ความก้าวหน้าในการวิจัยและการประยุกต์ใช้แอนติบอดี้โปรตีนฟลูออเรสเซนต์: การทบทวนที่เน้นไปที่นาโนบอดี

เชิงนามธรรม: นับตั้งแต่การค้นพบโปรตีนเรืองแสง (FPs) สเปกตรัมเรืองแสงที่อุดมสมบูรณ์และคุณสมบัติโฟโตเคมีของพวกมันได้ส่งเสริมการประยุกต์ใช้การวิจัยทางชีววิทยาอย่างกว้างขวาง FP สามารถจำแนกได้เป็นโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และอนุพันธ์ของมัน, โปรตีนเรืองแสงสีแดง (RFP) และอนุพันธ์ของมัน และ FP ใกล้อินฟราเรด ด้วยการพัฒนาอย่างต่อเนื่องของ FP แอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP ได้เกิดขึ้น แอนติบอดีซึ่งเป็นประเภทของอิมมูโนโกลบูลินเป็นองค์ประกอบหลักของภูมิคุ้มกันของร่างกายที่จดจำและจับแอนติเจนได้อย่างชัดเจน โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีต้นกำเนิดจากเซลล์บีเซลล์เดียวถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจอิมมูโนแอสเสย์ การวินิจฉัยภายนอกร่างกาย และการพัฒนายา นาโนบอดีเป็นแอนติบอดีชนิดใหม่ทั้งหมดประกอบด้วยโดเมนที่แปรผันได้ของแอนติบอดีสายหนัก เมื่อเปรียบเทียบกับแอนติบอดีทั่วไป นาโนบอดีที่มีขนาดเล็กและเสถียรเหล่านี้สามารถแสดงออกและทำงานในเซลล์ที่มีชีวิตได้ นอกจากนี้ยังสามารถเข้าถึงร่อง ตะเข็บ หรือเอพิโทปแอนติเจนที่ซ่อนอยู่บนพื้นผิวของชิ้นงานได้อย่างง่ายดาย การทบทวนนี้ให้ภาพรวมของ FP ต่างๆ ความคืบหน้าการวิจัยของแอนติบอดี โดยเฉพาะนาโนบอดี และการใช้งานขั้นสูงของนาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP การทบทวนนี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับนาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP ซึ่งทำให้ FP มีคุณค่ามากขึ้นในการวิจัยทางชีววิทยา

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ: โปรตีนเรืองแสง; โมโนโคลนอลแอนติบอดี; นาโนบอดี้; ความก้าวหน้าของการวิจัย แอปพลิเคชัน

1. บทนำ

โปรตีนเรืองแสง (FP) เป็นโปรตีนเครื่องมือที่ใช้กันมากที่สุดในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ หลังจากการใช้ FP เพิ่มมากขึ้น แอนติบอดีของ FP ก็ได้รับการพัฒนาเช่นกัน เมื่อเปรียบเทียบกับแอนติบอดีแบบดั้งเดิม (รูปที่ 1A) แอนติบอดีสายหนัก (HCAb) จากคาเมลิด (รูปที่ 1B) และรีเซพเตอร์แอนติเจนใหม่ของอิมมูโนโกลบุลิน (IgNAR) จากฉลาม (รูปที่ 1C) ขาดสายเบาโดยธรรมชาติ แอนติบอดีแบบโดเมนเดียว (sdAb) คือแอนติบอดีที่ประกอบด้วยโดเมนแปรผันของ HCAb หรือ IgNAR ทั้งหมด น้ำหนักโมเลกุลของมันคือ 12–15 kDa ซึ่งมีขนาดประมาณ 1/10 ของโมโนโคลนอลแอนติบอดี ดังนั้นจึงเรียกอีกอย่างว่านาโนบอดี้ นักวิจัยทางวิทยาศาสตร์ได้นำนาโนบอดีซึ่งมีขนาดเล็กกว่า มีความเสถียรสูงต่อกรดและความร้อน มีความสามารถในการแทรกซึมที่แข็งแกร่ง ความง่ายในการทำพันธุวิศวกรรมและการแสดงออก และความสัมพันธ์สูง สามารถเข้าถึงร่อง ตะเข็บ หรือเอพิโทปแอนติเจนที่ซ่อนอยู่บนพื้นผิวของเป้าหมายได้อย่างง่ายดาย โดยจดจำแอนติเจนจำนวนมากที่แอนติบอดีทั่วไปไม่สามารถจดจำได้ [1] ด้วยเหตุนี้ นาโนบอดีจึงถูกนำมาใช้เป็นชีวโมเลกุลในสิ่งมีชีวิตและระบบเพาะเลี้ยงเซลล์ในชีววิทยาพัฒนาการ ตัวนำที่เป็นผลึกสำหรับสถานะโครงสร้างในชีววิทยาที่เสถียร สารควบคุมหรือตัวยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ สารรีเอเจนต์อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมี และแอนติบอดีทุติยภูมิในอิมมูโนบล็อกติงและอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ [2 –6]. นาโนบอดีที่จับ FP โดยเฉพาะนั้นถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการแปลตำแหน่งเซลล์ย่อย การศึกษาวิถีการส่งสัญญาณภายในเซลล์ การสร้างภาพเซลล์ที่มีชีวิต และวัสดุนาโนเป้าหมาย [7–9] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง นาโนบอดีมีข้อได้เปรียบเหนือแอนติบอดี IgG แบบดั้งเดิมในการถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูงเป็นพิเศษ

รูปที่ 1 แผนภาพโครงสร้างของ IgG (A), Camelid HCAb (B) และ Shark IgNAR (C) VH, บริเวณแปรผันของสายหนัก; VL, บริเวณแปรผันของสายเบา; CH/C, บริเวณคงที่ของสายโซ่หนัก; CL คือบริเวณคงที่ของสายโซ่เบา VHH, โดเมนที่แปรผันได้ของ HCAb; VNAR โดเมนตัวแปรของ IgNAR

2. ภาพรวมของโปรตีนเรืองแสง

2.1. การค้นพบโปรตีนเรืองแสง

การเรืองแสงเป็นปรากฏการณ์ทั่วไปในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเล Coelenterates รวมถึงแมงกะพรุน ไฮดรา และปะการัง ปล่อยแสงเรืองแสงสีเขียวภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต (UV) หรือแสงสีน้ำเงิน ในขณะที่ ctenophores ปล่อยแสงเรืองแสงสีน้ำเงิน โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ถูกระบุครั้งแรกใน Aequorea victoria โดย Shimomura และคณะ ในปีพ.ศ. 2505 [10] จากนั้นจึงทำการโคลนและแสดงออกในปี พ.ศ. 2528 [11] คุณสมบัติที่เป็นเอกลักษณ์และโครงสร้างที่มั่นคงของ GFP แบบไวด์ (wtGFP) จึงดึงดูดนักวิจัยจำนวนมากให้ศึกษาเรื่องนี้ ตั้งแต่นั้นมา จากความรู้ที่มีอยู่และโครงสร้างผลึก Tisen และเพื่อนร่วมงานของเขาได้สร้างโปรตีน GFP ต่างๆ ที่มีคุณสมบัติเรืองแสงที่แตกต่างกันโดยการกลายพันธุ์ และอธิบายกลไกการเรืองแสงของ GFP [12] อย่างละเอียด เกี่ยวกับการวิจัยที่เกี่ยวข้องกับ GFP นักวิทยาศาสตร์สามคน (Shimomura, Chalfie และ Tsien) ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีประจำปี 2008 จากการค้นพบ GFP และผลงานที่โดดเด่นในการประยุกต์ GFP

โปรตีนเรืองแสงสีแดงของบรรพบุรุษ (RFP) คือ DsRed ถูกโคลนจากปะการังที่ไม่เรืองแสงในปี 1999 [13] RFP สามารถใช้ร่วมกับ GFP เพื่อแก้ไขปัญหาทางวิทยาศาสตร์ที่ GFP เพียงอย่างเดียวไม่สามารถแก้ไขได้ สิ่งสำคัญที่สุดคือ เนื่องจาก RFP มีพื้นหลังต่ำในการถ่ายภาพภายในเซลล์ จึงเหมาะสำหรับการประยุกต์ใช้ในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพมากกว่า [14,15] ด้วยความพยายามของนักวิทยาศาสตร์หลายคน สเปกตรัมเรืองแสงของ FP ได้รับการรายงานให้ครอบคลุมบริเวณที่มองเห็นได้ทั้งหมดและแม้แต่บริเวณที่มีอินฟราเรดใกล้ ทำให้มีเครื่องมือมากมายสำหรับการแสดงภาพและการหาปริมาณโปรตีนในเซลล์ที่มีชีวิต รูปที่ 2 สรุปการพัฒนา FP

รูปที่ 2 การพัฒนาโปรตีนเรืองแสง GFP โปรตีนเรืองแสงสีเขียว BFP โปรตีนเรืองแสงสีน้ำเงิน EGFP โปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่ได้รับการปรับปรุง YFP โปรตีนเรืองแสงสีเหลือง RFP โปรตีนเรืองแสงสีแดง VHH, โดเมนที่แปรผันได้ของสายหนัก; VNAR ตัวรับแอนติเจนใหม่ที่แปรผัน เครื่องหมายสีเขียวอ่อนบ่งบอกถึงความก้าวหน้าของการวิจัยเกี่ยวกับการใช้ GFP และเครื่องหมายสีเหลืองสีเขียวบ่งบอกถึงความก้าวหน้าของการวิจัยเกี่ยวกับแอนติบอดี GFP

2.2. โครงสร้างและคุณสมบัติเชิงหน้าที่ของ GFP

GFP เป็น FP ที่เป็นกรดที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ เป็นรูปทรงกลม และละลายได้ โครงสร้างปฐมภูมิของ GFP ประกอบด้วยโมโนเมอร์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 238 ตัวที่ตกค้าง โดยมีน้ำหนักโมเลกุล 27–30 kDa โครงสร้างผลึกของมันแสดงจุดศูนย์กลางที่เกิดจากสายโซ่ต้านขนาน 11 เส้น ทำให้เกิดเป็นโครงสร้างทรงกระบอกที่อัดแน่น ศูนย์กลางของลำกล้องได้รับการปกป้องโดยกลุ่มเปล่งแสงของ 4-(p-hydroxybenzylidene)-5-อิมิดาโซลิโนนที่เชื่อมต่อกับ -เกลียวของมัน โดยมีปลายทั้งสองข้างปิดผนึกด้วยส่วนของเกลียวสั้น [17,18] การเจริญเต็มที่ของโครโมฟอร์ไม่จำเป็นต้องมีโคแฟกเตอร์อื่นนอกจาก O2 [19] GFP ดูดซับแสงสีน้ำเงินหรือแสง UV และปล่อยแสงเรืองแสงสีเขียว โดยมีจุดสูงสุดของการกระตุ้นหลักที่ 395 นาโนเมตร จุดสูงสุดของการกระตุ้นต่ำสุดที่ 475 นาโนเมตร และจุดสูงสุดของการปล่อยแสงที่ 509 นาโนเมตร GFP มีความเสถียรอย่างยิ่งและสามารถทนต่อการบำบัดที่อุณหภูมิสูงได้อย่างง่ายดาย การตรึงฟอร์มาลดีไฮด์หรือการฝังพาราฟินไม่ส่งผลต่อคุณลักษณะการเรืองแสง จากการตรวจสอบเชิงลึกเกี่ยวกับโครงสร้างและกระบวนการเจริญเติบโตของ FPs นักวิจัยจำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ได้ออกแบบโครงสร้างของ FPs ใหม่เพื่อให้มีฟังก์ชันและคุณสมบัติใหม่ๆ ส่งเสริมการพัฒนาและการประยุกต์ใช้เพิ่มเติม

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

2.3. อนุพันธ์จีเอฟพี

ปัจจัยจำกัดในการใช้งาน GFP ได้แก่ pH ความไวของคลอไรด์ไอออน และความเสถียรต่อแสงต่ำ การปรับเปลี่ยน GFP แบบกำหนดเป้าหมายจะแก้ไขข้อบกพร่องเหล่านี้ โดยเพิ่มผลผลิตควอนตัม ความสว่าง ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของฟันกราม และความเสถียรทางแสง นอกจากนี้ ยังมีการสร้างอนุพันธ์ GFP หลายชนิดเพื่อขยายช่วงของสีที่ปล่อยออกมา รวมถึงสีน้ำเงิน อุลตรามารีน สีฟ้า และสีเหลือง

เพื่อตอบสนองต่อความเข้มของการเรืองแสงต่ำของ wtGFP ภายใต้การกระตุ้นด้วยแสงสีน้ำเงินและการแสดงออกที่ไม่เสถียรในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม Zhang และคณะ ออกแบบการทดแทนกรดอะมิโนของ GFP (F64L และ S65T) กล่าวคือ GFP ที่ได้รับการปรับปรุง (EGFP) ซึ่งมีความเข้มของการเรืองแสงเพิ่มขึ้น 35- เท่า [20] EGFP ยังคงเป็น FP กลายพันธุ์ที่ใช้บ่อยที่สุดในภูมิภาคแสงสีเขียว เนื่องจากมีความคงตัวของแสงที่ดีและมีความสว่างสูง นอกจากนี้ คุณสมบัติการพับของ GFP ยังได้รับการปรับให้เหมาะสม โดยได้รับ Super Folder GFP (sfGFP) ที่มีความสามารถในการพับแบบพิเศษ sfGFP มีการกลายพันธุ์ใหม่หกแบบ รวมถึง S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V และ A206V sfGFP สามารถพับได้อย่างมีประสิทธิภาพแม้ว่าจะแสดงออกในรูปแบบฟิวชั่นกับโปรตีนที่ไม่ละลายน้ำ ทำให้มั่นใจได้ถึงความสว่างของการเรืองแสง [21] GFPuv ซึ่งเป็น GFP รูปแบบอื่นที่ได้รับการดัดแปลง ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการเรืองแสงภายใต้แสง UV มันสร้างแสงเรืองแสงสีเขียวที่สว่างขึ้นเมื่อมีแสง UV โดยมีจุดสูงสุดของการกระตุ้นที่ 395 นาโนเมตรและการปล่อยสูงสุดที่ 509 นาโนเมตร และสามารถใช้เพื่อระบุตำแหน่งของโปรตีนในเซลล์ต่างๆ [22,23] การทดแทนกรดอะมิโนสามรายการเกิดขึ้นใน GFPuv รวมถึง F99S, M153T และ V163A การกลายพันธุ์เหล่านี้ทำให้เกิดการแสดงออกของ GFPuv ที่แข็งแกร่ง 18- เท่ามากกว่า wtGFP ใน E. coli ยีน GFPuv เป็นยีนสังเคราะห์ที่รหัส Arg ความถี่ต่ำห้าตัวถูกแทนที่ด้วยรหัสที่เหมาะสมสำหรับ E. coli เพื่อให้แน่ใจว่า GFPuv จะแสดงออกอย่างมีประสิทธิภาพ

