Phenylethanoid Glycosides ของ Cistanche Deserticola: กลไกของผลต่อระบบประสาท
Feb 27, 2022
Maiquan Li, et al
เชิงนามธรรม:อีรีทรอยด์ปัจจัยนิวเคลียร์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและความผิดปกติของระบบประสาทฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์(PhGs; ซาลิโดรไซด์แอคทีโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์ และเอ็กไคนาโคไซด์) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและสารป้องกันประสาทฤทธิ์ทางชีวภาพ การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบสารป้องกันประสาทผลกระทบและกลไกระดับโมเลกุลของปริญญาเอก. ปริญญาเอกการปรับสภาพยับยั้ง H2O2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญโดยกระตุ้นการโยกย้ายนิวเคลียร์ของ Nrf2 และย้อนกลับการแสดงออกของโปรตีนที่ลดลงของ heme oxygenase 1 (H2O-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ), กลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส-ตัวเร่งปฏิกิริยา (GCLC) และหน่วยย่อยตัวปรับกลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส (GCLM) Nrf2 siRNA หรือ HO-1 ตัวยับยั้งสังกะสีโปรโตพอร์ไฟริน (ZnPP) ลดลงสารป้องกันประสาทผล. PhGs แสดงปฏิสัมพันธ์ที่อาจเกิดขึ้นกับตำแหน่งการจับ Nrf2 ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ ECH คล้ายเคลช์ 1 (Keap1) ผลลัพธ์นี้อาจสนับสนุนสมมติฐานที่ว่า PhGs เป็นตัวกระตุ้นของ Nrf2 เราแสดงให้เห็นการเชื่อมโยงที่เป็นไปได้ระหว่าง PhGs และวิถีทาง Nrf2/ARE ที่กระตุ้นด้วย Keapl และ PhGs ที่มีไกลโคไซด์มากกว่ามีผลที่เพิ่มขึ้น
คำสำคัญ:คีป1; Nrf2;ป้องกันระบบประสาท; เซลล์ PC12;ปริญญาเอก(NQO1) และอื่นๆ [5-7] กระบวนการนี้แสดงถึงขั้นตอนสำคัญในการปกป้องเซลล์จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และกำลังปรากฏเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคที่มีแนวโน้มว่าจะปกป้องเซลล์ประสาท [8] Gaia รายงานว่า Nrf2 บรรเทา LRRK2- และการเสื่อมสภาพของระบบประสาทที่เกิดจาก a-synuclein โดยการส่งเสริม homeostasis ของโปรตีนของเซลล์ประสาทอย่างมีศักยภาพในลักษณะที่เซลล์อิสระและขึ้นอยู่กับเวลา [9]
ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (ปริญญาเอก) มีลักษณะเฉพาะโดยกรดซินนามิกและไฮดรอกซิล ฟีนิล เอทิล มอยอิตีที่ยึดติดกับ ap -glucopyranose ผ่านทางเอสเทอร์และการเชื่อมโยงไกลโคซิดิก ตามลำดับ โมเลกุลเหล่านี้เป็นสมาชิกของกลุ่มผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ละลายน้ำได้ซึ่งกระจายอยู่ทั่วไปในอาณาจักรพืช [10] การศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกายได้แสดงให้เห็นว่าสารเหล่านี้มีสารต้านอนุมูลอิสระ [11],สารป้องกันประสาท(12) ต้านเชื้อแบคทีเรีย
ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cistanche มีคุณสมบัติป้องกันระบบประสาท คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติม
1. บทนำ
ความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชัน ซึ่งเป็นความไม่สมดุลของสภาวะสมดุลของสารต้านอนุมูลอิสระ ทำให้เกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน การบาดเจ็บของโปรตีนและดีเอ็นเอ การแก่ของเซลล์ และการตายของเซลล์ กระบวนการนี้น่าจะก่อให้เกิดความผิดปกติของระบบประสาทหลายอย่าง เช่น โรคอัลไซเมอร์ (AD), โรคพาร์กินสัน (PD) และภาวะขาดเลือด/การกลับเป็นซ้ำ [1] ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) ซึ่งเป็นหนึ่งในสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยาหลัก (ROS) เป็นที่ทราบกันดีว่าทำให้เกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและความเสียหายของดีเอ็นเอ [2] นอกจากนี้ H2O2 ยังเป็นแหล่งของอนุมูลอิสระไฮดรอกซิลที่ก่อให้เกิดระดับพื้นหลังของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของเซลล์ [3,4] ดังนั้นกลยุทธ์การรักษาเพื่อป้องกันการตายของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชันอาจมีศักยภาพในการรักษาโรคทางระบบประสาท
ปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องอย่างยิ่งกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การกระตุ้น Nrf2 ทำให้เกิดการถอดรหัสของสารต้านอนุมูลอิสระและยีนล้างพิษจำนวนมาก รวมถึง heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1
ต้านการอักเสบ [13] และภูมิคุ้มกัน [14] ฤทธิ์ทางชีวภาพ Osmanthusfragrans เป็นส่วนผสมทั่วไปในอาหารเอเชียหลายชนิดและมีการบริโภคมานานแล้ว ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากดอก O.fragrans ช่วยเพิ่มการเรียนรู้เชิงพื้นที่และความจำ ยับยั้งความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และแสดงกิจกรรมในการป้องกันระบบประสาทในการเสื่อมสภาพที่เกิดจากดีกาแลคโตสในแบบจำลองเมาส์ ICR [15] Salidroside, acteoside และ isoacteoside เป็นการตอบสนองของ PhGs ที่สำคัญสำหรับกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากดอก O.fragrans [16]
