การโคลนยีน การระบุหน้าที่ การวิเคราะห์โครงสร้างและการแสดงออกของซูโครสซินเทสจาก Cistanche Tubulosa Ⅱ

ผลลัพธ์และการวิเคราะห์

1 การทำเหมืองยีนซูโครสซินเทสใน Cistanche tubulosa และการโคลนยีน CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>ส่วนทางอากาศ

Cistanche Tubulosa คุณภาพสูงเพื่อสุขภาพของผู้ชาย

ดังนั้นค่า FPKM ระดับการแสดงออกของยีนซูโครสซินเทสสองตัวที่ได้รับในการคัดกรองเบื้องต้นในข้อมูลการถอดเสียงของส่วนต่าง ๆ ของ Cistanche tubulosa จึงถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดย Z-Score และทำการวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ (รูปที่ 1A) ผลการวิจัยพบว่ายีน CtSus มีระดับการแสดงออกสูงสุดในฮอสโทเรียม และระดับการแสดงออกในส่วนใต้ดินสูงกว่าในส่วนทางอากาศ ซึ่งสอดคล้องกับรูปแบบการสะสมของสารประกอบไกลโคไซด์ในส่วนต่างๆ ของ Cistanche tubulosa ในขณะที่ระดับการแสดงออกของยีน CtSus1 ในฮอสทอเรียมต่ำ ดังนั้น ตามผลลัพธ์ข้างต้น ยีน CtSus จึงถูกเลือกสำหรับการขยายลำดับที่ตามมา การแสดงออกภายนอก และการระบุฟังก์ชัน การใช้ Cistanche tubulosa cDNA เป็นเทมเพลต จะได้ผลิตภัณฑ์แถบความถี่เดี่ยวที่ ~ 2,500 bp หลังจากการขยาย PCR (รูปที่ 1B) ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการกู้คืนจากเจลและผูกเข้ากับเวกเตอร์การโคลนนิ่ง และได้รับขอบเขตการเข้ารหัสแบบเต็มความยาวของยีนเป้าหมายโดยการจัดลำดับ ความยาวของลำดับ CtSus คือ 2418 bp

รูปที่ 1 การสำรวจและการโคลนยีนของ CtSus จาก C. tubulosa และการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของโปรตีนที่ถูกเข้ารหัส ตอบ: ระดับการแสดงออกของยีน CtSus และ CtSus1 ในส่วนต่าง ๆ ของ C. tubulosa ทำให้เป็นมาตรฐานเป็น Z-Scores ตามค่า FPKM B: การขยายยีนของ CtSus; M: DNA marker; C: โดเมนอนุรักษ์ของโปรตีน CtSus ที่ทำนายโดย SMART; D: การจัดลำดับหลายลำดับของ CtSus และซูโครสสังเคราะห์ที่ระบุได้จากพืชชนิดอื่น รวมถึง Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum และ Albuca bracteata โดเมนการสังเคราะห์ซูโครสและโดเมนการถ่ายโอนน้ำตาลแสดงด้วยกล่องสีแดงและสีน้ำเงินตามลำดับ E: การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของ CtSus และซูโครสซินเทสจากพืชชนิดอื่น F: การวิเคราะห์ SDS-PAGE ของการแสดงออกที่แตกต่างกันของ CtSus โดยใช้เวกเตอร์ pCold™ I ใน E. coli เลน 1: เครื่องหมายโปรตีน; เลน 2: เศษส่วนเหนือตะกอน; ช่องที่ 3: การตกตะกอนของฝน ลูกศรสีแดงแสดงโปรตีน CtSus G: Colony PCR ของโคลนเดี่ยวที่มีพลาสมิดรีคอมบิแนนต์ทั้งสองตัว อ: เครื่องหมายดีเอ็นเอ; 1: สัตว์เลี้ยง-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

ตารางที่ 2 ความคล้ายคลึงกันของลำดับกรดอะมิโนระหว่าง CtSus และการสังเคราะห์ซูโครสที่ระบุจากพืชชนิดอื่น