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

การกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ของ Y66H สร้างโปรตีนฟลูออเรสเซนต์สีน้ำเงิน (BFP) โดยมียอดการกระตุ้นที่ 384 นาโนเมตร และยอดการปล่อยที่ ~ 445 นาโนเมตร สเปกตรัมการกระตุ้นของมันอยู่ใกล้กับแสงยูวี ซึ่งทำลายเซลล์ระหว่างการทำงาน และความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมาสั้นจะกระตุ้นให้เกิดแสงออโตฟลูออเรสเซนต์ในเซลล์ Enhanced BFP (EBFP) มีแสงเรืองแสงน้อยและทนทานต่อการฟอกสีด้วยแสงและกรดได้ไม่ดี โดยมีสัญญาณพื้นหลังสูงสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ มีการพัฒนาสายพันธุ์กลายพันธุ์ EBFP ที่สว่างกว่าสามชนิด ได้แก่ Azurite [24], EBFP2 [25] และ mTagBFP [26] ซึ่งได้แก่ 1.6-, 2.0- และ 3.{{13} } สว่างกว่า EBFP ตามลำดับ mTagBFP ซึ่งเป็น BFP ที่สว่างที่สุดได้มาจากการกลายพันธุ์ของโปรตีนเรืองแสงสีแดง (RFP) TagRFP [27] โดยมีค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ 52,000 M−1 cm−1 และผลผลิตควอนตัมที่ {{19 }}.63 ซึ่งปรับปรุงความต้านทานต่อการฟอกด้วยแสงได้อย่างมาก การกลายพันธุ์ของ Y66F ใน wtGFP ส่งผลให้เกิดโปรตีนเรืองแสงอัลตรามารีนที่มีความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมา 442 นาโนเมตร [28] อย่างไรก็ตาม ผลผลิตควอนตัมเรืองแสงต่ำของตัวแปร GFP-Y66F จำกัดความสามารถในการนำไปใช้ในการถ่ายภาพอย่างรุนแรง การกลายพันธุ์เพิ่มเติมของ GFP-Y66F ด้วยการทดแทนกรดอะมิโนของ T65Q, Y145G, H148S และ T203V ส่งผลให้เกิดโปรตีนเรืองแสงอัลตรามารีน Sirius ซึ่งสว่างกว่า GFP-Y66F ถึง 25 เท่า [29]

โปรตีนฟลูออเรสเซนต์สีฟ้า (CFP) มีจุดสูงสุดในการกระตุ้นที่ 449 นาโนเมตรและมีการปล่อยรังสีสูงสุดที่ ~ 482 นาโนเมตร โดยมีคุณสมบัติทางสเปกตรัมอยู่ระหว่าง BFP และ EGFP ในทำนองเดียวกันกับ BFP การกลายพันธุ์ที่ควบคุมไซต์ของ Y66W ใช้เพื่อสร้าง CFP CFP มีการใช้งานอย่างกว้างขวางในการวิจัยการสร้างภาพหลายสีและการแปลเฉพาะจุด เนื่องจากมีความเสถียรทางแสงที่โดดเด่น ตัวอย่างเช่น การเข้ารหัสยีน CFP ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการกำหนดลักษณะโคดอนของมนุษย์ และขณะนี้มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ภายใต้ชื่อทางการค้า AmCyan1 (Clontech) นอกจากนี้ ยังมีการกลายพันธุ์ที่สว่างกว่า CFP (ECFP) ที่ปรับปรุงแล้วหลายตัว เช่น Cerulean, mTFP (สว่างเป็นสองเท่าของ Cerulean) และเทอร์ควอยซ์ (สว่างเป็นสองเท่าของ ECFP) [21,30]

การกลายพันธุ์ในโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (YFP) ไม่ได้ถูกจำกัดในมาตรฐานหลักของโครโมฟอร์ Y66 แต่ในสิ่งตกค้างที่มีโครงสร้างติดกับ Y66 จุดสูงสุดของการกระตุ้นของ YFP คือ ~518 นาโนเมตร โดยมีการปล่อยก๊าซสูงสุดที่ ~531 นาโนเมตร เมื่อเปรียบเทียบกับ GFP การเรืองแสงของ YFP จะเลื่อนไปทางสเปกตรัมสีแดง ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการแทนที่ Thr ด้วย Tyr ที่ตำแหน่ง 203 YFP ที่ปรับปรุงแล้ว (EYFP) เป็นหนึ่งในไบโอเซนเซอร์ FP ที่เรืองแสงและใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในการตรวจจับ pH ในเซลล์และ ความเข้มข้นของคลอไรด์ไอออน อย่างไรก็ตาม มีความไวต่อไอออนของกรดและคลอไรด์มาก และมีความเสถียรต่อแสงน้อยกว่า FP ที่ได้จากแมงกะพรุนจำนวนมาก [31] mCitrine และ mVenus ซึ่งเป็นเวอร์ชันปรับปรุงของ EYFP เป็น YFP ที่ใช้มากที่สุดในปัจจุบัน [32,33] คุณสมบัติทางแสงทางกายภาพของ GFP และอนุพันธ์ของมันถูกสรุปไว้ในตารางที่ 1

ตารางที่ 1. คุณสมบัติทางแสงของ GFP, RFP และอนุพันธ์ของพวกมัน

ตารางที่ 1. ต่อ

2.4. อนุพันธ์ RFP

RFP เป็นอีกหนึ่ง FP ที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย DsRed เป็น tetramer ที่มีแนวโน้มที่จะสร้างมัลติเมอร์เมื่อทำการหลอมโปรตีน และอาจเป็นพิษได้เมื่อแสดงออกภายในเซลล์ ดังนั้นจึงได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมเพื่อให้ได้โมโนเมอร์ RFP ที่โดดเด่นที่สุดคือกลุ่ม "mFruit" ซึ่งรวมถึง mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine และ mStrawberry (ตารางที่ 1) โดยที่ mCherry ซึ่งมีการกลายพันธุ์ของ K163Q และ K83L เป็นที่ต้องการมากที่สุด mCherry มีการสุกเร็ว มีคุณสมบัติโมโนเมอร์ที่ดี และมีความเสถียรต่อแสงดีกว่า แม้ว่าจะมีความสว่างน้อยกว่าก็ตาม [34] อย่างไรก็ตาม TagRFP ในรูปแบบโมโนเมอร์มีความสว่างมากกว่า mCherry ประมาณสามถึงสี่เท่า ทำให้เป็น RFP โมโนเมอร์ที่ค่อนข้างสว่างซึ่งมีอยู่ในปัจจุบัน [27] mKate เป็นโปรตีนเรืองแสงสีแดงไกลโมโนเมอร์ชนิดใหม่ที่ได้มาจากการกลายพันธุ์ของ TagRFP สี่ตำแหน่งโดยมีจุดสูงสุดในการกระตุ้นที่ 588 นาโนเมตรและการปล่อยสูงสุดที่ 635 นาโนเมตร ซึ่งสว่างเพียง 45% เท่า EGFP; โปรตีนไดเมอไรเซชันของมันคือ Katushka มีความสว่างถึง 67% เท่ากับ EGFP [35] mKate2 ซึ่งเป็นพันธุ์กลายของ mKate ที่มีการแทนที่กรดอะมิโนของ V38A, S165A และ K238R มีความสว่างประมาณสองเท่าของ mKate [36] เมื่อเปรียบเทียบกับ GFP และ RFP แล้ว mKate และ Katushka แสดงความลึกของการถ่ายภาพที่ดีกว่าและสัญญาณแสงที่สมบูรณ์ยิ่งขึ้นสำหรับการถ่ายภาพเรืองแสงภายในวัตถุ [35] ดังนั้นการพัฒนาโปรตีนฟลูออเรสเซนต์สีแดงฟาร์เรดจึงมีคุณค่ามากกว่าสำหรับการสร้างภาพทางชีวภาพ ในร่างกาย

2.5. FPs ใกล้อินฟราเรด

FPs ใกล้อินฟราเรด (NIR) เป็นที่ต้องการอย่างมากในฐานะแท็กโปรตีนในแอปพลิเคชันการถ่ายภาพ NIR FP ส่วนใหญ่ได้รับการออกแบบจากเซลล์รับแสงจากแบคทีเรีย (BphP) [37] NIR FP ตัวแรกที่ใช้ในการถ่ายภาพสัตว์ที่มีชีวิตคือ IFP1.4 ซึ่งเป็นโปรตีนเรืองแสงที่ได้มาจาก BphP ที่เรืองแสงโดยการจับกับโครโมฟอร์บิลิเวอร์ดิน (BV) [38] โดยการสับเปลี่ยน DNA และการกลายพันธุ์แบบสุ่ม IFP2.0 ที่สว่างยิ่งขึ้นจึงได้รับการพัฒนา [39] แม้ว่าโมโนเมอร์ IFP1.4 และ IFP2.0 สามารถทำได้โดยการแยกส่วนต่อประสานไดเมอไรเซชันของ BphP พวกมันยังคงมีแนวโน้มที่จะลดไดเมอร์ที่ความเข้มข้นสูง mIFP โปรตีนเรืองแสงอินฟราเรดโมโนเมอร์ตามธรรมชาติ (IFP) ได้รับการออกแบบในปี 2558 [40] mIFP ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีผลกระทบในการสร้างภาพเสียงในตัวอ่อนและเซลล์ประสาทของดรอสโซฟิล่า ชเชอร์บาโควา และคณะ ออกแบบ NIR FP แบบโมโนเมอร์ที่สว่างสามตัวพร้อมสเปกตรัมที่แตกต่างกัน ได้แก่ miRFP670, miRFP703 และ miRFP709 [41] NIR FP ที่ได้รับจาก BphP ต้องการอย่างน้อยสองโดเมน ได้แก่ PAS (Per-ARNT-Sim) และ GAF (cGMP phosphodiesterase-adenylate cyclase-FhlA) เพื่อติดโควาเลนต์โครโมฟอร์ BV และยังมีโครงสร้าง "ปมรูปแปดในแปด" ที่ซับซ้อน ทอพอโลยีเชื่อมโยงโดเมน GAF และ PAS ซึ่งส่งผลต่อการพับ ดังนั้น จึงมีการใช้เซลล์รับแสงจากแบคทีเรียอีกประเภทหนึ่งคือ อัลโลไฟโคไซยานิน (APC) เพื่อสร้าง NIR FP เช่น smURFP [42] แม้ว่า NIR FP ที่ใช้ APC จะมีขนาดเล็กกว่า แต่ก็จับ BV ได้อย่างมีประสิทธิภาพน้อยกว่า ส่งผลให้ความสว่างในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมลดลงอย่างมีนัยสำคัญมากกว่า NIR FP ที่ได้มาจาก BphP เพื่อเอาชนะข้อบกพร่องของ NIR FP ที่ใช้ BphP และ APC นั้น NIR FP โดเมนเดียวชื่อ miRFP670nano ได้รับการพัฒนาจากไซยาโนแบคทีเรียโครม (CBCR) ซึ่งเป็นตัวแทนของ NIR FP ที่ได้มาจาก CBCR ตัวแรกที่สามารถจับโครโมโซม BV ภายนอกได้อย่างมีประสิทธิภาพ และเปล่งแสงเรืองแสงที่สดใสใน เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [43] ข้อได้เปรียบที่สำคัญของ miRFP670nano เหนือ NIR FP ที่ได้มาจาก BphP คือความเสถียรทางแสงสูง miRFP670nano3 ที่ปรับปรุงแล้วซึ่งมีการกลายพันธุ์ 14 แบบสัมพันธ์กับ miRFP670nano ของผู้ปกครอง มีความเสถียรต่อแสงคล้ายกับ miRFP670nano [44] ตารางที่ 2 สรุปคุณสมบัติทางแสงของ NIR FP

ตารางที่ 2. คุณสมบัติทางแสงของ NIR FP

การค้นพบและการประยุกต์ใช้ FPs ได้มอบเครื่องมือวิจัยที่มีประสิทธิภาพสำหรับชีววิทยาสมัยใหม่ ปัจจุบัน FP ได้กลายเป็นหนึ่งในเครื่องมือทั่วไปที่นักวิทยาศาสตร์ใช้เพื่อขยายการใช้งานไปยังสาขาการวิจัยต่างๆ เช่น การควบคุมการแสดงออกของยีน การติดฉลากออร์แกเนลล์ การส่งสัญญาณ การคัดกรองยา และปฏิสัมพันธ์ทางชีวโมเลกุล เวกเตอร์การโคลนนิ่งส่วนใหญ่ที่แสดง FP ได้รับการจำหน่ายในเชิงพาณิชย์และมีจำหน่ายผ่านทางบริษัทการค้า