การศึกษาเกี่ยวกับผลการป้องกันระบบประสาทของ PhGs ได้ผลลัพธ์ที่น่าพอใจ Salidroside ลดการตายของเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญใน MPP plus [17,18] Acteoside ยังช่วยบรรเทา MPP บวก - การตายแบบอะพอพโทซิสและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์ PC12 [19] และ A p25-35-ทำให้เกิดการบาดเจ็บของเซลล์ SH-SY5Y [20]เอ็กไคนาโคไซด์ได้รับการตรวจสอบเกี่ยวกับการตายของเซลล์เนื้องอกที่เกิดจากปัจจัย-a (TNFa) ในเซลล์ SH-SY5Y [21] ความเป็นพิษของโดปามีนที่เกิดจาก MPTP ในหนูทดลอง [22], วัฒนธรรมปฐมภูมิที่ได้รับบาดเจ็บจากกลูตาเมตของเซลล์เยื่อหุ้มสมองของหนู [23] และ {{ 9}}ความเสียหายที่เกิดจาก OHDA ในเซลล์ PC12 [24] ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า PhGs แสดงผล cytoprotective และเป็นสารที่มีศักยภาพในการรักษาโรคทางระบบประสาท การศึกษาได้แสดงให้เห็นคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของ PhGs ภายใต้ฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นๆ มากมายสำหรับสารประกอบเหล่านี้ [25] อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่ตรวจสอบกลไกระดับโมเลกุลของ PhGs ต่อความเป็นพิษจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน
ในการศึกษาของเรา เราเลือก PhGs ทั่วไปสี่แบบดังนี้: ซาลิโดรไซด์ (โมโนแซ็กคาไรด์ฟีนิล), แอกเตโอไซด์ (ไดแซ็กคาไรด์ฟีนิล) และเอ็กไคนาโคไซด์(ฟีนิลทานอยด์ ไตรแซ็กคาไรด์) เราใช้แบบจำลองการตายของเซลล์ประสาทโดยใช้เซลล์ PC12 ที่แตกต่างกัน [26] เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันและกลไกระดับโมเลกุลของ PhGs ในแบบจำลองเซลล์ PC12 ที่เกิดจาก H2O2- เราแสดงให้เห็นว่า PhGs กระตุ้นวิถี Nrf2/ARE โดยจับกับโปรตีน 1 ที่เกี่ยวข้องกับ ECH คล้ายเคลช์ (Keap1) กระบวนการนี้ควบคุมเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและเพิ่มความต้านทานของเซลล์ PC12 ต่อความเครียดออกซิเดชัน
2. ผลลัพธ์
2.1. PhGs ยับยั้ง H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำในเซลล์ PC12
ผลที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2 และ PhGs (0.1,1,5 และ 10 卩g/mL) บนเซลล์ PC12 ได้รับการทดสอบ ผลการศึกษาพบว่า H2O2 ทำให้เกิดการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ PC12 ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นและขึ้นกับเวลา (รูปที่ 1A) การเปิดรับเซลล์ PC12 ต่อ 200 H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงส่งผลให้เซลล์มีชีวิตได้ 57.4 เปอร์เซ็นต์ การปรับสภาพเซลล์ด้วย PhGs ที่ 0.1,1, 5 และ 10 -/mL ไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ (รูปที่ 1B) และเซลล์ PC12 ที่ได้รับการปกป้องไว้อย่างชัดเจนจาก H2O2- ความเสียหายที่เกิดจากการปรับปรุงความมีชีวิตของเซลล์เป็น 9.549-22.141 เปอร์เซ็นต์ , 12.092-25.289 เปอร์เซ็นต์ , 1.470-9.289 เปอร์เซ็นต์ และ 3.411-11.441 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (รูปที่ 1C) . อย่างไรก็ตาม ซาลิโดรไซด์ (0.1 ^g/mL), ไอโซแอคทีโอไซด์ (0.1, 1, 5 และ 10 ^g/mL),เอ็กไคนาโคไซด์การปรับสภาพก่อน (0.1,1 และ 5 ^g/mL) ไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญต่อการบาดเจ็บของเซลล์ที่เกิดจาก HzOz การปรับสภาพเซลล์ด้วย PhGs ยังช่วยปรับปรุงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่เหนี่ยวนำโดย H2O2 (รูปที่ 1D)
รูปที่ 1 PhGs ยับยั้ง H2O2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ PC12 ตรวจพบความมีชีวิตของเซลล์โดยการทดสอบ MTT พิษต่อเซลล์ของ H2O2 (A) และ PhGs (B) ที่ความเข้มข้นต่างกันในเซลล์ PC12 (C) PhGs ลดทอน H2O2- เหนี่ยวนำให้เซลล์มีชีวิตรอด เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs ({{10}}.1 และ 10 wg/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงบ่มด้วย 200 pM H2O2 สำหรับอีกเซลล์หนึ่ง 2 ชั่วโมงหลังจากถอด PhGs (D) การสังเกตทางสัณฐานวิทยา เซลล์หลังการรักษาถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบ phase-contrast microscope (x100), CK: กลุ่มปกติ, H2O2: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, HL: กลุ่มที่ได้รับยา salidroside ในปริมาณต่ำ, HH: กลุ่มที่ได้รับยา salidroside ในปริมาณสูง, ML: กลุ่มที่ได้รับยา acteoside ในปริมาณต่ำ, MH: กลุ่มที่ได้รับยากลุ่ม Acteoside สูง, IL: กลุ่มที่ได้รับยา isoacteoside ในปริมาณต่ำ, IH: กลุ่มที่ได้รับยา isoacteoside ในปริมาณสูง, SL: กลุ่มที่ได้รับยา echinacoside ในปริมาณต่ำ, SH: กลุ่มที่ได้รับยา echinacoside ในปริมาณสูง ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2;="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.2. PhGs Suppressed H2O2-กระตุ้นการสะสมภายในเซลล์ของ ROS, Lipid Peroxidation (MDA) และกิจกรรม Superoxide Dismutase (SOD) ในเซลล์ PC12
การเปิดรับเซลล์ PC12 ถึง 200 pM H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เพิ่มระดับ ROS, ปริมาณ MDA และกิจกรรม SOD ที่ลดลง (รูปที่ 2) การปรับสภาพด้วย PhGs ช่วยลดระดับ ROS, ซาลิโดรไซด์ และแอกทิโอไซด์ และปริมาณที่สูงของการปรับสภาพไอโซแอคทีโอไซด์และเอไคนาโคไซด์ทำให้ระดับ ROS ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.01)="" การปรับสภาพซาลิโดรไซด์ไม่มีผลต่อเนื้อหาของ="" mda="">แอคทีโอไซด์การปรับสภาพก่อนลดทอนเนื้อหา MDA อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)="" การปรับสภาพ="" isoacteoside="" และ="" echinacoside="" ลดทอนเนื้อหา="" mda="">
