Phosphoinositide 3-kinase Inhibitor Alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ฟื้นฟูการจัดระเบียบของ actin และปรับปรุงความผิดปกติของหลอดทดลองในหลอดทดลองและในรูปแบบเมาส์ของโรค Lowe และ Dent

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

มารีน เบอร์เกซ^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, เบียทริซ เปาลา เฟสต้า^1,5, ริชาร์ด บัตเลอร์³ , Stephen P. Jackson², วาเลเรีย เบอร์โน⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6และเจนนิเฟอร์ แอล. กัลลอป^2,6

คำสำคัญ: โครงร่างเซลล์; เอนโดไซโทซิส; ไขมัน; หลอดใกล้เคียง; ไต Fanconi ดาวน์ซินโดรม

การกลายพันธุ์ที่สูญเสียจากการทำงานในยีน OCRL ซึ่งเข้ารหัส phosphatidylinositol [PI] 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] 5-phosphatase OCRL ทำให้เกิด endocytosis บกพร่องและความผิดปกติของท่อใกล้เคียง ในโรคโลว์และโรคบุ๋ม2. ข้อบกพร่องเกิดจากการเพิ่มระดับของ PI(4,5)P2 และแอกตินโพลิเมอไรเซชันที่ผิดปกติ ซึ่งขัดขวางการค้ามนุษย์จากเอนโดโซม PI 3-ฟอสเฟต [PI(3)P] ได้รับการระบุเมื่อเร็วๆ นี้ว่าเป็นโคแอคติเวเตอร์ที่มี PI(4,5)P2 ในวิถีแอคติน เราทดสอบสมมติฐานที่ว่าฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนสสารยับยั้ง (PI3K) อาจช่วย endocytic บกพร่องที่เกิดจากการสูญเสีย OCRL โดยการปรับสมดุลสัญญาณ phosphoinositide ไปยังเครื่องจักรของ actin PI3K ที่หลากหลาย (ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ตัวยับยั้ง copanlisib และคลาส IA p110a PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส) สารยับยั้ง alpelisibลดการโพลิเมอไรเซชันของแอคตินที่ผิดเพี้ยนในเซลล์ไตของมนุษย์ที่ขาด OCRL ในหลอดทดลอง ระดับของ PI 3,4,5-trisphosphate, PI(4,5) P2 และ PI(3)P ทั้งหมดลดลงด้วยการบำบัดด้วยอัลเปลิซิบ และการล้มลงของ siRNA ของหน่วยย่อยตัวเร่งปฏิกิริยา p110a ของ PI3K ได้จำลองฟีโนไทป์ของแอคติน ในแบบจำลองหนูเมาส์ OcrlY/- ที่มนุษย์สร้างขึ้น alpelisib ลดการย้อมสีแอคตินเอนโดโซมในขณะที่ฟื้นฟูสถาปัตยกรรมของเส้นใยความเครียดและระดับของเมกาลินที่พลาสมาเมมเบรนของเซลล์ทูบูลใกล้เคียง สะท้อนโดยการดูดซึมเอนโดไซติกที่ดีขึ้นของโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลต่ำในร่างกาย ดังนั้น การค้นพบของเราสนับสนุนความเชื่อมโยงระหว่างลิปิดฟอสโฟโนซิไทด์ แอกตินโพลิเมอไรเซชัน และการค้ามนุษย์ภายในเซลล์ในท่อใกล้เคียงโรคโลว์/โรคบุ๋ม2.

คำชี้แจงการแปล

โรคโลว์และโรคบุ๋ม2 เกิดจากการกลายพันธุ์ในฟอสโฟอิโนซิไทด์ ลิปิด 5-ฟอสฟาเตส OCRL ที่แสดงอาการผิดปกติของท่อใกล้เคียงและโปรตีนในปัสสาวะที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ โดยมีการดูแลแบบประคับประคองเท่านั้น ผลการวิจัยของเราเปิดเผยว่าฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส สารยับยั้ง alpelisibซึ่งปัจจุบันได้รับการอนุมัติสำหรับการรักษาโรคมะเร็ง บรรเทาความสมดุลของฟอสโฟโนซิไทด์ที่ผิดปกติและฟีโนไทป์ของแอคตินที่เกี่ยวข้องกับการสูญเสีย OCRL ทำให้เกิดการปรับปรุงอย่างมากของเครื่องจักร endocytic และความสามารถในการดูดซับในระบบเซลล์และแบบจำลองหนูเมาส์สำหรับกลุ่มอาการโลว์/โรคบุ๋ม 2 ด้วยโปรไฟล์ความปลอดภัยที่ชัดเจน alpelisib เป็นตัวเลือกที่มีแนวโน้มสำหรับการนำยากลับมาใช้ใหม่โรคโลว์และโรคบุ๋ม.

เซลล์เยื่อบุผิวที่บุท่อส่วนต้น (proximal tubules) ของไตมีวิถีทางเอนโดไลโซโซมที่อาศัยตัวรับที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งจะกู้คืนและประมวลผลสารสำคัญที่กรองผ่านโกลเมอรูลัส ความผิดปกติแต่กำเนิดที่ส่งผลต่อเอนโดลีโซโซมทำให้เกิดความผิดปกติของ PT (กลุ่มอาการของไต Fanconi) ที่มีการสูญเสียตัวละลายในปัสสาวะและโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ (LMW) ซึ่งมักจะซับซ้อนจากภาวะแทรกซ้อนทางเมตาบอลิซึมและการเจริญเติบโตและการพัฒนาของโรคไตเรื้อรัง¹การยับยั้งการกลายพันธุ์ใน OCRL มีความเกี่ยวข้องกับโรค Dent 2 (MIM #300555) ความผิดปกติที่มีลักษณะผิดปกติของ PT, นิ่วในไต และภาวะไตวายแบบลุกลาม และกับกลุ่มอาการเกี่ยวกับดวงตาของ Lowe (MIM #309000) ซึ่งแสดงให้เห็นด้วย ความผิดปกติของ PT และไตวาย อาการทางระบบ เช่น ต้อกระจก แต่กำเนิด ความบกพร่องทางสติปัญญา และภาวะ hypotonia^2-4การรักษาในปัจจุบันสำหรับ Dent disease 2 และ Lowe syndrome เป็นเพียงการประคับประคองเท่านั้น

รูปที่ 1|PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งช่วยลดการรวมตัวของแอคตินที่ผิดปกติที่เอนโดโซมในแบบจำลองเซลล์ไตของมนุษย์ที่ขาด OCRL (HK2) (a) ขั้นตอนของการแปลงไขมันฟอสโฟโนซิไทด์ที่เกี่ยวข้องกับการศึกษานี้ซึ่งบ่งชี้การเปลี่ยนแปลงระหว่าง PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 และ PI(3)P ที่มีเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องมากที่สุดเป็นตัวหนาและมีความเกี่ยวข้องมากที่สุด การแปลงเป็นเส้นทึบและอื่น ๆ ในเส้นประ PI(4,5)P2 สูงขึ้นในกลุ่มอาการ Lowe เนื่องจากขาด 5-กิจกรรมของฟอสฟาเตสจาก OCRL และทำจากฟอสโฟรีเลชันของ PI โดย phosphatidylinositol 4-kinases (PI4Ks) และ PI(4) พี 5-ไคเนส (PIP5K) PI(4,5)P2 ถูกฟอสโฟรีเลตโดย PI3K คลาส I เพื่อผลิต PI(3,4,5)P3 PI(3,4,5)P3 สามารถดีฟอสโฟรีเลตเป็น PI(4,5)P2 โดย PTEN หรือถึง PI(3,4)P2 โดย SH-2 ซึ่งมีอิโนซิทอล 50 โพลีฟอสเฟต (SHIP) 1 และ 2 synaptojanin 1 และ 2 และ OCRL แม้ว่าจะเป็น (ต่อ)

รูปที่ 1|(ต่อ) ถือว่ายังน้อยอยู่ PI(3,4)P2 ถูก dephosphorylated เป็น PI(3)P โดย inositol polyphosphate-4-phosphatase type IA (INPP4A) และ B. PI(3)P ยังสร้างที่เอนโดโซมผ่านฟอสโฟรีเลชั่นของ PI ตามคลาส III PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส), โปรตีนคัดแยกแบบแวคิวโอลาร์ Vps34. (b) Western blots ที่แสดงให้เห็นการสูญเสียการแสดงออกของ OCRL ในสายเซลล์ HK2 OCRL CRISPR Knockout (KO) ที่เปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม HK2 ชนิดพันธุ์ป่า (WT) ที่มีทูบูลินเป็นตัวควบคุมการโหลด (c–e) ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของ Airyscan และการหาปริมาณของเอนโดโซมแอนติเจน 1 (EEA1)/แอกตินคาบเกี่ยวกัน (แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของถุงน้ำ EEA1þ ที่ตรวจพบทั้งหมด) สำหรับเซลล์ HK2 WT หรือ OCRL KO ที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) (d) หรือตัวยับยั้งที่ระบุและตรึงโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ฟิกซ์ 4 เปอร์เซ็นต์ ในทุกกรณี รูปภาพแสดง z-slice อันเดียวจากสแต็กคอนโฟคอลของเซลล์ที่เคลือบด้วยอิมมูโนด้วย Airyscan ที่ติดฉลากสำหรับ EEA1 (สีเหลือง), ลึงค์ (แอกติน, สีม่วงแดง) และ 40,6-diamidino{ {14}}ฟีนิลลินโดล (DAPI) (สีฟ้า) แท่ง=5 มม. ในการหาปริมาณ เส้นระบุค่ากลาง±SEM และจุดข้อมูลแต่ละจุดเป็นเซลล์แต่ละเซลล์ ในการทดลองทั้งหมด ใช้การรักษา 16 ชั่วโมงก่อนการตรึง ในการหาปริมาณทั้งหมด นัยสำคัญทางสถิติได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนของ Kruskal-Wallis (KW) ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunn (c) เซลล์ WT หรือ KO ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ 100 นาโนโมลาร์ของโคแพนลิซิบ แสดงให้เห็นถึงการช่วยเหลือของการทับซ้อนกันของแอคติน-เอนโดโซม การทดสอบ KW: ***P < 0.0{{50}}1="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" copanlisib="" ทั้ง="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" เทียบกับ="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (ไม่สำคัญ="" [ns])="" n="52," 85,="" 67="" และ="" 63="" เซลล์สำหรับ="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" และ="" ko="" copanlisib="" ตามลำดับ="" (d)="" เซลล์="" wt="" หรือ="" ko="" ที่บำบัดด้วย="" dmso="" หรือ="" alpelisib="" 10="" มิลลิโมลาร์="" แสดงให้เห็นถึงการช่วยเหลือของการทับซ้อนกันของแอกติน-เอนโดโซม="" การทดสอบ="" kw:="" ***="" p="">< 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" alpelisib="" ทั้งคู่="" ***p="">< 0.001,="" wt="" alpelisib="" เทียบกับ="" ko="" alpelisib="" p=""> 0.99 (ns) N=31, 30, 43 และ 41 เซลล์สำหรับ WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO และ KO alpelisib ตามลำดับ (จ) เซลล์ WT หรือ KO ที่บำบัดด้วย DMSO, GSK2636771 10 มิลลิโมลาร์ หรืออิเดลาลิซิบ 10 มิลลิโมลาร์ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าสารประกอบทั้งสองชนิดไม่สามารถลดการทับซ้อนของแอคติน-เอนโดโซมได้อย่างมีนัยสำคัญ การทดสอบ KW: *** P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0.001,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0.99 (ns) N=159, 130, 203, 122, 131 และ 145 เซลล์สำหรับ WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 และ KO idelalisib ตามลำดับ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

