Cistanche Deserticola Polysaccharide สามารถลดการเกิด Osteoclastogenesis และการสลายของกระดูก

ติดต่อ: emily.li@wecistanche.com

เพลง Dezhi et al

โรคกระดูกพรุนเป็นโรคที่เกิดจากการเผาผลาญที่มีลักษณะ osteopenia และการเสื่อมสภาพของโครงสร้างจุลภาคของกระดูก Osteoclasts เป็นเซลล์เอฟเฟกเตอร์หลักที่ทำให้เมทริกซ์ของกระดูกเสื่อมโทรมและการทำงานที่ผิดปกติของพวกมันนำไปสู่การพัฒนาของโรคกระดูกพรุน การสะสมของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ระหว่างการเผาผลาญของเซลล์ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ดังนั้นจึงมีบทบาทสำคัญในโรคกระดูกพรุนCistanche ทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์ (CDP) มีสารต้านมะเร็ง, ต่อต้าน‐อักเสบ, และสารต้านอนุมูลอิสระ กิจกรรม. อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของเซลล์สร้างกระดูก CDPon นั้นไม่ชัดเจน ในการศึกษานี้ ใช้การย้อมสีกรดฟอสฟาเตสที่ดื้อต่อทาร์เทรต อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสแบบย้อนกลับ-โพลีเมอเรส และการวิเคราะห์ Western blot เพื่อแสดงให้เห็นว่า CDP ยับยั้งการสร้างกระดูกและการสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์ นอกจากนี้ CDP ยังยับยั้งการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย osteoclast รวมถึง Ctsk, Mmp9 และ Acp5 และไม่มีผลต่อการแสดงออกของปัจจัยกระตุ้นนิวเคลียส κB (RANK) การวิเคราะห์เชิงกลไกพบว่า CDP เพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อลดทอนการผลิต ROS ที่อาศัย RANKL ในเซลล์สร้างกระดูกและยับยั้งปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้นและการกระตุ้นโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CDP อาจเป็นตัวแทนของยาที่เป็นตัวเลือกสำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากกิจกรรมของ osteoclast มากเกินไป

คีย์เวิร์ด:กระดูก การสลาย, Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์, MAPK, osteoclast, ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา

คลิกที่นี่เพื่อรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ Cistanche

1. บทนำ

ความสมดุลระหว่างการสร้างกระดูกที่อาศัยเซลล์สร้างกระดูกและการสลายของกระดูกโดยอาศัยเซลล์สร้างกระดูก มีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลการเผาผลาญของกระดูก (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018) เมื่อการสลายของกระดูกเกินกว่าการสร้างกระดูก จะเกิดโรคกระดูกพรุน ซึ่งมีลักษณะเฉพาะโดยมวลกระดูกลดลงและความเสียหายของโครงสร้างจุลภาคของกระดูก (Ikeda, 2008) โรคกระดูกพรุนเป็นโรคที่พบได้บ่อยในผู้สูงอายุและสตรีวัยหมดประจำเดือน และการเกิดโรคยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์ (Cooper & Melton,1992) การขาดฮอร์โมนเอสโตรเจนเป็นสาเหตุหลักของโรคกระดูกพรุน (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). นอกจากนี้ รีแอคทีฟออกซิเจนสปีชีส์ (ROS) สามารถถูกเหนี่ยวนำโดยตัวกระตุ้นรีเซพเตอร์ของนิวเคลียสแฟกเตอร์ κB ลิแกนด์ (RANKL) และสัมพันธ์กับการสร้างเซลล์สร้างกระดูก (Yip et al., 2005) และอาจนำไปสู่การพัฒนาของโรคกระดูกพรุน (Manolagas, 2010) ). การศึกษาบางชิ้นพบว่าการขาดสารต้านอนุมูลอิสระ Nrf2 เพิ่มระดับ ROS และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ที่เกิดจากอันดับ (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013) ดังนั้น การลดการผลิต ROS ระหว่างการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ควรได้รับการประเมินว่าเป็นกลยุทธ์ในการรักษาโรคกระดูกพรุน

Osteoclasts มาจาก monocyte หรือ macrophage hematopoietic lineage และเป็นเซลล์ multinucleated เพียงเซลล์เดียวที่ทำงานกระดูก การสลาย(เทเทลบอม 2000). ดังนั้นการวิจัยเกี่ยวกับการสร้างเซลล์สร้างกระดูกจึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการพัฒนาวิธีการรักษาที่มีประสิทธิภาพสำหรับกระดูกเมแทบอลิซึมโรค(ลอเรนโซ,2017). Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) และ RANKL ที่ผลิตโดยเซลล์สร้างกระดูกและทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น เป็นไซโตไคน์ที่สำคัญที่ควบคุมการสร้างกระดูก (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003) RANKL กระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น (NFATc1) ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญที่ทำงานในระหว่างการสร้าง osteoclast (Ishidat al., 2002) Activated NFATc1 ส่งเสริมการแสดงออกของยีน osteoclast marker เช่น tartrate-resistant acid phosphatase (TRAcP) และ cathepsin K (CTSK) ที่ควบคุม osteoclastogenesis และ osteoclast function (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CDP อาจใช้ในการรักษาโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการสลายตัวของกระดูกที่มากเกินไป