รูปที่ 2 PhGs บล็อกการสะสม ROS และ MDA และเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเซลล์ PC12 เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs (0.1 และ 10 4g/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงบ่มด้วย 200 |^M H2O2 สำหรับอีกเซลล์หนึ่ง 2 ชั่วโมงหลังจากถอด PhGs (A) PhGs ขัดขวางการสะสม ROS และ MDA (B) PhGs ปิดกั้นการสะสม MDA (C) PhGs เพิ่มกิจกรรมของ SOD CK: กลุ่มปกติ, รุ่น: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, Salidroside: กลุ่มที่ได้รับ salidroside, Acteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย acteoside, Isoacteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย isoacteoside, Echinacoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย echinacoside ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.3.PhGs Reversed H2O2-กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12
การบำบัดด้วย H2O2 (200 |1M) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงเพิ่มการตายของเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญ โดยมีอัตราการตายแบบอะพอพโทซิสทั้งหมดสูงถึง 16.02 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3) อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพด้วย PhGs (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงช่วยลดอัตราการตายของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น (p < 0.01)="">แอคทีโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์ และเอ็กไคนาโคไซด์ลดเปอร์เซ็นต์การตายของเซลล์ตายลงอย่างเห็นได้ชัด 4.750-6.627 เปอร์เซ็นต์ , 4.413-5.800 เปอร์เซ็นต์ , 6.593-10.047 เปอร์เซ็นต์ และ 1.530-7 510 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ
รูปที่ 3 PhGs ย้อนกลับ H2O2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12 เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย 200 พิโคโมลาร์ H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก จากนั้น วัดการตายของเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ PI/FITC
CK: กลุ่มปกติ, รุ่น: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, Salidroside: กลุ่มที่ได้รับ salidroside, Acteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย acteoside, Isoacteoside: กลุ่มที่ได้รับ isoacteoside,เอ็กไคนาโคไซด์: เอ็กไคนาโคไซด์กลุ่มที่รับการรักษา ** p < {{0}}.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.4. PhGs Alleviated H2O2-Induced Dysregulation of the Nrf2-เป็นวิถีทางในเซลล์ PC12
เส้นทาง Nrf{{0}}ARE ในฐานะหนึ่งในวิถีทางต้านอนุมูลอิสระที่สำคัญในเซลล์เกือบทุกประเภท มีความสำคัญในการควบคุมการเติบโตของเซลล์และการตายของเซลล์ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าวิถี Nrf2-ARE เกี่ยวข้องกับการตายแบบอะพอพโทซิสที่เหนี่ยวนำโดย H2O2-โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และการวิเคราะห์ Western blot โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะหรือไม่ การทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แสดงให้เห็นว่า PhGs (0.1 และ 10 pg/mL) เหนี่ยวนำให้เกิดการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ Nrf2 (รูปที่ 4) หลังการรักษา PhGs, isoacteoside และเอ็กไคนาโคไซด์ส่งผลให้มีการฟื้นตัวของสัณฐานวิทยาปกติของเซลล์บางส่วน ผลจากการวิเคราะห์ Western blotting และ grey density แสดงให้เห็นว่า PhGs ({0}}.1 และ 10 pg/mL) ไม่มีอิทธิพลอย่างมีนัยสำคัญต่อการแสดงออกของ Nrf2 ในไซโตพลาสซึม (รูปที่ 5A, B) (p > {{20}}.05) แต่การแสดงออกของ Nrf2 ที่เพิ่มขึ้นในนิวเคลียส (รูปที่ 5C,D) (p < 0.01)="" จากนั้น="" เราศึกษาบทบาทของ="" nrf2="" ใน="" h2o2-อะพอพโทซิสที่เหนี่ยวนำโดยการนำเข้า="" nrf2="" sirna="" การแสดงออกของโปรตีนและ="" mrna="" ของ="" nrf2="" ถูกปรับลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่บำบัดด้วย="" nrf2="" sirna="" ทั้งหมด="" (รูปที่="" 5e-h)="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" pg/ml)="" ป้องกัน="" h2o2-ความเป็นพิษต่อเซลล์ในกลุ่มที่ไม่มีการบำบัดด้วย="" nrf2="" sirna="" (p="">< 0.01)="" แต่การป้องกันดังกล่าวถูกย้อนกลับโดย="" nrf2="" sirna="" หลังการบำบัดด้วย="" nrf2="" sirna="" ความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญแม้กับการบำบัดด้วย="" phgs="" (รูปที่="">
รูปที่ 5. ผลการป้องกันของ PhGs ต่อ Nrf2 ใน H2O2-เซลล์ PC12 ที่ได้รับการบำบัด (A) การแสดงออกของโปรตีน Nrf2 ในไซโตพลาสซึมถูกตรวจพบโดย immunoblotting โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะ ใช้ p-Actin เป็นตัวควบคุมการโหลด (B) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของโปรตีน Nrf2 ในไซโตพลาสซึม (C) การแสดงออกของโปรตีน Nrf2 ในนิวเคลียสถูกตรวจพบโดย immunoblotting โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะ ฮิสโตน H3 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด (D) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของโปรตีน Nrf2 ในนิวเคลียส (E, F) เซลล์ PC12 ถูกบ่มล่วงหน้าโดยไม่มี (E) หรือด้วย (F) Nrf2 siRNA เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นบ่มด้วยหรือไม่มี