3. ความก้าวหน้าการวิจัยเกี่ยวกับแอนติบอดีโปรตีนเรืองแสง

3.1. โมโนโคลนอลแอนติบอดีมุ่งเป้าไปที่โปรตีนเรืองแสง

แอนติบอดีเป็นอิมมูโนโกลบูลินชนิดหนึ่งที่หลั่งโดยบีลิมโฟไซต์ โมโนโคลนอลแอนติบอดีประกอบด้วยสายหนักสองสายและสายเบาสองเส้น โดยมีสายหนักประกอบด้วยหนึ่งบริเวณที่แปรผันได้ (VH) และบริเวณคงที่สามแห่ง (CH) และสายเบาประกอบด้วยหนึ่งบริเวณที่แปรผันได้ (VL) และหนึ่งบริเวณคงที่ (CL ). สายหนักถูกเชื่อมโยงแบบโควาเลนต์โดยพันธะไดซัลไฟด์ และบริเวณ CL ของสายเบาถูกเชื่อมโยงแบบไม่ใช่โควาเลนต์กับโดเมน CH1 ของสายหนักเพื่อสร้างโมเลกุลแอนติบอดีที่เสถียร [45] เนื่องจากความสามารถในการจับรีเซพเตอร์จำเพาะของพวกมัน โมโนโคลนอลแอนติบอดีผลิตกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลาย เช่น การปิดกั้นแบบคลาสสิก การทำให้เป็นกลาง การกระตุ้นคอมพลีเมนต์ การฆ่าเซลล์เป้าหมายผ่านรีเซพเตอร์ Fc และการควบคุมการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน พวกมันเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ทางชีววิทยาที่สำคัญซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจอิมมูโนแอสเสย์ การวินิจฉัยภายนอกร่างกาย และการพัฒนายา โพลีโคลนอลแอนติบอดีเป็นส่วนผสมของแอนติบอดีเฮเทอโรไทปิกที่ได้มาจากกระบวนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของบีเซลล์หลายเซลล์ และแอนติบอดีแต่ละตัวจะจดจำเอพิโทปที่แตกต่างกันของแอนติเจนเดียวกัน [45] เมื่อเปรียบเทียบกับโพลีโคลนอลแอนติบอดี โมโนโคลนอลแอนติบอดีตรวจจับอีพิโทปบนแอนติเจนโดยเฉพาะ และมีโอกาสน้อยที่จะทำปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนอื่นๆ ดังนั้นจึงสร้างสัญญาณการย้อมสีพื้นหลังต่ำ นอกจากนี้ ความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์ที่เกี่ยวข้องกับโมโนโคลนอล แอนติบอดีนั้นสูงกว่าของโพลีโคลนอล แอนติบอดีภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้2-เทคนิคขั้นตอนที่ตรงไปตรงมาโดยใช้ mAb FMU-GFP5-ควบคู่กับเรซิน Sepharose 4B นอกจากนี้ โปรตีนเป้าหมายรีคอมบิแนนท์เชิงฟังก์ชันทั้งหมดที่ควบคู่กับ GFP สามารถแยกออกจากเซลล์ได้อย่างง่ายดายและโดยตรง เนื่องจาก GFP อีพิโทป ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าวิธีนี้มีประสิทธิภาพในการทำให้ GFP บริสุทธิ์มากกว่าวิธีการใดๆ ที่มีอยู่ และแก้ปัญหาผลผลิตที่ต่ำและปัญหาด้านความบริสุทธิ์ในวิธีการทำให้บริสุทธิ์ GFP ส่วนใหญ่

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

3.2. นาโนบอดีมุ่งเป้าไปที่โปรตีนเรืองแสง

3.2.1. การแนะนำนาโนบอดี้

คุณสมบัติโดยธรรมชาติของโมโนโคลนอลแอนติบอดี เช่น น้ำหนักโมเลกุลขนาดใหญ่ โครงสร้างที่ซับซ้อน และกิจกรรมทางชีวภาพที่จำกัด ได้จำกัดการใช้งานเพิ่มเติมมากขึ้น ดังนั้นจึงเป็นเรื่องเร่งด่วนที่จะต้องพัฒนาทางเลือกอื่นแทนโมโนโคลนอลแอนติบอดี ในปี 1989 วอร์ดและคณะ เตรียมโดเมนที่แปรผันได้ของแอนติบอดีสายโซ่หนักเท่านั้นที่มีความสามารถในการจับกับไลโซไซม์ต่ำ ทำให้เกิดความสนใจในการวิจัย sdAb ที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว [48] ในปี 1993 Hamers Casterman และคณะ ค้นพบแอนติบอดีชนิดใหม่ในซีรั่มอูฐเป็นครั้งแรก ซึ่งแตกต่างจากแอนติบอดีของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแบบเดิมอย่างสิ้นเชิง [49] แอนติบอดีประเภทนี้มีชื่อว่า HCAb เนื่องจากขาดสายโซ่เบาตามธรรมชาติ HCAb ประกอบด้วย CH2, CH3, บริเวณส่วนพับ และโดเมนที่แปรผันได้ของ HCAb (VHH) แต่ยังคงมีความสามารถในการจับแอนติเจนเต็มรูปแบบ ในปี 1995 กรีนเบิร์ก และคณะ ค้นพบแอนติบอดีชนิดสายโซ่หนักเท่านั้นที่เรียกว่า IgNAR ในฉลามพยาบาล [50] มันมีอยู่ทั้งในรูปแบบสารคัดหลั่งและที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์ และประกอบด้วยบริเวณที่แปรผันได้ ชื่อตัวรับแอนติเจนใหม่ที่แปรผันได้ (VNAR) และบริเวณคงที่หลายแห่ง ต่อมา IgNAR ถูกพบในฉลามวอบบีกอง ปลาสุนัขหนาม ฉลามฮอร์น และฉลามไผ่จุดขาว ซึ่งเป็นส่วนเสริมของละคร sdAbs นาโนบอดีมีคุณลักษณะของน้ำหนักโมเลกุลขนาดเล็ก ความสัมพันธ์สูง ความเสถียรสูง ละลายได้ดี การซึมผ่านของเนื้อเยื่อที่แข็งแกร่ง และการรับรู้เอพิโทปของแอนติเจนที่ซ่อนอยู่ ได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นในการวินิจฉัยโรค สารรีเอเจนต์ภูมิคุ้มกัน การตรวจหาเชื้อโรค และการพัฒนายา [51] ด้วยการพัฒนาเทคนิคอณูชีววิทยาและการปรับปรุงเทคโนโลยีการเตรียมแอนติบอดีที่ดัดแปลงพันธุกรรม นาโนบอดีจึงกลายเป็นสาขาการวิจัยยอดนิยมในการตรวจอิมมูโนแอสเสย์ รูปที่ 3 สรุปการพัฒนาของนาโนบอดี้จนถึงปัจจุบัน

รูปที่ 3 การพัฒนานาโนบอดี้ เครื่องหมายสีฟ้าอ่อนบ่งบอกถึงความก้าวหน้าของการวิจัยยานาโนบอดี้ อย. สำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา; EMA, สำนักงานยาแห่งยุโรป; NMPA การบริหารผลิตภัณฑ์ทางการแพทย์แห่งชาติ; HCAb, แอนติบอดีสายหนัก; IgNAR, Ig ตัวรับแอนติเจนใหม่; sdAb, แอนติบอดีแบบโดเมนเดียว; VHH, โดเมนที่แปรผันได้ของ HCAb; VNAR โดเมนตัวแปรของ IgNAR; PD-L1, การตายของเซลล์ที่ถูกโปรแกรมไว้ 1 ลิแกนด์ 1

3.2.2. นาโนบอดีมุ่งเป้าไปที่โปรตีนเรืองแสง

โปรตีนเรืองแสงได้เปลี่ยนแปลงชีววิทยาของเซลล์และชีวเคมีโดยนำเสนอเครื่องหมายโปรตีนเรืองแสงที่เข้ารหัสด้วยยีนที่ใช้งานง่าย สารยึดเกาะแน่นหลายชนิดสำหรับการวิจัยและเป้าหมายยาได้รับการพัฒนาผ่านการสังเคราะห์และการคัดเลือกไลบรารีโครงสร้างโปรตีนในระหว่างการพัฒนาแบบขนาน [52] ตัวอย่างคือการพัฒนานาโนบอดี ซึ่งง่ายต่อการเลือกพร้อมความเสถียร การละลาย และผลผลิตที่ดีขึ้น [53] ต่างจากแอนติบอดีแบบดั้งเดิม นาโนบอดีที่มีขนาดเล็กและเสถียรเหล่านี้ทำงานในเซลล์ที่มีชีวิต ดังนั้นนาโนบอดีที่มีฤทธิ์จับกับ FP โดยเฉพาะจึงเป็นเครื่องมือที่มีศักยภาพสำหรับการหลอมรวม การแยก และวิศวกรรมเซลล์ของ FP ในการวิจัยทางชีววิทยาในด้านต่างๆ

• นาโนบอดีที่ได้มาจาก Camelidae ซึ่งมุ่งเป้าไปที่ GFP

โปรตีนหลายชนิดที่มีลักษณะเฉพาะตำแหน่งเซลล์ย่อยที่ยอดเยี่ยมได้ถูกหลอมรวมกับ GFP ทำให้เกิดแอนติเจนที่มองเห็นได้เพื่อตรวจจับโปรตีนโดยตรงในช่องย่อยเซลล์ต่างๆ ในปี 2549 Rothbauer และคณะ คัดกรองชิ้นส่วนแอนติบอดีจำเพาะ GFP (cAbGFP4) โดยการสร้างภูมิคุ้มกันให้อัลปาก้าด้วย GFP [54] การสอบวิเคราะห์เซอร์เฟสพลาสมอนเรโซแนนซ์ (SPR) ของอันตรกิริยาระหว่าง cAbGFP4 และแอนติเจน GFP แสดงสัมพรรคภาพสูง (KD=0.23 นาโนโมลาร์) นอกจากนี้ นาโนบอดีต้าน GFP ยังถูกรวมเข้ากับโมโนเมอร์ RFP ทำให้เกิดแอนติบอดีที่จับกับ GFP ที่มองเห็นได้ซึ่งใช้เพื่อตรวจสอบการกระจายตัวของนาโนบอดีต้าน GFP ในเซลล์ที่มีชีวิต โดยการกรองเจล อิมมูโนลอตติง และการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล พบว่านาโนบอดีที่จำเพาะต่อ GFP ได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีการกระจายอย่างเสถียรในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยไม่มีการย่อยสลายหรือการรวมตัวของโปรตีนที่ตรวจพบได้ซึ่งมักพบในชิ้นส่วนที่แปรผันของสายโซ่เดี่ยว นอกจากนี้ Kubala และคณะ กำหนดลักษณะของ GFP:cAbGFP4 เชิงซ้อน (รูปที่ 4A) โดยเอ็กซ์เรย์คริสตัลโลกราฟฟีและการวัดความร้อนด้วยการไตเตรทแบบไอโซเทอร์มอล (ITC) [55] ซึ่งเผยให้เห็นพื้นฐานสำหรับความสัมพันธ์และความจำเพาะสูงของนาโนบอดีในการจับกับโปรตีน ในปี 2020 นาโนบอดีต่อต้าน GFP สี่ชนิดที่เรียกว่า A12, B9, D5 และ E6 ได้รับการระบุโดยใช้ฟาจดิสเพลย์ [56] การตรวจ PAGE แบบเนทีฟและการตรวจภูมิคุ้มกันพบว่านาโนบอดีเหล่านี้สามารถจับ GFP ในหลอดทดลอง และ ในร่างกายได้

รูปที่ 4 แผนภาพของ GFP – nanobody complex (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, สีส้ม); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, สีฟ้าอ่อน); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, สีชมพู); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, สีเหลือง); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, สีม่วงแดง) (F) การซ้อนทับโครงสร้างของนาโนบอดีด้านบนด้วย GFP คอมเพล็กซ์ GFP แสดงเป็นสีเขียว

โครงสร้างโปรตีนมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการทำงาน และมักถูกควบคุมโดยปัจจัยด้านกฎระเบียบ แอ็กเซลและคณะ ระบุสารยึดเกาะเฉพาะ GFP เจ็ดตัว ได้แก่ โปรตีนที่จับกับ GFP (GBP) 1–7 [57] ในหมู่พวกเขา GBP1 เพิ่มการเรืองแสง GFP ขึ้น 10- เท่า ในขณะที่ GBP4 เหนี่ยวนำให้ 5- เท่าในการเรืองแสง GFP ลดลง ด้วยเหตุนี้สิ่งเหล่านี้จึงถูกเรียกว่า "ตัวเพิ่มประสิทธิภาพ" และ "ตัวย่อ" ตามลำดับ การวิเคราะห์โครงสร้างของ GFP-nanobody complex (รูปที่ 4B, C) เปิดเผยว่านาโนบอดีทั้งสองทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ขัดแย้งกันเล็กน้อยในสภาพแวดล้อมของโครโมฟอร์ โดยเปลี่ยนลักษณะการดูดซับของมัน [58] นอกจากนี้ นาโนบอดี (LaG) ที่จำเพาะต่อ GFP 25 ตัวถูกระบุ โดยมีค่า KD อยู่ในช่วงตั้งแต่ 0.5 นาโนโมลาร์ จนถึงมากกว่า 20 ไมโครโมลาร์ [59] นาโนบอดีแบบไบวาเลนต์ (LaG-16-LaG-2) แสดงสัมพรรคภาพสูงสุดโดยมีค่า KD เท่ากับ 36 พิโคโมลาร์ ยิ่งไปกว่านั้น ความเข้มของการเรืองแสงสูงสุดของ GFP เพิ่มขึ้นประมาณ 60% เมื่อบ่มด้วยโปรตีน LaG ส่วนเกิน จางและคณะ รายงานโครงสร้างผลึกของ GFPuv ที่ซับซ้อนด้วย LaG16 (รูปที่ 4D) ที่ความละเอียด 1.67 Å [60] ตำแหน่งการจับของ LaG16 บน GFP - บาร์เรลตั้งอยู่ที่อีกด้านหนึ่งของเอนแฮนเซอร์ GFP ดังนั้น ตัวเพิ่ม LaG16 และ GFP จึงถูกหลอมรวมกับตัวเชื่อมโยง (GS)4 นาโนบอดีชนิดไบวาเลนต์มีสัมพรรคภาพ 0.5 นาโนโมลาร์ ซึ่งแสดงให้เห็นความเป็นไปได้ของการออกแบบตัวจับโปรตีนเป้าหมายที่มีสัมพรรคภาพสูงเป็นพิเศษโดยไดเมอไรเซชันของนาโนบอดี 2 ตัวซึ่งจับกับอีพิโทปที่ต่างกัน

