ติดต่อ:jerry.he@wecistanche.com

Wei Lin1, Jue Fan2, Long-Fei Hu2, Yan Zhang2, Joshua D. Ooi3, Ting Meng4, Peng Jin5, Xiang Ding5, Long-Kai Peng6, Lei Song6, Rong Tang6, Zhou Xiao4, Xiang Ao4, Xiang-Cheng Xiao4, Qiao-Ling Zhou4, Ping Xiao4, Yong Zhong4

1ภาควิชาพยาธิวิทยา โรงพยาบาลเซียงยา มหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์ ฉางซา หูหนาน 410008 จีน;

2ภาควิชาชีวสารสนเทศและวิทยาศาสตร์ข้อมูล, Singleron Biotechnologies, Nanjing, Jiangsu 210032, China;

3Centre for Inflammatory Diseases, Monash University Department of Medicine, Monash Medical Center, Clayton, VIC 3168, ออสเตรเลีย;

4แผนกโรคไต, โรงพยาบาลเซียงยา, มหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์, ฉางซา, หูหนาน 410008, จีน;

5แผนกปลูกถ่ายอวัยวะ โรงพยาบาลเซียงยา มหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์ ฉางซา หูหนาน 410008 จีน

6ภาควิชาของไตการปลูกถ่าย, โรงพยาบาลเซียงยาแห่งที่สองของมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์, ฉางชา, หูหนาน 410011, จีน

Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต

เชิงนามธรรม

ความเป็นมา: ตั้งแต่ปี 2019 นวนิยายเรื่องหนึ่งไวรัสโคโรน่าชื่อ 2019 นวนิยายไวรัสโคโรน่า(2019-nCoV) ได้เกิดขึ้นทั่วโลก นอกเหนือจาก

ไข้และภาวะแทรกซ้อนทางเดินหายใจเฉียบพลันไตพบอาการบาดเจ็บในผู้ป่วยไม่กี่รายที่มีอาการไวรัสโคโรน่าโรค 2019 นอกจากนี้ จากการค้นพบล่าสุด ตรวจพบไวรัสในปัสสาวะ เอ็นไซม์แปลงแองจิโอเทนซิน II (ACE2) ได้รับการเสนอให้ทำหน้าที่เป็นตัวรับสำหรับการเข้าสู่ 2019-nCoV ซึ่งเหมือนกับเอนไซม์สำหรับกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบสาเหตุที่เป็นไปได้ของความเสียหายของไตและเส้นทางที่เป็นไปได้ของการติดเชื้อ nCoV ในระบบทางเดินปัสสาวะ

วิธีการ: เราใช้ทั้งเผยแพร่ไตและข้อมูล Atlas เซลล์กระเพาะปัสสาวะและอิสระใหม่ไตข้อมูลการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียวที่สร้างขึ้นภายในองค์กรเพื่อประเมินการแสดงออกของยีน ACE2 ในเซลล์ทุกประเภทในไตและกระเพาะปัสสาวะที่แข็งแรง ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สันระหว่าง ACE2 และยีนอื่นๆ ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นครั้งแรก จากนั้น ยีนที่มีค่า r มากกว่า 0.1 และค่า P น้อยกว่า 0.01 จะถือว่ายีนแสดงออกร่วมกันที่มีนัยสำคัญกับ ACE2

ผลลัพธ์: ผลลัพธ์ของเราแสดงการแสดงออกที่สมบูรณ์ของ ACE2 ในเซลล์ย่อยทั้งหมดของเซลล์ท่อใกล้เคียง (PT) ของไต. พบการแสดงออกของ ACE2 ใน 5.12 เปอร์เซ็นต์ , 5.80 เปอร์เซ็นต์ , และ 14.38 เปอร์เซ็นต์ ของเซลล์ทูบูลที่ใกล้เคียงกัน เซลล์ PT และเซลล์ทูบูลตรงส่วนต้นตามลำดับ ในสามฉบับที่ตีพิมพ์ไตชุดข้อมูลเซลล์ Atlas นอกจากนี้ การแสดงออกของ ACE2 ยังได้รับการยืนยันใน 12.05 เปอร์เซ็นต์ , 6.80 เปอร์เซ็นต์ และ 10.20 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ของหลอดอาหารส่วนปลาย PT และหลอดตรงส่วนปลาย ตามลำดับ ในตัวอย่างไตที่มีสุขภาพดีสองตัวอย่างของเรา สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลสาธารณะจากตัวอย่างกระเพาะปัสสาวะสามตัวอย่าง การแสดงออกของ ACE2 นั้นต่ำแต่สามารถตรวจพบได้ในเซลล์เยื่อบุผิวของกระเพาะปัสสาวะ มีเพียง 0.25 เปอร์เซ็นต์และ 1.28 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์กลางและเซลล์ในร่มตามลำดับที่มีการแสดงออกของ ACE2 สรุป: การศึกษาครั้งนี้ได้ให้หลักฐานทางชีวสารสนเทศเกี่ยวกับเส้นทางที่เป็นไปได้ของการติดเชื้อ nCoV 2019- nCoV ในระบบทางเดินปัสสาวะ คำสำคัญ: 2019-nCoV; อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน เอ็นไซม์แปลงแองจิโอเทนซิน 2; กระเพาะปัสสาวะ; โควิด-19; ไต; การวิเคราะห์ลำดับอาร์เอ็นเอ การวิเคราะห์เซลล์เดียว