PhGs (0.1 และ 10 昭/มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออกไป การแสดงออกของโปรตีน Nrf2 ทั้งหมดถูกตรวจพบโดยอิมมูโนบล็อตติงโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะ และ p-actin ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด (G) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของโปรตีน Nrf2 ทั้งหมด (H) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ Nrf2 mRNA (I) เซลล์ PC12 ถูกบ่มล่วงหน้าโดยมีหรือไม่มี siRNA เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นบ่มด้วยหรือไม่มี PhGs (0.1 และ 10 -/มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังการรักษา เซลล์การรอดชีวิตถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์ MTT CK: กลุ่มปกติ, รุ่น: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, กลุ่มควบคุม Si: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย siRNA, SiRNA เชิงลบ: ไม่มีกลุ่มที่ได้รับ siRNA, SiRNA Positive: กลุ่มที่ได้รับ SiRNA, Salidroside: กลุ่มที่ได้รับ salidroside, Acteoside: กลุ่มที่รักษาด้วย acteoside, Isoacteoside: isoacteoside ที่ได้รับการรักษา กลุ่ม,เอ็กไคนาโคไซด์: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วยอิชินาโคไซด์ ** p < {{0}}.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" (โดยไม่บำบัดด้วย="" nrf2="" sirna),="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" (โดยไม่บำบัดด้วย="" nrf2="" sirna);="" &="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" (โดยที่บำบัดด้วย="" nrf2="" sirna)="" และ="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" (ด้วยการบำบัดด้วย="" nrf2="">
2.4. PhGs กลับด้าน H2O2-ที่ชักนำให้เกิดการปรับลดการแสดงออกของโปรตีนของ HO-1, NQO1, GCLC และ GCLM
H O{{0}}, NQO1 และกลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส (GCL) เป็นเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระระดับเซลล์ที่สำคัญ และ HO-1, NQO1 และหน่วยย่อยเร่งปฏิกิริยาหรือดัดแปลงของ GCL (GCLC หรือ GCLM) คือ Nrf2-ควบคุมยีนดาวน์สตรีม [27] การแสดงออกของโปรตีนของ H2O-1, NQO1, GCLC และ GCLM สังเกตพบหลังการบำบัด พบความแตกต่างที่เห็นได้ชัดระหว่างการแสดงออกของโปรตีนของ H2O-1 และ NQO1 ที่มีหรือไม่มี H2O2 (รูปที่ 6A-C) (p < 0.01)="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" p^g/ml)="" กลับการควบคุม="" h2o2-="" ที่เหนี่ยวนำให้ลดการแสดงออกของโปรตีนของ="" h2o-1="" (ยกเว้นซาลิโดรไซด์ที่="" {{32}="" }.1="" pg/ml),="" nqo1="" (ยกเว้นแอคทีโอไซด์ที่="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01)="" นอกจากนี้="" h2o2="" ยังปรับลดการแสดงออกของโปรตีน="" gclc="" และ="" gclm="" (p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 6a,d,e)="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" pg/ml)="" กลับด้าน="" h2o2-="" การปรับลดการแสดงออกของโปรตีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดของ="" gclc="">เอ็กไคนาโคไซด์ที่ {{0}}.1 pg/mL) (p < 001)="" และ="" gclm="" (ยกเว้น="" salidroside="" ที่="" 0.1="" pg/ml)="" (="" พี="">< 0.01).="" จากนั้น="" สารยับยั้งทางเคมีสำหรับ="" h2o-1="" ถูกใช้เพื่อประเมินบทบาทของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มเติมในการควบคุมการป้องกัน="" phgs="" ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก="" h2o2-="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" pg/ml)="" ป้องกัน="" h2o2-ความเป็นพิษต่อเซลล์="" แต่ผลการป้องกันดังกล่าวถูกย้อนกลับโดย="" h2o-1="" ตัวยับยั้ง="" znpp="" (p="">< 0.01)="" ที่="" 20="" pm="" (รูปที่="" 6f,="" p="">< 0.01)="">
2.5. Keap1 Expression and Molecular Docking Analysis
ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา Keap1 ทำหน้าที่เป็นโปรตีนปราบปรามของ Nrf2 โดยการผูกมัดกับโดเมน Neh2 ของ Nrf2 และกำหนดเป้าหมาย Nrf2 ไปที่ E3 ubiquitin ligase ตาม Cul3- สำหรับการแพร่หลายและการย่อยสลายที่ตามมาโดย 26S proteasome [28] ความสามารถในการจับกับ Keap1 ของ PhGs ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์การเทียบท่าระดับโมเลกุลเพื่อตรวจสอบกลไกภายใต้ผลของสารต้านอนุมูลอิสระ
3. อภิปราย
เราตรวจสอบการป้องกันระบบประสาทของ PhGs เกี่ยวกับความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก H2O2 ในเซลล์ PC12 ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการปรับสภาพด้วย PhGs ยับยั้งความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก HzOz อย่างมีนัยสำคัญ ทำให้ระดับ ROS ภายในเซลล์อ่อนลง ปรับปรุงระดับของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ และทำให้ H2O2-เกิดพิษต่อเซลล์ในเซลล์ PC12 กลับด้านในที่สุด นอกจากนี้ PhGs ยังเพิ่มการกระตุ้นการถอดรหัสของ Nrf2 ย้อนกลับการปรับลดการควบคุมที่เกิดจาก HzOz ของการแสดงออกของโปรตีน HO-1, NQO1, GCLC และ GCLM นอกจากนี้ PhGs ยังแสดงปฏิสัมพันธ์ที่อาจเกิดขึ้นกับตำแหน่งการจับ Nrf2 ในโปรตีน Keap1