โปรตีนในปัสสาวะของ LMW เป็นลักษณะเฉพาะที่สังเกตได้ในกลุ่มอาการโลว์/โรคบุ๋ม 2 ซึ่งเผยให้เห็นว่า OCRL ส่งผลต่อเอนโดไซโทซิสที่อาศัยตัวรับ⁵OCRL เข้ารหัส phosphatidylinositol (PI) 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] 5- phosphatase OCRL,⁶ซึ่งควบคุมเอกลักษณ์ของไขมันในวิถีเอนโดไลโซโซมโดยการย่อยสลาย PI(4,5)P2 (รูปที่ 1a) การเสื่อมสภาพที่บกพร่องของ PI(4,5)P2 ผ่าน OCRL นั้นเกี่ยวข้องกับความล้มเหลวในการเคลือบถุงที่เคลือบด้วยคลาทรินในไฟโบรบลาสต์ ควบคู่ไปกับการก่อตัวของโครงสร้าง "ดาวหาง" ของแอคตินที่เป็นเส้นใยโพลีเมอร์จากออร์แกเนลล์ที่มีลักษณะเหมือนเอนโดโซมช่วงต้นที่ผิดเพี้ยน^7-9ในเซลล์ประเภทอื่นๆ โดยเฉพาะเซลล์ PT ของไต การขาด OCRL ส่งผลให้เกิดโครงสร้าง "ตะกร้า" ของ F-actin ที่ล้อมรอบออร์แกเนลล์เอนโดไลโซโซมที่ผิดปกติ¹⁰F-actin ที่มากเกินไปจะขัดขวางการลักลอบค้าเมมเบรนผ่านทาง endocytic และ endolysosomal pathway และแนะนำให้ลดการรีไซเคิลเมกาลินรีเซพเตอร์มัลติลิแกนด์ไปยังเยื่อหุ้มปลาย ซึ่งทำให้ข้อบกพร่องภายในทางเดินเอนโดไลโซโซมแย่ลง¹¹ตามข้อตกลงกับบทบาทที่สำคัญของ F-actin ที่ผิดปกติ การรับ endocytic ที่บกพร่องซึ่งเกิดจากการกลายพันธุ์ของ OCRL จะได้รับการบรรเทาโดยการกำหนดเป้าหมายเครื่องจักรของ actin ด้วย latrunculin B หรือโดยการทำลายโปรตีนควบคุมของ actin รวมทั้ง RNA ที่รบกวน (siRNA) ซึ่งเป็นสื่อกลางที่มีขนาดเล็ก ของ PI(4)P 5-kinase เพื่อปรับการสังเคราะห์ PI(4,5)P2^7,10(รูปที่ 1a).

การเกิดพอลิเมอไรเซชันของ Actin เป็นที่เข้าใจมากขึ้นว่าเกิดขึ้นไม่เพียงแค่จาก PI(4,5)P2 เท่านั้น แต่ยังมาจากลิปิดฟอสโฟโนซิไทด์อื่นๆ ด้วย ตัวอย่างเช่น PI(3,4,5)P3 กระตุ้น Rho-type GTPase Rac และ PI(3)P ทำงานร่วมกับ PI(4,5)P2 เพื่อกระตุ้นแอกตินโพลิเมอไรเซชันดาวน์สตรีมของ Rho-type GTPase, Cdc42 อีกชนิดหนึ่ง^12-14การแปลงระหว่างฟอสโฟโนซิไทด์เหล่านี้ควบคู่ไปกับการเคลื่อนที่ของไขมันผ่านทางเดินภายในและเอนโดโซม PI(4,5)P2 ถูกฟอสโฟรีเลตโดยคลาส I ฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล- 30 -ไคเนส (PI3K) ถึง PI(3,4,5)P3 ที่พลาสมาเมมเบรนและค่อยๆ สลายฟอสโฟรีเลตเป็น PI(3,4)P2 และ PI (3)P หรือ PI(4,5)P2^14,15PI(3)P ได้รับการเสริมสมรรถนะที่เอนโดโซม ซึ่งจำเป็นสำหรับหน้าที่ของพวกมัน และส่วนใหญ่สร้างขึ้นโดยฟอสโฟรีเลชันของ PI โดยตรงโดยคลาส III PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส), Vps34¹⁶(รูปที่ 1a). ในเซลล์เซลล์เยื่อบุผิวที่มีเม็ดสีเรตินอล (RPE) ที่จอตาขาด OCRL ดาวหางแอคตินที่สร้างขึ้นจะลดลงโดยการรักษาด้วย PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้ง wortmannin และ Vps34-IN1 ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาทางชีวเคมีที่แสดงการควบคุมแกนกลางของแอกตินผ่านทางความบังเอิญของทั้ง PI(3)P และ PI(4,5)P2¹⁴

การช่วยเหลือ endocytosis สังเกตได้เมื่อกำหนดเป้าหมายเครื่องจักรแอคตินในเซลล์ผู้ป่วย OCRL และน็อคเอาท์ (KO)^7,10ร่วมกับการควบคุมต้นน้ำของแอคตินโดย PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)กิจกรรม¹⁴และลักษณะที่เชื่อมโยงถึงกันอย่างสูงของการแปลง PI ให้ความเป็นไปได้ที่น่าสนใจที่คลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งอาจมีประโยชน์ในกลุ่มอาการโลว์ สารยับยั้งดังกล่าว ซึ่งพัฒนาขึ้นสำหรับการรักษามะเร็ง ได้รับการอนุมัติสำหรับการใช้งานทางคลินิก¹⁷และอาจคล้อยตามการนำยากลับมาใช้ใหม่ได้ แม้ว่าสารประกอบเช่นโคปันลิซิบ¹⁸มีความจำเพาะและผลข้างเคียงในวงกว้าง ความสำเร็จล่าสุดได้รับการพิสูจน์แล้วสำหรับสารยับยั้งที่จำเพาะเจาะจงมากขึ้น อิเดลาลิซิบ¹⁹ซึ่งกำหนดเป้าหมาย PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)หน่วยย่อย p110d ได้รับการอนุมัติสำหรับมะเร็งต่อมน้ำเหลืองลิมโฟซิติกเรื้อรัง และ alpelisib ซึ่งมีเป้าหมายที่ p110a ได้รับการอนุมัติให้ใช้ในมะเร็งเต้านม^20,21นอกจากนี้ alpelisib ยังแสดงให้เห็นประโยชน์ทางคลินิกในเด็กที่มีอาการ PROS/CLOVES²²กลุ่มอาการ overgrowth ที่หายากซึ่งเป็นผลมาจากการกระตุ้น PIK3A

ที่นี่เราทดสอบสมมติฐานว่าคลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งอาจช่วยชีวิตข้อบกพร่องของ endocytic เนื่องจากการสูญเสีย OCRL โดยใช้แบบจำลองเซลล์และเมาส์ที่จัดตั้งขึ้น^10,11,23เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)กิจกรรมผ่าน copanlisib หรือ alpelisib หรือการพร่องที่อาศัย siRNA ของหน่วยย่อยตัวเร่งปฏิกิริยา p110a ที่เป็นเป้าหมายของ alpelisib ช่วยลดการเกิดปฏิกิริยาโพลิเมอไรเซชันที่มากเกินไปในเซลล์ไตของมนุษย์ (HK2) ที่ขาด OCRL โดยเน้นที่ alpelisib เป็นสารประกอบที่จำเพาะที่สุดสำหรับการใช้งานทางคลินิก เราแสดงให้เห็นว่าช่วยลดการเกิดปฏิกิริยาโพลิเมอไรเซชันของแอคตินและปรับปรุงการดูดซึมผ่านวิถีเอนโดไลโซโซมในเซลล์ PT จาก Ocrl ที่มนุษย์สร้างขึ้น^Y/-หนูในหลอดทดลอง นอกจากนี้ การรักษาด้วย alpelisib ในร่างกาย ช่วยลดโปรตีนในปัสสาวะ ลดความผิดปกติของ PT และช่วยระดับเซลล์ของเมกาลินใน Ocrl ที่มนุษย์สร้างขึ้น^Y/-หนู ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุน alpelisib ในฐานะผู้สมัครสำหรับการนำยากลับมาใช้ใหม่โรคโลว์และโรคบุ๋ม 2.

รูปที่ 2|ผลกระทบของอัลเปลิซิบต่อแอคตินนั้นตอบสนองต่อขนาดยาและสรุปโดย siRNA ของ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)หน้า110ก. (a) ไมโครกราฟคอนโฟคอล Airyscan ที่เป็นตัวแทน (แก้ไขโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับเอนโดโซมแอนติเจน 1 [EEA1] ระยะแรก สีเหลือง; แอคติน [ลึงค์], สีม่วงแดง; และ 4{{40}}},{{ 5}}diamidino-2-phenylindole [DAPI], cyan; bar=5 mm) และการหาปริมาณของ wild-type (WT) หรือ Knockout (KO) เซลล์ไตของมนุษย์ (HK2) ที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรือขนาดยาอัลเปลิซิบที่ระบุเป็นเวลา 16 ชั่วโมง ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการช่วยเหลือที่ตอบสนองต่อขนาดยาของการทับซ้อนกันของแอคติน-เอนโดโซม ในทุกกรณี เส้นระบุค่าเฉลี่ย±SEM และจุดระบุแต่ละเซลล์ N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 และ 67 เซลล์สำหรับตัวควบคุม WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , และ KO 2.5, 5, 10, 15, 25 และ 50 mM alpelisib ตามลำดับ นัยสำคัญทางสถิติประเมินโดยการทดสอบ Kruskal-Wallis (KW) ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunn: โดยรวม *** P < 0.001="" การเปรียบเทียบแบบพหุคูณ="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" และ="" 50="" mm="" alpelisib="" ทั้งหมด="" ***p="">< 0.001,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" 2.5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" เทียบกับทั้ง="" wt="" 10="" และ="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0.9999 (ไม่สำคัญ [ns]) (b) Western blot สำหรับ p110a และสารควบคุมการโหลด a-tubulin ของเซลล์ WT หรือ KO ที่บำบัดด้วยการแย่งชิง (Scram.) หรือ p110a siRNA (c) ไมโครกราฟคอนโฟคอล Airyscan ที่เป็นตัวแทน (แก้ไขโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับ EEA1, สีเหลือง; แอคติน [ลึงค์], สีม่วงแดง; และ DAPI, สีฟ้า; แท่ง=5 มม.) และการหาปริมาณของเซลล์ WT หรือ KO ที่บำบัด ด้วยช่วงชิง (S) หรือ p110a siRNA อย่างใดอย่างหนึ่ง ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการลดลงของ EEA1-actin ที่ทับซ้อนกับการพร่องของ p110a การทดสอบ KW ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunn: ***P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" การแย่งชิง="" wt="" กับการแย่งชิง="" ko="" การแย่งชิง="" ko="" กับ="" ko="" p110a="" sirna="" ทั้งคู่="" ***="" p="">< 0.001="" ยังไม่มีข้อความ="79," 108,="" 93="" และ="" 131="" เซลล์ตามลำดับ="" hk2,="" ไตของมนุษย์;="" pi3k,="" ฟอสฟาติดิลโนซิทอล-30="" -ไคเนส;="" sirna="" อาร์เอ็นเอขนาดเล็กที่รบกวน="" หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้="" โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่="">

