Part1: Geraniol เยียวยาอาการบาดเจ็บที่ไตที่เกิดจาก Doxorubicin ผ่านการเปลี่ยนแปลงสถานะสารต้านอนุมูลอิสระ การอักเสบ และการตายของเซลล์: บทบาทที่เป็นไปได้ของ NF-kB และ Nrf2/Ho-1

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: Doxorubicin-mediatedไตบกพร่องเป็นปัญหาร้ายแรงในการรักษาโรคมะเร็ง ดังนั้น งานนี้จึงได้ตรวจสอบความสามารถของเจอรานิออลในการปรับสภาพที่เหนี่ยวนำด้วย doxorubicinไตเสียหายโดยใช้แบบจำลองหนู หนูถูกสุ่มให้อยู่ในกลุ่มสี่กลุ่ม: กลุ่มควบคุม, โดโซรูบิซิน (20 มก./กก., ในช่องท้อง, ip), โดโซรูบิซินร่วมกับเจอรานิออล 100 มก./กก. และด็อกโซรูบิซินร่วมกับเจอรานิออล 200 มก./กก. การฉีด doxorubicin เพียงครั้งเดียวทำให้เกิดการด้อยค่าของไต โดยเห็นได้จากค่า creatinine ในซีรัมที่เปลี่ยนแปลง ค่ายูเรียไนโตรเจนในเลือด และค่าอัลบูมิน มันยังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อในโครงสร้างไต นอกจากนี้ ด็อกโซรูบิซินยังช่วยเพิ่มลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในขณะที่ลดกลูตาไธโอน กิจกรรมของคาตาเลส และการแสดงออกของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสและซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส ที่น่าสนใจ การบำบัดล่วงหน้าด้วยเจอรานิออลช่วยการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก doxorubicin ในพารามิเตอร์การต้านอนุมูลอิสระของไต กิจกรรมของเอนไซม์ และการแสดงออกของยีนและโปรตีนที่ทำให้เกิดการอักเสบและการตายของเซลล์อะพอพโทซิส ยิ่งไปกว่านั้น การรักษาด้วยการป้องกันโรคด้วยเจอรานิออลยังรักษาลักษณะทางเนื้อเยื่อของไตส่วนใหญ่ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา การค้นพบนี้สนับสนุนว่า geraniol สามารถป้องกัน doxorubicin-mediatedความผิดปกติของไต. อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงกลไกของผลการป้องกันของ geraniol ต่อความผิดปกติของไตที่เกิดจาก doxorubicin-mediated

คีย์เวิร์ด: โดโซรูบิซิน; การอักเสบ; ความเครียดออกซิเดชัน อะพอพโทซิส; อาการบาดเจ็บที่ไต เจอรานิออล

1. บทนำ

นับตั้งแต่การค้นพบ ยา doxorubicin (Dox) ที่ต้านมะเร็งของแอนทราไซคลินได้ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการกำจัดเนื้องอกและมะเร็งทางโลหิตวิทยา ผลข้างเคียงที่พบบ่อยที่สุดคือพิษต่อไต ซึ่งอธิบายว่าเป็นความผิดปกติของไตด้วยการกรองที่ลดลง การดูดซึมกลับ และการขับถ่าย ซึ่งสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่สำคัญของการเจ็บป่วยและการตาย ผู้ป่วยมะเร็งประมาณ 60 เปอร์เซ็นต์ที่ได้รับเคมีบำบัดจะพัฒนาความเป็นพิษต่อไต ซึ่งจำกัดประสิทธิภาพการรักษาของ Dox[5,6] ในขณะที่กระบวนการพื้นฐานที่ก่อให้เกิดพิษต่อไตที่เป็นสื่อกลาง Dox ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด วรรณกรรมแนะนำว่าผู้มีส่วนร่วมที่น่าจะเป็นไปได้ ได้แก่ความเครียดออกซิเดชัน, การอักเสบ, และอะพอพโทซิส. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง หลักฐานบ่งชี้ว่าการลด Dox-associatedความเครียดออกซิเดชัน, การอักเสบและเหตุการณ์ apoptotic อาจช่วยลดความเป็นพิษต่อไตของยาได้