ในการบาดเจ็บของเซลล์ PC12 ที่เกิดจาก H2O2- ลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน ซึ่งหมายถึงการเสื่อมสภาพออกซิเดชันของลิพิด ทำให้การซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์เพิ่มขึ้น นำไปสู่ความเสียหายของเซลล์ [29] การก่อตัวของ MDA ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นดัชนีของลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน [30] H2O2 ช่วยเพิ่มการผลิต ROS และเอ็นไซม์ป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่หมดแล้ว เช่น SOD, catalase และ GPx กระบวนการนี้นำไปสู่ความเครียดออกซิเดชัน [31] ซึ่งมีบทบาทสำคัญในสาเหตุและความก้าวหน้าของความผิดปกติของระบบประสาทส่วนใหญ่ สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ เราสังเกตเห็นระดับ ROS ที่เพิ่มขึ้น เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ลดลง และเพิ่มการตายของเซลล์ PC12 หลังการรักษาด้วย H2O2 การปรับสภาพด้วย PhGs ได้ลดทอนการเพิ่มขึ้นของ ROS ภายในเซลล์ที่เกิดจาก HzOz อย่างมีนัยสำคัญ ปรับปรุงเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ และทำให้ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก HzOz ในเซลล์ PC12 ลดลงในที่สุด
กวง et al. [32] รายงานว่าเอ็กไคนาโคไซด์แสดงให้เห็นผลกระทบต่อเซลล์ประสาทที่มีนัยสำคัญต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2-ในเซลล์ PC12 ผ่านทางวิถีอะพอพโทติกของไมโตคอนเดรีย ในการศึกษานี้ เราพบว่า echinacoside, salidroside, acteoside และ isoacteoside แสดงผลทางประสาทโดยการเพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ PC12 เนื่องจากเพิ่มการกระตุ้นการถอดรหัสของ Nrf2 และเพิ่มการควบคุมการแสดงออกของโปรตีนปลายน้ำของ H2O-1, NQO1 GCLC และ GCLM การศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าการกระตุ้นยีนเป้าหมาย Nrf2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HO-1 ในแอสโตรไซต์และเซลล์ประสาทสามารถป้องกันการอักเสบ ความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการตายของเซลล์ได้อย่างมาก มีรายงานว่าระบบ HO-1 ทำงานอย่างมากในระบบประสาทส่วนกลาง และดูเหมือนว่าการมอดูเลตนั้นมีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของความผิดปกติของระบบประสาท [33] การศึกษาล่าสุดยังชี้แจงบทบาทของ Nrf2 ในความก้าวหน้าและความเสี่ยงของ PD [9] และ Keap1 เป็นเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเปิดใช้งาน Nrf2 อีกครั้งใน AD [34] ผลลัพธ์ดังกล่าวสนับสนุนหลักฐานใหม่สำหรับ Nrf2 ว่าเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคทางระบบประสาท
การวิเคราะห์เทียบท่าระดับโมเลกุลแสดงให้เห็นว่า PhGs สามารถจับกับ Keap1 ด้วยความสามารถในการจับดังต่อไปนี้:เอ็กไคนาโคไซด์>ไอโซแอคทีโอไซด์ > แอคทีโอไซด์ > ซาลิโดรไซด์ สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้ การปรับสภาพของ PhGs นำไปสู่การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ Nrf2 ด้วยการแสดงออกของ Nrf2 ต่อไปนี้ในนิวเคลียส:เอ็กไคนาโคไซด์>ไอโซแอคทีโอไซด์ * แอคทีโอไซด์ > ซาลิโดรไซด์ เราคิดว่าจำนวนของไกลโคไซด์ส่งผลต่อโหมดการจับที่เป็นไปได้ของ PhGs และ Keap1 และโหมดการจับทำให้เกิดการปลดปล่อย Nrf2 จาก Keap1 ต่อไป กระบวนการนี้ส่งผลให้เกิดการกระตุ้น Nrf2 และยีนดาวน์สตรีม และในที่สุดปกป้องเซลล์ PC12 จากความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก H2 O2 -
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. สารประกอบทางเคมีและรีเอเจนต์
Salidroside (CAS No. 10338-51-9), acteoside (CAS No. 61276-17-3), isoacteoside (CAS No. 61303-13-7) และเอ็กไคนาโคไซด์(CAS No. {0}}) ซื้อมาจาก YYuanye Biotechnology Company (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) PhGs ถูกละลายใน PBS เพื่อผลิตสารละลายสต็อก 10 มก./มล. ซึ่งถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา ซื้อ H2O2 จาก Aladdin® (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) RPMI-1640 ซีรั่มจากโคนมและทารกในครรภ์ถูกซื้อจากไฮโคลน (โลแกน รัฐยูทาห์ สหรัฐอเมริกา) และซื้อทริปซิน EDTA เพนิซิลลิน และสเตรปโตมัยซิน 0.5 เปอร์เซ็นต์จากเคอิ (หางโจว ประเทศจีน) MDA, ชุดตรวจวินิจฉัย SOD, MTT และ DCFH-DA ถูกซื้อจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (หนานจิง มณฑลเจียงซู ประเทศจีน) Annexin V-FITC/PI double staining Kit ซื้อมาจาก Solarbio Life Sciences (ปักกิ่ง ประเทศจีน) ซื้อแอนติบอดีต่อ Nrf2, Histone H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM และ p-actin, IgG ต้านหนู-พืชชนิดหนึ่ง (HRP) และสารต้านกระต่าย-HRP-IgG จาก Abcam (ลอนดอน สหราชอาณาจักร). สารยับยั้ง HO-1 และ ZnPP ถูกซื้อจาก Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ซื้อ RNAiso Plus, PrimeScript™ RT reagent Kit พร้อม gDNA Eraser และ SYBR® Premix Ex Taq™ II จาก Takara (เมืองชิงะ ประเทศญี่ปุ่น) ซื้อ Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent จาก Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK) ลำดับ Nrf2 siRNA มีดังนี้: ไปข้างหน้า CCGAAUUACAGUGUCUCUUA; และย้อนกลับ UUAAGACACUGUAAUUCGG ในขณะเดียวกัน ลำดับ siRNA ควบคุมมีดังนี้: ไปข้างหน้า UUCUCCGAACGUGUCACGU; และย้อนกลับ ACGUGACACGUUCGGAGAA
4.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์