บทนำ ในปี 2019 คดีปอดบวมลึกลับได้เกิดขึ้นและแพร่กระจายไปทั่วโลกอย่างรวดเร็ว การวิเคราะห์ลำดับขั้นเชิงลึกและการตรวจสอบสาเหตุยืนยันว่าเชื้อก่อโรคเป็นประเภทของการระบุชนิดใหม่ไวรัสโคโรน่าที่ได้รับการระบุว่าเป็นไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019 (2019-nCoV) การแพร่กระจายอย่างรวดเร็วของ 2019-nCoV ทำให้เกิดการระบาดของโรคปอดบวมทั่วโลก ทำให้เป็นภัยคุกคามร้ายแรงต่อความมั่นคงด้านสาธารณสุขระหว่างประเทศภายในระยะเวลาอันสั้น[1-3] จากการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ พบว่า จีโนม 2019- nCoV เป็น 88 เปอร์เซ็นต์เหมือนกับโคโรนาไวรัสระบบทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS) ที่เกิดจากค้างคาว 2 ตัว (bat-SL-CoVZC45 และ bat-SL CoVZXC21) 79 เปอร์เซ็นต์เหมือนกับ SARS-CoV และ 50 เปอร์เซ็นต์ เหมือนกับโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจตะวันออกกลาง (MERS-CoV)[4] การวิเคราะห์โครงสร้างโปรตีนพบว่า

2019-nCoV มีโดเมนที่ใช้จับรีเซพเตอร์คล้ายกับของ SARS-CoV ซึ่งจับโดยตรงกับเอ็นไซม์ที่ทำให้เกิด angiotensin-converting II(ACE2) ซึ่งแนะนำอย่างยิ่งว่า 2019-nCoV ใช้ ACE2 เป็นตัวรับของมัน I

อาการที่พบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อ 2019-nCoV คือไข้และไอในผู้ป่วยส่วนใหญ่ โดยมีอาการเจ็บหน้าอก หายใจลำบากแบบรุนแรง หรือกลุ่มอาการหายใจลำบากเฉียบพลัน (ARDS) ในผู้ป่วยรุนแรง เฉียบพลันไตมีรายงานการบาดเจ็บ (AKI) ในผู้ป่วยจำนวนน้อยที่ได้รับการยืนยันการติดเชื้อ nCoV {{0}} ผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการของผู้ป่วย 99 รายที่ติดเชื้อ 2019-nCoV พบว่าผู้ป่วย 3 ราย (3 เปอร์เซ็นต์) มีระดับ creatinine ในซีรัมแตกต่างกัน ในการศึกษาการสังเกตทางคลินิกอื่น ผู้ป่วย 41 ราย (10 เปอร์เซ็นต์) จำนวน 4 ราย (ร้อยละ 10) ชักนำ 2 ใน 13 ราย ( ผู้ป่วยในหอผู้ป่วยหนัก (ICU) ร้อยละ 15 และผู้ป่วยนอก ICU สองรายจาก 28 ราย (ร้อยละ 7) มีระดับ creatinine.i0lA ในซีรัมเพิ่มขึ้น 3.7 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยเสียชีวิตจากไตความล้มเหลวดังแสดงในการวิเคราะห์การเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับ 88 coronavirus 2019 (COVID-19) ที่เกี่ยวข้องกับการเสียชีวิต[iil นอกจากนี้การวิจัยล่าสุดยืนยันว่าผู้ป่วย 27.06 เปอร์เซ็นต์ (23/85) แสดงอาการเฉียบพลันไตความล้มเหลวและเนื้อร้ายท่อเฉียบพลันรุนแรงสังเกตได้จากการย้อมสีฮีมาทอกซิลิน-อีโอซินในผู้ป่วยหกรายหลังการชันสูตรพลิกศพ ตรวจพบแอนติเจน 2019-nCo V ในท่อไตโดยอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) เช่นกัน 12] นอกจากนี้ {{4 }}nCoV ตรวจพบในตัวอย่างปัสสาวะโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์-เอสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณของผู้ป่วยที่ติดเชื้อ 2019-nCoV134Iอย่างไรก็ตาม สาเหตุและวิธีที่ 2019-nCoV กระตุ้น AKI ในปัสสาวะยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด นอกจากนี้ ไม่ว่า 2019 nCoV สามารถส่งผ่านทางเดินปัสสาวะได้หรือไม่ยังคงเป็นคำถามที่ยังไม่ได้คำตอบส่วนใหญ่ เนื่องจาก ACE2 มีบทบาทสำคัญใน 2019-nCoVinfection เราจึงมุ่งที่จะระบุ ACE2-ที่แสดงองค์ประกอบและสัดส่วนของเซลล์ในมนุษย์ปกติไตและกระเพาะปัสสาวะโดยทรานสคริปโทมเซลล์เดียวเพื่อสำรวจเส้นทางการติดเชื้อที่เป็นไปได้ของ 2019-nCoV และบทบาทของ ACE2 ในการติดเชื้อระบบทางเดินเดียว

การจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว (scRNA-Seq) ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการวิจัย 2019-nCoV เนื่องจากมีความสามารถในการกำหนดรูปแบบการแสดงออกของยีนสำหรับเซลล์ทุกประเภทในเนื้อเยื่อต่างๆ อย่างเป็นกลางที่ความละเอียดสูง การแสดงออกของ ACE2 ได้รับการตรวจสอบในเซลล์ถุงลมชนิด 2 ที่รู้จักกันดีในปอด เช่นเดียวกับในเซลล์ท่อน้ำดีของตับ เซลล์เยื่อบุผิวหลอดอาหาร และเซลล์ที่ดูดซึม[15-171เซลล์ในลำไส้เล็กส่วนต้นและลำไส้ใหญ่โดย scRNA-Seq ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงยูทิลิตี้ที่เป็นไปได้ของ scRNA-Seq ในการเปิดโปงชนิดเซลล์เป้าหมายที่เป็นไปได้ของ 2019-nCoV เนื่องจากการติดเชื้อในระบบทางเดินปัสสาวะและผลที่ตามมาอาจมีความสำคัญต่อการดูแลผู้ป่วยในระหว่างและหลังการติดเชื้อ เราจึงใช้ชุดข้อมูลการถอดรหัส scRNA-Seq สองชุดในสุขภาพที่ดีไตและชุดข้อมูลหนึ่งชุดในกระเพาะปัสสาวะที่มีสุขภาพดีเพื่อตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของเซลล์ในระบบทางเดินปัสสาวะ

วิธีการ

การได้มาและการประมวลผลชุดข้อมูลสาธารณะ

เมทริกซ์การแสดงออกของยีนของข้อมูล scRNA-Seq จากค่าปกติไตของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีสามคนถูกดาวน์โหลดจาก Gene Expression Omnibus (GSE131685) เราทำซ้ำการวิเคราะห์ปลายน้ำโดยใช้รหัสที่ผู้เขียนให้ไว้ในบทความต้นฉบับ

เราได้รับข้อมูล scRNA-Seq ของเนื้อเยื่อกระเพาะปัสสาวะที่มีสุขภาพดีของผู้ป่วยมะเร็งกระเพาะปัสสาวะ 3 รายจาก Gene Expression Omnibus (GSE108097) เพื่อให้สอดคล้องกับไตชุดข้อมูลเราใช้ Harmony (วิธี Harmony เป็นอัลกอริทึมสำหรับดำเนินการรวมชุดข้อมูลจีโนมเซลล์เดียวสำหรับการแก้ไขแบทช์และการวิเคราะห์เมตาซึ่งรวดเร็ว ละเอียดอ่อน และแม่นยำ นอกจากนี้ยังสามารถลบอิทธิพลของชุดข้อมูลแหล่งกำเนิด จากการฝัง 1]เพื่อรวมตัวอย่างและดำเนินการวิเคราะห์ปลายน้ำโดยใช้ Seurat (เวอร์ชัน 3.1, Satija Lab, https://satijalab.org/seurat/) การแสดงออกของยีนทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานและปรับขนาดโดยใช้ NormalizeData และ ScaleData (NormalizeData เป็นฟังก์ชัน ของ Seurat ซึ่งสามารถปรับข้อมูลการนับที่มีอยู่ในการทดสอบที่กำหนดให้เป็นมาตรฐานได้ ScaleData เป็นฟังก์ชันของ Seurat ที่สามารถปรับขนาดและจัดศูนย์ยีนในชุดข้อมูลกำหนดช่วงของค่าการแสดงออกในยีนทั้งหมดให้เป็นมาตรฐาน), 2 อันดับสูงสุด0 FindVariableFeautres เลือกยีนตัวแปร 00 ยีนสำหรับการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก การวิเคราะห์คลัสเตอร์โดยใช้ FindClusters ดำเนินการโดยลดเมทริกซ์การแสดงออกของยีนเป็น 20 องค์ประกอบหลักแรก จากนั้นใช้ความละเอียด 0.3 f หรือการจัดกลุ่มตามกราฟ

การประมวลผลตัวอย่างไต

ไตเก็บตัวอย่างที่ไซต์เดียวโดยการตัดชิ้นเนื้อไตของผู้บริจาคที่มีชีวิตหลังการตัดชิ้นเนื้อและก่อนการปลูกถ่ายในผู้รับไตเก็บตัวอย่างที่จุดเดียวโดยการตัดชิ้นเนื้อจากลิ่มและเข็มของผู้บริจาคที่มีชีวิตไตหลังจากถอดออกจากผู้บริจาคและก่อนฝังในผู้รับ ขั้นตอนทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับผู้เข้าร่วมที่เป็นมนุษย์ได้ดำเนินการตามมาตรฐานทางจริยธรรมของคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลเซียงยาแห่งมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์ (IRB หมายเลขอนุมัติ 201711836) และตามปฏิญญาเฮลซิงกิปี 1964 และการแก้ไขเพิ่มเติมในภายหลังหรือมาตรฐานทางจริยธรรมที่เปรียบเทียบกันได้ ตัวอย่างชิ้นเนื้อไตถูกกำจัดด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตปลอดเชื้อ (PBS) หลังจากการได้มา

การแยกตัวของเนื้อเยื่อ

สดไตเนื้อเยื่อถูกถ่ายโอนไปยัง GEXSCOPE ทันที" Tissue Preservation Solution (Singleton Biotechnologies, Nanjing, Jiangsu Province, China) ที่อุณหภูมิ 2 องศาเซลเซียส ถึง 8 องศา ตัวอย่างถูกย่อยในสารละลายการแยกตัวของเนื้อเยื่อ GEXSCOPE 2 มล. (Singleron Biotechnologies) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที ขั้นต่ำในหลอดสำหรับการปั่นแยกแรงเหวี่ยงขนาด 15-มล. ที่มีการกวนอย่างต่อเนื่องหลังจากล้างด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์สสามครั้งแล้วหั่นเป็นชิ้นประมาณ 1 ถึง 2 มม. ต่อจากนั้น เศษเซลล์และสิ่งเจือปนอื่นๆ ถูกกรองโดยตัวกรองที่ปราศจากเชื้อขนาดไมครอน 40-ไมครอน (คอร์นิง, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 300×g และ 4 องศาเป็นเวลา 5 นาที เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน 1 มิลลิลิตรของ PBS (HyClone, Marlborough,MA,USA) เพื่อขจัดเซลล์เม็ดเลือดแดง2มล.LGEXSCOPE Red Blood Cell Lysis Buffer (Singleton Biotechnologies) ถูกเติมลงในสารแขวนลอยของเซลล์และฟักที่อุณหภูมิ 25 องศาเป็นเวลา 10 นาที จากนั้น ของผสมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 500×g เป็นเวลา 5 นาที และเม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS เซลล์ถูกนับด้วยตัวนับเซลล์อัตโนมัติ TC20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)