ในปี 2014 Twair และคณะ เตรียม sfGFP และสร้างภูมิคุ้มกันให้กับอูฐหนึ่งหนอกที่โตเต็มวัย นาโนบอดีต้าน sfGFP เจ็ดตัวที่มีเป้าหมายสามเอพิโทป (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 และ 08) ถูกแยกออก [61] จากการตรวจ ELISA และการทดสอบการซับภูมิคุ้มกัน นาโนบอดีเหล่านี้จดจำ sfGFP ที่มีป้ายกำกับว่าอิสระหรือผสมกับฮอร์โมนการเจริญเติบโต นอกจากนี้ โครงสร้างผลึกของ nanobody NbsfGFP02 ที่ซับซ้อนด้วย sfGFP (รูปที่ 4E) ถูกสร้างขึ้นที่ความละเอียด 2.2 Å ความสัมพันธ์ระหว่าง NbsfGFP02 และ sfGFP ถูกกำหนดให้เป็น 15.8 นาโนโมลาร์โดย biolayer interferometry (BLI) อุณหภูมิหลอมเหลวอยู่ที่ 75.6 องศาสำหรับ NbsfGFP02 [62]; ดังนั้นจึงเป็นตัวเลือกนาโนบอดี้ GFP ในอนาคตในการใช้งานที่ต้องการสภาวะการทดสอบที่รุนแรง นาโนบอดีส่วนใหญ่สามารถแสดงออกตามหน้าที่ในร่างกาย ผ่านการถ่ายพลาสมิดเข้าไปในเซลล์ยูคาริโอต ดังนั้นนาโนบอดีจึงเป็นเครื่องมือที่ดีเยี่ยมในการระบุลักษณะทางโครงสร้างหรือไดนามิกในเซลล์ที่มีชีวิต ในปี 2020 โจวและคณะ เสนอวิธีการใหม่ในการแสดงนาโนบอดีที่จับกับ GFP (cAbGFP4) ที่สร้างขึ้นเช่นเดียวกับ mRNA ในหลอดทดลอง (IVT) เรียกว่า nanobody-mCherry [63] mRNA ที่มีบริเวณที่ไม่ถูกแปลความหมายและสารอะนาล็อกแบบฝากลับที่ต่อยอดด้วยนิวคลีโอไทด์ดัดแปลงทางเคมีและส่วนท้ายของโพลี (A) ถูกเตรียม ในหลอดทดลอง และใช้สำหรับทรานส์เฟกชัน ตรงกันข้ามกับนาโนบอดีที่แสดงโดยใช้พลาสมิด DNA นาโนบอดีต่อต้าน GFP ที่แสดงโดยใช้ IVT mRNA ถูกระบุภายใน 3 ชั่วโมงของการทรานส์เฟกชันและสลายตัวภายใน 48 ชั่วโมง ดังนั้น การแสดง mRNA ที่เข้ารหัสของนาโนบอดีในเซลล์ที่มีชีวิตทำให้สามารถส่งนาโนบอดีได้อย่างมีประสิทธิภาพ

• นาโนบอดีที่ได้มาจากปลาฉลามซึ่งมีเป้าหมายไปที่ GFP

เหว่ยและคณะ แสดงให้เห็นว่าฉลามไม้ไผ่สร้างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพต่อการสร้างภูมิคุ้มกัน GFP โดยมีลักษณะเฉพาะคือจำนวนเม็ดเลือดขาวที่เพิ่มขึ้นและ IgNAR ที่จำเพาะต่อแอนติเจน [64] โดยรวมแล้ว นาโนบอดีที่ต้าน GFP 7 ตัว รวมถึง BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 และ 105 ที่มีสัมพรรคภาพสูงถึง 0.3 นาโนโมลาร์ ถูกแยกออกจากฉลามไม้ไผ่ที่ได้รับภูมิคุ้มกัน ซึ่งหมายความว่าฉลามไม้ไผ่ ผลิต IgNAR ที่มีความสัมพันธ์สูง นอกจากนี้ VNAR แบบสองพาราโทปิกที่มีสัมพรรคภาพสูงสุดกับ GFP (20.7 พิโคโมลาร์) ได้ถูกสร้างขึ้น และลักษณะของนาโนบอดีที่ต้าน GFP ในฐานะภายในร่างกายได้รับการตรวจสอบความถูกต้องในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การค้นพบนี้จะช่วยเร่งการวิจัยและความก้าวหน้าของ Bamboo Shark sdAbs เพื่อผลิตนาโนบอดีที่มีต้นทุนต่ำและใช้งานง่ายสำหรับอุตสาหกรรมชีวการแพทย์

• นาโนบอดีมุ่งเป้าไปที่โปรตีนเรืองแสงอื่นๆ

มาซาบิเป็นโปรตีนเรืองแสงสีเขียวโมโนเมอร์ที่สดใส หลี่และคณะ ประสบความสำเร็จในการสร้างคลังแอนติบอดีของทรานส์ฟอร์แมนต์ 4 × 107 ตัวโดยการสร้างภูมิคุ้มกันให้อูฐด้วย mWasabi เป็นแอนติเจน และคัดกรองนาโนบอดีที่จำเพาะต่อ mWasabi ที่มีความสัมพันธ์สูง 3 ตัว ที่เรียกว่า Nb4, Nb6 และ Nb27 [65] นาโนบอดีเหล่านี้รู้จักวาซาบิเพียงอย่างเดียวหรือเมื่อรวมกับโปรแกรมความตาย 1 (PD{10}}) โดยรวมแล้ว มีการระบุนาโนบอดี (LaM) 6 ตัวที่กำหนดเป้าหมาย mCherry ด้วยความจำเพาะสูง โดยมีค่า KD อยู่ในช่วงตั้งแต่ 0.18 นาโนโมลาร์ถึง 63 นาโนโมลาร์ [59] นอกจากนี้ นาโนบอดีเฉพาะของ iRFP{16}} สามตัว (BSR1, BSR3 และ BSR4) ที่มีความชอบจับกันของนาโนโมลาร์ถูกแยกออก [64] ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับฉลามไม้ไผ่สามารถผลิตนาโนบอดีที่มีความสัมพันธ์สูงได้ โดยรวมแล้ว ความสามารถของนาโนบอดีในการจับโปรตีนของเซลล์และดึงดูดโปรตีนฟิวชัน FP ช่วยให้สามารถควบคุมกระบวนการและโครงสร้างของเซลล์ในเซลล์ที่มีชีวิตได้อย่างแม่นยำ ตัวดัก FP-นาโนแบบมัลติฟังก์ชั่นนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ชีวเคมี และเชิงฟังก์ชันด้วยการผสมผสานโปรตีนชนิดเดียวกันที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัว นาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP สรุปไว้ในตารางที่ 3

ตารางที่ 3. สรุปของนาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP

4. การใช้ฟลูออเรสเซนต์โปรตีนนาโนบอดี้

4.1. การประยุกต์ในการตรวจหาโปรตีน

4.1.1. การตรวจหาโปรตีนในเซลล์

การทำความเข้าใจฟังก์ชันของโปรตีนจำเป็นต้องมีการแปลโปรตีนที่มีความละเอียดสูงที่เชื่อถือได้และเชิงปริมาณได้ แม้ว่าการใช้แอนติบอดีเพื่อติดฉลากโปรตีนเป้าหมายได้รับการยอมรับอย่างดีในอณูชีววิทยา แต่เทคนิคนี้ก็ยังถูกจำกัดด้วยขนาดและความหลากหลายของแอนติบอดีทั่วไป เนื่องจากนาโนบอดีมีขนาดเล็ก จึงสามารถใช้เป็นตัวติดตามสำหรับการถ่ายภาพภายในเซลล์หลังจากการผูกมัดด้วยโมเลกุลเรืองแสง เอนไซม์ เปปไทด์ ตัวรับ ไบโอติน และยาอื่นๆ ตัวอย่างเช่น nanobodies เทียบกับ FP ถูกนำมาใช้ในการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีความละเอียดสูงเมื่อติดแท็กด้วยสีย้อมอินทรีย์ [66,67] เซลล์ Ptk2 ที่แสดง tubulin YFP อย่างต่อเนื่องถูกถ่ายภาพโดยใช้วิธีนี้ และความละเอียดได้รับการปรับปรุงเป็น 269 ± 37 Å ซึ่งต่างจากประมาณ 450 Å ด้วยแอนติบอดีทั่วไป

การติดฉลากที่ใช้สื่อกลางนาโนนำเสนอวิธีการที่รวดเร็วและหลากหลายในการติดฉลากโครงสร้างฟิวชันที่ได้มาจาก FP ที่สามารถเข้าถึงได้โดยทั่วไปเกือบทั้งหมดสำหรับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์โมเลกุลเดี่ยว (SMLM) ที่ซับซ้อน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง SMLM แบบสองสีสามารถตรวจสอบการแปลตำแหน่งเซลล์ย่อยของโครงสร้างฟิวชั่น GFP และ RFP ที่ทำงานได้ เมื่อใช้นาโนบอดีกับ GFP และ RFP พร้อมกัน [68] ดังนั้นปัญหาทางชีวภาพจำนวนมากสามารถแก้ไขได้ทันทีโดยใช้การถ่ายภาพ SMLM สองสี อาริโอตติ และคณะ เสนอแนวทางแบบแยกส่วนสำหรับการติดฉลากโปรตีนที่ใช้เอนไซม์ ซึ่งช่วยให้เพิ่มความเร็วและการสุ่มตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์การกระจายตัวของโปรตีนใต้เซลล์จนถึงความละเอียด EM [7] ด้วยการออกแบบ GBP4 โดยตรงกับแท็กถั่วเหลือง ascorbate peroxidase (APEX) ที่ได้รับการดัดแปลง แสดงให้เห็นว่า APEX สามารถนำไปยังโปรตีนที่มีฉลาก GFP ที่สนใจได้โดยตรง ฟิวชั่น APEX-GBP4 ให้การแปลโปรตีนที่มีความละเอียดสูงที่โดดเด่นไปยังโดเมนย่อยของออร์แกเนลล์ และลดระยะเวลาในการกำหนดลักษณะการกระจายโปรตีนของเซลล์ย่อยลงอย่างมาก นอกจากนี้ยังอนุญาตให้มีความละเอียด EM ของโปรตีนที่ติดฉลาก GFP ซึ่งแสดงออกในระดับภายนอก

กล่องเครื่องมือของพลาสมิดที่เข้ารหัสนาโนบอดีเฉพาะของ FP ถูกสร้างขึ้นและหลอมรวมเข้ากับโมดูลการทำงาน กล่องเครื่องมือนี้ช่วยให้มองเห็นและจัดการเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์ในเซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งขยายการใช้งานในสิ่งมีชีวิตได้อย่างมีนัยสำคัญ [9] สิ่งเหล่านี้รวมถึงเซ็นเซอร์ฟลูออเรสเซนต์สำหรับการแสดงภาพไดนามิกของ Ca2+, H+ และ ATP/ADP และโมดูลโอลิโกเมอริกหรือเฮเทอโรไดเมอริกที่ช่วยให้การสรรหาหรือการแยกโปรตีนและการจดจำตำแหน่งสัมผัสของเมมเบรนระหว่างออร์แกเนลล์ ในปี 2560 Herce และคณะ ใช้เปปไทด์ที่เจาะเซลล์ (CPP) เพื่อขนส่งแอนติบอดีเข้าสู่เซลล์โดยตรงสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันและการจัดการแอนติเจน [69] ระบบที่ใช้ประโยชน์จากความสัมพันธ์สูงของ CPP ที่อุดมด้วยอาร์จินีนแบบไซคลิกต่อ RNA ในนิวเคลียสถูกสร้างขึ้น ด้วยการเชื่อมโยง CPP ที่อุดมด้วยอาร์จินีนแบบไซคลิกกับ GFP nanobody ทำให้สามารถสังเกตตำแหน่งของ GFP ในนิวเคลียสได้โดยตรงในเซลล์ (รูปที่ 5A) ดังนั้น ระบบที่มองเห็นภาพนี้จึงสามารถใช้เพื่อติดตามตำแหน่งของโปรตีนและเปรียบเทียบประสิทธิภาพของ CPP ต่างๆ ในเชิงปริมาณ

เทคนิคการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพ เนื่องจากช่วยให้สามารถตรวจจับโมเลกุลการส่งสัญญาณแบบเรียลไทม์แบบไดนามิกภายใต้สภาพทางสรีรวิทยาในเซลล์ที่มีชีวิต เนื่องจากมีความละเอียดอ่อนและความจำเพาะเป็นพิเศษ การวิเคราะห์ด้วยการถ่ายโอนพลังงานด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง Förster (TR-FRET) แบบแก้ไขเวลาจึงกำลังได้รับความนิยมมากขึ้นในการวิจัยทางชีวการแพทย์ วิธี TR-FRET ที่ใช้นาโนบอดีช่วยให้สามารถหาปริมาณโปรตีนฟลูออเรสเซนต์ (ฟิวชัน) ในไลซีนที่มีความไวสูงกว่าการอ่านค่าความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ทั่วไปได้อย่างง่ายดาย [70]

รูปที่ 5 การใช้นาโนบอดี้โปรตีนเรืองแสง ( A ) การแสดงภาพปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนและโปรตีน Anti-GFP nanobody (Nb) จับกับเปปไทด์ที่เจาะเซลล์ (CPP) สามารถเจาะนิวเคลียสของเซลล์ได้ หากโปรตีนที่ติดแท็ก GFP ไม่โต้ตอบกับโปรตีนที่ติดแท็ก RFP มีเพียงโปรตีนที่ติดแท็ก GFP เท่านั้นที่จะแปลตำแหน่งใหม่เป็นนิวเคลียสผ่าน Nb-CPP โดยแสดงสีเขียว อย่างไรก็ตาม หากโปรตีนทั้งสองมีปฏิสัมพันธ์กัน โปรตีนทั้งสองจะจัดตำแหน่งใหม่เป็นนิวเคลียส โดยจะแสดงเป็นสีเหลือง (B) GFP nanobody ช่วยให้สามารถเลือกการติดฉลากโปรตีนตุ่มที่ถูกเอ็กโซไซโตสใหม่ได้ ขั้นตอนที่ 1: โปรตีนตุ่มถูกจับคู่กับ GFP และบ่มด้วยนาโนบอดีที่ไม่เรืองแสง (NbGFP) ส่งผลให้ GFP เข้าไม่ถึงด้วยนาโนบอดีที่จับกับฟลูออเรสเซนซ์ (NbGFP*) ขั้นตอนที่ 2 และ 3: หลังจากการกระตุ้น exocytosis ของเซลล์ โปรตีนตุ่มใหม่จะถูกสัมผัสกับพลาสมาเมมเบรนและสามารถติดป้ายกำกับโดย NbGFP* (C) ภาพประกอบแผนผังของการเสื่อมสภาพ การย่อยสลายแบบคัดเลือกโปรตีนทำได้สำเร็จผ่านวิถียูบิควิติน ซึ่งดำเนินการโดยชุดเอนไซม์ที่ซับซ้อน โปรตีน F-box (FBP) ใน SKP1-CUL1-F-box โปรตีนลิกาสเชิงซ้อน (SCF) ถูกหลอมรวมกับนาโนบอดีที่ต้าน GFP (Nb) เพื่อจดจำฟิวชันโปรตีนของ GFP และ เอนไซม์ ubiquitin-conjugating (E2) โควาเลนต์เชื่อมโยงโมเลกุลของ ubiquitin หลายตัวเข้ากับโปรตีนเป้าหมาย ต่อจากนั้น โปรตีนโพลียูบิควิทิเนเต็ดจะถูกสลายโดยโปรตีโอโซม (D) คำอธิบายแผนผังของ BiCAP โปรตีน HER ถูกหลอมรวมกับชิ้นส่วนของปลาย N (GFP1) หรือปลาย C (GFP2) ของ GFP เมื่อฟิวชันทั้งสองก่อตัวเป็นไดเมอร์ GFP จะพับกลับและเรืองแสง จากนั้นไดเมอร์ของ HER และโปรตีนที่ทำปฏิกิริยาระหว่างกันจะถูกเสริมสมรรถนะโดยใช้นาโนบอดี GFP ซึ่งไม่มีความสามารถในการจับกับชิ้นส่วนของ GFP และด้วยเหตุนี้ จึงทำให้สามารถแยกไดเมอร์ได้ (E) ระบบการถอดความขึ้นอยู่กับ GFP โดเมนการจับ DNA (DBD) และโดเมนการกระตุ้น (AD) ถูกหลอมรวมกับ GFP nanobody 1 (Nb1) และ GFP nanobody 2 (Nb2) ตามลำดับ เมื่อมี GFP, DBD-Nb1 และ AD-Nb2 สามารถกระตุ้นยีนนักข่าวลำดับการเปิดใช้งานอัปสตรีม (UAS) ซึ่งนำไปสู่การควบคุมยีนเป้าหมาย ( F ) การรับรู้โปรตีนที่ติดฉลาก GFP บนโครงสร้างนาโน DNA โครงสร้างนาโนของ DNA ที่มีจุดจับสองจุดถูกผูกเข้ากับเรซินแม่เหล็ก จับกับนาโนบอดี GFP (Nb) โดยการจับคู่เบสเสริม จากนั้นบ่มด้วยโปรตีนที่ติดฉลาก GFP ดังนั้นโปรตีนที่มีฉลาก GFP จึงสามารถติดเข้ากับโครงสร้างนาโนได้อย่างแม่นยำ

รูปที่ 5. ต่อ

4.1.2. การตรวจหาโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์

การแสดงพื้นผิวของแบคทีเรียเป็นเทคโนโลยีที่น่าหวังสำหรับการผลิตโปรตีนที่ยึดเซลล์และการออกแบบตัวเร่งปฏิกิริยาทั้งเซลล์ แม้ว่าโปรตีนเมมเบรนชั้นนอกต่างๆ จะถูกนำมาใช้สำหรับการแสดงพื้นผิว แต่ไม่มีวิธีการที่ใช้ร่วมกันได้แบบง่าย เป็นสากล และมีปริมาณงานสูงในการประเมินและพัฒนาระบบการแสดงผลพื้นผิว นอกจากนี้ การแยกความแตกต่างระหว่างโปรตีนในเซลล์และโปรตีนที่แสดงบนพื้นผิวเป็นเรื่องท้าทาย เวนเดล และคณะ สร้างระบบตรวจจับการแสดงผลพื้นผิวแบบเรืองแสงโดยการหลอมรวม GFP-nanobody เข้ากับพุกเมมเบรนด้านนอก [71] โปรตีนเมมเบรนด้านนอกที่ใช้กันทั่วไปสองตัวถูกเลือกเป็นแองเคอร์: โปรตีนเมมเบรนด้านนอก A (OmpA) และ autotransporter (C-IgAP) ดังนั้น โมดูลการแสดงผลที่แตกต่างกันสองโมดูลจึงถูกสร้างขึ้นโดยการหลอมรวม OmpA หรือ C-IgAP กับนาโนบอดีเฉพาะของ GFP ซึ่งแสดงภาพโดยการเพิ่ม GFP บริสุทธิ์จากภายนอก แม้ว่า GFP จะสามารถแสดงบนพื้นผิวเซลล์ได้ แต่วิธีการใหม่นี้จะช่วยหลีกเลี่ยงปัญหาผลบวกลวง เนื่องจาก GFP เชื่อมโยงกับนาโนบอดีที่แสดงบนพื้นผิวเซลล์เท่านั้นที่เซลล์จะสร้างสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ได้ การทดสอบนี้เข้ากันได้กับวิธีการตรวจจับเรืองแสงหลายวิธี รวมถึงการตรวจจับเรืองแสงทั้งเซลล์ในเพลต การเรืองแสงในเจล กล้องจุลทรรศน์ และโฟลว์ไซโตเมทรี วิธีการแสดงพื้นผิวที่ราคาไม่แพงและอ่านง่ายนี้จะช่วยสาธิตกลไกการขนส่งโปรตีนลงบนพื้นผิวเซลล์ที่มีชีวิต ช่วยให้สามารถพัฒนาระบบแสดงพื้นผิวของแบคทีเรียและตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพทั้งเซลล์ที่แข็งแกร่งได้อย่างมีเหตุผลในอนาคต

การปล่อยสารสื่อประสาทจำเป็นต้องอาศัยภาวะ exocytosis, endocytosis และการสร้างถุงฟิวชันใหม่ จะเกิดอะไรขึ้นกับโปรตีนตุ่มหลังจากการเกิด exocytosis เมื่อปล่อยทิ้งไว้บนพลาสมาเมมเบรนไม่เป็นที่เข้าใจกัน โปรตีนเหล่านี้มักถูกควบเข้ากับมอยอิตี GFP ที่ไวต่อค่า pH (ฟลูออรีน) เนื่องจากการถ่ายภาพด้วย pHluorin มักถูกจำกัดโดยการเลี้ยวเบนของจุดที่มีขนาดใหญ่กว่าถุงหลายเท่า การใช้นาโนบอดีที่ต่อต้าน GFP ในการเลือกติดฉลากถุงที่มี exocytosed จึงมีคุณค่า [72] ด้วยการเชื่อมโยงนาโนบอดีที่ต้าน GFP กับฟลูออโรฟอร์เคมีที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูง ทำให้สามารถตรวจพบขนาดและความเข้มของโปรตีนที่ติดฉลาก pHluorin ภายใต้สภาวะต่างๆ ได้ด้วยวิธีที่ pHluorin เพียงอย่างเดียวทำไม่ได้ เมื่อกระตุ้นภาวะ exocytosis โปรตีนตุ่มใหม่จะถูกสัมผัสกับพลาสมาเมมเบรน จากนั้นนาโนบอดีที่มีป้ายกำกับเรืองแสงจะจับกับ pHluorin (รูปที่ 5B) ดังนั้นการตรวจจับ pHluorin ที่ใช้นาโนบอดี้จึงเป็นเครื่องมือที่น่าหวังสำหรับการศึกษาเหตุการณ์หลังการเกิด exocytosis ในเซลล์ประสาท

4.2. การประยุกต์ในการย่อยสลายโมเลกุลโปรตีนแบบกำหนดเป้าหมาย

เมื่อเปรียบเทียบกับการแก้ไขยีนและการรบกวน RNA การจัดการโดยตรงของชีวโมเลกุลในระดับโปรตีนเป็นเส้นทางที่มีประสิทธิภาพมากกว่าสำหรับการศึกษาการทำงานของโปรตีน การเอาชนะข้อจำกัดต่างๆ เช่น ผลกระทบนอกเป้าหมายที่อาจเกิดขึ้น การยับยั้งการทำงานของยีน และการสูญเสียฟังก์ชันฟีโนไทป์ของยีนที่สำคัญ ปัจจุบันการย่อยสลายโปรตีนแบบกำหนดเป้าหมายเป็นกลยุทธ์การวิจัยที่สำคัญเพื่อให้บรรลุถึงการสูญเสียการทำงานและการสลายโปรตีนของโปรตีนที่น่าสนใจ ตัวย่อยสลายโปรตีนที่มีนาโนบอดีสามารถช่วยให้เกิดการย่อยสลายอย่างรวดเร็วและการควบคุมโปรตีนที่สนใจแบบผันกลับได้ คอสซินัส และคณะ พัฒนาวิธีการย่อยสลายโปรตีนสำหรับการสูญเสียโปรตีนฟิวชัน GFP เป้าหมายโดยตรงและรวดเร็วในระบบยูคาริโอตใดๆ [73] โดยสรุป เพื่อล้มโปรตีนฟิวชัน GFP ลง นาโนบอดีต้าน GFP จะถูกหลอมรวมกับโปรตีน F-box (FBP) ในสารเชิงซ้อน SKP1-CUL1-F-box โปรตีน (SCF) E3 ligase เพื่อจดจำโปรตีนฟิวชัน GFP เอนไซม์ ubiquitin-conjugating enzyme (E2) โควาเลนต์เชื่อมโยงโมเลกุลของ ubiquitin หลายตัวเข้ากับโปรตีนฟิวชั่น GFP เป้าหมาย ต่อจากนั้นคอมเพล็กซ์ SCF จะสลายโปรตีนโพลียูบิควิทิเนต ดังนั้นการเอาโปรตีนเป้าหมายออกจึงง่ายต่อการตรวจสอบ (รูปที่ 5C) เทคนิคนี้เรียกว่าโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่เสื่อมคุณภาพ (deGradFP) ถูกนำมาใช้สำหรับการย่อยสลาย GFP และการหลอมรวมในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เอ็มบริโอเซบีริช [74] และพืช [75]

4.3. การใช้งานในระบบการทำให้บริสุทธิ์ด้วยความสัมพันธ์ของการเสริมแบบสองโมเลกุล

ในปี 2559 Croucher และคณะ พัฒนาระบบการทำให้บริสุทธิ์ด้วยความสัมพันธ์ระหว่างการเสริมด้วยโมเลกุลคู่ (BiCAP) ซึ่งสามารถแยกแยะ dimer ของตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์ (HER) (คล้ายคลึงกันและต่างกัน) ออกจากโมโนเมอร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ [76] ในระบบนี้ ชิ้นส่วนเสริมสองส่วนของโมเลกุล FP ถูกหลอมรวมกับโปรตีน HER สองตัว (HER1, HER2 หรือ HER3) ชิ้นส่วนทั้งสองนี้ไม่สามารถประกอบเป็นโปรตีนเรืองแสงที่แอคทีฟได้ตามธรรมชาติ อย่างไรก็ตาม สมมติว่าโปรตีน HER ทั้งสองมีปฏิสัมพันธ์กัน ในกรณีนั้น ชิ้นส่วนทั้งสองจะอยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่และประกอบกัน โดยสร้างใหม่ให้เป็นโปรตีนเรืองแสงที่สมบูรณ์และแอคทีฟ (รูปที่ 5D) ไดเมอร์ HER และโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากันสามารถเสริมสมรรถนะได้โดยใช้นาโนบอดี GFP ซึ่งไม่มีความสัมพันธ์กับชิ้นส่วน GFP ดังนั้นจึงทำให้สามารถแยกและเพิ่มคุณค่าของไดเมอร์ได้ จากการวิเคราะห์โปรตีนที่ระบุ พบว่าไดเมอร์ทั้งสาม (HER2:HER2, HER2:HER3 และ HER1:HER2) มีโปรตีนที่มีปฏิกิริยาเหมือนกันและมีปฏิกิริยาโต้ตอบเฉพาะของพวกมัน FAM59A ซึ่งเป็นโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับไดเมอร์ของ HER1:HER3 โดยเฉพาะ เป็นสื่อกลางในการกระตุ้นการทำงานของวิถีไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ ทำให้เกิดเป้าหมายใหม่สำหรับการรักษามะเร็งเต้านม