สาย pheochromocytoma ต่อมหมวกไตของเมาส์ (เซลล์ PC12) ได้รับจากสถาบันชีวเคมีและเซลล์ชีววิทยา SIBS (CAS เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) เซลล์ถูกคงรักษาไว้ใน RPMI-1640 (Hyclone) ที่มี 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมของวัวในครรภ์ (Hyclone), 100 U/mL เพนิซิลลินและ 0.1 มก./มล. สเตรปโตมัยซินที่ 37 องศาโดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ สื่อถูกเปลี่ยนวันเว้นวัน
4.3. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์
เซลล์ PC12 ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมที่ 2 x 104 เซลล์/หลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าโดยมีหรือไม่มีตัวยับยั้งเป็นเวลา 20 นาที บ่มโดยมีหรือไม่มี PhG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกบำบัดด้วย MTT 5 มก./มล. เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37 องศา และตัวกลางถูกกำจัดออกอย่างระมัดระวัง ผลึกฟอร์มาซานที่ก่อตัวขึ้นโดยเซลล์ที่รอดตายถูกละลายใน DMSO 150 rL เพื่อสร้างสีน้ำเงิน [35] และการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 570 นาโนเมตรบนเครื่องอ่านเพลต กลุ่มควบคุมใช้สื่อที่มีความเข้มข้นเท่ากันกับ DMSO เพียงอย่างเดียว ความมีชีวิตของเซลล์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นเปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม
ความเข้มข้นของ PhGs (0.1,1,5 และ 10 Rg/mL) ถูกเลือกโดยขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ PhGs และรายงานผลการป้องกันเซลล์ของเอไคนาโคไซด์ [32] ตามรายงาน ไม่มีผลต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่แสดงด้านล่าง 10 Rg/mL และรายงานว่าอิชินาโคไซด์แสดงผลต่อเซลล์ในแบบจำลองเซลล์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก HzOz
4.4. การทดสอบอะพอพโทซิส
ตรวจพบอะพอพโทซิสด้วย Annexin V-FITC/PI double staining Kit (Solarbio) เซลล์ PC12 ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ 2 x 105 เซลล์/หลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบำบัดด้วย PhG (0.1 และ 10 Rg/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบ่มด้วย H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างใน PBS เย็น หมุนเหวี่ยงสองครั้งที่ 1500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และแขวนลอยใหม่อีกครั้งใน 500 rL ของบัฟเฟอร์การจับ Annexin V ที่ติดฉลาก FITC (5 rL) และโพรพิเดียมไอโอไดด์
4.5. การวัด ROS ภายในเซลล์ การผลิต MDA และ SOD
ระดับ ROS ภายในเซลล์ถูกกำหนดหาโดยใช้โพรบเรืองแสงที่ไวต่อ ROS กล่าวคือ 2,7-ไดคลอโรไดไฮโดรฟลูออเรสเซนต์ไดอะซีเตต (DCFH-DA) เซลล์ PC12 ถูกเพาะในจาน 6-หลุมที่ 2 x 105 เซลล์/หลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบำบัดด้วย PhG (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบ่มด้วย H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างด้วย PBS สามครั้งและต่อมาบ่มด้วย DCFH-DA 10 ไมโครโมลาร์ หลังจากการฟักไข่ที่ 37 องศาเป็นเวลา 20 นาที เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และรวบรวมโดยการปั่นเหวี่ยงอย่างอ่อนโยน ROS ภายในเซลล์วัดโดยใช้ Gallios™ flow cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)
MDA และ SOD ถูกวัดโดยชุดทดสอบ (Beyotime Biotechnology, Nanjing, Jiangsu, China) ขั้นตอนทั้งหมดเป็นไปตามคำแนะนำของผู้ผลิตอย่างสมบูรณ์ เนื้อหาของ MDA และ SOD ถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยปริมาณโปรตีนทั้งหมดที่สอดคล้องกัน
4.6. Nrf2 นิวเคลียส Translocation Immunofluorescence
เซลล์ PC12 ถูกเพาะใน6-สไลด์แก้วหลุมที่ความหนาแน่น 2 x 105 ต่อหลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบำบัดด้วย PhGs (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างใน PBS เย็นและตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตามด้วยการทำให้ซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์โดยใช้ 0.5 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 ใน PBS เป็นเวลา 5 นาที เซลล์ถูกบ่มด้วย anti-Nrf2 Rabbit IgG (Abcam) ที่มี FBS 5 เปอร์เซ็นต์ในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา จากนั้น แอนติ-แรบบิทแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตกับ FITC ถูกนำไปใช้กับเซลล์เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง นิวเคลียสถูกย้อมด้วย 4z,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ที่ขั้นตอนการเตรียมขั้นสุดท้าย สไลด์ถูกล้างชั่วครู่ด้วย PBS อบแห้งด้วยอากาศ และติดตั้งในสารต้านการเรืองแสงในตัวกลางที่ซีดจาง สไลด์ถูกแสดงภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล (LMS780, Zeiss, Germany)
4.7. การสกัดโปรตีน