2|วัสดุและวิธีการ

2.1|วัสดุ

ซื้อ CDP (ความบริสุทธิ์ > 98 เปอร์เซ็นต์) จาก Solarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และเตรียมที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) แอนติบอดีจำเพาะสำหรับ c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphorylated (p)‐ERK,p-p38, p-JNK และ ‐actin ได้จากซานต้า ครูซ เทคโนโลยีชีวภาพ(ซานโฮเซ่ แคลิฟอร์เนีย) แอนติบอดีต่อ V-ATPase d2 ถูกผลิตขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (H. Feng et al., 2009) ระบบ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) และ luciferase assay ได้มาจาก Promega (ซิดนีย์ ประเทศออสเตรเลีย) . ซื้อ Recombinant M-CSF จาก R&D Systems (มินนิอาโปลิส, มินนิโซตา) โปรตีน GST-rRANKL แบบลูกผสมถูกแสดงและทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Xu et al., 2000)

2.2|การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ RAW264.7 (เซลล์มาโครฟาจของเมาส์) ได้มาจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่จำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลงแล้ว (Thermo FisherScientific, Scoresby, Australia) เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, 2 mM ของ L-glutamine, 100 U/ml ของ penicillin และ 100 ug/ml ของ streptomycin (อาหารสมบูรณ์) monocytes(BMMs) ที่ได้จากไขกระดูกถูกแยกได้จากหนู C57BL/6J อายุ 6 สัปดาห์ ซึ่งถูกทำการุณยฆาตตามขั้นตอนที่อนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมสำหรับสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยเวสเทิร์นออสเตรเลีย (RA/3/100/1244) กระดูกยาวถูกผ่าโดยไม่มีเนื้อเยื่ออ่อน และไขกระดูกถูกล้างออกจากกระดูกโคนขาและกระดูกหน้าแข้ง ซึ่งจากนั้นจึงเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่สมบูรณ์ต่อหน้า M-CSF (50 ng/ml)

2.3|การทดสอบ Osteoclastogenesis

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>สามนิวเคลียส) ถูกระบุว่าเป็นเซลล์สร้างกระดูก

2.4|การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

BMM ถูกเพาะลงในเพลต 96 หลุมที่ 6 × 103 เซลล์ต่อหลุมและปล่อยทิ้งไว้ค้างคืนเพื่อให้เกาะติด วันต่อมา เซลล์ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง สารละลาย MTS (20 ไมโครลิตร/หลุม) ถูกเติมและบ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรถูกกำหนดด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA)

2.5|การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

BMM ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 6 × 103 เซลล์ต่อหลุมในการมีอยู่ของ M-CSF (50 ng/ml) ในชั่วข้ามคืน จากนั้นเซลล์ถูกกระตุ้นด้วย M-CSFและ GST-rRANKL (100 นาโนกรัม/มล.) จนกระทั่งสร้างเซลล์สร้างกระดูกที่เจริญเต็มที่ จากนั้น osteoclasts ได้รับการรักษาด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP เป็นเวลา 48 ชั่วโมงก่อนที่จะทำการตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ซึมผ่านด้วย Triton X-100–PBS 0.1 เปอร์เซ็นต์ และปิดกั้นด้วย 3 เปอร์เซ็นต์ของ bovine serum albumin ใน PBS เซลล์ที่เตรียมไว้ถูกบ่มด้วย phalloidin ที่คอนจูเกตโรดามีนเป็นเวลา 45 นาทีในความมืดเพื่อย้อม F-actin จากนั้นล้างเซลล์ด้วย PBS นิวเคลียสที่ย้อมด้วย 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) และติดตั้งด้วยแผ่นปิดสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

2.6|การทดสอบการสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์

ในการวัด BMM ของการทำงานของ Osteoclast (1 × 105 เซลล์ต่อหลุม) ที่เพาะเลี้ยงบนแผ่นเคลือบคอลลาเจนหกหลุม (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) ถูกกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) และ M-CSF (50 ng/ml) ) จนกว่าจะสร้างเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ (Zhou et al., 2016) จากนั้นเซลล์ถูกแยกออกจากเพลตอย่างนุ่มนวลโดยใช้สารละลายการแยกตัวของเซลล์ (Sigma-Aldrich) และจำนวนเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่จำนวนเท่ากันถูกเพาะลงบนเพลต 96 หลุมที่เคลือบด้วยไฮดรอกซีอะพาไทต์แต่ละหลุม (Corning Osteoassay, Corning, NY) เซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ถูกบ่มในอาหารที่มี rRANKL และ M-CSF โดยมีหรือไม่มี CDP ที่ความเข้มข้นที่ระบุ หลังจาก 48 ชั่วโมง ครึ่งหนึ่งของหลุมถูกย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับกิจกรรม TRAcP ตามที่อธิบายข้างต้น เพื่อประเมินจำนวนของเซลล์ที่มีนิวเคลียสหลายนิวเคลียสต่อหลุม หลุมที่เหลือถูกฟอกเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อเอาเซลล์ออกและยอมให้วัดพื้นที่ที่ถูกดูดซับ พื้นที่ที่ถูกดูดซับถูกถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาตรฐาน และซอฟต์แวร์ Ima geJ (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, เบเทสดา, แมรี่แลนด์) ถูกใช้เพื่อหาปริมาณพื้นที่เปอร์เซ็นต์ของพื้นผิวไฮดรอกซีอะพาไทต์ที่ถูกดูดซับโดยเซลล์สร้างกระดูก