ปัจจัยนิวเคลียร์ (ที่ได้มาจากอีรีทรอยด์ 2) เหมือน 2 (Nrf2) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ไวต่อสารรีดอกซ์ที่มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และปกป้องเซลล์ที่รักษาระบบการป้องกันของเซลล์ เมื่อเกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน Nrf2 จะปล่อยโปรตีนตัวยับยั้งไซโตพลาสซึมซึ่งเข้าสู่นิวเคลียสและกระตุ้นยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ เช่น heme oxygenase-1(Ho-1), กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GPx), catalase( CAT) และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) [14-19] การรักษาด้วย Dox แสดงให้เห็นว่าสามารถลดทั้ง mRNA และการแสดงออกของโปรตีนของ Nrf2 และด้วยเหตุนี้ ยีนและโปรตีนของสารต้านอนุมูลอิสระที่ปลายน้ำจึงนำไปสู่ความเป็นพิษต่อไต

ปัจจัยนิวเคลียร์-kB (NF-kB) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ควบคุมการแสดงออกของยีนอักเสบหลายชนิด เป็นตัวกลางของวิถี NF-kB ซึ่งถูกกระตุ้นโดยสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) มันสามารถกระตุ้นการตอบสนองต่อการอักเสบและส่งผลให้เนื้อเยื่อบาดเจ็บ [8,22,23] มีรายงานการศึกษาจำนวนมากที่รายงานว่า Dox ทำให้เกิดการอักเสบและเพิ่มการผลิตไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ เช่น interleukin-6(IL-6), interleukin-1 beta (L-1 ) และ tumor necrosis factor-alpha(TNF- )[11,13] นอกจากนี้ การผลิต ROS ที่เพิ่มขึ้นหลังการแสดงความเสียหายของไตที่เกิดจาก Dox มีบทบาทสำคัญในการกระตุ้นวิถี apoptotic ภายในผ่านความไม่แน่นอนของยล ตัวกำหนดหลักของวิถีนี้คือโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโตคอนเดรีย Bax และ Bcl-2; อัตราส่วนที่สมดุลของ Bcl-2 ต่อ Bax ช่วยป้องกันการตายของเซลล์ ในขณะที่ความไม่สมดุลนำไปสู่การซึมผ่านของเมมเบรนที่เพิ่มขึ้นและการรั่วไหลของไซโตโครมซีเข้าไปในไซโทซอล ซึ่งจะกระตุ้นแคสเปส-9(Casp-9) และแคสเปส{ {21}} (แคสป์-3) โดยทั่วไปการกระตุ้นดังกล่าวจะนำไปสู่การแตกตัวของดีเอ็นเอและการตายของเซลล์

เป็นเรื่องที่น่าสนใจอย่างยิ่งที่จะเพิ่มการใช้ยาเคมีบำบัดทางคลินิกให้เกิดประโยชน์สูงสุดในขณะที่ลดผลกระทบด้านลบของยาเหล่านั้น ดังนั้นจึงมีความพยายามในการวิจัยเพื่อตรวจสอบการใช้สารต่างๆ ร่วมกับ Dox เพื่อปรับปรุงผลข้างเคียง [13,30,31] สารสกัดจากสมุนไพรและส่วนผสมออกฤทธิ์ทางชีวภาพเป็นที่ทราบกันมานานแล้วว่าสามารถลดความเป็นพิษจากยาได้ Geraniol เป็นแอลกอฮอล์ monoterpene แบบอะไซคลิกที่พบในน้ำมันหอมระเหยเกือบทั้งหมด เช่น ขิง กุหลาบ ส้ม ลาเวนเดอร์ และมะนาว [32,33] จากการศึกษาหลายชิ้นรายงานว่าเจอรานิออลมีคุณสมบัติที่เป็นประโยชน์หลายอย่าง เช่น ต้านแผลในกระเพาะอาหาร ต้านมะเร็ง [35] ต้านอาการซึมเศร้า [36] ต้านการอักเสบ [33] และยังช่วยบรรเทาอาการไตจากเบาหวานได้ [37] .