รูปที่ 3|ระดับของฟอสฟาติดิลโนซิทอล (PI) 4,5-บิสฟอสเฟต [PI(4,5)P2] สูงขึ้นด้วย OCRL knockout (KO) และ PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 และ PI(3)P ถูกระงับโดยการรักษาด้วยอัลเปลิซิบ ในการทดลองทั้งหมด การรักษาที่ระบุถูกนำไปใช้ 16 ชั่วโมงก่อนการตรึง ในการหาปริมาณ เส้นระบุค่ากลาง±SEM และจุดข้อมูลแต่ละจุดเป็นผลมาจากเซลล์แต่ละเซลล์ ในการหาปริมาณทั้งหมด นัยสำคัญทางสถิติได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนของ Kruskal-Wallis (KW) ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunn บาร์=20มม. ในทุกภาพ (a) ไมโครกราฟที่เป็นตัวแทนของไวด์ฟิลด์ชนิด wild-type (WT) หรือ KO ของมนุษย์ในไต (HK2) ที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรืออัลเปลิซิบ 10 มิลลิโมลาร์ จากนั้นตรึงด้วยฟิฟิกซ์เมมเบรนในพลาสมาและติดฉลากอิมมูโนสำหรับ PI(3,4,5) )P3 (สีแดง) และ 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (สีฟ้า) ด้วยการหาปริมาณของความเข้มของการติดฉลาก P3 ที่มีค่าเฉลี่ยของเซลล์ PI(3,4,5)P3 ซึ่งแสดงประสิทธิผลของ alpelisib การบำบัดด้วยการสังเคราะห์ PI(3,4,5)P3 N=96, 128 และ 109 เซลล์สำหรับ WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO และ KO alpelisib ตามลำดับ กิโลวัตต์ (ต่อ)

รูปที่ 3|(ต่อ) การทดสอบ: โดยรวม ***P < 0.001,="" การเปรียบเทียบหลายรายการ;="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" wt="" alpelisib="" และ="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" alpelisib="" ทั้งหมด="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของเซลล์="" wt="" หรือ="" ko="" hk2="" ที่บำบัดด้วย="" dmso,="" 10="" mm-="" หรือ="" 50-mm="" alpelisib="" เป็นเวลา="" 16="" ชั่วโมง="" จากนั้นตรึงด้วยโปรแกรมฟิกซ์="" golgi="" และติดฉลากโดยใช้="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" probe="" (magenta)="" และ="" dapi="" (cyan)="" พร้อมการหาปริมาณของ="" pi(3)p-positive="" puncta="" ที่ตรวจพบในเซลล์ที่บำบัดด้วยช่วงความเข้มข้นของ="" alpelisib="" ตามที่ระบุไว้="" การแสดง="" pi(3)p-positive="" punctae="" จะลดลงในลักษณะที่ตอบสนองต่อขนานยา="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" และ="" 215="" เซลล์สำหรับการควบคุม="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" และ="" ko="" 2.5,="" 5,="" 10,="" 25="" และ="" 50="" มิลลิโมลาร์="" อัลเปลิซิบ="" ตามลำดับ="" การทดสอบ="" kw:="" โดยรวม="" ***="" p="">< 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" wt="" 10="" และ="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" ทั้งหมด="" ***p="">< 0.001;="" ko="" dmso="" เทียบกับ="" ko="" 2.5="" และ="" 5="" mm="" alpelisib="" ทั้ง="" p=""> 0.9999 (ไม่สำคัญ [ns]); KO DMSO เทียบกับ KO 10 มิลลิโมลาร์ อัลเปลิซิบ **P=0.0049; KO DMSO เทียบกับ KO 25 มิลลิโมลาร์ อัลเปลิซิบ ***P=0.0002 (c) ไมโครกราฟไวด์ฟิลด์ที่เป็นตัวแทนของเซลล์ WT หรือ KO HK2 ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ 10 มิลลิโมลาร์ของอัลเปลิซิบ จากนั้นตรึงด้วยไฟฟิกซ์เมมเบรนในพลาสมาและติดฉลากอิมมูโนสำหรับ PI(4,5)P2 (สีเหลือง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ด้วยการหาปริมาณของ ค่าเฉลี่ยความเข้มของการติดฉลาก PI (4,5)P2 ของเซลล์ ซึ่งแสดงการเพิ่มขึ้นของพลาสมาเมมเบรน PI (4,5)P2 ในเซลล์ KO ซึ่งลดลงโดยการบำบัดด้วยอัลเปลิซิบ โดยเฉพาะในเซลล์ KO N=126, 112, 85 และ 116 เซลล์สำหรับ WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO และ KO alpelisib ตามลำดับ การทดสอบ KW: โดยรวม *** P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" กับ="" ko="" dmso="" และ="" ko="" dmso="" กับ="" ko="" alpelisib="" ทั้งคู่="" ***p="">< 0.001;="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns)="" (d)="" ไมโครกราฟแบบไวด์ฟิลด์ที่เป็นตัวแทนของเซลล์="" wt="" หรือ="" ko="" hk2="" ที่บำบัดด้วย="" dmso="" หรือ="" 10="" มิลลิโมลาร์ของอัลเปลิซิบ="" จากนั้นตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ไฟิกซ์="" 4="" เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับ="" pi(4,5)p2="" (สีเหลือง)="" และ="" dapi="" (สีน้ำเงิน)="" ด้วยการหาปริมาณ="" ของจำนวนของ="" pi(4,5)p2-="" puncta="" ที่เป็นบวก="" ซึ่งแสดง="" pi(4,5)p2="" puncta="" ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์="" ko="" ซึ่งลดลงโดยการบำบัดด้วย="" alpelisib="" โดยเฉพาะในเซลล์="" ko="" n="75," 65,="" 52="" และ="" 69="" เซลล์สำหรับ="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" และ="" ko="" alpelisib="" ตามลำดับ="" การทดสอบ="" kw:="" โดยรวม="" ***="" p="">< 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" wt="" dmso="" กับ="" ko="" dmso="" และ="" ko="" dmso="" กับ="" ko="" alpelisib="" ทั้งคู่="" ***p="">< 0.001;="" wt="" dmso="" เทียบกับ="" wt="" alpelisib="" p=""> 0.99 (ns) au หน่วยพล. หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

1. ผลลัพธ์

1.1 สารยับยั้ง PI3K คลาส I ลดการรวมตัวของแอคตินในเซลล์ OCRL-KO HK2

เราใช้การแก้ไขยีน CRISPR-Cas9 เพื่อทำให้น็อคเอาท์ (KO) OCRL ในเซลล์ HK2 เพื่อให้สามารถทดสอบคลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งลักษณะการรวมตัวของแอกตินที่ช่องเอนโดไลโซโซม^7,9,10,14Western blotting ตรวจสอบการลดลง 980± 0.7 เปอร์เซ็นต์ในการแสดงออกของ OCRL ในไลเสตจากเซลล์ KO HK2 (รูปที่ 1b) OCRL KO สรุปฟีโนไทป์ของตะกร้าแอคตินในเซลล์ HK2 ตามที่ระบุโดยการทับซ้อนกันที่เพิ่มขึ้นระหว่าง F-actin และแอนติเจนเอนโดโซม 1 (EEA1) ในระยะเริ่มต้น ซึ่งหาปริมาณบน z-stacks z-stacks ของกล้องจุลทรรศน์ Airyscan confocal microscopy (รูปที่ 1c–e) การทับซ้อนที่เพิ่มขึ้นนี้สังเกตพบในเซลล์ OCRL KO ถูกย้อนกลับโดยการรักษาด้วย copanlisib (C) ซึ่งเป็น PI3K ในวงกว้างฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งที่กำหนดเป้าหมาย p110a และ d และไอโซฟอร์ม p110b และ g ในระดับที่น้อยกว่า (รูปที่ 1c) โดยการซับแบบตะวันตกของสารสกัด HK2 ทั้งเซลล์ เราพบว่า PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)หน่วยย่อยควบคุม p110 a, b และ d ล้วนแสดงออกอย่างดีทั้งในเซลล์ไวด์ (WT) และ KO โดยมีระดับการติดตามของไอโซฟอร์ม p110g เท่านั้น (รูปที่ S1A เสริม)

เราแยกแยะ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ความจำเพาะของการยับยั้ง F-actin โดยใช้ alpelisib (A) สารยับยั้งการคัดเลือกของ p110a และ GSK2636771 (G) และ idelalisib (I) สารยับยั้งการคัดเลือกของ p110b และ p110d ตามลำดับ (รูปที่ S1A เพิ่มเติม) แม้ว่าการรักษาด้วย alpelisib จะให้การลดลงของเอนโดโซมอลแอกตินโพลิเมอไรเซชันที่คล้ายคลึงกันเมื่อเปรียบเทียบกับโคแพนลิซิบ (รูปที่ 1d) GSK2636771 และอิเดลาลิซิบมีผลเพียงเล็กน้อยต่อการสะสมแอคติน (รูปที่ 1e) คลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งไม่มีความเป็นพิษเพิ่มขึ้นต่อ OCRL KO เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ถูกดัดแปลง ตามการทดสอบ MTT (รูปที่ S1B เสริม)

1.2 Alpelisib และ p110a การล้มลงช่วยฟีโนไทป์ของแอคตินในเซลล์ HK2

สำหรับการศึกษาที่ตามมาของเรา เรามุ่งเน้นไปที่ alpelisib เนื่องจากเป็น PI3K ที่คัดเลือกมาดีที่สุดและเป็นพิษน้อยที่สุดฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งได้รับการพัฒนาจนถึงขณะนี้ และปัจจุบันใช้ในการรักษาโมเสก overactivation ของ PI3K class Ia ในเด็กที่มีอาการ PROS/CLOVES²²Alpelisib ลดตะกร้าแอคตินในเซลล์ OCRL KO HK2 ในลักษณะที่ตอบสนองต่อปริมาณรังสี (รูปที่ 2a) สังเกตผลกระทบที่ขนาดยา 10 มิลลิโมลาร์ ทันที 4 ชั่วโมงหลังการรักษา โดยไม่มีความเป็นพิษปรากฏชัด (รูปที่ S2) เสริม เพื่อทดสอบว่า PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)การยับยั้งโดย alpelisib เป็นสาเหตุของการย้อมสีแอคตินที่ลดลง เราลดเป้าหมายลงโดยเฉพาะ นั่นคือหน่วยย่อย p110a โดยใช้ siRNA (รูปที่ 2b) เมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วย siRNA กลุ่มควบคุม (ที่มีสัญญาณรบกวนตามลำดับ) siRNA เทียบกับ p110a ให้ผลการพร่องโปรตีน p110a 78.3±4.8 เปอร์เซ็นต์ และ 68.9±7.7 เปอร์เซ็นต์ในเซลล์ WT และ OCRL KO HK2 ตามลำดับ ซึ่งสะท้อนจากการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในตะกร้าแอคติน ( รูปที่ 2c)

1.3 ระดับที่ลดลงของ PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 และ PI(3)P ในเซลล์ HK2 ที่ได้รับการรักษาด้วย alpelisibtreated