การเตรียมห้องสมุดและการวิเคราะห์ข้อมูลของ scRNA-Seq สารแขวนลอยเซลล์เดียวอยู่ภายใต้การเตรียมและการจัดลำดับห้องสมุดเซลล์เดียวตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[19] เพื่อให้สอดคล้องกับข้อมูลสาธารณะที่ใช้ข้างต้น เราใช้เวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์ดาวน์สตรีมที่คล้ายกัน[18] เราแก้ไขจำนวนองค์ประกอบหลักเป็น 20 และใช้ความละเอียด 0.6 เพื่อให้ได้ผลลัพธ์การจัดกลุ่มประเภทเซลล์ที่เปรียบเทียบได้กับสาธารณะไตข้อมูล. ประเภทเซลล์ได้รับการอธิบายโดยอิงจากเครื่องหมายบัญญัติในวรรณคดี[18,20] การแสดงออกร่วม การเสริมสมรรถนะทางเดิน และการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน สำหรับแต่ละชุดข้อมูล เราใช้เซลล์ทั้งหมดของเซลล์ที่เลือกและคำนวณยีนที่แสดงออกร่วมกันด้วย ACE2 (สามชุด)

รูปที่ 1: การวิเคราะห์เซลล์เดียวของสาธารณะไตข้อมูลจากผู้บริจาค 3 ราย (A) พล็อต UMAP เปิดเผยคำอธิบายประกอบประเภทเซลล์ของตัวอย่างสามตัวอย่าง (B) องค์ประกอบเซลล์ของตัวอย่างไตที่มีสุขภาพดีสามตัวอย่าง เซลล์ทูบูลที่ใกล้เคียงกันมีสัดส่วน 48.3 เปอร์เซ็นต์, 52.6 เปอร์เซ็นต์ และ 38.5 เปอร์เซ็นต์; เซลล์ PT คิดเป็น 26.3 เปอร์เซ็นต์, 36.9 เปอร์เซ็นต์ และ 43.7 เปอร์เซ็นต์; และเซลล์หลอดตรงส่วนต้นคิดเป็น 7.6 เปอร์เซ็นต์ 2.1 เปอร์เซ็นต์ และ 5.8 เปอร์เซ็นต์ (C) พล็อตจุดแสดงเครื่องหมายบัญญัติที่ใช้สำหรับการจำแนกประเภทเซลล์ abscissa แทนแต่ละประเภทของเซลล์, กำหนดแทนยีนของเครื่องหมาย, สีของจุดในภาพแทนระดับของการแสดงออก และขนาดของจุดแสดงถึงสัดส่วนของการแสดงออกของยีนในเซลล์ (D) รูปแบบการแสดงออกของยีนของ ACE2 ของชนิดเซลล์ทั้งหมดที่ตรวจพบในไต. ประเภทเซลล์จะแสดงในแนวนอน และค่านิพจน์ ACE2 จะแสดงในแนวตั้ง แต่ละจุดแสดงถึงหนึ่งเซลล์ เซลล์ที่แสดง ACE2 ในตัวอย่างไตเป็นส่วนใหญ่คือเซลล์ PT ACE2: เอ็นไซม์แปลง Angiotensin II; PT: ท่อใกล้เคียง; UMAP: การประมาณและการฉายภาพที่หลากหลายสม่ำเสมอ

รูปที่ 2: การวิเคราะห์เซลล์เดียวของตัวอย่างชิ้นเนื้อไตสองตัวอย่าง (A) คำอธิบายประกอบประเภทเซลล์ที่แสดงโดย UMAP ชนิดเซลล์ต่างๆ จะถูกกำหนดรหัสสี และมีการเพิ่มชื่อเซลล์ (B) การแสดงภาพ UMAP เฉพาะตัวอย่างสำหรับสองตัวอย่าง ประเภทเซลล์มีความโดดเด่นด้วยสีที่ต่างกัน (C) แผนที่ความหนาแน่นของเครื่องหมายบัญญัติที่ใช้สำหรับการกำหนดประเภทเซลล์ ประเภทเซลล์จะแสดงในแนวนอน รายการยีนจะแสดงในแนวตั้ง และระดับการแสดงออกจะแสดงด้วยสีในรูป (D) โครงไวโอลินแสดงสัญญาณการแสดงออกของเซลล์ไต ประเภทเซลล์จะแสดงในแนวนอน และค่านิพจน์ ACE2 จะแสดงในแนวตั้ง แต่ละจุดกระจายเป็นตัวแทนของเซลล์เดียว เซลล์ที่แสดง ACE2 ในตัวอย่างไตเป็นส่วนใหญ่คือเซลล์ PT ACE2: เอ็นไซม์แปลง Angiotensin II; PT: ท่อใกล้เคียง; UMAP: การประมาณและการฉายภาพที่หลากหลายสม่ำเสมอ