เท่าที่ทราบ ขณะนี้ยังไม่มีข้อมูลเฉพาะเจาะจงเกี่ยวกับผลการป้องกันของเจอรานิออลต่อพิษต่อไตที่อาศัย Dox ดังนั้นเราจึงศึกษาผลกระทบและกลไกที่น่าจะเป็นของการกระทำของ geraniol ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจาก Dox ผ่านเส้นทางส่งสัญญาณ NF-kB และ Nrf2/Ho-1 ในไตของหนู Wistar

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.สัตว์

หนู Wistar เพศผู้ถูกจัดหามาจากศูนย์ดูแลสัตว์มหาวิทยาลัย King Saud (KSU) ในเมืองริยาด ประเทศซาอุดีอาระเบีย สัตว์เหล่านี้ได้รับการดูแลในสภาวะควบคุม เช่น เลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิห้อง (25 ± 1 องศา) โดยมีวัฏจักรแสง/มืด 12 ชั่วโมง และเข้าถึงน้ำได้ไม่จำกัดและอาหารมาตรฐานตามที่ได้รับอนุญาตจากคณะกรรมการจริยธรรมการศึกษาสถาบันท้องถิ่นของ KSU (REC) ภายใต้หมายเลขอนุญาต KSU-SE-19-122

2.2. การออกแบบทดลอง

การตรวจสอบนี้ตรวจสอบหนู Wistar เพศผู้จำนวน 32 ตัวที่มีน้ำหนัก 190-210 กรัม แบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม หนูได้รับหนึ่งสัปดาห์เพื่อปรับตัวให้เข้ากับสิ่งแวดล้อมก่อนการศึกษา กลุ่มกระสายยา หรือที่เรียกว่ากลุ่มควบคุม ประกอบด้วยหนูที่ได้รับสูตรผสมน้ำเกลือปกติทางปาก Group II ประกอบด้วยหนูที่ได้รับ Dox (20 มก./กก. ip ครั้งเดียว) ในวันที่ 17 [11] หนูแรทกลุ่ม ⅢI และ IV ได้รับขนาดยาป้องกันโรคของเจอรานิออล (ทางปาก) ที่ 100 และ 200 มก./กก. ตามลำดับ เป็นเวลา 18 วัน และในวันที่ 17 เช่นเดียวกัน ภายใต้ Dox (20 มก./กก., ip) ในวันที่ 18 หนูแรทถูกการุณยฆาตโดยใช้สารผสมคีตามีน/ไซลาซีนในสภาพแวดล้อมที่ควบคุม เก็บเลือดและแยกซีรั่ม และไตทั้งสองข้างถูกกำจัดออกและแช่แข็งแบบแฟลชทันทีในไนโตรเจนเหลว การสอบวิเคราะห์การแสดงออกทางชีวเคมี ยีนและโปรตีนถูกดำเนินการบนเนื้อเยื่อที่ถูกแช่แข็ง สำหรับการตรวจชิ้นเนื้อ ตัวอย่างเนื้อเยื่อไตถูกล้างใน PBS และเก็บรักษาไว้ในสารละลายฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ ตลอดการสอบสวน ไม่มีสัญญาณของความทุกข์หรือความตายในสัตว์ทดลอง

2.3. การกำหนดเครื่องหมายการทำงานของไต

เพื่อแยกซีรั่มออกจากเลือดที่เก็บในช่วงเวลาของการบูชายัญ ตัวอย่างเลือดถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 2000×g ในเครื่องหมุนเหวี่ยงที่เย็นไว้ล่วงหน้า จากนั้นนำซีรัมที่ได้รับมาวิเคราะห์เพื่อหาปริมาณอัลบูมิน ยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) และครีเอตินีน ค่าของการทำงานของไตเครื่องหมายถูกคำนวณโดยใช้ Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, USA