2.7|นักข่าว Luciferase ตรวจ

เพื่อตรวจสอบการเปิดใช้งานการถอดรหัส NFATc1 เซลล์ RAW264.7 ได้รับการถ่ายอย่างเสถียรด้วยโครงสร้างตัวรายงาน luciferase ที่ตอบสนองต่อ NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013) เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 48 หลุมที่ความหนาแน่น 1.5 × 105 เซลล์ต่อหลุมและปรับสภาพด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ CDP เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังการปรับสภาพ เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และวัดฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสโดยใช้ระบบทดสอบลูซิเฟอเรสรีพอร์เตอร์ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (โพรเมกา)

2.8|การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณเชิงปริมาณ (RT-PCR)

RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์โดยใช้รีเอเจนต์ Trizol ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Thermo Fisher Scientific) DNA เสริมถูกสังเคราะห์โดยใช้ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ที่มีเทมเพลต RNA 1 ไมโครกรัมและไพรเมอร์ oligo-dT การขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสของลำดับจำเพาะดำเนินการโดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้: 94 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบที่ 94 องศาเป็นเวลา 40 วินาที 60 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และ 72 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และการขยายขั้นสุดท้ายเป็น 5 นาทีที่ 72 องศา ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับไพรเมอร์เฉพาะแสดงไว้ในตารางที่ 1 ระดับ RNA ของผู้ส่งสารสัมพัทธ์คำนวณโดยการทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อแสดงออกของยีน Hmbs การดูแลทำความสะอาด

2.9|การวิเคราะห์ Western blot

BMM ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่สมบูรณ์ด้วย M-CSF ในเพลตหกหลุมและกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) ตามเวลาที่ระบุไว้ เซลล์ถูกสลายในบัฟเฟอร์การแยกสลายด้วยเรดิโออิมมูโนพรีซิเดชั่น และโปรตีนได้รับการแก้ไขโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโตรโฟรีซิส และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลี (ไวนิลลิดีน ฟลูออไรด์) (GE Healthcare, Silverwater, Australia) เยื่อหุ้มเซลล์ถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่จำเพาะต่างๆ โดยเขย่าเบาๆ ข้ามคืนที่ 4 องศา เมมเบรนถูกล้างและต่อมาบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส จากนั้นจึงตรวจพบปฏิกิริยาของแอนติบอดีด้วยรีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) และแสดงภาพด้วย Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare)

2.10|การตรวจจับ ROS ภายในเซลล์

ตรวจพบระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate cellular ROS ชุดทดสอบ (Abcam, เมลเบิร์น, ออสเตรเลีย) BMM (5 × 103 เซลล์ต่อหลุม) ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 96 หลุมและบำบัดด้วย RANKL (100 นาโนกรัม/มล.), M-CSF (50 นาโนกรัม/มล.) และ CDP เป็นเวลา 72 ชั่วโมง วัดระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate ซึ่งออกซิไดซ์เป็น CSF เรืองแสงเมื่อมี ROS เซลล์ถูกล้างในบัฟเฟอร์ของแฮงค์และฟักในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีด้วย DCFH-DA 10 ไมโครโมลาร์ ได้ภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

2.11|การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดเป็นตัวแทนของการทดลองอย่างน้อยสามครั้งที่ทำขึ้นเป็นสามเท่า เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบ Student–Newman–Keulspost hoc เพื่อกำหนดความสำคัญของความแตกต่างระหว่างผลลัพธ์ โดย p < 0.05="">

3|ผลลัพธ์

3.1|CDP ยับยั้งการสร้าง osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL และการรวมตัวของ osteoclast

เพื่อตรวจสอบว่า CDP สามารถยับยั้งการสร้าง osteoclast ที่เกิดจาก RANKL ได้หรือไม่ ขั้นแรกเราทำการทดสอบ osteoclastogenesis โดยใช้เมาส์ BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016) BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 5 วันโดยเพิ่มความเข้มข้นของ CDP CDP ลดจำนวนเซลล์หลายนิวเคลียสที่เป็นบวก TRAcP เมื่อความเข้มข้นของ CDPreached 5 µM หรือสูงกว่า (รูปที่ 1a,b) เพื่อประเมินความเป็นพิษของ CDP และยืนยันว่าผลลัพธ์เหล่านี้ไม่ใช่ภาพสะท้อนของการเสียชีวิตหรือจำนวนของเซลล์ เราได้ทำการทดสอบ MTS BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 48 ชั่วโมงด้วยปริมาณ CDP ที่แตกต่างกัน CDP ไม่มีผลต่อการเพิ่มจำนวน BMM ที่ความเข้มข้นน้อยกว่า 15 µMor (รูปที่ 1c)

เพื่อทดสอบผลของ CDP ต่อการหลอมรวมของกระดูก osteoclasts ถูกกระตุ้นด้วยการบำบัดด้วย RANKL และ M-CSF โดยมีหรือไม่มีปริมาณ CDP ที่แตกต่างกัน Osteoclasts ถูกย้อมด้วย rhodamine-phalloidin และ DAPI เพื่อประเมินจำนวนนิวเคลียสต่อ osteoclast (รูปที่ 2a) จำนวน osteoclast และจำนวนนิวเคลียสเฉลี่ยต่อ osteoclast ลดลงหลังการบำบัดด้วย CDP (5–10 µM; รูปที่ 2b,c) ดังนั้น CDP จึงมีผลยับยั้งต่อการสร้างกระดูกและกระดูกที่เหนี่ยวนำโดย RANKL ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา

3.2|CDP ลดทอนกิจกรรมการสลายของ osteoclastic hydroxyapatite ที่เกิดจาก RANKL

การสอบวิเคราะห์การสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์ถูกดำเนินการเพื่อตรวจหาผลของ CDP ต่อการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก (รูปที่ 3a) หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง จำนวนของ osteoclasts ต่อหลุมไม่เปลี่ยนแปลงในขณะที่พื้นที่การดูดซับของไฮดรอกซีอะพาไทต์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย CDP 5 และ 10 µM เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3b,c) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CDP มีผลการยับยั้งอย่างแรงต่อทั้งการก่อรูปของกระดูกและการทำงานของการดูดซับของออสติโอพลาสต์โดยไม่มีผลที่เป็นพิษต่อเซลล์ใดๆ

3.3|CDP ยับยั้งการแสดงออกของยีน osteoclast marker

เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลการยับยั้งของ CDP ต่อการสร้างกระดูกและการสลายของกระดูกสลายกระดูก BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 5 วันด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP จากนั้น RT-PCR ได้ดำเนินการเพื่อตรวจหาการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย osteoclast การแสดงออกของ Nfatc1 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญระหว่างการสร้างกระดูก ถูกยับยั้งโดย CDP ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4a) นอกจากนี้ CDP (5 และ 10 ไมโครโมลาร์) ปรับลดการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสลายของกระดูก ซึ่งรวมถึง Mmp9, Ctsk และ Acp5 (รูปที่ 4bd)

3.4|CDP ยับยั้งกิจกรรม NFATc1 และการแสดงออกของโปรตีนที่ปลายน้ำ

เพื่อตรวจสอบผลของ CDP ต่อกิจกรรม NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL ได้ทำการทดสอบตัวรายงาน luciferase การรักษาด้วย CDP ที่ความเข้มข้น 5 µM และสูงกว่า ยับยั้งกิจกรรม NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ การวิเคราะห์ western blot พบว่า CDP ยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนของ NFATc1 และ c-Fos ใน BMM ที่บำบัดด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 3 และ 5 วันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่ของ osteoclast เช่น V-ATPase-d2 และ CTSK ถูกปรับลดลงเมื่อมี CDP เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม CDP ไม่มีผลต่อนิพจน์ RANK (รูปที่ 5b)

3.5|CDP ส่งเสริมการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อกำจัดการผลิต ROS ในระหว่างการสร้างกระดูกที่เกิดจาก RANKL

เพื่อสำรวจกลไกเบื้องหลังของการยับยั้งการสร้างกระดูกที่ขึ้นกับ CDP BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL (100 ng/ml) และ M-CSF (50 ng/ml) ร่วมกับ PBS หรือ CDP เป็นเวลา 72 ชั่วโมง เราตรวจสอบผลกระทบของ CDP ต่อการผลิต ROS ภายในเซลล์ที่กระตุ้นโดย RANKL ระดับ ROS ภายในเซลล์เพิ่มขึ้นโดยการบำบัด RANKL ซึ่งถูกทำให้อ่อนฤทธิ์โดย CDP (5 และ 10 ไมโครโมลาร์; รูปที่ 6a) ทั้งจำนวนของเซลล์ ROS-positive และความเข้มของการย้อมสี ROS ลดลงโดยการบำบัดด้วย CDP ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 6b,c) การวิเคราะห์ Western blot แสดงให้เห็นว่า CDP ส่งเสริมการแสดงออกของ thioredoxin (TRX1) และกลูตาไธโอนรีดักเตส (GSR) ในขณะที่ยับยั้งการแสดงออกของไนตริกออกไซด์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด (NOS2) ใน BMM ซึ่งบำบัดด้วย RANKL และ ‐CSF เป็นเวลา 3 วัน (รูปที่ 6d)

เพื่อสำรวจเพิ่มเติมว่า CDP ยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ osteoclast โดยลดการผลิต ROS หรือไม่ เราจึงบำบัด BMM ด้วยเปอร์ออกไซด์ (10 µM) เพื่อเลียนแบบสถานะ ROS ที่สูงในเซลล์ BMM เกิดขึ้นโดย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 3 วัน และผลของการวิเคราะห์ western blot และ RT-PCR พบว่าเปอร์ออกไซด์ส่งเสริมการแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม สอดคล้องกับผลลัพธ์ในรูปที่ 5 การแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos ถูกระงับโดย CDP ในขณะที่เปอร์ออกไซด์ช่วยผลการยับยั้งของ CDP (รูปที่ 6e,f) ข้อมูลเหล่านี้ระบุว่า CDP ยับยั้งการแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos โดยการขจัดการผลิต ROS

3.6|CDP ยับยั้งเส้นทางของ MAPK ระหว่างการสร้างกระดูกที่กระตุ้นโดย RANKL

ต่อไป เราตรวจสอบผลของการรักษา CDP ต่อนิพจน์ RANKL-mediatedTRAF6 และการเปิดใช้งานเส้นทาง MAPK หลังจากการฟักไข่ในตัวกลางที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 2 ชั่วโมง BMM ถูกกระตุ้นด้วย RANKL โดยมีหรือไม่มี CDP เป็นเวลา 60 นาที การกระตุ้นด้วย CDP (10 ไมโครโมลาร์) ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ TRAF6 และฟอสโฟรีเลชันที่ถูกทำให้อ่อนฤทธิ์ของ JNK2 และ ERK1/2 ที่ 10 และ 20 นาที (รูปที่ 7) นอกจากนี้ ฟอสโฟรีเลชัน p38 ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย CDP ที่ 60 นาทีเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 7) ข้อมูลเหล่านี้เปิดเผยว่า CDP ยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ที่เกิดจาก RANKL ซึ่งสอดคล้องกับผลการยับยั้งต่อการสร้างและกิจกรรมของ osteoclast