เพื่อตรวจสอบว่าไขมันฟอสโฟโนซิไทด์ได้รับผลกระทบจากการรักษาด้วย OCRL KO และ alpelisib อย่างไร เราได้ย้อมสีเซลล์ HK2 ด้วยแอนติบอดีหรือโดเมนโปรตีนเทียบกับ PI(3,4,5)P3, PI(3)P และ PI(4,5)P2 โดยใช้ สภาวะการตรึงที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเมมเบรนพลาสม่าหรือการย้อมสีภายในเซลล์^24,25PI(3,4,5)P3 มีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นแบบกระจายไปยังเมมเบรนของพลาสมา และการรักษาด้วยอัลเปลิซิบ (10 mM) ทำให้เกิดการย้อมสีที่ลดลงอย่างมากสำหรับ PI(3,4,5)P3 ทั้งในเซลล์ WT และ OCRL KO เช่น คาดหวังจากกลไกการทำงานและความจำเพาะสำหรับคลาส IA PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)p110a (รูปที่ 3a) PI(3,4,5)P3 คาดว่าจะถูกดีฟอสโฟรีเลตแบบค่อยเป็นค่อยไปเนื่องจากเยื่อหุ้มเซลล์ถูกเอนโดไซโตสและนำเข้าสู่เอนโดโซม^14,26,27โดยการตรึงเซลล์ให้คง PI(3)P ภายในเซลล์ไว้²⁵เราพบว่า PI(3)P punctae ลดลงด้วยการรักษาด้วย alpelisib (ในรูปแบบที่ตอบสนองต่อขนาดยาที่เห็นได้ชัดจากความเข้มข้นที่ต่ำถึง 10 มม. สำหรับการรักษา 16-ชั่วโมง) ทั้งในเซลล์ WT และ OCRL KO (รูปที่ 3b และรูปเสริม S2C) ตามที่คาดไว้ KO ของ OCRL ในเซลล์ HK2 กระตุ้นให้ระดับ PI(4,5)P2 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดทั้งที่พลาสมาเมมเบรน (รูปที่ 3c) และภายในเซลล์ (รูปที่ 3d) เมื่อเทียบกับเซลล์ WT^10,28การรักษาด้วย alpelisib ทำให้ความสูงของ PI(4,5)P2 ที่สร้างโดย OCRL KO ลดลงอย่างเห็นได้ชัดในทั้งสองส่วน ในขณะที่ไม่มีผลในเซลล์ WT (รูปที่ 3c และ d) มีรายงานว่า Alpelisib ยับยั้ง PI 4-kinase b ด้วยความเข้มข้นในการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ที่ 0.5 mM¹⁹ซึ่งเป็นแหล่งที่เป็นไปได้ของการลด PI(4,5)P2 โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราแนะนำว่า alpelisib ยับยั้งการประกอบแอคตินบนเอนโดโซม OCRL KO ผ่านผลกระทบแบบสองความจำเพาะต่อระดับ PI(4,5)P2 และ PI(3)P

รูปที่ 4|Alpelisib บรรเทาข้อบกพร่องของแอคตินในช่องปากในOcrl .ที่เลี้ยงด้วยมนุษย์^Y/-PTC ของเมาส์ (m PTC) (a) ไมโครกราฟคอนโฟคอลการฉายภาพ Z ที่มีความเข้มสูงสุดแทนของ OcrlY/þ หรือ Ocrl^Y/-m PTC ที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรืออัลเปลิซิบ 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ไฟฟิกซ์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับแอคติน (ลึงค์) (สีขาว) และ 406-ไดอามิดิโน-2-ฟีนิลลินโดล (DAPI) (สีน้ำเงิน) โดยหาปริมาณของระดับความเค้นที่มีอยู่ในแต่ละสภาวะ แสดงว่าเส้นใยความเครียดสูญเสียใน Ocrl^Y/-m PTCs ได้รับการช่วยเหลือโดยการรักษาด้วย alpelisib เส้นระบุค่าเฉลี่ย±SEM และจุดข้อมูลระบุพื้นที่การถ่ายภาพแต่ละส่วน: พื้นที่การถ่ายภาพ N=5 ต่อเงื่อนไข (แต่ละส่วนมีเซลล์ประมาณ 15-20 เซลล์) ความสำคัญได้รับการประเมินโดย 1-การวิเคราะห์ทางของความแปรปรวน (ANOVA) แบบธรรมดาด้วยการทดสอบเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Holm-Sidak **P=0.001 การเปรียบเทียบแบบพหุคูณ Ocrl Y/þ DMSO กับ Ocrl^Y/-ดีเอ็มเอสโอ **

ป=0.002, ออร์ล^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO เทียบกับ Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (ไม่สำคัญ [ns]) บาร์=20มม. (b) การเรนเดอร์พื้นผิว 3 มิติที่เป็นตัวแทนกำลังขยายสูงของ Ocrl m PTCs ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ 10 mM ของ alpelisib เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นแก้ไขด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ไฟฟิกซ์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับเอนโดโซมแอนติเจน 1 (EEA1) ระยะแรก (สีม่วง) แอคติน ( phalloidin, สีเหลือง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) และการแสดงปริมาณที่แสดงให้เห็นการช่วยเหลือของการทับซ้อนกันของ actin-endosomal โดย alpelisib มุมมองการขยายด้านล่างแสดงภาพรวมของ (ต่อ)

รูปที่ 4|(ต่อ) ภูมิภาคเหล่านี้แสดงในรูปเสริม S4B และภาพยนตร์เสริม S1–S3 เส้นแสดงค่าเฉลี่ย±SEM ฟิลด์ที่เลือกแบบสุ่ม N=42, 47 และ 45 สำหรับ OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO และ Ocrl^Y/-þ เงื่อนไข alpelisib ตามลำดับ ในแต่ละกรณีที่รวมกันจากไตเมาส์ 4 ตัวต่อเงื่อนไข ความสำคัญได้รับการทดสอบโดย Kruskal-Wallis (KW) ANOVA ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunn: โดยรวม ***P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" ocrly/þ="" dmso="" กับ="">^Y/-DMSO และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-อัลเปลิซิบ ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" กับ="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns) แท่ง=1 มม. (c) ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของ OcrlY/þ หรือ Ocrl^Y/-m PTC ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ 10-mM alpelisib จากนั้นแก้ไขด้วยโปรแกรมฟิกซ์ Golgi และติดป้ายกำกับโดยใช้โพรบ m Ch-2xFYVE PI(3)P (สีม่วงแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ด้วยการหาปริมาณของ จำนวนของ PI(3)P-positive puncta ที่ตรวจพบในเซลล์ N=188, 177, 246 และ 206 เซลล์จาก OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO และ Ocrl^Y/-þ alpelisib ตามลำดับ; เซลล์ถูกรวมเข้าด้วยกันจากไตในช่องปาก 3 ตัวต่อกลุ่ม การทดสอบ KW: โดยรวม ***P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" ocrly/þ="" dmso="" กับ="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO เทียบกับ OcrlY/þ alpelisib และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-alpelisib ทั้งหมด ***P < 0.001.="" แท่ง="20" มม.="" (d)="" ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของ="" ocrly/þ="" หรือ="">^Y/-m PTC ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ 10 mM ของ alpelisib เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ไฟฟิกซ์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดฉลากอิมมูโนสำหรับฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล (PI) 4,5-บิสฟอสเฟต [PI(4,5) P2] (สีเหลือง) และ DAPI (สีฟ้า) พร้อมการหาปริมาณของจำนวน PI(4,5)P2- puncta ที่เป็นบวก แสดง PI(4,5)P2 puncta ที่เพิ่มขึ้นใน Ocrl^Y/-เซลล์ซึ่งลดลงโดยการรักษา alpelisib N=477, 444, 423 และ 494 จาก OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO และ Ocrl^Y/-þ alpelisib ตามลำดับ; เซลล์ถูกรวมเข้าด้วยกันจากไตในช่องปาก 3 ตัวต่อกลุ่ม การทดสอบ KW: โดยรวม ***P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" ocrly/þ="" dmso="" กับ="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO เทียบกับ OcrlY/þ alpelisib และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-alpelisib ทั้งหมด ***P < 0.001.="" แท่ง="20" มม.="" หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้="" โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่="">

1.4 Alpelisib ช่วยลด phosphoinositides ภายในเซลล์และบรรเทาความบกพร่องของโครงร่างเซลล์ใน Ocrl^Y/-m PTCs

ต่อไปเราจะทดสอบว่า alpelisib มีผลเช่นเดียวกันในเซลล์ปฐมภูมิของเซลล์ PT ที่ได้มาจากแบบจำลองเมาส์ Ocrldefificient ที่ทำให้มีลักษณะของมนุษย์ (Ocrl) หรือไม่^Y/-) ซึ่งจะสรุปความผิดปกติของแอกตินโพลิเมอไรเซชันและข้อบกพร่องภายในเซลล์ที่สังเกตพบในเซลล์ที่ได้รับจากผู้ป่วย^10,11PTC ของเมาส์ (m PTCs) แสดงคล้ายกับคลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส) หน่วยงานกำกับดูแลหน่วยย่อยไปยังเซลล์ HK2 ทั้งใน WT และ Ocrl^Y/-หนูเมาส์และแสดงโปรไฟล์ความเป็นพิษที่คล้ายคลึงกันต่ออัลเปลิซิบเมื่อประเมินโดยการสอบวิเคราะห์ MTT (รูปที่ S3) เสริม การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเผยให้เห็นการหยุดชะงักของสถาปัตยกรรมเส้นใยความเครียด F-actin ปกติใน m PTCs จาก Ocrl^Y/-เมื่อเปรียบเทียบกับหนู OcrlY/þ น่าจะเป็นเพราะการย้ายตำแหน่งของโปรตีนควบคุมแอคตินจากตำแหน่งเซลล์ปกติของพวกมันไปยังเอนโดโซม เนื่องจากกลุ่มแอคตินจำนวนมากล้อมรอบออร์แกเนลล์เหล่านี้และคิดว่าเป็นที่มาของข้อบกพร่องในการค้ามนุษย์^10,29การรักษาOcrl^Y/- m PTC ที่มี alpelisib (10 mM) ได้ฟื้นฟูสถาปัตยกรรมของ stress fibre (รูปที่ 4a)

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

เป็นปัญหาหลักในโรคโลว์และโรคบุ๋ม2 คือการลดการค้ามนุษย์ในเอนโดโซมและการเสื่อมโทรมของเมกาลินที่ตามมา เราพยายามแยกแยะแอคตินของเอนโดโซมจากเส้นใยความเครียด เรารวบรวม z-stacks คอนโฟคอลการสแกนด้วยเลเซอร์ทั่วทั้งเซลล์ สร้างรูปแบบการย้อมสีขึ้นใหม่ในการเรนเดอร์พื้นผิว 3 มิติ และใช้รูปร่าง/พารามิเตอร์ขนาดเพื่อระบุโครงสร้างแอคตินที่แบ่งและระดับที่ซ้อนทับกับโครงสร้างเอนโดโซม (รูปที่ S4 และภาพยนตร์เสริม S1 –S3). การวิเคราะห์นี้เปิดเผยว่าการรักษาด้วยอัลเปลิซิบลดการเกิดพอลิเมอไรเซชันแบบผิดปกติของ F-actin ที่เอนโดโซมที่ย้อมด้วย EEA1 ซึ่งแตกต่างจากสถาปัตยกรรมของเส้นใยความเครียด (รูปที่ 4b) m PTCs มาจากOcrl^Y/-หนูเมาส์แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการย้อมสีภายในเซลล์สำหรับ PI(3)P (ลดลง) และ PI(4,5)P2 (เพิ่มขึ้น) เมื่อเทียบกับ m PTC จาก WT OcrlY/þ หนูเมาส์ (รูปที่ 4c และ d) การรักษา m PTCs จากOcrl^Y/- หนูเมาส์ที่มี alpelisib ส่งผลให้การย้อมสี PI(3)P และ PI(4,5)P2 ภายในเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c และ d)