proximal tubule [PT] เซลล์สำหรับไตและเซลล์ร่มสำหรับกระเพาะปัสสาวะ) ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สันระหว่าง ACE2 และยีนอื่นๆ ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นครั้งแรก จากนั้น ยีนที่มีค่า r มากกว่า 0.1 และค่า P น้อยกว่า 0.01 ถือเป็นยีนที่มีการแสดงออกร่วมกันที่มีนัยสำคัญกับ ACE2 เราลบยีนของไมโตคอนเดรียสำหรับการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของวิถีและปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีน (PPI) ต่อไปนี้ สำหรับชุดข้อมูลไต เราใช้ยีนที่แสดงออกร่วมกันในเซลล์ PT อย่างน้อยสองในสามประเภท, ท่อตรงส่วนปลาย และเซลล์ทูบูลที่ใกล้เคียงกันในแผนภาพเวนน์ ยีนทั้งหมด 126 และ 65 ตัวยังคงอยู่สำหรับชุดข้อมูลไตของภาครัฐและเอกชนตามลำดับ สำหรับชุดข้อมูลกระเพาะปัสสาวะ ชุดสุดท้ายมี 372 ยีน Gene Ontology (GO) และ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) วิเคราะห์การเสริมสมรรถนะทางเดินโดยใช้แพ็คเกจ R ClusterProfiler (เวอร์ชัน 3.8.1, Bioconductor, https:// bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterPro ไฟล์.html). เส้นทางที่มีค่า P_adj น้อยกว่า 0.05 ถูกพิจารณาว่าได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ สำหรับการวิเคราะห์ PPI ยีนสองชุดสุดท้ายจากชุดข้อมูลไตสองชุดถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างรายการยีน 170- การวิเคราะห์ PPI ถูกคาดการณ์โดยอิงจากการโต้ตอบของยีนที่รู้จักกับเงื่อนไข GO ที่เกี่ยวข้องในแพ็คเกจ R STRINGdb (เวอร์ชัน 1.20.0 https://string-db.org/) จากข้อมูลเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของยีนโปรตีนที่ได้รับการควบคุมที่แตกต่างกัน เครือข่าย PPI ถูกส่งออกโดยใช้ซอฟต์แวร์ Cytoscape (เวอร์ชัน 3.4,https://cytoscape.org/)

รูปที่ 3: ชุดข้อมูลเซลล์เดียวในกระเพาะปัสสาวะสาธารณะ (A) การสร้างภาพสองมิติของ Atlas เซลล์กระเพาะปัสสาวะโดย UMAP เซลล์ชนิดต่างๆ จะถูกกำหนดรหัสสี และมีการเพิ่มชื่อเซลล์ (B) รูปแบบการแสดงออกของเครื่องหมายบัญญัติที่ใช้สำหรับระบุประเภทเซลล์กระเพาะปัสสาวะ แกน X แทนแต่ละประเภทของเซลล์ แกน Y แทนยีนของตัวทำเครื่องหมาย สีของจุดในรูปแทนระดับการแสดงออก และขนาดของจุดแสดงถึงสัดส่วนของการแสดงออกของยีนในเซลล์ (C) การแสดงออกของ ACE2 ในกลุ่มย่อย 12 เซลล์ในชุดข้อมูลกระเพาะปัสสาวะ ประเภทเซลล์อยู่บนแกนนอน และค่านิพจน์ ACE2 จะแสดงในแนวตั้ง แต่ละจุดกระจายเป็นตัวแทนของเซลล์เดียว ACE2 แสดงในเซลล์ร่มในตัวอย่างกระเพาะปัสสาวะ

ACE2: เอ็นไซม์แปลง Angiotensin II; UMAP: การประมาณและการฉายภาพที่หลากหลายสม่ำเสมอ

Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต

การวิเคราะห์ทางสถิติ

Marker genes for each cluster were identified with the Wilcox likelihood-ratio test with default parameters via the FindAllMarkers function in Seurat v.3.1.2. Marker genes that are expressed in >10% of the cells in a cluster and average log (fold change) of >เลือก {0}}.25 แล้ว ความสัมพันธ์แบบเพียร์สันใช้ในการวิเคราะห์ยีนที่แสดงออกร่วมกันอย่างมีนัยสำคัญกับ ACE2 และใช้ค่า P ที่น้อยกว่า 0.01 เพื่อระบุยีนที่แสดงออกร่วมกันอย่างมีนัยสำคัญกับ ACE2 สำหรับข้อมูล scRNA-Seq การวิเคราะห์ทางสถิติและตัวเลขเสร็จสิ้นโดย R (เวอร์ชัน 3.5.1, https://www.r-project.org/)

ผลลัพธ์

รูปแบบการแสดงออกของ ACE2 ในไต จากการวิเคราะห์ชุดข้อมูลการถอดรหัสเซลล์เดียวแบบสาธารณะของเซลล์ไตปกติของมนุษย์จากผู้บริจาค 3 ราย เราพบว่าการแสดงออกของ ACE2 ถูกกระจายไปทั่วเซลล์หลายประเภท โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ACE2 ส่วนใหญ่ถูกทำให้สมบูรณ์ในเซลล์ PT ซึ่งรวมถึงทั้งทูบูลแบบซับซ้อนและทูบูลแบบตรง [รูปที่ 1A–1D] ชนิดย่อยของเนฟรอนอื่นๆ เช่น การรวบรวมท่อและท่อส่วนปลาย เช่นเดียวกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน ทั้งหมดแสดงการแสดงออกของยีนที่ต่ำมาก

