ในหนูเมาส์ ClockD19/D19, 55 ส่งผลให้จำนวนเกล็ดเลือดไม่สั่นตามรอบวัน ไม่สามารถ ได้รับการยืนยันในโมเดลเมาส์ของเรา (รูปที่ 6d) การค้นพบที่สำคัญอีกประการหนึ่งคือการสูญเสียความแตกต่างของเวลาในแต่ละวันของการหมุนเวียน WBCs ในหนูทดลอง Cry-null ในทางตรงกันข้ามกับหนู WT (รูปที่ 6e) ซึ่งสอดคล้องกับกิจกรรมที่รายงานของ CLOCK/BMAL1 ในการผลิต WBC ที่โตเต็มที่^56,57

สำหรับการตีความข้อมูลของเรา ความแตกต่างของกิจกรรมกลางวันและกลางคืนในหนูและมนุษย์ต้องได้รับการพิจารณา: เวลา CT06 ในมนุษย์นั้นสัมพันธ์กันอย่างคร่าวๆ เป็นเวลาเที่ยงคืน (ระยะการนอนหลับ) ในขณะที่ CT18 นั้นสัมพันธ์กันอย่างคร่าวๆ กับช่วงเที่ยงวัน (ระยะกิจกรรม) สิ่งที่ตรงกันข้ามคือความจริงสำหรับหนูที่ออกหากินเวลากลางคืน แต่สิ่งมีชีวิตทั้งสองแสดงรูปแบบการแสดงออกของ Epo circadian ที่เหมือนกัน (ต่ำที่ CT/ZT06 สูงที่ CT/ZT18) สิ่งนี้บ่งชี้ว่ากลไกเพิ่มเติม (เช่น ปัจจัยการเผาผลาญ) สามารถปรับเปลี่ยนจังหวะของการแสดงออก Epo ในสิ่งมีชีวิตทั้งสองได้ การซิงโครไนซ์ระหว่างระดับสูงสุดของ Epo และการแสดงออกของตัวรับ Epo ในบรรพบุรุษของอีรีทรอยด์ระยะแรก (หน่วยที่ก่อตัวเป็นระเบิด–erythroid และแม้แต่หน่วยที่สร้างอาณานิคม– เซลล์เม็ดเลือดแดง)⁵² แนะนำว่าผู้ป่วยที่รับการรักษาด้วย rhEpo (เช่น ภาวะโลหิตจางในไตระยะสุดท้ายหรือความผิดปกติทางโลหิตวิทยา) จะได้รับประโยชน์จากการเลียนแบบสรีรวิทยาของชีวิตประจำวันโดยการใช้ hypo ในตอนกลางคืน ยังไม่มีรายงานความผิดปกติของเม็ดเลือดในมนุษย์ที่มี CRY1 (Online Mendelian Inheritance in Man *601933) หรือ CRY2 (Online Mendelian Inheritance in Man *603732) การกลายพันธุ์ที่สูญเสียหน้าที่ รายงานทางคลินิกเชื่อมโยงตัวแปร CRY1 กับความผิดปกติของสมาธิสั้น/สมาธิสั้น มักมาพร้อมกับอาการนอนไม่หลับ วิตกกังวล ซึมเศร้า หรือความผิดปกติของระยะการนอนหลับที่ล่าช้า^58,59สิ่งนี้สมควรได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมเนื่องจากโรคดังกล่าวสามารถแย่ลงได้ด้วยโรคโลหิตจางหรือความผิดปกติของเม็ดเลือด

โดยสรุป การศึกษานี้ให้หลักฐานแรกที่แสดงว่าการแสดงออกของ Epo แบบ circadian ในไตของหนูผู้ใหญ่ที่มีภาวะปกติปกติถูกควบคุมที่ระดับการถอดรหัสโดย CLOCK/BMAL1-ที่กระตุ้นการทำงานขององค์ประกอบ E-box ในโปรโมเตอร์ 5'EPO เนื่องจาก EPO ทำหน้าที่อย่างเด่นชัดภายในเครือข่ายการกำกับดูแลที่ซับซ้อนของการสร้างเม็ดเลือดแดง การใช้ repo อย่างเหมาะสมในผู้ป่วยที่มีภาวะไตไม่เพียงพออาจรวมถึงการใช้ก่อนช่วงเวลาสูงสุดทางสรีรวิทยาในตอนกลางคืน