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

4.4. การใช้งานในพื้นที่อื่น ๆ

การวินิจฉัยโรคในหลอดทดลองตั้งแต่เนิ่นๆ และการติดตามผลการรักษาเป็นปัญหาสำคัญในการวินิจฉัยโรค สารคอนทราสต์ที่เหมาะสมควรมีการแทรกซึมของเนื้อเยื่อที่ดี สัมพรรคภาพแอนติเจนสูง และความสามารถในการกวาดล้างที่รวดเร็วโดยสร้างความเสียหายต่อเนื้อเยื่อปกติน้อยที่สุด นาโนบอดีมีศักยภาพในการเป็นสารสร้างภาพในอุดมคติที่สามารถผ่านหลอดเลือดและเข้าสู่เนื้อเยื่อเพื่อการถ่ายภาพและการรักษาที่ดีขึ้น

FPs ไม่เพียงแต่ให้แสงสว่างแก่เซลล์และกระบวนการทางชีวภาพเท่านั้น แต่ยังสร้างโครงสร้างที่ดีเยี่ยม เนื่องจากขาดการเชื่อมโยงกับเครือข่ายโปรตีนโฮสต์จำนวนมาก การใช้ GBP และ GFP เป็นโครงในการขับเคลื่อนการก่อตัวที่ซับซ้อนทางชีวภาพ Tang และคณะ สร้างไลบรารีของปัจจัยการถอดรหัสแบบไฮบริดที่ควบคุมการแสดงออกของยีนโดยเฉพาะเมื่อมี GFP และอนุพันธ์ของมัน [77] การผลิต GFP ควบคุมการแสดงออกของยีนเฉพาะเซลล์ (รูปที่ 5E) และส่งเสริมความผิดปกติของเรตินาของหนูและสมอง นอกจากนี้ หนูพันธุ์ GFP และสายพันธุ์เซบาริชยังได้รับการแก้ไขเพื่อให้เกิดการถอดรหัสที่ขึ้นกับ GFP สำหรับการตรวจสอบด้วยแสงของวงจรประสาท งานนี้กำหนดตำแหน่งของ GFP ให้เป็นโครงรองรับอเนกประสงค์ และเปิดประตูสู่การเลือกจัดการเซลล์ที่ติดแท็ก GFP ต่างๆ ในสายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรม จากสิ่งนี้ ผลิตภัณฑ์ภายในเซลล์อื่นๆ ยังสามารถพัฒนาเป็นโครงสร้างเฉพาะเซลล์ในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ได้

โครงสร้างนาโนของ DNA ได้กลายเป็นเครื่องมือสำคัญและมีประสิทธิภาพในการศึกษาการทำงานของเอนไซม์และการทำงานของโปรตีน อย่างไรก็ตาม การพัฒนากลยุทธ์สากลสำหรับการสร้างโปรตีนเชิงซ้อนบนโครงสร้างนาโน DNA เป็นเรื่องยาก ปัญหาประการหนึ่งคือการเกาะติดโปรตีนที่น่าสนใจกับโครงสร้างนาโนของ DNA ซอมมีส และคณะ เสนอแนวทางใหม่ในการติดฉลากโครงสร้างนาโนดีเอ็นเอ [78] ด้วยการทำให้พวกมันทำงานได้ด้วยนาโนบอดี GFP สามารถควบคุมความสามารถในการเกาะติดโปรตีนได้อย่างแม่นยำ (รูปที่ 5F) เมื่อเปรียบเทียบกับเครื่องตรวจสอบ DNA ที่จำเพาะต่อ GFP แล้ว นาโนบอดีจะมีความจำเพาะ ความเสถียร และความสัมพันธ์กับ GFP ที่สูงกว่า ดังนั้นการประยุกต์ใช้โครงสร้างนาโนของ DNA เป็นโครงที่ตั้งโปรแกรมได้ในการวิจัยทางชีววิทยาจึงง่ายขึ้นอย่างมากโดยการเชื่อมต่อโครงสร้างนาโนของ DNA กับ FP ที่พบในเซลล์ ชีววิทยาพัฒนาการ และชีวเคมีโปรตีน

5. การอภิปรายเกี่ยวกับแนวโน้มในอนาคต

เมื่อเปรียบเทียบกับแอนติบอดีแบบดั้งเดิม นาโนบอดีมีคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่ดีกว่า และแสดงและคัดกรองได้ง่ายกว่า นาโนบอดีมีโครงสร้างง่ายกว่าแอนติบอดีทั่วไปมาก พวกมันถูกเข้ารหัสด้วยยีนตัวเดียวและสามารถผลิตโดยจุลินทรีย์ได้ง่าย ซึ่งช่วยลดต้นทุนการผลิตได้อย่างมาก แม้ว่านาโนบอดีจะเป็นความก้าวหน้าในการวิจัยแอนติบอดี แต่ปัญหาบางอย่างยังคงต้องได้รับการแก้ไข ประการหนึ่ง พวกเขามีข้อเสียคือการดำเนินการไม่สะดวกและมีค่าใช้จ่ายสูงในการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับสัตว์ นอกจากนี้ เนื่องจาก HCAb และ IgNAR มีมากมายในโมโนไซต์ในเลือด ส่วนนาโนบอดีที่มุ่งเป้าไปที่แอนติเจน FP มักจะถูกคัดกรองจาก Camelidae หรือห้องสมุดภูมิคุ้มกันของปลาฉลามโดยเฉพาะ ด้วยเทคโนโลยีการก่อสร้างห้องสมุดและเทคโนโลยีการพัฒนานาโนบอดีที่เติบโตเต็มที่ การคัดกรองนาโนบอดีเฉพาะ FP จากห้องสมุดสังเคราะห์จึงเป็นทิศทางใหม่ที่จะเอาชนะความไม่สะดวกในการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับสัตว์ ลดระยะเวลาการทดลอง และลดต้นทุนลงอย่างมาก ในทางกลับกันแม้ว่าการคัดกรองและการแสดงออกของนาโนบอดีนั้นค่อนข้างง่าย แต่การได้รับ FP นาโนบอดีที่มีค่าการใช้งานที่เป็นไปได้นั้นเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนมาก การคัดกรองคลังนาโนบอดีของฟาจไม่สามารถหลีกเลี่ยงผลบวกลวงที่เกิดจากการเกาะกันของพื้นผิวฟาจแบบเส้นใยกับแอนติเจน ในขณะที่ความจุขนาดเล็กของยีสต์และคลังนาโนบอดีของแบคทีเรียก็เป็นอีกปัญหาที่ยากในการคัดกรองนาโนบอดี

การใช้งานของนาโนบอดีกับ FP จะเพิ่มขึ้นต่อไปในอนาคต (1) ด้วยการพัฒนาเทคโนโลยีแอนติบอดีในเซลล์ การตรวจจับโมเลกุลในเซลล์ในเซลล์ที่มีชีวิตจึงสามารถเข้าถึงได้ นาโนบอดีมีข้อได้เปรียบที่ไม่เหมือนใครในแง่นี้ เนื่องจาก (i) นาโนบอดีมีขนาดเล็ก และประสิทธิภาพของการเข้าสู่เซลล์สูงกว่าแอนติบอดีแบบเดิมมาก; และ (ii) นาโนบอดีสามารถแสดงออกและทำงานในเซลล์ที่มีชีวิตได้ (2) นาโนบอดีที่มีความจำเพาะแบบคู่คือแอนติบอดีดัดแปลงชนิดหนึ่งที่สามารถจับแอนติเจนที่แตกต่างกันสองตัวโดยเฉพาะพร้อมกัน สามารถสร้างได้ง่ายจากนาโนบอดีเดี่ยวและแสดงออกเป็นจุลินทรีย์ ดังนั้นนาโนบอดีกับ FP จึงให้โอกาสการใช้งานที่กว้างขวางสำหรับการพัฒนานาโนบอดีที่มีความจำเพาะแบบคู่

6. ข้อสรุป

บทความนี้จะทบทวนต้นกำเนิด โครงสร้าง และคุณสมบัติของ FP โมโนโคลนอลแอนติบอดีและนาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP และการใช้งานของพวกมันก็สรุปเช่นกัน แม้ว่าแอนติบอดีเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าสำหรับการแสดงส่วนประกอบทางชีววิทยาในเซลล์ที่ถูกตรึงไว้ แต่การใช้แอนติบอดีแบบดั้งเดิมในเซลล์ที่มีชีวิตถูกจำกัดโดยการพับและการประกอบที่ไม่มีประสิทธิภาพของสายโซ่หนักและสายเบาที่แปรผันได้ การฉีดแอนติบอดีโดยตรงแบบไมโครอินเจ็กต์เป็นวิธีการหลักที่ใช้ในการประยุกต์ใช้แอนติบอดีในเซลล์ ซึ่งเป็นความท้าทายทางเทคนิคและก่อให้เกิดความเครียดต่อเซลล์ แอนติบอดีโดเมนเดี่ยวที่ได้มาจากอูฐหรือปลาฉลามจดจำแอนติเจนผ่านโดเมนที่แปรผันได้ของสายโซ่หนัก นาโนบอดีที่มีขนาดเล็กและเสถียรเหล่านี้สามารถแสดงออกและทำงานในเซลล์ที่มีชีวิตได้ ดังนั้นการสร้างนาโนบอดีที่กำหนดเป้าหมาย FP จะทำให้พวกมันมีคุณค่ามากขึ้นในการวิจัยทางชีววิทยา

อ้างอิง

1. Muyldermans, S. Nanobodies: แอนติบอดีโดเมนเดี่ยวตามธรรมชาติ แอนนู. สาธุคุณไบโอเคม. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. เฮลมา เจ.; คาร์โดโซ พิธีกร; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; Leonhardt, H. Nanobodies และสารยึดเกาะรีคอมบิแนนท์ในชีววิทยาของเซลล์ เจ เซลล์ ไบโอล 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. อัสชูร์ เจ.; ชมิดต์ FI; ฮานเกะ, ล.; คราโนลินี เจ.; คาวาลลารี ม.; อัลเทนเบิร์ก, อ.; บรูเออร์อาร์.; อินแกรม เจ.; ช่างทำรองเท้า, ค.; Ploegh, HL การแสดงออกภายในเซลล์ของแอนติบอดีโดเมนเดียวแบบ Camelid ซึ่งจำเพาะต่อนิวคลีโอโปรตีนของไวรัสไข้หวัดใหญ่เผยให้เห็นลักษณะเฉพาะของการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นด้วยนิวเคลียร์ เจ. วิโรล. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. มังลิค, อ.; โคบิลกา, บีเค; Steyaert, J. Nanobodies เพื่อศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของตัวรับโปรตีน G แอนนู. สาธุคุณเภสัช. สารพิษ 2017, 57, 19–37. [ครอสอ้างอิง]

5. ฮาร์มานซา ส.; ฮามาราโตกลู ฟ.; แอฟโฟลเตอร์, ม.; จำเป็นต้องมีการแพร่กระจาย Caussinus, E. Dpp สำหรับอยู่ตรงกลาง แต่ไม่ใช่สำหรับการเติบโตของแผ่นดิสก์ปีกด้านข้าง ธรรมชาติ 2015, 527, 317–322. [ครอสอ้างอิง]

6. ยามากาตะ ม.; Sanes, JR Reporter–nanobody fusions (RANbodies) เป็นรีเอเจนต์อิมมูโนฮิสโตเคมีที่มีความอเนกประสงค์ ขนาดเล็ก และละเอียดอ่อน โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 2018, 115, 2126–2131 [ครอสอ้างอิง]

7. อาริโอตติ น.; ฮอลล์, เตหะราน; เรย์ เจ.; เฟอร์กูสัน, ซี.; แมคมาฮอน, เค-เอ.; มาร์เทล น.; เวบบ์ RE; เวบบ์, โรดไอแลนด์; ทีสเดล, ถ.; Parton, RG การตรวจจับแบบโมดูลาร์ของโปรตีนที่ติดฉลาก GFP สำหรับการคัดกรองอย่างรวดเร็วด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในเซลล์และสิ่งมีชีวิต นักพัฒนา เซลล์ 2015, 35, 513–525 [ครอสอ้างอิง]

8. ฟรูโฮลซ์ ส.; ฟาสเลอร์ เอฟ.; โกลูกิเซากลู, Ü.; Pimpl, P. Nanobody กระตุ้นการล็อค VSR เผยให้เห็นการโหลดลิแกนด์ใน Golgi แนท. ชุมชน 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. โพรเล ดีแอล; Taylor, CW ชุดเครื่องมือที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมของนาโนบอดีที่ทำหน้าที่ต่อต้านโปรตีนเรืองแสงสำหรับการแสดงภาพและจัดการการส่งสัญญาณภายในเซลล์ บีเอ็มซี ไบโอล 17, 41. 2019. [CrossRef]

10. ชิโมมูระ โอ.; จอห์นสัน เอฟเอช; Saiga, Y. การสกัด การทำให้บริสุทธิ์ และคุณสมบัติของ Aequorin ซึ่งเป็นโปรตีนเรืองแสงจาก Luminous Hydromedusan, Aequorea เจเซลล์. คอมพ์ ฟิสิออล. 1962, 59, 223–239. [ครอสอ้างอิง]