เพื่อตรวจสอบผลลัพธ์นี้ เราได้วิเคราะห์ตัวอย่างไตปกติเพิ่มเติมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีสองคน เซลล์ 4736 ถูกจำแนกเป็นเซลล์เก้าชนิด ซึ่งซ้อนทับกันอย่างมากกับข้อมูลสาธารณะ ซึ่งรวมถึงชนิดย่อยที่จำเพาะต่อเนฟรอนเจ็ดชนิดที่อิงตามยีนมาร์กเกอร์ตามรูปแบบบัญญัติ [รูปที่ 2A] PT (CUBN, SLC13A3 และ SLC22A8) ถูกจำแนกเป็นทูบูลที่ซับซ้อนใกล้เคียงและทูบูลตรงส่วนต้นตามระดับการแสดงออกของเครื่องหมายที่ต่างกัน[18,20] รวบรวมเซลล์หลักในท่อดักไอ (AQP2), รวบรวมเซลล์ที่สอดแทรกในท่อ (ATP6V0D2) และเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อมไต (KRT8 และ KRT18) ถูกใส่คำอธิบายประกอบไว้ด้วย และผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ก่อนหน้านี้ นอกจากนี้เรายังระบุกลุ่มของการวนซ้ำของเซลล์ Henle (UMOD, SLC12A1 และ CLDN16) ซึ่งไม่มีในชุดข้อมูลสาธารณะ นอกจากนี้ พบสโตรมาและเซลล์ภูมิคุ้มกันที่ประกอบด้วยเซลล์บุผนังหลอดเลือดจำนวนเล็กน้อย (CD34 และ PECAM1) และโมโนไซต์ (CD14, FCN1 และ VCAN) [รูปที่ 2B] ยีนเครื่องหมายที่เป็นตัวแทนสำหรับประชากรย่อยทั้งหมดถูกพล็อตในรูปที่ 2C

ตามที่สังเกตในชุดข้อมูลสาธารณะ เราสังเกตการแสดงออกของ ACE2 ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ PT ทั้งหมดเมื่อเทียบกับเซลล์ประเภทอื่นๆ [รูปที่ 2D] ในเชิงปริมาณ การแสดงออกของ ACE2 ยังได้รับการยืนยันใน 12.05 เปอร์เซ็นต์ , 6.79 เปอร์เซ็นต์ และ 10.20 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ของ proximal convoluted tubule, PT และ proximal straight tubule ตามลำดับในตัวอย่างไตปกติที่มีสุขภาพดีสองตัวอย่างของเรา การวิเคราะห์ IHC ก่อนหน้านี้[21] ระบุการกระจายเชิงพื้นที่ที่ซับซ้อนของการแสดงออกของโปรตีน ACE2 ที่เข้มข้นในขอบแปรงของ PTs

รูปแบบการแสดงออกของ ACE2 ในกระเพาะปัสสาวะ

จากชุดข้อมูลกระเพาะปัสสาวะสาธารณะ 12 ประเภท [ภาพที่ 3A และ 3B] เราพบว่าการแสดงออกของ ACE2 ต่ำในเซลล์เยื่อบุผิวทุกประเภท ความเข้มข้นของ ACE2 ดูเหมือนจะมีแนวโน้มลดลงจากชั้นนอกของเยื่อบุผิวกระเพาะปัสสาวะ (เซลล์ร่ม) ไปจนถึงชั้นใน (เซลล์ฐาน) ที่มีเซลล์กลางอยู่ระหว่าง เซลล์ประเภทอื่นๆ เช่น endothelial และเซลล์ภูมิคุ้มกัน ส่วนใหญ่เป็นค่าลบสำหรับ ACE2 [ภาพที่ 3C] เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ร่มในกระเพาะปัสสาวะที่แสดง ACE2 (1.3 เปอร์เซ็นต์) ต่ำกว่าในเยื่อบุผิวของไต การวิเคราะห์ผู้ป่วยโรคซาร์สครั้งก่อนระบุว่าไวรัสซาร์ส (SARS-CoV) สามารถอยู่รอดได้ในปัสสาวะในระดับที่ตรวจพบได้[22,23] การตรวจหา SARS-CoV ในปัสสาวะบ่งบอกถึงความเป็นไปได้ที่ไวรัสจะปล่อยออกจากเซลล์เยื่อบุผิวกระเพาะปัสสาวะที่ติดเชื้อ ซึ่งสอดคล้องกับการวิเคราะห์ของเราข้างต้น

การวิเคราะห์หน้าที่ของยีนที่แสดงออกร่วมกับ ACE2

ในชุดข้อมูลไตทั้งสองชุด เราพบยีนจำนวนมากที่แสดงร่วมกับ ACE2 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์หลอดตรงส่วนต้น [ภาพที่ 4A และ 4D] ยีนที่แสดงออกร่วมกันถูกทำให้สมบูรณ์ในส่วนประกอบของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรน (CC) [รูปที่ 4B และ 4E] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เส้นขอบพู่กันและเยื่อหุ้มขอบของแปรงเป็นคำศัพท์ CC ที่เสริมคุณค่าอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับตำแหน่งเซลล์ของ ACE2 ที่ตรวจพบโดยการวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีได้ดี เงื่อนไข KEGG ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะนั้นรวมถึงฟังก์ชันปกติของ ACE2 เช่น ระบบ renin-angiotensin, PT