1.5 Alpelisib ปรับปรุงการรับ endocytic ในOcrl^Y/-m PTCs

ต่อไปเราประเมินว่าผลของ alpelisib ต่อความบกพร่องของโครงกระดูกและตุ่มที่สังเกตพบใน m PTCs ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในความสามารถในการดูดซึมของ endocytic หรือไม่ เพื่อแยกความแตกต่างผลของ alpelisib ต่อการจับและ/หรือการทำให้อยู่ภายในของลิแกนด์ m PTCs ถูกฟักไข่ครั้งแรกด้วย bovine serum albumin (BSA) ที่ติดฉลากเพื่อกระตุ้นการจับของโพรบกับ endocytic receptors จากนั้นจึงบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อ ปฏิบัติตามการทำให้เป็นภายในของอัลบูมิน (รูปที่ 5a) The Ocrl^Y/-เซลล์แสดงการจับกับเมมเบรนในพลาสมาที่ต่ำกว่าของ Alexa 488-bovine serum albumin พร้อมกับการทำให้อัลบูมินภายในบกพร่องเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ OcrlY/þ การรักษาด้วย alpelisib ช่วยทั้งการจับและการดูดซึมของอัลบูมินในOcrl^Y/-เซลล์ โดยมีการช่วยเหลือโดยรวม 50 เปอร์เซ็นต์ของการรับ endocytic (รูปที่ 5b และ c) ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนโดยการวัดการดูดซึมอัลบูมินทั้งหมด (รูปเสริม S5a และ b) เราตั้งข้อสังเกตว่าอัตราส่วนอัลบูมินในซีรัมในซีรัมของ Alexa 488-ในซีรัมภายใน/ที่ถูกผูกไว้ยังคงใกล้เคียงกันระหว่างสภาวะต่างๆ (รูปที่ 5d) ซึ่งหมายความว่าการดูดซึมอัลบูมินที่ลดลงนั้นส่วนใหญ่เกิดจากการผูกมัดที่บกพร่องมากกว่ากระบวนการสร้างภายในที่บกพร่อง

1.6 Alpelisib ปรับปรุงความผิดปกติของ PT และ endocytosis ที่รับสื่อกลางในOcrl^Y/- หนู

เราทดสอบผลการรักษาที่เป็นไปได้ของ alpelisib ต่อความผิดปกติของ PT ในร่างกาย หนูเมาส์ทางปากถูกบริหารให้ด้วยกระสายยาหรืออัลเปลิซิบ (50 มก./กก. ของน้ำหนักตัวต่อวัน) โดยทางปากเป็นเวลา 6 สัปดาห์ (รูปที่ 6a) ระบบการปกครองนี้ได้รับการคัดเลือกตามการศึกษา ในร่างกาย ก่อนหน้านี้ ที่แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพและความปลอดภัย^22,30สอดคล้องกับการให้ยา alpelisib ที่ทราบว่าทำให้เกิดการดื้อต่ออินซูลินและน้ำตาลในเลือดสูง²²การรักษาด้วย alpelisib ทำให้ glycosuria เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งใน Ocrl Y/þ และ Oral^Y/-หนู ซึ่งถือได้ว่าเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับการจ่ายยา (ตารางเสริม S1) หลังการรักษา alpelisib 6 สัปดาห์ Ocrl^Y/-หนูเมาส์แสดงการขับถ่ายโปรตีน LMW ในปัสสาวะลดลงอย่างมีนัยสำคัญ CC16 (-34 เปอร์เซ็นต์ ) และอัลบูมิน (-38 เปอร์เซ็นต์ ) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วยกระสายยา (รูปที่ 6b และ c) ในขณะที่ปริมาตรของ ปัสสาวะและพารามิเตอร์อื่น ๆ ไม่ได้รับผลกระทบ (ตารางเสริม S1) หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Alpelisib ของยีนทั้งสองมีอัตราการเติบโตที่ลดลงเมื่อเทียบกับหนูควบคุมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้²²อย่างไรก็ตาม ทั้งหนูทดลองและหนูที่ได้รับการบำบัดมีน้ำหนักตัว ซึ่งบ่งชี้ว่ายาไม่ส่งผลกระทบอย่างรุนแรงต่อพัฒนาการหลังคลอด (รูปที่ 6d และตารางเสริม S1)

เพื่อทดสอบว่าผลของ alpelisib ต่อโปรตีนในปัสสาวะ LMW สะท้อนการฟื้นตัวของเอนโดไซโทซิสที่อาศัยตัวรับในเซลล์ PT หรือไม่ เราได้ติดตามการดูดซึมของ Cy5-b-lactoglobulin ที่ติดฉลากในไตของหนูเมาส์ Ocrl . ที่รักษาด้วยอัลเปลิซิบ^Y/-หนูเมาส์แสดงการช่วยชีวิตที่สำคัญของการดูดซึม b-lactoglobulin ที่ติดฉลาก Cy5- ใกล้กับขอบเขตของการทำให้เป็นภายในที่สังเกตพบในหนูเมาส์ OcrlY/þ ที่บำบัดด้วยกระสายยา (รูปที่ 6e) สิ่งนี้สะท้อนให้เห็นโดยการช่วยเหลือที่สำคัญในการแสดงออกของเมกาลินตัวรับ endocytic ในเซลล์ PT ตามที่สังเกตได้จากการสร้างฉลากภูมิคุ้มกันและการซับไตแบบตะวันตกของ Ocrl ที่ได้รับการรักษาด้วย alpelisib^Y/-หนู; โปรดทราบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของเครื่องหมาย PT AQP1 (รูปที่ 6f และ g และรูปที่เสริม S5C และ D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้ง alpelisibทำให้เกิดการปรับปรุงอย่างมากของเครื่องจักร PT endocytic และลดโปรตีนในปัสสาวะ LMW ในรูปแบบเมาส์ที่มีลักษณะของมนุษย์สำหรับ Lowe syndrome

รูปที่ 5|Alpelisib ปรับปรุงการดูดซึม endocytic ของOcrl .ที่ทำให้เป็นมนุษย์^Y/-PTC ของเมาส์ (m PTC) (a) Schematic ที่แสดงให้เห็นการทดลองพัลส์ไล่ที่ใช้เพื่อตรวจสอบการผูกมัดและการทำให้อยู่ภายในของ Alexa 488-bovine serum albumin (BSA) เป็น m PTCs เซลล์สัมผัสกับ Alexa 488-BSA (0.2 มก./มล.) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 องศา เพื่อให้ BSA จับกับตัวรับที่ผิวเซลล์ (พัลส์) จากนั้นจึงอุ่นถึง 37 องศาในตัวกลางของเซลล์ เป็นเวลา 20 นาทีก่อนการตรึงเพื่อให้ลิแกนด์ internalization (ไล่) (b) ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของ OcrlY/þ หรือ Ocrl^Y/-m PTC ที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรืออัลเปลิซิบ 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 16 ชั่วโมง และอยู่ภายใต้การทดสอบการไล่ตามชีพจรของ Alexa 488-BSA (สีเขียว) ก่อนที่จะได้รับการแก้ไขและติดป้ายกำกับสำหรับ 406-diamidino{ {6}}ฟีนิลลินโดล (DAPI) (สีน้ำเงิน) เฟสพัลส์ของการทดสอบจะแสดงในแผงด้านบนสำหรับแต่ละเงื่อนไข โดยมีการไล่ตามด้านล่าง แท่ง=20 มม. (c) การหาปริมาณของพื้นผิวเซลล์ Alexa 488-BSA (i) และ Alexa 488-BSA (ii) ที่อยู่ภายในเซลล์ ซึ่งประเมินเป็นความเข้มของฟลูออเรสเซนส์เฉลี่ยต่อเซลล์ Alpelisib ช่วยชีวิตการผูก BSA ที่ได้รับการช่วยเหลือและการทำให้เป็นภายในซึ่งพบในOcrl^Y/-เซลล์. N=209, 228, 186 และ 196 เซลล์สำหรับ OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO และ Ocrl^Y/-เงื่อนไข alpelisib ตามลำดับใน (i) และ N=203, 183, 199 และ 233 เซลล์สำหรับ OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO และOcrl^Y/-เงื่อนไข alpelisib ตามลำดับใน (ii) ในแต่ละกรณีที่รวบรวมจากไตของหนูเมาส์ 2 ตัวต่อเงื่อนไข แต่ละจุดข้อมูลแสดงถึงความเข้มของฟลูออเรสเซนส์เฉลี่ยในแต่ละเซลล์ ความสำคัญได้รับการทดสอบโดยการวิเคราะห์ Kruskal-Wallis (KW) ของความแปรปรวน (ANOVA) ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunn: สำหรับ (i) BSA ที่ผิวเซลล์ โดยรวม *** P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ:="" ocrly/þ="" dmso="" กับ="">^Y/-DMSO และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" เทียบกับ="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (ไม่สำคัญ="" [ns]);="" สำหรับ="" (ii)="" bsa="" ภายใน="" โดยรวม="" ***="" p="">< 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ:="" ocrly/þ="" dmso="" เทียบกับ="">^Y/-DMSO และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-อัลเปลิซิบ ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" เทียบกับ="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns)="" (d)="" การหาปริมาณของอัตราส่วนระหว่างพื้นผิวเซลล์="" alexa="" 488-="" bsa="" และความเข้มการเรืองแสงของ="" alexa="" 488–bsa="" fl="" ภายใน="" ซึ่งไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในอัตราส่วนระหว่างแต่ละเงื่อนไข="" แต่ละจุดแสดงค่าเฉลี่ยของอัตราส่วนในฟิลด์ที่มีเซลล์ประมาณ="" 15-20="" เซลล์="" (n="13," 13,="" 10="" และ="" 11="" ฟิลด์ที่เลือกแบบสุ่มสำหรับ="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO และOcrl^Y/-เงื่อนไข alpelisib ตามลำดับ ในแต่ละกรณีที่รวมกันจากไตของหนูเมาส์ 2 ตัวต่อเงื่อนไข) ความสำคัญได้รับการทดสอบโดย KW ANOVA ด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunn: P=0.46 โดยรวม (ns) การเปรียบเทียบหลายรายการ: OcrlY/þ DMSO กับ Ocrl^Y/-DMSO และ Ocrl^Y/-DMSO กับ Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO เทียบกับ OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns) หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

รูปที่ 6|Alpelisib ปรับปรุงฟังก์ชัน proximal tubule (PT) ของหนูเมาส์ OcrlY/L ฟื้นฟูการดูดซึมลิแกนด์และการแสดงออกของเมกาลิน (ก) การตั้งค่าทดลอง หนูเมาส์ในช่องปากได้รับการรักษาเป็นเวลา 6 สัปดาห์ด้วยปริมาณคาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส 1 เปอร์เซ็นต์ (พาหนะ) หรืออัลเปลิซิบ (50 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) ในช่องปากทุกวัน ในวันสุดท้ายของการรักษา หนูถูกฉีดด้วย Cy5-ที่ติดฉลาก b-lactoglobulin (N=6 Ocrl^Y/-, หรือ 8 Ocrl^Y/-หนูต่อกลุ่ม) (b–d) ค่า D ที่แสดงแสดงถึงการเปลี่ยนแปลงเฉลี่ยจาก BL เป็น D42 สำหรับเงื่อนไข±SEM (b) โปรตีนจากเซลล์ Clara 16 (CC16), (c) การส่งออกอัลบูมินในปัสสาวะ (ทั้งภายใน 15 ชั่วโมง) และ (d) วัดมวลกายใน OcrlY/- หนูเมาส์ที่บำบัดด้วยกระสายยาหรืออัลเปลิซิบอย่างใดอย่างหนึ่งที่จุดเวลาที่ระบุ แต่ละจุดแทนเมาส์ 1 ตัว ความสำคัญได้รับการประเมินโดย 2-การทดสอบ t-test ของนักเรียนที่จับคู่แบบ tailed; ใน (b) CC16 (ต่อ)