4|อภิปรายผล

Cistanche หรือที่รู้จักในชื่อ "โสมทะเลทราย" ได้รับความสนใจอย่างมากเมื่อเร็ว ๆ นี้สำหรับความสามารถในการปรับภูมิคุ้มกันและทำหน้าที่ป้องกันในช่วงอายุมากขึ้นและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012) Phenylpropanoid-substitutioned diglycosides ซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญของ Cistanche ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถยับยั้งกิจกรรมในแมคโครฟาจ (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017) นอกจากนี้ สารสกัดจาก Cistanche ยังช่วยลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในกล้ามเนื้อหัวใจตายที่ตอบสนองหลังขาดเลือด และมีบทบาทสำคัญในการยับยั้งวิถี apoptotic ที่นำไปสู่การป้องกันโรคหัวใจ (Yu, Li, & Cao, 2016) ในฐานะส่วนประกอบสำคัญของ Cistanche CDP มีหน้าที่ทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย การศึกษาปัจจุบันของเราพบว่า CDP ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการเปิดใช้งานของ osteoclast ที่เปิดใช้งาน RANKL โดยการลดทอนการผลิต ROS เช่นเดียวกับการเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK

ในฐานะที่เป็นกรดฟอสฟาเตส TRAcP มีอยู่ในเซลล์ที่หลากหลายและมีมากในเซลล์สร้างกระดูกและเซลล์มาโครฟาจในถุงน้ำ (Snipes, Lam, Dodd, Grey, & Cohen, 1986) TRAcP เป็นเอนไซม์ที่มีลักษณะเฉพาะของ osteoclasts และการแสดงออกของมันสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับหน้าที่ของ osteoclast ซึ่งถือเป็นตัวบ่งชี้กิจกรรมของ osteoclast และการสลายของกระดูก (Minkin, 1982) ในการศึกษาของเรา CDP ยับยั้งจำนวนเซลล์ที่เป็นบวกของ TRAcP ซึ่งบ่งชี้ว่า CDP ที่กระตุ้นการสร้างกระดูกโดย RANKL ถูกบล็อกโดย CDP การเสื่อมสภาพของเมทริกซ์กระดูกโดย osteoclasts ขึ้นอยู่กับ cathepsin K (CTSK) และ MPs (Gruber, 2015) ที่นี่ CDP ลดการแสดงออกของยีนที่ทำหน้าที่ของ osteoclast อย่างมีนัยสำคัญ เช่น Mmp9, Ctsk และ Acp5

ความแตกต่างและการทำงานของ Osteoclast ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณที่หลากหลาย (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003) หลังจากผูกมัดกับ RANK แล้ว RANKL จะคัดเลือกโปรตีนอะแดปเตอร์ TRAF6 เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ NFATc1 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญสำหรับการสร้างเซลล์สร้างกระดูก ซึ่งส่งผลต่อการแสดงออกของยีนที่จำเพาะต่อเซลล์กระดูก ซึ่งรวมถึง TRAcP และ CTSK (X. Feng,2005; Takayanagi et al., 2002). ในการศึกษานี้ เราพบว่า CDPhad ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ RANK และ TRAF6 ในเซลล์สร้างกระดูก อย่างไรก็ตาม CDP ยับยั้งการกระตุ้น NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL ในระหว่างการสร้างกระดูกของ BMM นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่า ROS ซึ่งผลิตโดยไมโตคอนเดรียในกระบวนการส่งอิเล็กตรอน ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกและการสลายตัวของเมทริกซ์ของกระดูกที่มีการควบคุม (Ha et al., 2004) การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่า RANKL ชักนำการนำเข้านิวเคลียร์ของ Bach1 และลดการผลิตเอ็นไซม์สารต้านอนุมูลอิสระด้วย Nrf2 ซึ่งจะช่วยเพิ่มการแสดงออกของ ROS ภายในเซลล์และการสร้างกระดูกในหนูทดลอง (Kanzaki et al., 2017) นอกจากนี้ การสร้าง ROS ภายในเซลล์เพิ่มขึ้นโดย homocysteine ​​ช่วยเพิ่มการสร้างและกิจกรรมของ osteoclast (Koh et al., 2006) การศึกษาของเราพบว่า CDP ลดการสะสม ROS ในเซลล์สร้างกระดูกโดยการยับยั้งการแสดงออกของ NOS2 และส่งเสริมการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น TRX1 และกลูตาไธโอนรีดักเตส เมื่อเรารักษา BMM ด้วยเปอร์ออกไซด์เพื่อเพิ่มการสะสม ROS ภายในเซลล์ ผลลัพธ์ที่ ROS เพิ่มขึ้นสามารถปรับปรุงการแสดงออกของ NFATc1 ได้เปิดเผยว่า ROS อยู่เหนือ NFATc1 นอกจากนี้ เรายังพบว่าเปอร์ออกไซด์ช่วยยับยั้งผลการแสดงออกของ CDPon NFATc1 ดังนั้น ข้อมูลของเราแนะนำว่า CDP ยับยั้งการสะสม ROS เพื่อยับยั้งการแสดงออกของ NFATc1 จากนั้นยับยั้งการก่อตัวและการทำงานของ osteoclast