รูปที่ 4: การวิเคราะห์หน้าที่ของยีนที่เกี่ยวข้องกับ ACE ในไต (A, D) แผนภาพเวนน์ของยีนการแสดงออกร่วม ACE2 จากเซลล์ PT สามเซลล์ในที่สาธารณะไตdataset (Data 1) and the private kidney dataset (Data 2). (B, E) Analysis of ACE2 co-expression genes in each cell (expression related to >2 ประเภทเซลล์) สำหรับการเพิ่มคำศัพท์ GO CC ใน Data 1 และ Data 2 แกน X แทนค่า P ที่แปลงบันทึก (C, F) การวิเคราะห์ยีนการแสดงออกร่วม ACE2 สำหรับการเสริมสมรรถนะระยะ KEGG ในข้อมูลที่ 1 และข้อมูลที่ 2 คำที่เป็นสีแดงคือเส้นทางทั่วไประหว่างชุดข้อมูล ACE2: เอ็นไซม์แปลง Angiotensin II; CC: ส่วนประกอบเซลลูล่าร์; ไป: ยีน Ontology; KEGG: สารานุกรมเกียวโตของยีนและจีโนม; PT: ท่อใกล้เคียง

รูปที่ 5: การวิเคราะห์หน้าที่ของยีนที่เกี่ยวข้องกับ ACE2-ในกระเพาะปัสสาวะ (A) การวิเคราะห์ยีนการแสดงออกร่วม ACE2 ในเซลล์ร่มของกระเพาะปัสสาวะเพื่อการเสริมสมรรถนะระยะ GO CC แกน X แทนค่า Pvalue ที่แปลงบันทึก (B) การวิเคราะห์ยีนการแสดงออกร่วม ACE2 ในเซลล์ร่มของกระเพาะปัสสาวะเพื่อการเสริมสมรรถนะระยะ KEGG (C, D) เครือข่าย PPI แสดงความสัมพันธ์ระหว่าง ACE2 กับยีนที่เกี่ยวข้องในไตและกระเพาะปัสสาวะ ขนาดของโหนด (ยีน) แสดงถึงจำนวนพันธมิตรที่มีปฏิสัมพันธ์ (เพื่อนบ้าน) ความกว้างของเส้นและสี (แคบถึงกว้างที่สัมพันธ์กับสีน้ำเงินถึงสีแดง) เป็นสัดส่วนกับความชัดเจนของการโต้ตอบในฐานข้อมูล STRING ACE2: เอ็นไซม์แปลง Angiotensin II; CC: ส่วนประกอบเซลลูล่าร์; ไป: ยีน Ontology;

KEGG: สารานุกรมเกียวโตของยีนและจีโนม; PPI: ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีน

การฟื้นฟูไบคาร์บอเนต การดูดซึมแร่ธาตุ และวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมที่หลากหลาย [รูปที่ 4C และ 4F] ผลการศึกษายืนยันว่า ACE2 และยีนที่เกี่ยวข้องมีความจำเป็นต่อการรักษาการทำงานของไต สำหรับชุดข้อมูลของกระเพาะปัสสาวะ ผลการเสริมสมรรถนะ CC และ KEGG โดยทั่วไปจะสอดคล้องกับของไต ซึ่งเกี่ยวข้องกับโปรตีนเมมเบรนและการทำงานของไต เช่น การดูดซึมและเมแทบอลิซึม [รูปที่ 5A และ 5B] เราทำการวิเคราะห์ PPI สำหรับ ACE2 และยีนที่แสดงออกร่วมกันในทั้งสองไตและกระเพาะปัสสาวะ ดังแสดงในรูปที่ 5C และ 5D โปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์เหล่านี้เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดโรคของ PT และการติดเชื้อในเซลล์ในร่มหรือไม่นั้นไม่ชัดเจนและจำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม การสนทนา AKI ใน2019-การติดเชื้อ nCoV และ SARS-CoV COVID-19 เป็นโรคติดเชื้อชนิดใหม่ที่มีความเร็วการแพร่เชื้อที่น่าเกรงขาม แม้ว่าผู้ป่วยส่วนใหญ่เหล่านี้จะแสดงอาการเกี่ยวกับระบบทางเดินหายใจ แต่ก็มีรายงานอาการต่างๆ ที่ไม่เกี่ยวกับระบบทางเดินหายใจเช่นกัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอวัยวะอื่นๆ ได้รับผลกระทบในระหว่างที่เป็นโรค ในการวิเคราะห์ลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วยที่ติดเชื้อ 2019- nCoV ความเสียหายของการทำงานของไตได้รับการยืนยันแล้ว [9,10] และต่อเนื่องไตจำเป็นต้องมีการรักษาทดแทนในประมาณร้อยละ 9 ของผู้ป่วยที่ติดเชื้อทั้งหมด 99 ราย[9] Gabarre et al[25] ทบทวน AKI อย่างเป็นระบบในผู้ป่วยวิกฤตที่ติดเชื้อโควิด-19 นอกจากนี้ ยังพบอาการบาดเจ็บที่ไตและการทำงานของไตผิดปกติอีกด้วยไวรัสโคโรน่าเกี่ยวข้องกับการติดเชื้อทางเดินหายใจ โดยเฉพาะ 2 betaไวรัสโคโรน่า(SARS-CoV และ MERS-CoV)[26] ซึ่งมีพันธุกรรมคล้ายกับ 2019-nCoV[4,8] การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าผู้ป่วยโรคซาร์ส 36 ราย (6.7 เปอร์เซ็นต์) 536 รายพัฒนา AKI และ 33 ราย ของผู้ป่วยทั้งหมด 36 ราย (ร้อยละ 91.7) ที่มีความผิดปกติของไตเสียชีวิต [27] ที่สำคัญ ชิ้นส่วน SARS-CoV ตรวจพบโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสในตัวอย่างปัสสาวะของผู้ป่วยบางราย นอกจากนี้ ยังพบการติดเชื้อ SARS-CoV และการจำลองแบบอย่างต่อเนื่องในไตโดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์เยื่อบุผิวท่อในหลอดทดลอง [29] บ่งชี้ว่าความเสียหายของไตในผู้ป่วยโรคซาร์สอาจเกิดจากการติดเชื้อไวรัสโดยตรงในเซลล์เป้าหมาย ยกเว้นการกระตุ้นอื่นๆ เช่น การตอบสนองภูมิคุ้มกันของโฮสต์ โรคปอดบวมอย่างรุนแรง และ ARDS แม้ว่ากลไกการก่อโรคจะคล้ายกันมากกับ SARS-CoV แต่กลไกโดยละเอียดของการมีส่วนร่วมของไตของ 2019-nCoV ยังคงไม่ชัดเจน

Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต

การวิเคราะห์การแสดงออกของ ACE2 ในระบบทางเดินปัสสาวะ

สาเหตุของ AKI ในโรคซาร์สดูเหมือนจะมีหลายปัจจัยและยังไม่แน่ใจ ซึ่งคิดว่ามีความสัมพันธ์บางอย่างกับการแสดงออกของ ACE2 ในไตในระดับสูง [29,30] scRNA-seq ซึ่งเป็นแนวทางใหม่ที่ใช้กันมากขึ้นใน สาขาวิชาชีววิทยาและการแพทย์ สามารถวิเคราะห์ประเภทเซลล์และยีนการแสดงออกในระดับเซลล์ได้ จากการวิเคราะห์เซลล์เดียวของเราทั้งแบบปกติไต(ทั้งสาธารณะและข้อมูลของเรา) และกระเพาะปัสสาวะ เราพบระดับ ACE2 ที่ตรวจพบได้ทั้งในไตและกระเพาะปัสสาวะ คล้ายกับข้อมูลของเรา เติ้งและเพื่อนร่วมงาน[31] วิเคราะห์ต่อสาธารณะไตข้อมูลและแนะนำว่าไตมีความเสี่ยงสูงของไวรัสโคโรน่าการติดเชื้อ. นอกจากนี้ ในข้อมูลของเรา เราพบว่าเซลล์ PT มีเปอร์เซ็นต์การแสดงออกที่สูงกว่าเซลล์เยื่อบุผิวของกระเพาะปัสสาวะ ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าไตไวต่อการติดเชื้อ nCoV มากกว่าในกระเพาะปัสสาวะ เมื่อเทียบกับระดับการแสดงออกของ ACE2 ในระบบย่อยอาหาร [15] การแสดงออกที่ต่ำกว่าของ ACE2 ในระบบทางเดินปัสสาวะอาจแนะนำผู้ป่วยที่มีอาการเกี่ยวกับไตน้อยลง ซึ่งสัมพันธ์ในทางบวกกับการสังเกตของผู้ป่วยโรคซาร์ส การแสดงออกร่วมและการวิเคราะห์เส้นทางเผยให้เห็นหน้าที่ที่สำคัญของ ACE2 ในระบบทางเดินปัสสาวะ ซึ่งอาจอธิบายความผิดปกติของไตที่เกิดจากไวรัส ACE2- ที่มีผลผูกพัน นอกจากนี้ การแสดงออกของ ACE2 ในเซลล์ภายนอก (เซลล์ PT ในท่อไตและเซลล์ร่มในเยื่อบุผิวกระเพาะปัสสาวะ) อาจเป็นสาเหตุหนึ่งที่ทำให้มีไวรัสในปัสสาวะ

ความสำคัญของการศึกษา

AKI ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นตัวทำนายอัตราการเสียชีวิตสูงในผู้ป่วยโรคซาร์ส[27] อาจนำไปสู่ความยากลำบากในการรักษา สภาพที่แย่ลง และแม้กระทั่งเป็นตัวบ่งชี้การพยากรณ์โรคเชิงลบสำหรับการอยู่รอดของผู้ป่วย 2019-nCoV ที่ติดเชื้อ . การศึกษานี้ให้หลักฐานโดยตรงถึงความเป็นไปได้ในการติดเชื้อของเซลล์เยื่อบุผิวไตที่มี 2019-nCoV ซึ่งเรียกร้องให้ผู้ป่วยโรค AKI ให้ความสนใจมากขึ้น-19 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงที่มีการระบาดอย่างกว้างขวางและการแพร่ระบาดของโรคทั่วโลกยังคงแย่ลง . นอกจากนี้ การกระจายของ ACE2 ในระบบทางเดินปัสสาวะและการตรวจหาเชื้อ [32] ในตัวอย่างปัสสาวะบ่งชี้ถึงความจำเป็นของการทดสอบไวรัสในตัวอย่างปัสสาวะของผู้ป่วยโควิด-19 ซึ่งอาจลดความเสี่ยงของการแพร่เชื้อได้ในระดับหนึ่ง ผลลัพธ์ของเรายังต้องดูในแง่ของข้อจำกัด อันดับแรก เราวิเคราะห์การแสดงออกของ ACE2 เฉพาะในกลุ่มตัวอย่างที่มีสุขภาพดี และการขาดตัวอย่างจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อโควิด-19เป็นข้อจำกัดหลัก นอกจากนี้ เรายังไม่ได้รวมกลุ่มตรวจสอบเพื่อยืนยันผลการวิจัยของเรา จำเป็นต้องมีหลักฐานโดยตรงเพิ่มเติมจากการทดลองในหลอดทดลองและตัวอย่างผู้ป่วย

ทุนสนับสนุน งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากโครงการคณะกรรมการสุขภาพของมณฑลหูหนาน (หมายเลข C2019184) และมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 81800641)

ความขัดแย้งทางผลประโยชน์ ไม่มี