รูปที่ 6|(ต่อ) ผลลัพธ์ที่เปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับเส้นฐาน; þ พาหนะ, P=0.9802 (ไม่สำคัญ [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; ใน (c) การเปลี่ยนแปลงของผลผลิตอัลบูมินที่สัมพันธ์กับการตรวจวัดพื้นฐาน þ ยานพาหนะ, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0.0006; ใน (ง) การเปลี่ยนแปลงของมวลกายเทียบกับการตรวจวัดพื้นฐาน þ ยานพาหนะ ***P < 0.0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0.0083" (e)="" ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนซึ่งแสดง="" cy5-b-lactoglobulin="" (สีม่วงแดง)="" ที่ติดฉลากไว้="" 15="" นาทีหลังจากการฉีดหลอดเลือดดำที่หางและติดฉลากสำหรับ="" 40,6-diamidino-2-phenylindole="" (dapi)="" (สีน้ำเงิน)="" บวกการหาปริมาณของสัญญาณเรืองแสง="" fl="" ที่สอดคล้องกันจากไตของหนูเมาส์="" ocrl="" (n="412," 500="" และ="" 588="" หลอดตามลำดับสำหรับยานพาหนะ="" ocrly/þþ,="">^Y/-þ ยานพาหนะ และ Ocrl^Y/-þ alpelisib) สำหรับหนู 3 ตัวต่อกลุ่มการรักษา การดูดซึม b-Lactoglobulin ได้รับการช่วยเหลือโดยการรักษาด้วย alpelisib แท่ง ¼ 20 มม. ในการหาปริมาณ แต่ละจุดแทนความเข้มของฟลูออเรสเซนส์ FL ที่ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยพื้นที่ท่อ ข้อมูลที่พล็อตระบุค่าเฉลี่ย±SEM ความสำคัญได้รับการประเมินโดยการทดสอบ Kruskal-Wallis (KW) ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunn; ***P <0.001 การเปรียบเทียบหลายรายการ="" ยานพาหนะ="" ocrly/þþ="" กับ="">^Y/-þ ยานพาหนะและ Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะกับ Ocrl^Y/-þ alpelisib ทั้ง ***P < 0.001.="" (f)="" การวิเคราะห์="" western="" blotting="" และ="" densitometry="" ของระดับเมกาลินในไตทั้งหมดไลเซทจากหนูในช่องปาก="" ใช้="" a-tubulin="" เป็นตัวควบคุมการโหลด="">^Y/-ได้รับการช่วยชีวิตโดย alpelisib ในการหาปริมาณของการวิเคราะห์ความหนาแน่น แต่ละจุดแทนเมาส์ 1 ตัว (ยานพาหนะ N=4 OcrlY/þþ และ Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะและ N=3 Ocrl^Y/-þ หนู alpelisib); เส้นระบุค่าเฉลี่ย±SEM ความสำคัญได้รับการประเมินโดย 2-tailed unpaired Student's t-tests: รถ OcrlY/þþ เทียบกับ Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะ; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะกับ Ocrl^Y/- þ อัลเปลิซิบ, *P=0.0246. (g) ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนซึ่งมีส่วนแทรกที่มีกำลังขยายสูงและการหาปริมาณของความเข้มข้นของเมกาลิน (สีเหลือง) ใน AQP1þ PTs (สีม่วงแดง) จากไตในช่องปากยังถูกติดฉลากสำหรับ DAPI (สีฟ้า) ซึ่งแสดงให้เห็นการช่วยชีวิตระดับเมกาลินหลังการรักษาด้วยอัลเปลิซิบ แท่ง=20 มม. ในการหาปริมาณ แต่ละจุดแทนความเข้มของฟลูออเรสเซนส์ FL ที่ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยพื้นที่ท่อ ข้อมูลที่พล็อตระบุค่าเฉลี่ย±SEM N=142, 191 และ 266 tubules ตามลำดับ สำหรับยานพาหนะ OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะ และ Ocrl^Y/-þ alpelisib สำหรับหนู 3 ตัวต่อกลุ่มการรักษา ความสำคัญได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนของ KW ตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบพหุคูณของดันน์ โดยรวม ***P < 0.001="" การเปรียบเทียบหลายรายการ="" ยานพาหนะ="" ocrly/þþ="" กับ="">^Y/-þ ยานพาหนะและ Ocrl^Y/-þ ยานพาหนะกับ Ocrl^Y/-þ alpelisib ทั้ง ***P < 0.001.="" หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้="" โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่="">

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

2. การอภิปราย

ขณะนี้ยังไม่มีการรักษาเพื่อบรรเทา endocytosis ที่บกพร่องซึ่งทำให้เกิดความผิดปกติของ PT ในโรคโลว์และโรคบุ๋ม2. การค้นพบของเราเปิดเผยว่า alpelisib บรรเทาฟีโนไทป์ของแอคตินที่ผิดปกติโดยการลดระดับของ PI(4,5)P2 และ PI(3)P ทำให้เกิดการปรับปรุงอย่างมากของเครื่องจักร endocytic และความสามารถในการดูดซับในระบบเซลล์และแบบจำลองเมาส์ที่มีลักษณะของมนุษย์สำหรับ กลุ่มอาการโลว์/โรคบุ๋ม 2. ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนความเชื่อมโยงระหว่างไขมันฟอสโฟโนซิไทด์ แอกตินโพลีเมอไรเซชัน และการค้ามนุษย์ภายใน โดยมีความเกี่ยวข้องในทันทีสำหรับเซลล์เยื่อบุผิวที่มีฤทธิ์สูงซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการสภาวะสมดุลที่สำคัญ (รูปที่ 7) เนื่องจากขาดการรักษาที่มีประสิทธิภาพและความปลอดภัยที่ชัดเจนของ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้ง alpelisib เป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับการนำยากลับมาใช้ใหม่โรคโลว์และโรคบุ๋ม.

โปรตีนในปัสสาวะ LMW เป็นลักษณะเฉพาะที่สม่ำเสมอที่สุดที่พบในผู้ป่วยโรคโลว์และโรคบุ๋ม2 เนื่องจากปิดใช้งานการกลายพันธุ์ใน OCRL⁴โปรตีน LMW เหล่านี้สามารถตรวจพบและหาปริมาณได้ง่าย โดยนำเสนอไบโอมาร์คเกอร์ที่เที่ยงตรงของเอนโดไซโทซิสที่อาศัยตัวรับที่มีข้อบกพร่องในเซลล์ PT1 โปรตีนในปัสสาวะของ LMW มีความเกี่ยวข้องเป็นพิเศษ เนื่องจากตรวจพบได้อย่างสม่ำเสมอและบ่อยกว่าตัวละลายอื่นๆ (เช่น กลูโคส ฟอสเฟต กรดอะมิโน) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของ "กลุ่มอาการไตแฟนโคนี" แบบคลาสสิก—อย่างน้อยก็ในความผิดปกติแต่กำเนิดของวิถีทางเอนโดไลโซโซม¹ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่า alpelisib ช่วยชีวิตความสามารถในการดูดซับ endocytic ปลายของเซลล์ PT ในหลอดทดลอง และในร่างกาย เนื่องจากระดับการคืนค่าของตัวรับเมกาลินที่พลาสมาเมมเบรน ผลกระทบนี้สะท้อนให้เห็นจากการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการสูญเสียโปรตีน LMW ในปัสสาวะ (CC16 และอัลบูมิน) ใน Ocrl^Y/-หนูที่ได้รับ alpelisib เป็นเวลา 6 สัปดาห์ ผลกระทบเหล่านี้ของ alpelisib ได้รับการสังเกตใน m PTCs ซึ่งรักษาความแตกต่างของยอดและเหมาะสมอย่างยิ่งในการตรวจสอบ endocytosis ที่อาศัยตัวรับในสรีรวิทยาและโรค⁹ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราได้รับ m PTC จากแบบจำลองหนูเมาส์ที่ทำให้มีลักษณะของมนุษย์ซึ่งแสดงออก INPP5B ของมนุษย์ในOcrl^Y/-; Inpp5b^-/-พื้นหลัง ซึ่งช่วยให้เราตรวจสอบผลเฉพาะของการสูญเสียกิจกรรม OCRL^11,23

การช่วยเหลือ endocytosis โดย alpelisib อธิบายได้จากผลกระทบต่อเครื่องจักรของ actin ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนในเซลล์ OCRL KO HK2 และ m PTCs การสังเกตของเราจึงเป็นการยืนยันและขยายผลการศึกษาก่อนหน้านี้ซึ่งแสดงให้เห็นความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมสมดุลของฟอสโฟโนซิไทด์และ F-actin ในวิถีทางเอ็นโดโซมในระยะแรกในผู้ป่วย OCRL และเซลล์ KO^7,10การสูญเสียการทำงานของกิจกรรม OCRL บั่นทอนการเสื่อมสภาพของ PI(4,5)P2 ซึ่งในทางกลับกัน นำไปสู่ความล้มเหลวในการเคลือบผิวถุงที่เคลือบด้วยคลาทรินทำให้เกิดออร์แกเนลล์เอนโดโซมผิดปกติในเซลล์ประเภทต่างๆ รวมทั้งเซลล์ PT^7-10เมื่อเร็วๆ นี้เราแสดงให้เห็นว่า F-actin ส่วนเกินลดการรีไซเคิลเมกาลินรีเซพเตอร์มัลติลิแกนด์ไปยังเยื่อหุ้มปลายของเซลล์ PT ทำให้เกิดเอ็นโดไซโทซิสที่บกพร่องและโปรตีนในปัสสาวะ LMW¹¹

ข้อมูลของเราระบุว่ากลไกการออกฤทธิ์ของ alpelisib ต่อเอนโดโซมอลแอกตินเกิดขึ้นจากผลที่มีความจำเพาะแบบคู่ของการยับยั้ง alpelisib: อันดับแรกในการผลิต PI(3,4,5)P3 และการแปลงเป็น PI(3)P และอันดับที่สองใน การผลิต PI (4,5)P2 การลดลงของระดับ PI(4,5)P2 โดยตรงจะต่อต้านการขาด OCRL และสอดคล้องกับงานก่อนหน้านี้ที่บรรเทาแอกตินส่วนเกินและเพิ่มการไหลออกของเอ็นโดไซติกโดยการลดระดับของฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 4-ฟอสเฟต 5-ไคเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สร้าง PI(4,5)P2¹⁰Alpelisib มีความเข้มข้น 50 เปอร์เซ็นต์ในการยับยั้ง 0.5 mM 50 เปอร์เซ็นต์บน PI(4,5)P2 ที่สร้างไคเนส PI4Kb ซึ่งอาจรับผิดชอบ หรืออาจเป็นผลมาจากผลกระทบทั่วไปที่มากขึ้นต่อความสมดุลของฟอสโฟอิโนซิไทด์ที่เกิดจากการรวมกันของ OCRL การรักษา KO และ alpelisib เราได้ระบุคลาส IA PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)การยับยั้งโดย alpelisib เกี่ยวข้องกับการยับยั้ง actin เนื่องจากการทำให้ p110a เป็นสื่อกลางโดย siRNA ยับยั้งการสะสมของ actin ในทำนองเดียวกันกับการรักษา alpelisib และ copanlisib (ซึ่งไม่ได้รายงานว่ายับยั้ง PI4Ks) ในเซลล์ RPE เราเคยสังเกตว่า siRNA ของ INPP4A ซึ่งแปลง PI(3,4)P2 เป็น PI(3)P ยับยั้งการรวมตัวของแอกตินในเซลล์ OCRL KO ซึ่งเป็นเส้นทางจากการยับยั้ง PI(3,4,5) การผลิต P3 ลดลงในเอนโดโซม PI(3)P เราแสดงให้เห็นว่า PI(3)P บางส่วนยังคงอยู่ น่าจะเป็นพูลที่สร้างขึ้นที่เอ็นโดโซมช่วงต้นโดย PI3K คลาส III, Vps34 เนื่องจากเราพบว่าการค้ามนุษย์เอนโดโซมได้รับการปรับปรุงมากกว่าที่จะระงับโดยการรักษาด้วยอัลเปลิซิบ Coregulation ที่ซับซ้อนของการเผาผลาญ PI และความเกี่ยวข้องสำหรับการเลิกใช้ OCRL ยังได้รับการเน้นในการศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ซึ่งหน้าที่ noncatalytic ของ phosphoinositide 3- phosphatase PTEN เปิดใช้งานการย่อยสลาย PI (4,5) P2 ผ่านทาง PLCXD ซึ่งช่วยลดฟีโนไทป์ของเซลล์และการดูดซึมของ ลิแกนด์ในรูปแบบปลาม้าลาย³¹