2.3 การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ

ต้นไม้สายวิวัฒนาการที่สร้างโดยซอฟต์แวร์ MEGA ใช้เพื่อวิเคราะห์ความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการระหว่างซูโครสซินเทส CtSus จาก Cistanche tubulosa และการสังเคราะห์ซูโครสที่ได้จากพืชอื่นๆ ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 1E การสังเคราะห์ซูโครสจากพืชแสดงกิ่งก้านของวิวัฒนาการที่แตกต่างกันในพืชใบเลี้ยงคู่ (บริเวณ I และ II) และพืชใบเลี้ยงเดี่ยว (บริเวณ III) CtSus อยู่ในกิ่ง dicot และลำดับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดที่สุดกับ CtSus ทั้งหมดมาจากพืช Lamiaceae (Cistanche tubulosa เป็นพืช Lamiaceae Orobanchaceae) ในขณะที่สาขาอื่นๆ ส่วนใหญ่ประกอบด้วยพืช Solanales ซึ่งบ่งบอกถึงการอนุรักษ์และ ความคล้ายคลึงของยีนซูโครสซินเทสจากพืชในการวิวัฒนาการของพืชในลำดับเดียวกัน ในหมู่พวกเขา ซูโครสสังเคราะห์ PrSus (AEN79500.1) จาก Pelipanche ramosa ของพืช Orobanchaceae มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ CtSus มากที่สุด

3 การแสดงออกภายนอกและการวิเคราะห์กิจกรรมของ CtSus

3.1 การแสดงออกภายนอกของยีน CtSus พลาสมิด pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus และ pCold™ I-CtSus ที่ตรวจสอบโดยการหาลำดับถูกถ่ายโอนไปยังนิพจน์ที่มีความสามารถในการแสดงออก E. coli Transetta (DE3) และโคลนที่เป็นบวกได้รับการคัดเลือกโดย PCR ของโคโลนีเพื่อการตรวจสอบลำดับ สายพันธุ์การแสดงออกลูกผสมที่ได้รับถูกเหนี่ยวนำโดยอุณหภูมิต่ำของ IPTG สำหรับการแสดงออกของโปรตีน แบคทีเรียถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง และบัฟเฟอร์สลายถูกเติมเพื่อแยกแบคทีเรียเพื่อให้ได้ส่วนลอยเหนือตะกอนและตะกอน และดำเนินการ SDS-PAGE สำหรับการตรวจจับ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเมื่อใช้ pET-28a และ pET-24b เป็นเวกเตอร์นิพจน์ CtSus จะไม่แสดงใน E. coli ในขณะที่ pCold™ I ถูกใช้เป็นเวกเตอร์นิพจน์ CtSus ที่ชัดเจน ตรวจพบแถบโปรตีนรีคอมบิแนนท์ในบริเวณ ~100 kDa ซึ่งสอดคล้องกับมวลโมเลกุลสัมพัทธ์ที่คาดการณ์ไว้ในทางทฤษฎีของมันที่ 92.2 kDa (รูปที่ 1F)

3.2 การเปลี่ยนแปลงทั้งเซลล์

เพื่อตรวจสอบฟังก์ชันการเร่งปฏิกิริยาของ CtSus ในเบื้องต้น จึงมีการสร้างสายพันธุ์การแสดงออกร่วมของ CtSus และยีนไกลโคซิลทรานสเฟอเรส UGT71BD1 UGT71BD1 ถูกโคลนและระบุได้จาก Cistanche tubulosa และเป็น UDP-กลูโคซิลทรานสเฟอเรสที่สามารถรับสารประกอบอะโรมาติก เช่น ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์, ฟลาโวนอยด์ประเภทต่างๆ, สติลบีน และคูมาริน เป็นตัวรับและกระตุ้นปฏิกิริยากลูโคซิเลชันของกลุ่มฟีนอลไฮดรอกซิลของสารตั้งต้นโดยใช้ UDP-กลูโคส เป็นผู้บริจาคน้ำตาล [18] การนำ CtSus มาใช้ในทางทฤษฎีสามารถให้ UDP-กลูโคสของผู้ให้ไกลโคซิลที่เพียงพอมากขึ้นสำหรับปฏิกิริยากลูโคซิเลชันที่เร่งปฏิกิริยาโดย UGT71BD1 ดังนั้นจึงส่งเสริมสมดุลของปฏิกิริยาเพื่อเคลื่อนไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลชัน โดยวิธีนี้จึงเพิ่มผลผลิตของผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลชัน พลาสมิด pCold™ I-CtSus และพลาสมิด pET-28a-UGT71BD1 ถูกแปลงไปพร้อมกันเป็น E. coli Transetta (DE3) ที่มีความสามารถในการแสดงออกพร้อมกัน โคลนเดี่ยวที่มีพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ทั้งสองถูกคัดกรองโดยโคโลนี PCR และสายพันธุ์การแสดงออกรีคอมบิแนนท์ที่เป็นบวกได้รับโดยการตรวจสอบหาลำดับ (รูปที่ 1G) การแสดงออกร่วมของยีนคู่ถูกชักนำ ภายนอกร่างกาย และใช้สายพันธุ์การแสดงออกของยีนเดี่ยว pET-28aUGT71BD1 เป็นกลุ่มควบคุม กิจกรรมของ CtSus ในการเร่งการสร้างผู้บริจาค UDP-กลูโคสได้รับการตรวจสอบเบื้องต้นโดยการเปลี่ยนแปลงเซลล์ทั้งหมด ผลลัพธ์ของ HPLC และแมสสเปกโตรเมทรีที่มีความละเอียดสูงแสดงให้เห็นว่าเมื่อทำปฏิกิริยาการเปลี่ยนรูปเซลล์ทั้งหมดโดยมีอะโคนิทีน 1 และเรสเวอราทรอล 2 เป็นซับสเตรต จะตรวจพบการสร้างผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลชันที่ชัดเจนหลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงของการเปลี่ยนแปลง ดังแสดงในรูปที่ 2