เซลล์ PC12 ถูกเพาะในจานขนาด 10ขนาด 0 มม. ที่ 1 x 107 เซลล์/จาน หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบำบัดด้วย PhGs (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงด้วยการกำจัด PhGs หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นและขูดออกจากจานด้วย 1000 卩L ของ PBS เซลล์โฮโมจิเนตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที หลังการรักษา โปรตีนในเซลล์ถูกสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์สลายเซลล์ Beyotime RIPA ที่มี PMSF 1 มิลลิโมลาร์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต นอกจากนี้ โปรตีนไซโตพลาสซึมและนิวเคลียสถูกแยกออกตามที่อธิบายไว้ในชุดอุปกรณ์สกัดนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึมของบีโยไทม์ ความเข้มข้นของโปรตีนของตัวอย่างถูกตรวจพบโดยชุดทดสอบโปรตีน Beyotime BCA และตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาสำหรับการวิเคราะห์ Western blot
4.8. การวิเคราะห์ Western Blot
การวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการโดยใช้วิธีมาตรฐาน โดยย่อ ตัวอย่างโปรตีน (20 หรือ 30 ไมโครกรัม) ถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF เมมเบรนถูกบล็อกในนม 5 เปอร์เซ็นต์-TBST และฟักในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาในแอนติบอดีปฐมภูมิ แอนติบอดีที่ใช้ประกอบด้วย Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histone H3 (Abcam) และ พี-แอคติน (Abcam) IgG แอนติ-เมาส์ที่คอนจูเกตเปอร์ออกซิเดส (Abcam) หรือ IgG ต้านกระต่าย (Abcam) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ แถบโปรตีนถูกแสดงภาพโดยใช้ชุด ChemiScope (Clinx Science Instruments, Shanghai, China) ค่าสีเทาของแถบโปรตีนถูกหาปริมาณโดยใช้ ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)
4.9. PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ
RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่าง RNA ทั้งหมดถูกคัดลอกย้อนกลับด้วย PrimeScript™RT reagent Kit พร้อม gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japan) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japan) ใน Applied Biosystems ViiA™ 7 Real-Time PCR System การแสดงออกสัมพัทธ์ของยีนเป้าหมายถูกทำให้เป็น p-Actin และวิเคราะห์โดยวิธี 2-AACt ลำดับไพรเมอร์สำหรับ Nrf2 มีดังนี้: ไปข้างหน้า, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA และย้อนกลับ, TCTGGGCGGCGACTTTAT ลำดับไพรเมอร์สำหรับ p-Actin มีดังนี้: ไปข้างหน้า GCTGTCCCTGTATGCCTCT; และย้อนกลับ TTGATGTCACGCACGATTT
4.10. siRNA Transfection
เซลล์ PC12 ถูกเพาะเลี้ยงใน6-หลุมแก้วสไลด์ที่ความหนาแน่น 2 x 105 ต่อหลุม (สำหรับการวิเคราะห์ Western blot) หรือใน96-สไลด์แก้วหลุมที่ความหนาแน่น 2 x 104 ต่อหลุม (สำหรับเซลล์ การวิเคราะห์ความมีชีวิต) siRNA ควบคุมและ Nrf2 siRNA ถูกถ่ายโอนไปยังเซลล์โดยใช้ Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดด้วยหรือไม่มี PhG และ H2O2 สำหรับเวลาที่ระบุและจากนั้นใช้ในการวิเคราะห์ Western blot, qRT-PCR หรือการวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ตามที่บรรยายไว้ข้างต้น
4.11. การวิเคราะห์การเทียบท่าระดับโมเลกุล
Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).
4.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ
วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ ANOVA ทางเดียวด้วยการวิเคราะห์ LSD โดยใช้ SPSS ผลลัพธ์ทั้งหมดได้รับการยืนยันจากการทดลองอิสระสามครั้ง ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย 土 SD พิจารณาความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติที่ p <>
กิตติกรรมประกาศ: การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนโดยโครงการวิจัยและพัฒนาหลักแห่งชาติของจีน (หมายเลข 2017YFD0400200), มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติประจำจังหวัดเจ้อเจียง (หมายเลข R15C200002) และโครงการพิเศษการประเมินความเสี่ยงด้านความปลอดภัยคุณภาพผลิตภัณฑ์ทางการเกษตร (ฉบับที่ GJFP2018015) กระทรวงเกษตรและกิจการชนบทของจีน
ผลงานของผู้เขียน:Baiyi Lu และ Maiquan Li ออกแบบการศึกษา Maiquan Li ดำเนินการห้องปฏิบัติการ วิเคราะห์ข้อมูล และเขียนบทความ Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao และ Baiyi Lu แก้ไขต้นฉบับ
1 ห้องปฏิบัติการวิศวกรรมแห่งชาติของเทคโนโลยีและอุปกรณ์อาหารอัจฉริยะ
ห้องปฏิบัติการหลักสำหรับการจัดการหลังการเก็บเกี่ยวผลิตภัณฑ์เกษตรของกระทรวงเกษตรและกิจการชนบท ห้องปฏิบัติการหลักสำหรับการประเมินคุณค่าทางโภชนาการของผลิตภัณฑ์เกษตรของกระทรวงเกษตรและกิจการชนบท ห้องปฏิบัติการหลักเจ้อเจียงเพื่อการแปรรูปอาหารเกษตร สถาบันวิทยาศาสตร์การอาหาร Fuli วิทยาลัยชีวภาพ วิศวกรรมศาสตร์และวิทยาศาสตร์การอาหาร มหาวิทยาลัยเจ้อเจียง หางโจว 310058 ประเทศจีน;
2 วิทยาลัยการแพทย์คลินิกแห่งแรก มหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนกวางโจว
อ้างอิง
1. ซัน, AY; Chen, YM ความเครียดออกซิเดชันและความผิดปกติของระบบประสาท เจ. ไบโอเมด. วิทย์. 1998, 5, 401-414.
2. Maheshwari, A.; มิสโร MM; Aggarwal, A.; ชาร์มา RK; Nandan, D. เส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์สืบพันธุ์ของอัณฑะที่เกิดจาก H2O2 ในหลอดทดลอง FEBS J. 2009,276, 870-881.
3. Halliwell, B. ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาและระบบประสาทส่วนกลาง เจ. นิวโรเคม. 1992, 59,1609-1623.
4. ริชาร์ดสัน เจเอส; ซับบาเรา, KV; Ang, LC เกี่ยวกับบทบาทที่เป็นไปได้ของการเกิดอนุมูลอิสระที่เกิดจากเหล็กในการเสื่อมสภาพของระบบประสาทในโรคอัลไซเมอร์ แอน. นิวยอร์ก อเคด วิทย์. 1992, 648, 326-327.