การบรรเทาฟีโนไทป์ของแอคตินโดยการลดระดับของ PI(4,5)P2 และ PI(3)P โดยการรักษาด้วย alpelisib เห็นด้วยกับการเสริมฤทธิ์กันของ PI(4,5)P2 และ PI(3)P ในการสรรหา SNX9 เพื่อเปิดใช้งาน เครื่องจักรแอกตินที่เอ็นโดโซม Ocrl¹⁴แนะนำการจับคู่ที่มีประสิทธิภาพมากของความจำเพาะ alpelisib เพื่อจัดการกับการควบคุมระดับโมเลกุลของการกระตุ้นแอคตินที่เอนโดโซม ในทางกลับกัน ดังที่แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ การรวมเอนโดโซมอลแอกตินที่ลดลง ในทางกลับกัน นำไปสู่การปรับปรุงในเอ็นโดไซโทซิส PT ในเซลล์ที่ขาด OCRL¹⁰จำเป็นต้องมีการกำหนดลักษณะพิเศษเพิ่มเติมเพื่อให้เข้าใจได้ดีขึ้นว่าการควบคุมของแอคตินผ่านเมแทบอลิซึมของฟอสโฟโนซิไทด์เป็นแหล่งที่แท้จริงของผลการรักษาที่เราสังเกตด้วยอัลเปลิซิบใน Ocrl หรือไม่^Y/-โมเดลเมาส์ เพราะคลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ควบคุมวิถีทางที่ควบคุมการเจริญเติบโต การเพิ่มจำนวน การอยู่รอด เมตาบอลิซึม และ autophagy³²เราไม่สามารถแยกได้ว่าการช่วยเหลือ endocytic นั้นเกิดจากผลกระทบต่อ PI(3,4,5)P3 โดยตรง และผลรวมในวิถีทางอื่นๆ ที่มอดูเลตโดยคลาส I PI3K จำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติมเพื่อทดสอบว่า PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)สารยับยั้งยังอาจบรรเทาอาการทางระบบประสาทและอาการทางคลินิกอื่นๆ ของผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ OCRL⁴

ประสบการณ์ล่าสุดของ alpelisib ในผู้ป่วยเด็กที่เป็นโรค PROS/CLOVES แสดงให้เห็นว่ายานี้มีศักยภาพที่จะทนต่อยาได้ดี Alpelisib ถูกนำมารับประทานโดยเลือกกำหนดเป้าหมาย isoform ของ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)class I และแสดงโปรไฟล์ความเป็นพิษเล็กน้อยเมื่อเปรียบเทียบกับสารยับยั้ง pan-PI3K เนื่องจาก alpelisib ไม่ได้บล็อก PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)กิจกรรม ดังนั้นการรักษาหน้าที่ของเส้นทางการส่งสัญญาณจึงอาจเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้งานในระยะยาว สิ่งที่น่าสนใจคือภาวะน้ำตาลในเลือดสูงที่เกิดจากการใช้อัลเปลิซิบอาจสามารถจัดการได้โดยการเปลี่ยนแปลงในอาหาร²²เนื่องจากความผิดปกติของ PT เป็นอาการแรกของโรคไตที่พบในทารกอายุน้อยที่เป็นโรค Dent 2 และ Lowe syndrome การรักษาในช่วงต้นของความผิดปกติของ PT ดังกล่าว นำไปสู่การปรับปรุงในรายละเอียดการเผาผลาญและการเจริญเติบโต จึงอาจชะลอการลุกลามไปสู่โรคไตเรื้อรัง ดังนั้นจึงมี ส่งผลอย่างมากต่ออายุขัยและคุณภาพชีวิต³³แม้ว่าอาการของโรคของการกลายพันธุ์ OCRL จะกว้างเป็นพิเศษ แต่การศึกษาล่าสุดจากกลุ่มผู้ป่วยจีโนไทป์กลุ่มใหญ่ที่มีกลุ่มอาการ Lowe ของ Dent disease 2 ไม่ได้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่มีนัยสำคัญของประเภทของการกลายพันธุ์หรือตำแหน่งของการกลายพันธุ์ต่อการอยู่รอดของไต³⁴โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราเน้นถึงศักยภาพในการนำ alpelisib มาใช้ใหม่ในการรักษาความผิดปกติของ PT ในกลุ่มอาการ Lowe/Dent disease 2 จึงเป็นพื้นฐานสำหรับการปรับใช้อย่างรวดเร็วและคุ้มค่าในการทดลองทางคลินิกในมนุษย์

3. วิธีการ

3.1 รายละเอียดทั้งหมดสามารถพบได้ในวิธีการเสริม

เซลล์ HK2 ถูกบำบัดด้วยโคแพนลิซิบ, อัลเปลิซิบ, GSK2636771 หรืออิเดลาลิซิบที่ความเข้มข้นที่ระบุเป็นเวลา 16 ชั่วโมง เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น สกัดโปรตีนโดยใช้วิธีการมาตรฐานจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อไต และการทำ Western blotting โดยใช้แอนติบอดีที่เผยแพร่หรือมีจำหน่ายทั่วไป การทำให้ล้มลงของ siRNA ดำเนินการโดยใช้การเปลี่ยนถ่าย 2 ครั้ง 72 และ 24 ชั่วโมงก่อนการวิเคราะห์ เราใช้ OcrlY/þ ที่จับคู่อายุและเพศ Inpp5b^{- /-}; และOcrl^Y/-; Inpp5b^-/- ลูกครอกของหนูเก็บการแสดงออกของ BAC-INPP5B วัฒนธรรมปฐมภูมิของ m PTCs ถูกสร้างขึ้นจากไตที่เก็บเกี่ยวจากหนูเมาส์ Ocrl อายุ 8 สัปดาห์ และประเมินความสามารถภายในเซลล์ของ PTC ในช่องปากโดยการวัดการดูดซึมอัลบูมิน การรักษาด้วยอัลเปลิซิบคือ 10 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 16 ชั่วโมง เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น การดูดซึมอัลบูมินใน m PTC ถูกประเมินโดยใช้โปรโตคอล "การไล่ตามพัลส์" เพื่อประเมินการจับปลายและการดูดที่เป็นผลลัพธ์ m PTC ถูกย้อมข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เหมาะสมและเป็นเวลา 45 นาทีด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกต FL ที่เหมาะสมและ/หรือ Alexa-488 Phalloidin การย้อมสี PI(3)P บน m PTC ถูกดำเนินการโดยใช้โพรบโดเมน FYVE วิเคราะห์รูปภาพด้วย CellProfifiler โดยใช้ไปป์ไลน์แบบกำหนดเองเพื่อวัดการทับซ้อนของ actin/EEA1 และจำนวน puncta และด้วย ImageJ เพื่อวัดความเข้มของอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และขอบที่ตรวจพบเพื่อคำนวณคะแนนของเส้นใยความเครียด ข้อมูลเชิงปริมาณแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย สำหรับการทดลองภายในร่างกาย หนูเมาส์อายุ 6 สัปดาห์ได้รับการรักษาด้วยกระสายยาหรืออัลเปลิซิบ 50 มก./กก. ของน้ำหนักตัว เก็บปัสสาวะทุก 14 วัน และสัตว์ถูกสังเวยหลังการรักษา 42 วัน โดยเก็บเลือดและไต ความจุ PT endocytic ของหนูเมาส์ในช่องปากถูกตรวจสอบโดยการวัดการดูดซึม b-lactoglobulin

4. การเปิดเผยข้อมูล

JLG ได้รับเงินทุนจาก AstraZeneca สำหรับการเป็นนักศึกษาในห้องปฏิบัติการของเธอ SPJ อยู่ในคณะกรรมการที่ปรึกษาและถือหุ้นใน Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics และ Adrestia Therapeutics และเป็นพันธมิตรด้านวิทยาศาสตร์ของ Ahren Innovation Capital ผู้เขียนคนอื่น ๆ ทั้งหมดประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

5. กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย European Research Council Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) ถึง JLG และ Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z ถึง SPJ และเรารับทราบการระดมทุนของสถาบัน Gurdon จาก Wellcome Trust (092096) และ CRUK (C6946/A14492) เราขอขอบคุณมูลนิธิวิจัยโรคซิสติโนซิส (เออร์ไวน์ แคลิฟอร์เนีย) มูลนิธิวิทยาศาสตร์แห่งชาติสวิส (ทุนโครงการ 310030_189044) โครงการวิจัยทางคลินิกที่มีความสำคัญ (KFSP) RADIZ (โครงการโรคหายากซูริก) ของ UZH ประเทศสวิสเซอร์แลนด์

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) for support, and the NIDDK/NIH and the Lowe Syndrome Trust/UK for support the development of the Oral mice. เรารับทราบ Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation and UCSF, San Francisco, CA) และ Maria Antonietta De Matteis (Telethon Institute of Genetics and Medicine, University Federico II Naples, Naples, Italy) ในการจัดหาผู้ก่อตั้งกลุ่มหนูเมาส์ออรัล

และ Eric Olinger (UZH, Zurich) สำหรับการอภิปรายที่ได้ผล เราขอขอบคุณ Nadine Näegele และ Daniela Nieri สำหรับการให้ความช่วยเหลือด้านเทคนิคในระหว่างการเก็บและวิเคราะห์ปัสสาวะ Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris) สำหรับการแบ่งปันรายละเอียดโปรโตคอลสำหรับการเตรียม Alpelisib สำหรับการรักษาในร่างกาย และ Renata Kozyraki และ Pierre Verroust สำหรับการจัดหารีเอเจนต์ นอกจากนี้เรายังขอขอบคุณศูนย์กล้องจุลทรรศน์และการวิเคราะห์ภาพของมหาวิทยาลัยซูริก (ซูริค ประเทศสวิตเซอร์แลนด์) และศูนย์สรีรวิทยาสัตว์ฟันแทะแบบบูรณาการของซูริก (ZIRP) สำหรับการจัดหาอุปกรณ์สำหรับการถ่ายภาพและการสนับสนุนด้านเทคนิคในระหว่างการทดลองในร่างกาย

phosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib ใช้สำหรับโรค Lowe/Dent อย่างไร?