รูปที่ 2 การเปลี่ยนรูปทางชีวภาพทั้งเซลล์ของซับสเตรต 1 หรือ 2 โดยสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ที่รองรับ UGT71BD1 หรือสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ที่รองรับการควบคู่ UGT71BD1 กับ CtSus ตามลำดับ ตอบ: HPLCchromatograms ของการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพทั้งเซลล์ของสารตั้งต้น 1 ความยาวคลื่นในการตรวจจับคือ 360 นาโนเมตร; B: HRESI-MS และ MS2spectra ของผลิตภัณฑ์ 1a; C: HPLC chromatograms ของการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพทั้งเซลล์ของสารตั้งต้น 2; ความยาวคลื่นการตรวจจับคือ 330 นาโนเมตร D: สเปกตรัม HRESI-MS ของผลิตภัณฑ์ 2a และ 2b

เมื่อ 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, สูตรโมเลกุล C9H6O4) ถูกใช้เป็นสารตั้งต้น, พีคโครมาโตกราฟีของผลิตภัณฑ์ 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, สูตรโมเลกุลที่ทำนายไว้ C15H16O9) ถูกตรวจพบที่ 5.39 นาที ซึ่งสอดคล้องกับ UV การดูดซับของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์ควบคุม ในเวลาเดียวกัน ยอดแฟรกเมนต์ของ m/z 179.033 4 [M+H]+ ถูกตรวจพบในสเปกตรัม MS2 ที่ 1a ซึ่งเกิดจากการที่ 1a สูญเสียโมเลกุลกลูโคส (162 Da) ซึ่งบ่งชี้ว่า 1a เป็นผลิตภัณฑ์ของซับสเตรต 1 ที่เชื่อมต่อกับโมเลกุลกลูโคส อัตราการแปลงคำนวณโดยการรวมพื้นที่พีคเข้าด้วยกัน พบว่าอัตราการแปลงของ UGT71BD1 ทั้งเซลล์ที่เร่งปฏิกิริยาซับสเตรต 1 เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลต 1a อยู่ที่ 71.87% ในขณะที่การเติม CtSus เพิ่มอัตราการแปลงของปฏิกิริยาเป็น 95.84% หรือ 1.3 เท่าของกลุ่มควบคุม เมื่อซับสเตรตเป็นสารประกอบ 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, สูตรโมเลกุล C14H12O3) ผลิตภัณฑ์โครมาโตกราฟีจะมีจุดสูงสุด 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, โมเลกุลที่คาดการณ์ไว้ สูตร C20H22O8) และ 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, สูตรโมเลกุลที่คาดการณ์ไว้ C26H32O13) สอดคล้องกับคุณลักษณะการดูดกลืนรังสียูวีของซับสเตรตและผลิตภัณฑ์ควบคุมถูกตรวจพบที่ 10.32 และ 6.52 นาที ตามลำดับ . ตรวจพบส่วนพีคของชิ้นส่วนที่ 3 [MH]- ซึ่งเกิดขึ้นจากการสูญเสียโมเลกุลกลูโคสหนึ่งโมเลกุล (162 Da) ซึ่งบ่งชี้ว่า 2a เป็นผลิตภัณฑ์ของซับสเตรต 2 ที่เชื่อมต่อกับโมเลกุลกลูโคสหนึ่งโมเลกุล เมื่อเปรียบเทียบกับข้อมูลในวรรณกรรม [18] และข้อมูลการทำนายแมสสเปกโตรเมทรี พบว่าผลิตภัณฑ์ 2b เป็นผลิตภัณฑ์ของซับสเตรต 2 ที่เชื่อมต่อกับโมเลกุลกลูโคส 2 โมเลกุล อัตราการแปลงคำนวณโดยใช้พื้นที่พีครวม พบว่าการเติม CtSus สามารถเพิ่มอัตราการแปลงของปฏิกิริยาไกลโคซิเลชันของซับสเตรต 2 จาก 64.01% เป็น 78.51% ซึ่งในจำนวนนี้ผลผลิตของผลิตภัณฑ์โมโนแซ็กคาไรด์ 2a เพิ่มขึ้นจาก 45.09% เป็น 63.58% และผลผลิตของผลิตภัณฑ์ไดแซ็กคาไรด์ 2b เปลี่ยนจาก 18.92% เป็น 14.93%

