Part1:Acteoside ยับยั้ง RANKL-Mediated Osteoclastogenesis โดยการยับยั้ง C-Fos Induction และ NF- KB Pathway และลดการผลิต ROS
Mar 05, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
เชิงนามธรรม
การศึกษาจำนวนมากได้รายงานว่าไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบเป็นตัวกลางที่สำคัญสำหรับการสร้างกระดูก ซึ่งทำให้เกิดการสลายของกระดูกและโรคกระดูกพรุนมากเกินไปActeoside จาก cistanche สมุนไพรสารออกฤทธิ์หลักของ Rehmannia glutinosa ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการแพทย์แผนโบราณของตะวันออก มีศักยภาพในการต้านการอักเสบและต้านอนุมูลอิสระ ในการศึกษานี้ เราพบว่าแอคทีโอไซด์ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการก่อตัวของ osteoclast อย่างเห็นได้ชัดจากมาโครฟาจของไขกระดูก (BMM) และมาโครฟาจ RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นโดยตัวกระตุ้นรีเซพเตอร์ของลิแกนด์ปัจจัยนิวเคลียร์-kappaB (NF-kB) (RANKL)แอคทีโอไซด์การปรับสภาพยังป้องกันการดูดซึมของกระดูกโดยเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา Acteoside (10 mM) ลดทอนการกระตุ้น RANKL ของ p38 kinase, kinase ที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ และ c-Jun N-terminal kinase และยังยับยั้งการกระตุ้น NF-kB โดยการยับยั้ง phosphorylation ของ p65 subunit และตัวยับยั้ง kBa นอกจากนี้ RANKL-mediated เพิ่มขึ้นในการแสดงออกของ c-Fos และปัจจัยนิวเคลียร์ของ T-cells ที่ถูกกระตุ้น, ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1) และในการผลิตเนื้องอกเนื้อร้าย factor-a, interleukin (IL)-1b และ IL-6 เห็นได้ชัดว่าถูกยับยั้งโดยการปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ นอกจากนี้ช่องปากแอคทีโอไซด์ลดการสูญเสียกระดูกที่เกิดจากการตัดรังไข่และการผลิตไซโตไคน์อักเสบเพื่อควบคุมระดับ ข้อมูลของเราแนะนำว่าแอกทีโอไซด์ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการเจริญเติบโตของ osteoclast จากสารตั้งต้นของ osteoclastic โดยการยับยั้งการกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดย RANKL ของไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนและปัจจัยการถอดรหัส เช่น NF-kB, c-Fos และ NFATc1 โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแอกทิโอไซด์อาจทำหน้าที่เป็นสารต้านการดูดซับเพื่อลดการสูญเสียมวลกระดูกโดยการปิดกั้นการกระตุ้นของ osteoclast
บทนำ
กระดูกได้รับการปรับปรุงใหม่อย่างต่อเนื่องโดยการทำงานของเซลล์สร้างกระดูกและกระดูกที่สมดุล [1] Osteoclasts เกิดขึ้นจากเซลล์ตั้งต้นของเม็ดเลือดของสายเลือด monocyte/macrophage ในขณะที่เซลล์สร้างกระดูกมีเชื้อสาย mesenchymal [2] การกระตุ้น osteoclast อย่างผิดปกติหรือการสร้าง osteoblastogenesis ที่ลดลงสามารถขัดขวางสภาวะสมดุลของกระดูก ทำให้เกิดโรคต่างๆ เช่น โรคกระดูกพรุน โรคข้ออักเสบ และมะเร็งกระดูกในที่สุด [3,4] โรคกระดูกพรุนเป็นโรคกระดูกที่พบได้บ่อยซึ่งนำไปสู่ความเสี่ยงที่จะเกิดการแตกหักเพิ่มขึ้น รูปแบบของโรคกระดูกพรุนที่พบบ่อยที่สุดเกิดจากการขาดฮอร์โมนเอสโตรเจนในสตรีวัยหมดประจำเดือน ยาเช่น corticosteroids และยากันชักอาจก่อให้เกิดความไม่สมดุลระหว่างการสลายและการก่อตัวของกระดูก ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดโรคกระดูกพรุนได้ [5]
มีการใช้สารยับยั้งการดูดกลืนแสงหลายชนิด เช่น bisphosphonates, calcitonin, estrogen และ selective estrogen receptor modulators ในการรักษาโรคกระดูกพรุน สารยับยั้งเหล่านี้รักษามวลกระดูกโดยการยับยั้งการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก [6] การบำบัดทดแทนเอสโตรเจนเป็นการรักษาที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการป้องกันและรักษาโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน อย่างไรก็ตาม การบำบัดทดแทนฮอร์โมนเอสโตรเจนในระยะยาวสามารถเพิ่มความเสี่ยงของมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกและมะเร็งเต้านมได้ ดังนั้น ผู้วิจัยหลายคนจึงมุ่งความพยายามในการพัฒนาสารต้านการดูดกลืนแบบใหม่ที่ไม่มีผลข้างเคียง [7–10] เนื่องจากเซลล์สร้างกระดูกทำหน้าที่ในการสลายของกระดูก การยับยั้งเซลล์สร้างกระดูกโดยเฉพาะจึงถือเป็นเป้าหมายหลักในการศึกษาจำนวนมาก