2.4.Ealuation ของลิปิดเปอร์ออกซิเดชัน

การประเมินไขมันเปอร์ออกซิเดชันในเนื้อเยื่อไตตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Ohkawa et al. โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย

2.5. ปริมาณของกลูตาไธโอนลดลง

ระดับของกลูตาไธโอนที่ลดลง (GSH) ในไตหลังเกิดไมโทคอนเดรีย supernatant (PMS) ถูกวัดตามวิธีการที่อธิบายโดย Sedlak และ Lindsay โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย

2.6. ปริมาณของกิจกรรมของ Catalase

กิจกรรมของ CAT ใน PMS ของไตถูกกำหนดตามวิธีการที่อธิบายโดย Claiborne โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย

2.7. การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน (RT-qPCR)

TRIzolTMreagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ถูกนำมาใช้เพื่อแยก RNA ทั้งหมดออกจากเนื้อเยื่อไตตามแนวทางของผู้ผลิต ความบริสุทธิ์และปริมาณของตัวอย่าง RNA ที่สกัดออกมาถูกกำหนดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, USA) จากนั้น RNA ที่แยกได้จะถูกแปลงกลับเป็น cDNA โดยใช้ cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, USA) และการแสดงออกของยีนถูกหาปริมาณด้วย SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, USA) บน Applied Biosystems 7500 Fast Real- ระบบ PCR เวลา จากนั้นจึงใช้แนวทาง AACt เพื่อกำหนดการแสดงออกสัมพัทธ์ของยีนต่างๆ ในกลุ่ม โดย GAPDH ใช้เป็นยีนดูแลทำความสะอาด ตารางที่ 1 แสดงลำดับไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้ (IDT, Leuven, Belgium)

2.8. การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน

การวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการตามที่อธิบายโดย Alasmari et al [41]. โดยสังเขป โปรตีนที่ถูกแยกเดี่ยว (30-50 ug) ถูกอิเล็กโตรโฟเรสบนเจล SDS-PAGE จากนั้นถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF หลังจากการปิดกั้นด้วยนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 60 นาที บล็อตถูกตรวจสอบข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่คัดเลือกมา (เทียบกับ Ho-1, Nrf2, TNF- , I6, NF-kB-p65, คลีฟ-แคสเปส{{ 14}}, Bcl-2, Bax และ GAPDH, การเจือจาง 1:1000) ต่อมาเยื่อถูกล้าง จากนั้นบ่มเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับ HRP ที่เหมาะสม (การเจือจาง: 1:5000) ชุดรีเอเจนต์ ECL และอุปกรณ์สร้างภาพเจล (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ถูกใช้เพื่อตรวจจับการปรากฏตัวของโปรตีนบนเมมเบรน

2.9.จุลพยาธิวิทยาศึกษา

เนื้อเยื่อไตถูกตรึงภายหลังด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 4% จากนั้นจึงนำไปแปรรูปสำหรับการแบ่งส่วนพาราฟินและการย้อมสี ใช้ไมโครโทมเพื่อตัดส่วนพาราฟินที่ความหนา 3 ไมโครเมตร จากนั้น ส่วนที่ตัดจะได้รับการบำบัดเพื่อเอาแว็กซ์ออก และย้อมโดยใช้สีย้อม hematoxylin plus eosin (H&E) สำหรับการตรวจทางจุลพยาธิวิทยา ภาพจุลพยาธิวิทยาของไตได้มาจากการใช้กล้อง DP72 ร่วมกับกล้องจุลทรรศน์ Olympus BX

2.10.การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์ข้อมูลด้วยโปรแกรม Graph Pad Prism 5 ที่ใช้คอมพิวเตอร์ (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) และนำเสนอผลลัพธ์เป็นค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (mean± SD) ความแตกต่างระหว่างกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้ ANOVA ทางเดียวตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบของ Tukey โดยมีค่า p น้อยกว่า 0.05 ซึ่งแสดงถึงนัยสำคัญทางสถิติ (p<>