6. วัสดุเสริม

ไฟล์เสริม (PDF)

วิธีการเสริมและข้อมูลอ้างอิง

ตาราง S1 ค่าพารามิเตอร์ของน้ำหนักตัว ปัสสาวะ และเลือดเมื่อเวลาผ่านไปในหนูเมาส์ที่รักษาด้วยอัลเปลิซิบหรือยานพาหนะ

รูปที่ S1 การแสดงออกของไอโซฟอร์ม p110 และการสอบวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ตอบสนองต่อขนาดยาในเซลล์ HK2

รูปที่ 2. PI3Kสารยับยั้ง alpelisibคืนค่าการทับซ้อนกันของแอคติน-เอนโดโซมอล และลดระดับ PI(3)P ในลักษณะที่ตอบสนองต่อขนาดยา 4 ชั่วโมงหลังการรักษาด้วยยาในเซลล์ HK2

รูปที่ S3 การแสดงออกของไอโซฟอร์ม p110 และความเป็นพิษของอัลเปลิซิบใน Ocrl mPTCs

รูปที่ S4 เวิร์กโฟลว์ของ EEA1 / การวิเคราะห์การทับซ้อนของแอคตินใน Ocrl mPTC

รูปที่ S5 Alpelisib ฟื้นฟูการดูดซึมอัลบูมินในOcrl^Y/-mPTC นิพจน์ Aqp1 ไม่ได้รับผลกระทบ ไฟล์เสริม (ภาพยนตร์)

ภาพยนตร์ S1 การเรนเดอร์ Imaris 3D ของ EEA1/actin ซ้อนทับกันใน OcrlY/þ mPTCs ที่รับการรักษาด้วย DMSO การเรนเดอร์พื้นผิว 3 มิติที่เป็นตัวแทนของสแต็กคอนโฟคอลของ OcrlY/þ mPTCs ที่บำบัดด้วย DMSO เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นแก้ไขด้วยไฟฟิกซ์ฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดอิมมูโนลาเบลสำหรับ EEA1 (สีม่วง), แอคติน (ลลลอยด์; สีเหลือง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) แสดงภาพประกอบเพียงเล็กน้อย สมาคมแอกติน/เอนโดโซม บาร์=5 มม.

ภาพยนตร์ S2 การเรนเดอร์ Imaris 3D ของ EEA1 / actin ทับซ้อนกันในOcrl^Y/-mPTC ที่บำบัดด้วย DMSO การเรนเดอร์พื้นผิว 3 มิติที่เป็นตัวแทนของสแต็กคอนโฟคอลของ OcrlY/– mPTC ที่บำบัดด้วย DMSO เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นแก้ไขด้วยไฟฟิกซ์ฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดอิมมูโนลาเบลสำหรับ EEA1 (สีม่วง), แอคติน (ลลลอยด์; สีเหลือง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ที่แสดงเครื่องหมายวรรคตอน แอกตินที่สัมพันธ์กับโครงสร้างเอนโดโซม บาร์=5มม.

ภาพยนตร์ S3 การเรนเดอร์ Imaris 3D ของ EEA1 / actin ทับซ้อนกันในOcrl^Y/- mPTC ที่รักษาด้วย alpelisib การเรนเดอร์พื้นผิว 3 มิติที่เป็นตัวแทนของสแต็กคอนโฟคอลของ OcrlY/– mPTCs ที่บำบัดด้วย alpelisib 10 mM เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นแก้ไขด้วยไฟฟิกซ์ฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และติดอิมมูโนลาเบลสำหรับ EEA1 (สีม่วง), แอคติน (ลลลอยด์; สีเหลือง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) แสดงให้เห็นการช่วยเหลือโครงสร้าง punctate ของแอคตินรอบ ๆ เอนโดโซม บาร์=5 มม.

ข้อมูลอ้างอิง

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. การเรียนรู้สรีรวิทยาจากความผิดปกติของไตที่สืบทอดมา Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. กลุ่มอาการลอย เอ็ม โลว์ เด็กกำพร้า J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, บริวเวอร์ ED โลว์ซินโดรม ใน: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., eds. GeneReviews® [อินเทอร์เน็ต] ซีแอตเทิล (WA): มหาวิทยาลัยวอชิงตัน ซีแอตเทิล; 1993-2020. สามารถดูได้ที่: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/ ตีพิมพ์ 24 กรกฎาคม 2544; อัปเดต 18 เมษายน 2019 เข้าถึง 8 สิงหาคม 2019

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-phosphatase OCRL ในโรคโลว์และโรคบุ๋ม2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Chloride transporters และ endocytosis ที่รับสื่อกลางในท่อไตใกล้เคียง เจ ฟิสิโอล. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, เจฟเฟอร์สัน AB, เอื้อทวีเกียรติ วี, มาเจรัส พีดับบลิว. การขาดโปรตีนในกลุ่มอาการโลว์คือ phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 5- phosphatase Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M และอื่น ๆ บทบาทของ OCRL ในไดนามิกของหลุมที่เคลือบด้วยคลาทรินและการไม่เคลือบผิวที่เปิดเผยโดยการศึกษาเซลล์กลุ่มอาการโลว์ อีไลฟ์. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. หน้าที่ของเซลล์และสรีรวิทยาของโปรตีน Lowe syndrome OCRL1 การจราจร. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, และคณะ ฟิวชั่นออโตฟาโกโซม-ไลโซโซมกระตุ้นการตอบสนองของไลโซโซมโดยอาศัย TLR9 และควบคุมโดย OCRL แนท เซลล์ ไบโอล. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E และอื่น ๆ OCRL ควบคุมการค้ามนุษย์ผ่านเอ็นโดโซมระยะแรกผ่านการควบคุมที่ขึ้นกับ PtdIns4,5P(2) ของแอคตินเอนโดโซม EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A และอื่น ๆ การขาด OCRL บั่นทอนการทำงานของเอนโดไลโซโซมในแบบจำลองเมาส์ที่ทำให้มีลักษณะของมนุษย์สำหรับโรคโลว์และโรคบุ๋ม. ฮัม โมล เจเนท. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD และอื่น ๆ P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- และปัจจัยการแลกเปลี่ยนกัวนีน-นิวคลีโอไทด์ที่ควบคุมโดย Gbetagamma สำหรับ Rac เซลล์. 2002;108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. ฟอสโฟอิโนซิไทด์และความโค้งของเมมเบรนเปลี่ยนโหมดของแอกตินโพลิเมอไรเซชันผ่านการคัดเลือก Toca-1 และ Snx9 Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, ใบสำคัญแสดงสิทธิ A, Holst MR, et al. การควบคุมการเกิดพอลิเมอไรเซชันของแอกตินโดยบังเอิญของฟอสโฟโนซิไทด์และความโค้งของเมมเบรนสูง เจ เซลล์ ไบโอล. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T และอื่น ๆ PTEN ควบคุม PI(3,4)P2 ส่งสัญญาณดาวน์สตรีมของคลาส I PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส). เซลล์โมล 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, และคณะ การแปลความหมายของฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-ฟอสเฟตในเซลล์ยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม EMBO เจ. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD และอื่น ๆ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ทางเดินในโรคของมนุษย์ เซลล์. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, และคณะ BAY 80-6946 เป็น PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ตัวยับยั้งที่มีฤทธิ์ p110alpha และ p110delta ในเซลล์เนื้องอกและแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ โมลมะเร็งเธอ. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C และอื่น ๆ ลักษณะของนวนิยายและเฉพาะ PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ตัวยับยั้งอัลฟา NVP-BYL719 และการพัฒนากลยุทธ์การแบ่งชั้นผู้ป่วยสำหรับการทดลองทางคลินิก โมลมะเร็งเธอ. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA และอื่น ๆ การค้นพบ NVP-BYL719 ฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล-3 kinase alpha inhibitor ที่มีศักยภาพและคัดเลือกที่เลือกไว้สำหรับการประเมินทางคลินิก ไบโอออร์ก เมด เคม เลตต์ 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G และอื่น ๆ Alpelisib สำหรับมะเร็งเต้านมขั้นสูงที่มีตัวรับฮอร์โมนที่กลายพันธุ์โดย PIK3CA N Engl เจ เมด 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH และอื่น ๆ การรักษาแบบกำหนดเป้าหมายในผู้ป่วยที่มีอาการ overgrowth syndrome ที่เกี่ยวข้องกับ PIK3CA ธรรมชาติ. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, และคณะ แบบจำลองเมาส์สำหรับโรค Lowe syndrome/Dent Disease 2 ไตทูบูโลพาที เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J และอื่น ๆ โมโนโคลนัลแอนติบอดีสำหรับแสดงภาพ PtdIns(3,4,5)P(3) ในเซลล์ เจ ฮิสโตเคม ไซโตเคม. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, เออร์ไวน์ RF เทคนิคอิมมูโนไซโตเคมีคอลเผยให้เห็นกลุ่มเซลล์ที่แตกต่างกันของ PtdIns4P และ PtdIns (4,5)P(2) Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S และอื่น ๆ พลวัตของการแปลงฟอสโฟโนซิไทด์ในทราฟฟิก endocytic ที่เป็นสื่อกลางของคลาทริน ธรรมชาติ. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, แย่ Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)ไอโซฟอร์มในการส่งสัญญาณของเซลล์และการค้าถุงอัณฑะ แนท เรฟ โมล เซลล์ ไบโอล. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P และอื่น ๆ ไฟโบรบลาสต์ที่กลายพันธุ์โดย OCRL จากผู้ป่วยที่มีโรค Dent-2 แสดงความแปรปรวนของฟีโนไทป์ที่ไม่ขึ้นกับ INPP5B เทียบกับเซลล์กลุ่มอาการโลว์ ฮัม โมล เจเนท. 2015;24: 994–1006.

29. ซูชี่ เอสเอฟ, นุสบอม อาร์แอล การขาด PIP2 5-phosphatase ในกลุ่มอาการ Lowe ส่งผลต่อการเกิดปฏิกิริยาโพลิเมอไรเซชัน แอม เจ ฮุม เจเน็ต. 2002;71:1420– 1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J และอื่น ๆ PI3K เฉพาะเนื้องอก (ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส)การยับยั้งโดยการส่งมอบที่กำหนดเป้าหมายเป็นอนุภาคนาโนในมะเร็งเซลล์สความัสที่ศีรษะและคอ แนท คอมมูน. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C และอื่น ๆ PTEN ลด endosomal PtdIns (4,5)P2 ในลักษณะที่ไม่ขึ้นกับฟอสฟาเตสผ่านทางเดินของ PLC เจ เซลล์ ไบโอล. 2019;218:2198–2214.

32. ฌอง เอส, คีเกอร์ เอเอ การประสานงานระหว่าง RAB GTPase และการควบคุมและหน้าที่ของ phosphoinositide แนท เรฟ โมล เซลล์ ไบโอล. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G และอื่น ๆ โรคไตที่สืบทอดมาที่หายาก: ความท้าทาย โอกาส และมุมมอง มีดหมอ 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M และอื่น ๆ ผลลัพธ์ของไตในระยะยาวในเด็กที่มีการกลายพันธุ์ของ OCRL: การวิเคราะห์ย้อนหลังของกลุ่มประชากรนานาชาติที่มีขนาดใหญ่ การปลูกถ่าย Nephrol Dial 2018;33:85–94.

จาก: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

ลิขสิทธิ์ ª 2020, International Society of Nephrology เผยแพร่โดย Elsevier Inc. นี่เป็นบทความเปิดการเข้าถึงภายใต้ใบอนุญาต CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/)

สถาบัน มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์ ถนนสนามเทนนิส เคมบริดจ์ CB2 1QN สหราชอาณาจักร อีเมล: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; หรือ Olivier Devuyst, Institute of Physiology, University of Zurich, Zurich, Switzerland อีเมล: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ ผู้เขียนเหล่านี้มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน⁶ผู้เขียนเหล่านี้ร่วมกำกับการศึกษา ได้รับ 8 สิงหาคม 2019; แก้ไขเมื่อ 1 พฤษภาคม 2563; ยอมรับ 15 พฤษภาคม 2020; เผยแพร่ออนไลน์ 9 กันยายน 2020