3.3 การทำบริสุทธิ์โปรตีนรีคอมบิแนนท์ของ CtSus และการระบุการทำงานของเอนไซม์ ในหลอดทดลอง

ผลการทดลองการเปลี่ยนรูปเซลล์ทั้งหมดชี้ให้เห็นว่า CtSus มีฤทธิ์ในการเร่งการผลิต UDP-กลูโคสของผู้บริจาคกลูโคสที่ออกฤทธิ์ เพื่อที่จะตรวจสอบกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยานี้โดยตรงเพิ่มเติมผ่านปฏิกิริยาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ ในหลอดทดลอง ฟิวชันโปรตีนของยีน CtSus ในระบบการแสดงออกของ pCold™ จะถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์โดย affinity chromatography ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเมื่อใช้ pCold™ I เป็นเวกเตอร์การแสดงออก โปรตีนรีคอมบิแนนท์จะถูกแสดงออกในปริมาณมาก แต่ส่วนใหญ่จะอยู่ในตะกอน เมื่อใช้ pCold™ TF เป็นเวกเตอร์การแสดงออก ยีน CtSus จะถูกแสดงออกในปริมาณมากใน E. coli (รูปที่ 3A) ฟิวชันโปรตีนถูกทำให้บริสุทธิ์โดย HisTrap FF affinity chromatography และอยู่ภายใต้ปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ ในหลอดทดลอง ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 3B เมื่อใช้ซูโครสและ UDP เป็นซับสเตรต เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ ตรวจพบพีคของผลิตภัณฑ์ใหม่ที่ 10.32 นาที เวลากักเก็บและการดูดซับรังสียูวีสอดคล้องกับ UDP-กลูโคส ผลิตภัณฑ์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็น UDP-กลูโคสโดยเปรียบเทียบกับมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากฟิวชันโปรตีนที่แสดงโดยเวกเตอร์การแสดงออก pCold™ TF มีแท็กที่ละลายน้ำได้เป็นปัจจัยกระตุ้นขนาดใหญ่ (ขนาดโปรตีนของแท็กคือ 48 kDa) จึงมีผลกระทบอย่างมากต่อกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของโปรตีน ดังนั้นแท็กของฟิวชันโปรตีนจึงถูกตัดเพิ่มเติมโดยเอนไซม์แฟคเตอร์ Xa และโปรตีน CtSus ที่ไม่มีแท็กจากภายนอกถูกทำให้บริสุทธิ์ (รูปที่ 3A) โปรตีนดังกล่าวได้รับการเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลอง และผลการทดลองพบว่าผลผลิตของ UDP-กลูโคสเพิ่มขึ้นจาก 3.53% เป็น 10.66%

(รูปที่ 3B) ผลลัพธ์ข้างต้นยืนยันการทำงานของ CtSus ในการเร่งการผลิต UDP-กลูโคสผ่านการเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลอง และยังแสดงให้เห็นว่าการมีแท็กความสัมพันธ์ขนาดใหญ่เอื้อต่อการแสดงออกที่ละลายน้ำได้ของ CtSus แต่จะส่งผลอย่างมีนัยสำคัญต่อ กิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาในหลอดทดลองของเอนไซม์

รูปที่ 3 การแสดงออกที่แตกต่างกันและการระบุการทำงานของ CtSus ตอบ: การวิเคราะห์ SDS-PAGE ของโปรตีน CtSus เลน 1: เครื่องหมายโปรตีน; ช่องที่ 2: CtSus แบบรีคอมบิแนนท์พร้อมปัจจัยกระตุ้น ช่องที่ 3: การแยกแท็กปัจจัยทริกเกอร์โดยใช้แฟกเตอร์ Xa โปรตีเอสเพื่อให้โปรตีน CtSus ที่มีป้ายกำกับด้วยลูกศรสีแดง B: การตรวจเอนไซม์ในหลอดทดลองโดยใช้ฟิวชันโปรตีนและกระตุ้นโปรตีน CtSus ที่ปราศจากปัจจัยเพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์ UDP-กลูโคสเมื่อมีซูโครสและ UDP ตามลำดับ โดยมีมาตรฐาน UDP-กลูโคสอ้างอิง โปรตีนต้มถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมภายใต้สภาวะเดียวกัน ความยาวคลื่นการตรวจจับคือ 260 นาโนเมตร