11. พราเชอร์ ดี.; แมคแคน โรแลนด์; Cormier, การโคลน MJ และการแสดงออกของการเข้ารหัส cDNA สำหรับ aequorin ซึ่งเป็นโปรตีนที่จับกับแคลเซียมที่เรืองแสงได้ ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 1985, 126, 1259–1268. [ครอสอ้างอิง]

12. เฮม ร.; พราเชอร์ ดีซี; Tsien, RY การกลายพันธุ์ของความยาวคลื่นและการเกิดออกซิเดชันอัตโนมัติหลังการแปลของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 1994, 91, 12501–12504 [ครอสอ้างอิง]

13. แมทซ์ ม.; ฟราดคอฟ, AF; ลาบาส, YA; ซาวิทสกี้, อ.; ซาไรสกี้ เอจี; มาร์เคลอฟ ม.ล.; Lukyanov, SA โปรตีนเรืองแสงจากแอนโธซัวชนิดไม่เรืองแสง แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 1999, 17, 969–973. [ครอสอ้างอิง]

14. ปาร์ค น.; ซองเจ.; จอง ส.; ทราน, TT; เกาะ HW; Kim, EY Vaccinia-ที่เกี่ยวข้องกับไคเนส 3 (VRK3) กำหนดช่วงเวลาและแอมพลิจูดโดยส่งผลกระทบต่อการแปลโปรตีนนาฬิกาในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 2017, 487, 320–326. [ครอสอ้างอิง]

15. จ้าว ด.; ซู่ ค.; ลิน ส.; ชิ ส.; หลี่คิว.; หลิว ม.; ไค, เอ็กซ์.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway ควบคุมการสร้างเส้นเลือดใหม่ผ่านเซลล์บุผนังหลอดเลือดในแบบจำลองวัฒนธรรมร่วม 3 มิติ เจเซลล์. ฟิสิออล. 2016, 232, 1548–1558. [ครอสอ้างอิง]

16. โรดริเกซ อีเอ; แคมป์เบลล์ RE; ลิน เจวาย; ลิน, MZ; มิยาวากิ อ.; พาลเมอร์, AE; ชู เอ็กซ์.; จางเจ.; Tsien, RY กล่องเครื่องมือที่กำลังเติบโตและเปล่งประกายของโปรตีนเรืองแสงและโฟโตแอกทีฟ เทรนด์ไบโอเคม วิทยาศาสตร์ 2017, 42, 111–129. [ครอสอ้างอิง]

17. หยาง เอฟ.; มอส, แอลจี; Phillips, GN, Jr. โครงสร้างโมเลกุลของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 1996, 14, 1246–1251. [ครอสอ้างอิง]

18. ออร์โม ม.; คิวบิตต์, AB; คาลิโอ, ก.; กรอสส์ ลุยเซียนา; เซียน ไรเดอร์; โครงสร้างคริสตัล Remington, SJ ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวของ Aequorea victoria วิทยาศาสตร์ 1996, 273, 1392–1395 [ครอสอ้างอิง]

19. รีด บีจี; Flynn, GC Chromophore การสร้างในโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ชีวเคมี 1997, 36, 6786–6791. [ครอสอ้างอิง]

20. จาง ก.; กูร์ตู ว.; Kain, SR โปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่ได้รับการปรับปรุงช่วยให้ตรวจจับการถ่ายโอนยีนในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้อย่างละเอียดอ่อน ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 1996, 227, 707–711. [ครอสอ้างอิง]

21. เปเดแล็ค เจ.-ดี.; คาบันทัส, ส.; ทราน ต.; เทอร์วิลิเกอร์ ต.; Waldo, GS Engineering และลักษณะเฉพาะของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวซุปเปอร์โฟลเดอร์ แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 2549, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

22. แครเมรี อ.; ไวท์ฮอร์น, อีเอ; เทต อี.; Stemmer, WP ปรับปรุงโปรตีนเรืองแสงสีเขียวโดยวิวัฒนาการระดับโมเลกุลโดยใช้ DNA Shuffling แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 1996, 14, 315–319. [CrossRef] [PubMed]

23. มิอุระ ฮ.; อิโนโกะ, เอช.; อิโนะอุเอะ ฉัน.; ทานาคา ม.; ซาโต้ ม.; Ohtsuka, M. กลยุทธ์การโคลนนิ่งอย่างง่ายโดยใช้ยีน GFPuv เป็นตัวบ่งชี้เชิงบวก/เชิงลบ ก้น ไบโอเคม 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. เมนา, แมสซาชูเซตส์; เทรย์เนอร์, TP; มาโย, SL; Daugherty, โปรตีนเรืองแสง PS Blue พร้อมความสว่างและความคงตัวของแสงที่เพิ่มขึ้นจากไลบรารีที่มีเป้าหมายเชิงโครงสร้าง แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. ไอ, ฮ.; แชเนอร์ น.; เฉิง ซ.; เซียน ไรเดอร์; Campbell, RE การสำรวจโครงสร้างโครโมฟอร์ใหม่นำไปสู่การระบุโปรตีนฟลูออเรสเซนต์สีน้ำเงินที่ปรับปรุงแล้ว ชีวเคมี 2550, 46, 5904–5910 [ครอสอ้างอิง]

26. ซูบัค โอม; กุนโดรอฟ ไอเอส; โยชิมูระ ม.; ซูบัค, FV; จางเจ.; กรึนวาลด์, ดี.; ซูสโลวา, อีเอ; ชูดาคอฟ DM; Verkhusha, VV การแปลงโปรตีนเรืองแสงสีแดงเป็นโพรบสีน้ำเงินสดใส เคมี. ไบโอล 2008, 15, 1116–1124. [ครอสอ้างอิง]

27. เมิร์ซเลียค อี.; โกดาร์ต เจ.; ชเชอร์โบ ด.; บูลินา, เมน; ชเชกลอฟ อส; ฟราดคอฟ, AF; เกนเซวา, อ.; ลุคยานอฟ, เค.; ลุคยานอฟ ส.; กาเดลลา ต.; และคณะ โปรตีนเรืองแสงสีแดงโมโนเมอร์สดใสพร้อมอายุการเรืองแสงที่ยาวนานขึ้น แนท. วิธีการ 2007, 4, 555–557 [ครอสอ้างอิง]

28. คิวบิตต์ AB; เฮม อาร์.; อดัมส์ เอสอาร์; บอยด์ AE; กรอสส์ ลุยเซียนา; Tsien, RY ทำความเข้าใจ ปรับปรุง และใช้โปรตีนเรืองแสงสีเขียว เทรนด์ไบโอเคม วิทยาศาสตร์ 1995, 20, 448–455. [ครอสอ้างอิง]

29. โทโมสึกิ ว.; มัตซึดะ ต.; ทานี่ ต.; เนโมโต ต.; โคเทรา ไอ.; ไซโตะ, ก.; โฮริคาว่า เค.; Nagai, T. โปรตีนเรืองแสงอุลตร้ามารีนที่มีความคงตัวต่อแสงเพิ่มขึ้นและไม่ไวต่อค่า pH แนท. วิธีการ 2009, 6, 351–353 [ครอสอ้างอิง]

30. โกดาร์ต เจ.; ฟาน วีเรน, ล.; ฮิงค์, แมสซาชูเซตส์; วิสเชอร์, NOE; จาลิงค์, เค.; Gadella, TWJ ตัวแปรโปรตีนเรืองแสงสีฟ้าสดใสที่ระบุโดยการตรวจคัดกรองตลอดอายุการเรืองแสง แนท. วิธีการ 2010, 7, 137–139. [ครอสอ้างอิง]

31. วัน ร.น.; เดวิดสัน เมกะวัตต์ จานสีโปรตีนเรืองแสง: เครื่องมือสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ เคมี. สังคมสงเคราะห์ ฉบับที่ 2009, 38, 2887–2921. [ครอสอ้างอิง]

32. กรีสเบค โอ.; แบร์ด, จีเอส; แคมป์เบลล์ RE; เศคาริยาห์ ดา; Tsien, RY การลดความไวต่อสิ่งแวดล้อมของโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง เจ. ไบโอล. เคมี. 2001, 276, 29188–29194. [ครอสอ้างอิง]

33. ต.นาไก.; อิบาตะ, เค.; พาร์ก, อีเอส; คูโบต้า ม.; มิโคชิบะ, เค.; Miyawaki, A. ตัวแปรของโปรตีนเรืองแสงสีเหลืองที่มีการสุกเร็วและมีประสิทธิภาพสำหรับการใช้งานทางชีววิทยาของเซลล์ แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 2002, 20, 87–90. [ครอสอ้างอิง]

34. แชเนอร์ นอร์ทแคโรไลนา; แคมป์เบลล์ RE; สไตน์บาค, เพนซิลเวเนีย; กีปมานส์, บีเอ็นเอ; พาลเมอร์, AE; Tsien, RY ปรับปรุงโปรตีนเรืองแสงสีแดง สีส้ม และสีเหลืองแบบโมโนเมอร์ที่ได้จาก Discosoma sp โปรตีนเรืองแสงสีแดง แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ 2004, 22, 1567–1572. [ครอสอ้างอิง]

35. ชเชอร์โบ ด.; แมร์ซลิอัค, อีเอ็ม; Chepurnykh ทีวี; ฟราดคอฟ, AF; เออร์มาโควา, GV; โซโลเวียวา, อีเอ; ลุคยานอฟ, แคลิฟอร์เนีย; บ็อกดาโนวา, อีเอ; ซาไรสกี้ เอจี; ลุคยานอฟ ส.; และคณะ โปรตีนเรืองแสงสีแดงไกลที่สว่างสำหรับการถ่ายภาพทั้งร่างกาย แนท. วิธีการ 2007, 4, 741–746 [ครอสอ้างอิง]

36. ชเชอร์โบ ด.; เมอร์ฟี่ ซีเอส; เออร์มาโควา, GV; โซโลเวียวา, อีเอ; Chepurnykh ทีวี; ชเชกลอฟ อส; เวอร์คุชา, วี.; เพลตเนฟ, VZ; เฮเซลวูด, เคแอล; โรช PM; และคณะ แท็กเรืองแสงสีแดงไกลสำหรับการถ่ายภาพโปรตีนในเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต ไบโอเคม เจ. 2009, 418, 567–574. [ครอสอ้างอิง]

37. โอลินีค ระบบปฏิบัติการ; เชอร์นอฟ เคจี; Verkhusha, VV Bacterial Phytochromes, Cyanobacteriochromes และ Allophycocyanins เป็นแหล่งที่มาของโพรบฟลูออเรสเซนต์ใกล้อินฟราเรด นานาชาติ เจ. โมล. วิทยาศาสตร์ 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. ชู เอ็กซ์.; โรยองต์, อ.; ลิน, MZ; อากีเลรา, TA; เลฟ-ราม, ว.; สไตน์บาค, เพนซิลเวเนีย; Tsien, RY การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของโปรตีนเรืองแสงอินฟราเรดที่ออกแบบจากแบคทีเรียไฟโตโครม วิทยาศาสตร์ 2009, 324, 804–807 [ครอสอ้างอิง]

39. ยู ด.; กุสตาฟสัน สุขา; ฮันค.; ลาฟาย์, ซี.; นัวร์แคลร์ก-ซาโวเย, ม.; Ge, W.-P.; เธเยอร์ ดา; หวาง เอช.; คอร์นเบิร์ก, วัณโรค; โรยองต์, อ.; และคณะ โปรตีนเรืองแสงอินฟราเรดโมโนเมอร์ที่ได้รับการปรับปรุงสำหรับการถ่ายภาพสมองของเซลล์ประสาทและเนื้องอก แนท. ชุมชน 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. ยู ด.; แบร์ด, แมสซาชูเซตส์; อัลเลน เจอาร์; ฮาว อีเอส; คลาสเซ่น ส.ส. ; รีด, อ.; มาคิจานี, เค.; ซองย.; หลิว ส.; เมอร์ธี่ ซ.; และคณะ โปรตีนเรืองแสงอินฟราเรดโมโนเมอร์ตามธรรมชาติสำหรับการติดฉลากโปรตีน ในร่างกาย แนท. วิธีการ 2015, 12, 763–765 [ครอสอ้างอิง]

41. ชเชอร์บาโควา DM; บาลาบัน, ม.; เอเมลยานอฟ, AV; บรีโนวิทซ์ ม.; กัว ป.; Verkhusha, VV Bright monomeric โปรตีนฟลูออเรสเซนต์ใกล้อินฟราเรดเป็นแท็กและไบโอเซนเซอร์สำหรับการถ่ายภาพหลายระดับ แนท. ชุมชน 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. โรดริเกซ อีเอ; ทราน, GN; กรอสส์ ลุยเซียนา; คริสป์ เจแอล; ชู เอ็กซ์.; ลิน เจวาย; Tsien, RY โปรตีนเรืองแสงสีแดงไกลพัฒนามาจากไซยาโนแบคทีเรียไฟโคบิลิโปรตีน แนท. วิธีการ 2016, 13, 763–769 [CrossRef] [PubMed]

43. โอลีนีค ระบบปฏิบัติการ; เชเมตอฟ, AA; เพลทเนฟ ส.; ชเชอร์บาโควา, DM; Verkhusha, VV โปรตีนเรืองแสงใกล้อินฟราเรดที่เล็กที่สุดพัฒนาจากไซยาโนแบคทีเรียเป็นแท็กอเนกประสงค์สำหรับมัลติเพล็กซ์สเปกตรัม แนท. ชุมชน 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. โอลีนีค ระบบปฏิบัติการ; บาลาบัน, ม.; คลาร์ก ซีแอล; แครี่ อี.; เพลทเนฟ ส.; นิมเมอร์จาห์น, อ.; Verkhusha, VV โปรตีนใกล้อินฟราเรดโดเมนเดียวเป็นโครงสำหรับนาโนบอดีเรืองแสงที่ขึ้นกับแอนติเจน แนท. วิธีการ 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. ทิลเลอร์, KE; Tessier, PM ก้าวหน้าในการออกแบบแอนติบอดี แอนนู. สาธุคุณชีวการแพทย์. อังกฤษ 2015, 17, 191–216. [ครอสอ้างอิง]