ERK, JNK และ p38 เป็นของตระกูล MAPK ซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมความแตกต่างของ osteoclast (Seger & Krebs, 1995)RANKL เปิดใช้งานเส้นทาง MAPK โดยการเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของ ERK, JNK และ p38 (Mizukami et al ., 2002). เราแสดงให้เห็นว่า CDP ยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลาง RANKL ของโปรตีนหลักในวิถีของ MAPK ดังนั้นจึงมีส่วนทำให้เกิดผลการยับยั้งของ CDPon ในการแสดงออกของยีนเครื่องหมายออสติโอคลาสต์ ตามความรู้ของเรา นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่แสดงผลการยับยั้งของ CDP ต่อการผลิต ROS, การเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK ซึ่งแสดงถึงกลไกใหม่ของการกระทำของ CDP ในหลอดทดลอง

โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่า CDP ลดทอน osteoclastogenesis และ hydroxyapatite resorption และการแสดงออกของยีน osteoclast marker รวมถึง Ctsk, Mmp9 และ Acp5 CDP สามารถระงับการผลิต ROS ที่ใช้ RANKL ได้ เช่นเดียวกับการเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK (รูปที่ 8) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า CDP อาจเป็นตัวแทนของยาที่เป็นตัวเลือกสำหรับการรักษาภาวะที่เกี่ยวข้องกับ osteoclast ที่มาพร้อมกับ ROS ที่มากเกินไป

กิตติกรรมประกาศ

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนโดยมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งประเทศจีน (81572164) โครงการวิจัยและพัฒนาเทคโนโลยีหลักแห่งชาติของจีน (2017YFC1103300) มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งมณฑลกวางสี (2016GXNSFAA380295) และโครงการวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีมหาวิทยาลัยของมณฑลกวางสี ( KY2015YB054). นอกจากนี้ยังได้รับการสนับสนุนบางส่วนโดยโครงการแผนพัฒนาการวิจัยและเทคโนโลยีวิทยาศาสตร์กวางสี (GKG13349003, 1598013-15), กองทุนโครงสร้างพื้นฐานด้านการวิจัยทางการแพทย์และสุขภาพของเวสเทิร์นออสเตรเลีย, มูลนิธิโรคข้ออักเสบออสเตรเลีย, The University of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards และ Australian Health and สภาวิจัยทางการแพทย์(NHMRC หมายเลข 1107828 และ 1027932)

ผลประโยชน์ทับซ้อน

ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

ข้อมูลอ้างอิง

Ahn, J., Chae, HS, Shin, YW, & Kim, J. (2017). การแยกตามการจำลองของ diglycosides ที่ถูกแทนที่ด้วย phenylpropanoid ใหม่จาก Cistanche salsa และกิจกรรมการยับยั้งของพวกมันต่อการผลิต NO ในมาโครฟาจ โมเลกุล 22(7), 1138.
Balkan, W., Martinez, AF, Fernandez, I., Rodriguez, MA, Pang, M., & Troen, BR (2009). การระบุตำแหน่งการจับ NFAT ที่เป็นสื่อกลางในการกระตุ้นกิจกรรมโปรโมเตอร์ cathepsin K โดยแกนด์ RANK ยีน, 446(2), 90–98.
Boyle, WJ, Simonet, WS, & Lacey, DL (2003). การสร้างความแตกต่างและการเปิดใช้งาน Osteoclast ธรรมชาติ 423(6937), 337–342
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, & Qi, Y. (2010) ฤทธิ์ต้านอาการเมื่อยล้าของสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนิลทานอยด์จาก Cistanche Deserticola การวิจัย Phytotherapy, 24(2), 313–315.

Cheng, J. , Zhou, L. , Liu, Q. , Tickner, J. , Tian, ​​Z. , Li, X. , … Xu, J. (2018). ไซยานิดินคลอไรด์ยับยั้งโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการตัดรังไข่โดยการยับยั้งการสร้างกระดูกพรุนโดยอาศัย RANKL และเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้อง วารสารสรีรวิทยาเซลล์, 233(3), 2502–2512.

Cooper, C. และ Melton, LJ, 3rd (1992). ระบาดวิทยาของโรคกระดูกพรุน Trends in Endocrinology and Metabolism, 3(6), 224–229.