5. Zhang, DD การศึกษากลไกของ Nrf2-เส้นทางการส่งสัญญาณ Keap1 ยาเมตาบ. รายได้ 2549, 38, 769-789
6. Itoh, K.; ตอง KI; Yamamoto, M. กลไกระดับโมเลกุลที่กระตุ้น Nrf2-เส้นทาง Keap1 ในการควบคุมการตอบสนองแบบปรับตัวต่ออิเล็กโทรไลต์ ฟรี Radic ไบโอล. เมดิ. 2004, 36,1208-1213.
7. กง AN; Owuor, E.; ยูอาร์ .; เฮบบาร์, วี.; เฉิน, ค.; หู, ร.; Mandlekar, S. การเหนี่ยวนำของเอนไซม์ซีโนไบโอติกโดยเส้นทางไคเนสของแผนที่และองค์ประกอบการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระหรืออิเล็กโตรไฟล์ (ARE/EpRE) ยาเมตาบ. รายได้ 2001, 33, 255-271.
8. บวนเดีย ฉัน.; มิคาลสกา, พี.; นาวาร์โร อี.; กาเมโร, ฉัน.; Egea, เจ.; Leon, R. Nrf2-คือวิถีทาง: เป้าหมายใหม่ที่ต่อต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบของเส้นประสาทในโรคทางระบบประสาท ฟา. เธอ. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]
9. สกีบินสกี้, จี.; ฮวัง วี; อันโด DM; Daub, A.; ลี อลาสกา; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; โทรม, บริติชแอร์เวย์; Finkbeiner, S. Nrf2 บรรเทา LRRK2- และการเสื่อมสภาพของระบบประสาทที่เกิดจาก a-synuclein โดยการปรับ proteostasis Proc. นัท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 2016, 114, 1165-1170
10. จิเมเนซ ซี.; Riguera, R. Phenylethanoid glycosides ในพืช: โครงสร้างและกิจกรรมทางชีวภาพ. แนท. แยง. ตัวแทน. 1994, 11, 591-606.
11. Georgiev, M.; Alipieva, K.; Orhan, ฉัน.; Abrashev, R.; เดเนฟ, พี.; Angelova, M. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและยับยั้ง cholinesterases ของ Verbascum xanthophoeniceum Griseb และฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ของมัน เคมีอาหาร. 2011, 128, 100-105.
12. หลี่ N.; วังเจ .; หม่า เจ.; Gu, Z.; เจียงซี.; Yu, L.; Fu, X. ผลกระทบทางระบบประสาทของการบำบัดด้วย Cistanches Herba ต่อผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์ระดับปานกลาง Evid.-Based Complement. ทางเลือก เมดิ. 2558, 2558,103985.
13. หลิว วายแอล; เขา WJ; โม, แอล.; ชิ MF; จู้, ปปปป; แพน, ส.; หลี่ XR; Xu, QM; Yang, SL ฤทธิ์ต้านจุลชีพ ฤทธิ์ต้านการอักเสบ และพิษวิทยาของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จาก Monochasma savatieri Franch อดีตแม็กซิม เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 2013,149, 431-437.
14. ดง, คิว; ยาว, เจ.; ฝาง JN; Ding, K. ลักษณะโครงสร้างและกิจกรรมทางภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดได้ในน้ำเย็น 2 ชนิดจาก Cistanche deserticola YC Ma คาร์โบไฮเดรต ความละเอียด 2007, 342,1343-1349.
15. Xiong, L.; เหมา, S.; ลู, บี.; หยาง เจ.; โจว, เอฟ.; หูย.; เจียง, วาย.; เซิน ซี.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Flower Extract และ Acteoside ป้องกันริ้วรอยที่เกิดจาก d-Galactose ในรูปแบบเมาส์ ICR เจ เมด อาหาร 2016, 19, 54-61.
16. เจียง วาย.; เหมา, S.; หวาง W.; ลู, บี.; Cai, Z .; โจว, เอฟ.; หลี่, ม.; ลู, ต.; Zhao, Y. โปรไฟล์ Phenylethanoid Glycoside และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ Osmanthusfragrans Lour ดอกไม้ตาม UPLC/PDA/MS และแบบจำลองการย่อยอาหารจำลอง เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2016, 64, 2459-2466.
17. หลี่ X.; ครับ X.; หลี่ X .; ซัน, X.; เหลียง, คิว.; เต๋า, ล.; คัง, X.; Chen, J. Salidroside ปกป้องจากการตายแบบอะพอพโทซิสที่เกิดจาก MPP plus ในเซลล์ PC12 โดยการยับยั้งวิถี NO ความละเอียดของสมอง 2011,1382, 9-18.
18. จางแอล.; ดิง, ว.; ซัน, เอช.; โจว Q.; หวางเจ .; หลี่ X .; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside ปกป้องเซลล์ PC12 จากกระบวนการอะพอพโทซิสที่เกิดจาก MPP บวกด้วยการเปิดใช้งานวิถีทาง PI3K/Akt เคมีอาหาร. ท็อกซิคอล 2012, 50, 2591-2597.
19. เซิง GQ; จาง เจอาร์; ปู, XP; หม่า เจ.; Li, CL ผลการป้องกันของ verbascoside ต่อ 1-methyl-4- ความเป็นพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจากฟีนิลไพริดิเนียมไอออนในเซลล์ PC12 ยูโร เจ. ฟาร์มาคอล. 2002, 451,119-124.
20. วัง H.; Xu, Y.; ยาน เจ.; จ้าว X.; ซัน, X.; จาง, วาย.; กัว เจ.; Zhu, C. Acteoside ปกป้องเซลล์ neuroblastoma SH-SY5Y ของมนุษย์จากการบาดเจ็บของเซลล์ที่เกิดจาก beta-amyloid ความละเอียดของสมอง 2552, 1283, 139-147