46. ​​เค็งเงียว-อันโดะ.; Mitani, S. 1020 การผลิตและการศึกษาคุณลักษณะของโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) โรคประสาท ความละเอียด 1997, 28, S122. [ครอสอ้างอิง]

47. จ้วง ร.; จาง ย.; จางร.; ซองค.; ยางเค.; หยาง อ.; Jin, B. การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนฟิวชั่น GFP ที่มีความบริสุทธิ์สูงและผลผลิตโดยโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ความสัมพันธ์แบบโมโนโคลนอลแอนติบอดี โปรตีนเอ็กซ์พีอาร์ ปุริฟ. 2551, 59, 138–143. [ครอสอ้างอิง]

48. วอร์ด อีเอส; กุสโซว ด.; กริฟฟิธส์ โฆษณา; โจนส์ พีที; ฤดูหนาว, G. กิจกรรมการเชื่อมโยงของโดเมนตัวแปรอิมมูโนโกลบูลินเดี่ยวที่หลั่งจาก Escherichia coli ธรรมชาติ 1989, 341, 544–546. [ครอสอ้างอิง]

49. ฮาเมอร์ส-แคสเตอร์แมน ซี.; อาทาฮูช, ต.; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; โรบินสัน ก.; แฮมเมอร์ส ค.; ซองกา, EB; เบนดาห์แมน น.; Hammers, R. แอนติบอดีที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติปราศจากสายโซ่เบา ธรรมชาติ 1993, 363, 446–448. [ครอสอ้างอิง]

50. กรีนเบิร์ก, AS; อวิลา ด.; ฮิวจ์ ม.; ฮิวจ์ อ.; แมคคินนีย์ อีซี; Flajnik, MF ตระกูลยีนตัวรับแอนติเจนใหม่ที่ได้รับการจัดเรียงใหม่และการกระจายตัวของร่างกายในฉลามอย่างกว้างขวาง แนท. เซลล์ไบโอล 1995, 374, 168–173. [ครอสอ้างอิง]

51. เดอ เมเยอร์ ต.; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; Depicker, A. ผลิตภัณฑ์ที่ใช้ Nanobody เป็นเครื่องมือในการวิจัยและวินิจฉัย เทรนด์ไบโอเทคโนโลยี 2014, 32, 263–270. [ครอสอ้างอิง]

52. Skerra, A. โครงสร้างที่ไม่ใช่แอนติบอดีทางเลือกสำหรับการรับรู้ระดับโมเลกุล สกุลเงิน ความคิดเห็น. เทคโนโลยีชีวภาพ 2007, 18, 295–304. [ครอสอ้างอิง]

53. มอยล์เดอร์มานส์ ส.; บาราล ต.; เรตามอซโซ, วีซี; เดอ เบตเซลิเยร์, ป.; เดอ เกนสต์ อี.; คินน์ เจ.; ลีออนฮาร์ด, เอช.; มาเจซ ส.; เหงียน ว.; รีเวทส์, เอช.; และคณะ อิมมูโนโกลบูลินแบบคาเมลิดและเทคโนโลยีนาโนบอดี้ สัตวแพทย์. อิมมูนอล. อิมมูโนพาทอล. 2009, 128, 178–183. [ครอสอ้างอิง]

54. รอธบาวเออร์ ส.; โซลกาดร์, เค.; ทิลลิบ ส.; โนวัก ดี.; เชอร์เมลเลห์, ล.; กอล, อ.; แบ็คแมนน์ น.; คอนราธ, เค.; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; คาร์โดโซ พิธีกร; และคณะ การกำหนดเป้าหมายและติดตามแอนติเจนในเซลล์ที่มีชีวิตด้วยนาโนบอดีฟลูออเรสเซนต์ แนท. วิธีการ 2549, 3, 887–889 [ครอสอ้างอิง]

55. คูบาลา, MH; คอฟตุน โอ.; อเล็กซานดรอฟ เค.; Collins, BM การวิเคราะห์โครงสร้างและอุณหพลศาสตร์ของ GFP: GFP-nanobody complex โปรตีนวิทยา 2010, 19, 2389–2401. [ครอสอ้างอิง]

56. ฝาง จ.; เฉา ด.; Qiu, J. การพัฒนาและการผลิตนาโนบอดีโดยเฉพาะกับโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ใบสมัคร ไมโครไบโอล เทคโนโลยีชีวภาพ 2020, 104, 4837–4848. [ครอสอ้างอิง]

57. เคียร์ชโฮเฟอร์ อ.; เฮลมา เจ.; ชมิดธาลส์, เค.; เฟราเออร์, ซี.; ชุย ส.; คาร์เชอร์, อ.; เปลลิส ม.; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; คาซาส-เดลุชชี, ซีเอส; คาร์โดโซ พิธีกร; และคณะ การปรับคุณสมบัติโปรตีนในเซลล์ที่มีชีวิตโดยใช้นาโนบอดี แนท. โครงสร้าง โมล ไบโอล 2009, 17, 133–138. [ครอสอ้างอิง]

58. รอธบาวเออร์ ส.; โซลกาดร์, เค.; มอยล์เดอร์มานส์ ส.; เชปเปอร์ส, อ.; คาร์โดโซ พิธีกร; Leonhardt, H. A Nanotrap อเนกประสงค์สำหรับการศึกษาทางชีวเคมีและการทำงานด้วยโปรตีนฟิวชั่นเรืองแสง โมล เซลล์ โปรตีโอม. 2008, 7, 282–289. [ครอสอ้างอิง]

59. ฟรายดี้ พี.; หลี่ย.; คีแกน ส.; ทอมป์สัน เอ็มเค; นูเดลแมน, ไอ.; ไชด์ เจเอฟ; โอฟิงเกอร์, ม.; นุสเซนไวก์ พิธีกร; เฟนโย, ด.; ชายิต, BT; และคณะ ไปป์ไลน์ที่แข็งแกร่งสำหรับการผลิตนาโนบอดีอเนกประสงค์ที่รวดเร็ว แนท. วิธีการ 2014, 11, 1253–1260 [ครอสอ้างอิง]

60. จาง จ.; วังย.; ติ๊ง ย.; Hattori, M. วิศวกรรมที่ใช้โครงสร้างของนาโนบอดี้ต่อต้าน GFP ควบคู่กันเป็นรีเอเจนต์ที่มีความสัมพันธ์สูงเป็นพิเศษสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. ทไวร์ อ.; อัล-โอคลา ส.; ม.ซาร์กาวี.; Abbady, AQ การแสดงลักษณะเฉพาะของนาโนบอดีอูฐซึ่งจำเพาะสำหรับโปรตีนฟิวชั่น GFP ของซุปเปอร์โฟลเดอร์ โมล ไบโอล ตัวแทน 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. จง ป.; วังซ.; เฉิง ส.; จาง ย.; เจียง เอช.; หลิวร.; Ding, Y. ข้อมูลเชิงลึกเชิงโครงสร้างเกี่ยวกับนาโนบอดีสองตัวที่แตกต่างกันซึ่งรับรู้ถึงเอพิโทปเดียวกันของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. โจว เอ็กซ์.; เฮาร.; เฉิน ค.; ซู ซ.; จ้าว ล.; หลัว ซ.; Xie, W. การจัดส่งนาโนบอดี/VHHs อย่างรวดเร็วเข้าสู่เซลล์ที่มีชีวิตผ่านการแสดง mRNA ที่ถอดความในหลอดทดลอง โมล คลินิกหมอ-เมธอด. นักพัฒนา 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. เหว่ย ล.; วัง ม.; เซียง เอช.; เจียงย.; กง เจ.; ซู ด.; อัลอาซาด, MAR; ดงฮ.; เฟิง ล.; วูเจ.; และคณะ ฉลามไม้ไผ่เป็นสัตว์ทดลองขนาดเล็กสำหรับการผลิตแอนติบอดีโดเมนเดียว ด้านหน้า. ไบโอเอ็ง. เทคโนโลยีชีวภาพ 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. หลี่ ส.; ฉาน เอช.; วัง ต.; เจิ้งเอ็กซ์.; ชิ ม.; เฉินบี.; ลู เอช.; จาง ย.; จ้าว ส.; Hua, Z. การสร้างนาโนบอดี้ที่จับกับโปรตีนเรืองแสง mWasabi ก้น ไบโอเคม 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. รีส เจ.; แคปแลน ค.; พลาโตโนวาอี.; เอกลิดี HM; Ewers, H. วิธีการที่เรียบง่ายและหลากหลายสำหรับกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษที่ใช้ GFP ผ่านทางนาโนบอดี แนท. วิธีการ 2012, 9, 582–584 [ครอสอ้างอิง]

67. เบเกน อี.; Gettemans, J. เทคโนโลยี Nanobody: ชุดเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ การวิเคราะห์ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีน และการสำรวจฟังก์ชันโปรตีน ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. พลาโตโนวา อี.; วินเทอร์ฟลัด, CM; จูนมันน์, อ.; อัลเบรชท์ ดี.; แฟกซ์ เจ.; Ewers, H. กล้องจุลทรรศน์โมเลกุลเดี่ยวของโมเลกุลที่ติดแท็กด้วยอนุพันธ์ GFP หรือ RFP ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยใช้สารยึดเกาะนาโน วิธีการ 2015, 88, 89–97. [ครอสอ้างอิง]

69. เฮิร์ซ, HD; ชูมัคเกอร์ ดี.; ชไนเดอร์ เอเอฟ; ลุดวิก อลาสก้า; แมนน์ เอฟเอ; ฟิลลีส์ ม.; แคสเปอร์ ม.-ก.; ไรน์เก้ ส.; กรอส อี.; ลีออนฮาร์ด, เอช.; และคณะ นาโนบอดีที่ซึมผ่านเซลล์ได้สำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันแบบกำหนดเป้าหมายและการจัดการแอนติเจนในเซลล์ที่มีชีวิต แนท. เคมี. 2017, 9, 762–771. [ครอสอ้างอิง]

70. เพย์น นอร์ทแคโรไลนา; Mazitchek, R. Tiny Titans: นาโนบอดีเป็นเครื่องมืออันทรงพลังสำหรับการพัฒนาการทดสอบ TR-FRET ก้น เซนเซอร์ 2022, 2, e202200020. [ครอสอ้างอิง]

71. เวนเดล ส.; ฟิสเชอร์ อีซี; มาร์ติเนซ, วี.; เซ็ปปาลา ส.; Nørholm, MHH A nanobody: แพลตฟอร์มแบคทีเรีย GFP ที่ช่วยให้สามารถแสดงเอนไซม์ที่ใช้งานได้และวัดปริมาณความจุในการแสดงผลได้ง่าย ไมโครบ. โรงงานเซลล์ 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. ไซทซ์ เคเจ; นาโนบอดีของ Rizzoli, SO GFP เผยโมเลกุล pHluorin ที่เพิ่งถูกเอ็กโซไซโตส วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. คอสซินัส อี.; กาญจนา โอ.; Affolter, M. ฟลูออเรสเซนต์ฟิวชันโปรตีนที่น่าพิศวงโดยสื่อกลางโดยนาโนบอดี้ต่อต้าน GFP แนท. โครงสร้าง โมล ไบโอล 2011, 19, 117–121. [ครอสอ้างอิง]

74. ชิน วายเจ; พาร์ค, SK; จุง วายเจ; นาคิม, ย.; คิม แคนซัส; ปาร์ค โอเค; ควอน S.-H.; จอน ช.; ทรินห์, ลอสแอนเจลิส; เฟรเซอร์ ส.; และคณะ E3-ubiquitin ligase เชิงซ้อนที่มีเป้าหมายนาโนจะสลายโปรตีนนิวเคลียร์ วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. บอดิช บ.; ฟอร์ท, I.; ซอร์จ อี.; Conrad, U. การย่อยสลายโปรตีนโดยอาศัยนาโนบอดีโดย 26S-Proteasome ในพืช ด้านหน้า. วิทยาพืช 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. เคร้าเชอร์ DR; อิโคโนมู ม.; เฮสติ้งส์ เจเอฟ; เคนเนดี, เอสพี; ฮัน เจซีอาร์; เชียเรอร์ RF; แมคเคนนา เจ.; วรรณ อ.; เลา เจ.; อาปาริซิโอ ส.; และคณะ การทำให้บริสุทธิ์ด้วยสัมพรรคภาพการเสริมทางชีวโมเลกุล (BiCAP) เผยอันตรกิริยาของโปรตีนที่จำเพาะต่อไดเมอร์สำหรับไดเมอร์ ERBB2 วิทยาศาสตร์ สัญญาณ. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. ถัง เจซี; ซิกรา ต.; Kozorovitskiy, Y.; เตเซรา ม.; ซาบาตินี บีแอล; รอสก้า บ.; Cepko, CL ระบบที่ใช้นาโนบอดีโดยใช้โปรตีนเรืองแสงเป็นโครงสำหรับการจัดการยีนเฉพาะเซลล์ เซลล์ 2013, 154, 928–939 [ครอสอ้างอิง]

78. ซอมเมส RF; ฮาเรียดี RF; คิมเค; หลิว ม.; ทิสก้า, เอ็มเจ; Sivaramakrishnan, S. การสร้างโปรตีนเชิงซ้อนบนโครงสร้างนาโน DNA โดยใช้ GFP nanobody โปรตีนวิทยา 2016, 25, 2089–2094. [ครอสอ้างอิง]