Crotti, TN, Sharma, SM, Fleming, JD, Flannery, MR, Ostrowski, MC, Goldring, SR, & McHugh, KP (2008) PU.1 และ NFATc1 เป็นสื่อกลางในการเหนี่ยวนำการสร้างกระดูกของโปรโมเตอร์อินทิกริน beta3 ของหนูเมาส์ วารสารสรีรวิทยาเซลล์, 215(3), 636–644.
Feng, H., Cheng, T., Steer, JH, Joyce, DA, Pavlos, NJ, Leong, C., … Xu, J. (2009). Myocyte Enhancer factor 2 และ microphthalmia-associated transcription factor ร่วมมือกับ NFATc1 เพื่อทรานส์แอคทีฟโปรโมเตอร์ V- ATPase d2 ในระหว่างการสร้างกระดูกที่เกิดจาก RANKL วารสารเคมีชีวภาพ 284(21), 14667–14676
Feng, X. (2005). การจัดอันดับการส่งสัญญาณภายในเซลล์ในเซลล์สร้างกระดูก IUBMB ชีวิต 57(6), 389–395
Gruber, R. (2015). พื้นฐานโมเลกุลและเซลล์ของการสลายกระดูก วีเนอร์ เมดิซินีเช วอเชนชริฟต์, 165(3–4), 48–53.
Guo, Y. , Cao, L. , Zhao, Q. , Zhang, L. , Chen, J. , Liu, B. , & Zhao, B. (2016) ลักษณะเบื้องต้น สารต้านอนุมูลอิสระ และกิจกรรมป้องกันตับของพอลิแซ็กคาไรด์จาก Cistanche deserticola วารสารนานาชาติของโมเลกุลขนาดใหญ่ทางชีวภาพ, 93, 678–685.
Ha, H., Bok kwak, H., Woong lee, S., Mi jin, H., Kim, HM, Kim, HH, & Hee lee, Z. (2004). ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาเป็นสื่อกลางในการส่งสัญญาณ RANK ในเซลล์สร้างกระดูก การวิจัยเซลล์ทดลอง, 301(2), 119–127.
Hyeon, S., Lee, H., Yang, Y., & Jeong, W. (2013). การขาด Nrf2 ทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL ฟรี Radical Biology & Medicine, 65, 789–799
อิเคดะ, เค. (2008). Osteocytes ในการเกิดโรคของโรคกระดูกพรุน Geriatrics & Gerontology International, 8(4), 213–217.
Ishida, N., Hayashi, K., Hoshijima, M., Ogawa, T., Koga, S., Miyatake, Y., … Takeya, T. (2002). การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนขนาดใหญ่ของการสร้าง osteoclastogenesis ในหลอดทดลอง และการชี้แจงของ NFAT2 ในฐานะตัวควบคุมหลัก วารสารเคมีชีวภาพ, 277(43), 41147–41156.
Jia, Y., Guan, Q., Guo, Y., & Du, C. (2012) การลดการเกิด hyperplasia อักเสบในลำไส้ในหนูที่มีแนวโน้มเป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่ด้วยสารสกัดจากน้ำ Cistanche deserticola การวิจัย Phytotherapy, 26(6), 812–819.
Kanzaki, H. , Shinohara, F. , Itohiya, K. , Yamaguchi, Y. , Katsumata, Y. , Matsuzawa, M. , … Nakamura, Y. (2017). RANKL ชักนำให้เกิดการนำเข้านิวเคลียร์ของ Bach1 และลดทอนเอ็นไซม์สารต้านอนุมูลอิสระที่อาศัย Nrf2 ซึ่งจะช่วยเพิ่มการส่งสัญญาณของสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาภายในเซลล์และการสร้างกระดูกในหนูทดลอง วารสาร FASEB, 31(2), 781–792.
Kim, JH, & Kim, N. (2016). เส้นทางการส่งสัญญาณในการสร้างความแตกต่างของ osteoclast วารสารการแพทย์ชลน. 52(1), 12–17.
Koh, JM, Lee, YS, Kim, YS, Kim, DJ, Kim, HH, Park, JY, … Kim, GS (2006). Homocysteine ​​ช่วยเพิ่มการสลายของกระดูกโดยกระตุ้นการสร้างและการทำงานของ osteoclast ผ่านการเพิ่มขึ้น
การสร้าง ROS ภายในเซลล์ วารสารการวิจัยกระดูกและแร่ธาตุ, 21(7), 1003–1011.
van der Kraan, AGJ, Chai, RCC, Singh, PP, Lang, BJ, Xu, J., Gillespie, MT, … Quinn, JMW (2013). สารยับยั้ง HSP90 ช่วยเพิ่มกิจกรรมการสร้างความแตกต่างและ MITF (ปัจจัยการถอดรหัส microphthalmia) ในต้นกำเนิดของ osteoclast วารสารชีวเคมี, 451(2), 235–244.
Liu, Q., Wu, H., Chim, SM, Zhou, L., Zhao, J., Feng, H., … Xu, J. (2013). SC-514 สารยับยั้งการคัดเลือกของ IKKbeta ช่วยลดการสร้างกระดูกและการกระตุ้น NF-kappaB ที่เกิดจาก RANKL เภสัชวิทยาชีวเคมี, 86(12), 1775–1783.
Lorenzo, J. (2017). หลายวิธีในการเปิดใช้งาน osteoclast วารสารการสืบสวนทางคลินิก, 127(7), 2530–2532.
มาโนลากัส เซาท์แคโรไลนา (2000) การเกิดและการตายของเซลล์กระดูก: กลไกการกำกับดูแลขั้นพื้นฐานและผลกระทบต่อการเกิดโรคและการรักษาโรคกระดูกพรุน รีวิวต่อมไร้ท่อ, 21(2), 115–137.
มาโนลากัส เซาท์แคโรไลนา (2010). จากเอสโตรเจนที่เน้นไปที่อายุและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน: มุมมองที่แก้ไขแล้วของการเกิดโรคของโรคกระดูกพรุน รีวิวต่อมไร้ท่อ, 31(3), 266–300.
Manolagas, SC, O'Brien, CA, & Almeida, M. (2013) บทบาทของตัวรับเอสโตรเจนและแอนโดรเจนต่อสุขภาพและโรคของกระดูก บทวิจารณ์ธรรมชาติวิทยาต่อมไร้ท่อ, 9(12), 699–712.
Minkin, C. (1982). กรดฟอสฟาเตสของกระดูก: กรดฟอสฟาเตสที่ทนต่อทาร์เตรตเป็นเครื่องหมายของฟังก์ชัน osteoclast Calcified Tissue International, 34(3), 285–290.
Mizukami, J. , Takaesu, G. , Akatsuka, H. , Sakurai, H. , Ninomiya-Tsuji, J. , Matsumoto, K. , & Sakurai, N. (2002) ตัวกระตุ้นตัวรับของ NF-kappaB ลิแกนด์ (RANKL) กระตุ้น TAK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase ผ่านสารเชิงซ้อนการส่งสัญญาณที่มี RANK, TAB2 และ TRAF6 ชีววิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์, 22(4), 992–1000.
น่าน Z. Zeng, K. , Shi, S. , Zhao, M. , Jiang, Y. , & Tu, P. (2013). Phenylethanoid glycosides ที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบจากลำต้นของ Cistanche Deserticola ที่เพาะเลี้ยงในทะเลทรายทาริม Fitoterapia, 89, 167–174.
Seger, R. , & Krebs, EG (1995) น้ำตกสัญญาณ MAPK วารสารฟาเส็บ, 9(9), 726–735.
Snipes, RG, Lam, KW, Dodd, RC, Grey, TK, & Cohen, MS (1986) กิจกรรมของกรดฟอสฟาเตสในฟาโกไซต์โมโนนิวเคลียร์และสายเซลล์ U937: มาโครฟาจที่ได้มาจากโมโนไซต์แสดงกรดฟอสฟาเตสที่ดื้อต่อทาร์เทรต เลือด, 67(3), 729–734.
Snytnikova, OA, Tsentalovich, YP, Stefanova, NA, Fursova, AZ, Kaptein, R. , Sagdeev, RZ, & Kolosova, NG (2012) ผลการรักษาของสารต้านอนุมูลอิสระเป้าหมายไมโตคอนเดรีย SkQ1 และ Cistanche deserticola สัมพันธ์กับระดับทริปโตเฟนและไคนูเรนีนที่เพิ่มขึ้นในเลนส์ของหนู Doklady ชีวเคมีและชีวฟิสิกส์, 447, 300–303.
เพลง, F., Zhou, L., Zhao, J., Liu, Q., Yang, M., Tan, R., … Xu, J. (2016). Eriodictyol ยับยั้งการสร้างและการทำงานของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL ผ่านการยับยั้งการทำงานของ NFATc1 วารสารสรีรวิทยาเซลล์ 231(9), 2526-2536
Takayanagi, H. , Kim, S. , Koga, T. , Nishina, H. , Isshiki, M. , Yoshida, H. , … Taniguchi, T. (2002). การเหนี่ยวนำและการเปิดใช้งานปัจจัยการถอดรหัส NFATc1 (NFAT2) รวมการส่งสัญญาณ RANKL ในการแยกแยะขั้วของเซลล์สร้างกระดูก เซลล์พัฒนาการ, 3(6), 889–901.
Teitelbaum, SL (2000). การสลายของกระดูกโดย osteoclasts วิทยาศาสตร์ 289 (5484), 1504–1508
Teitelbaum, SL, & Ross, FP (2003). การควบคุมทางพันธุกรรมของการพัฒนาและการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก ธรรมชาติรีวิวพันธุศาสตร์, 4(8), 638–649.
Xu, J., Tan, JW, Huang, L., Gao, XH, Laird, R., Liu, D., … Zheng, MH (2000) การโคลน การหาลำดับ และการแสดงคุณลักษณะเชิงหน้าที่ของโฮโมล็อกของหนูของตัวกระตุ้นรีเซพเตอร์ของลิแกนด์ NF-kappaB วารสารการวิจัยกระดูกและแร่ธาตุ 15(11), 2178–2186
Yip, KH, Zheng, MH, Steer, JH, Giardina, TM, Han, R., Lo, SZ, … Xu, J. (2005). Thapsigargin ปรับ osteoclastogenesis ผ่านการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกิดจาก RANKL และการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา วารสารการวิจัยกระดูกและแร่ธาตุ, 20(8), 1462–1471.
Yu, Q., Li, X. และ Cao, X. (2016). ฤทธิ์ป้องกันโรคหัวใจของสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จาก Cistanche Deserticola ในภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เกิดจากภาวะขาดเลือดขาดเลือดในหนูแรท พงศาวดารของการผ่าตัดหลอดเลือด, 34, 234–242.
Zhou, L., Liu, Q., Yang, M., Wang, T., Yao, J., Cheng, J., … Xu, J. (2016). Dihydroartemisinin ยาต้านมาลาเรีย ยับยั้งโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการขาดฮอร์โมนเอสโตรเจน การสร้างเซลล์สร้างกระดูก และเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกิดจาก RANKL วารสารการวิจัยกระดูกและแร่ธาตุ, 31(5), 964–974.
Zhu, S., Yao, F., Qiu, H., Zhang, G., Xu, H., & Xu, J. (2018). ปัจจัยการมีเพศสัมพันธ์และ microRNA ของบรรจุภัณฑ์ภายนอกมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการเปลี่ยนแปลงของกระดูก บทวิจารณ์ทางชีววิทยาของ Cambridge Philosophical Society, 93(1), 469–480.