Osteoclasts เป็นเซลล์ยักษ์ที่มีนิวเคลียสหลายนิวเคลียสซึ่งเกิดขึ้นจากต้นกำเนิดที่มีนิวเคลียสเดียวของตระกูล monocyte/macrophage ผ่านการงอกขยาย การแยกตัว และการรวมตัวของเซลล์ตั้งต้นของเม็ดเลือด [11] ปัจจัยกระตุ้นโคโลนีของมาโครฟาจ (M-CSF) และตัวกระตุ้นตัวรับของลิแกนด์ปัจจัยนิวเคลียร์ (NF)-kB (RANK) (RANKL) เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับการสร้างความแตกต่างของ osteoclast [12] นอกจากนี้ ไซโตไคน์ที่มีการอักเสบหลายชนิด เช่น tumor necrosis factor (TNF) และ interleukin (IL)-1b มีส่วนทำให้เกิด osteoclastogenesis โดยการปรับการเหนี่ยวนำของ RANKL, osteoprotegerin และ M-CSF [7,13] การจับ RANKL กับผิวเซลล์ ตัวรับ RANK ส่งผลให้เกิดสารเชิงซ้อน RANKL/RANK/TNFR (TRAF) ที่กระตุ้นตามลำดับ NF- kB และไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโทเจน (MAPK) รวมถึงไคเนสที่ปลาย N ของ c Jun (JNK), p38 ไคเนสและไคเนสที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณนอกเซลล์ (ERK) [14] การเปิดใช้งานนี้มีบทบาทสำคัญในการไกล่เกลี่ยการสร้างความแตกต่าง การเปิดใช้งาน และการอยู่รอดของ osteoclast RANKL ยังกระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส เช่น ปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น, ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1) และ c-Fos ซึ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาเซลล์สร้างกระดูก [7,9] ดังนั้นการส่งสัญญาณ RANKL จึงเป็นเป้าหมายหลักของสารต้านการดูดกลืนแสงที่ยับยั้งการกระตุ้นของ osteoclast และการสูญเสียกระดูก
แอคทีโอไซด์เป็นสารประกอบออกฤทธิ์หลักของ Rehmannia glutinosa ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการแพทย์แผนตะวันออก [15,16] แอคทีโอไซด์เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่แรงและมีฤทธิ์ต้านตับ ต้านการอักเสบ และต้านอาการประสาทรับความรู้สึกเจ็บปวด [17–20] ก่อนหน้านี้เราพบว่าแอคทีโอไซด์ลดการทำงานของไทโรซิเนสและการสังเคราะห์เมลานินโดยควบคุมการส่งสัญญาณ ERK [21] ป้องกันความเสียหายของเหงือกที่เป็นสื่อกลางของออกซิเจน (ROS) [22] และยับยั้งความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจากสารพิษจากเชื้อรา [23] ผลกระทบเหล่านี้เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความสามารถของนิวคลีโอไซด์ในการขจัด ROS และควบคุมการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางด้วย MAPK โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แนะนำให้ใช้ ROS กับช่องทางการส่งสัญญาณที่เหนี่ยวนำโดย RANKL และเหตุการณ์ของเซลล์ในเซลล์สร้างกระดูก การปรับสภาพด้วยสารต้านอนุมูลอิสระยับยั้งการกระตุ้น RANKL ของ NF-kB, ERK และ IkBa ซึ่งจะช่วยยับยั้งการสร้างกระดูก [24] การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่านอกจากฤทธิ์ต้านการอักเสบแล้ว ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระยังมีความสำคัญต่อสารต้านการดูดซับ ดังนั้นแอกทีโอไซด์จึงสามารถยับยั้งการสร้างกระดูกที่เกิดจาก RANKL ได้
ในการศึกษานี้ เราสำรวจว่าแอกทีโอไซด์มีผลการรักษาต่อการสูญเสียมวลกระดูกหรือไม่ เราตรวจสอบผลของแอกทิโอไซด์ต่อการสร้างความแตกต่างของกระดูกและการสลายตัวของกระดูก และกลไกของเซลล์ที่เกี่ยวข้องโดยใช้ระบบการทดลองในหลอดทดลองและในร่างกาย
Cistanche acteoside ยับยั้ง osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL
วัสดุและวิธีการ
คำชี้แจงจริยธรรม
แนวทางปฏิบัติในการดูแลและการใช้สัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแห่งชาติชลบุรี (ใบอนุญาตเลขที่ CBU 2010-0007) การทดลองทั้งหมดในการศึกษานี้ดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัย
หนู เคมีภัณฑ์ และเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการ
หนู ICR เพศเมียอายุสี่สัปดาห์ซื้อมาจาก Orient Bio Inc. (โซล ประเทศเกาหลี) และเลี้ยงที่อุณหภูมิ 2261uC และความชื้น 5565 เปอร์เซ็นต์ในรอบแสง/มืด 12 ชั่วโมงโดยสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี แอกทิโอไซด์ (3,4-ไดไฮดรอกซี-บีฟีนทิล-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (รูปที่ S1) ถูกแยกออกจากใบของเรห์มานเนีย กลูติโนซา แอกทิโอไซด์ถูกละลายในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนใช้ RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 และ M-CSF ถูกซื้อจาก R & D Systems (มินนิอาโปลิส มินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa และ b-actin ได้มาจากเทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ (Santa Cruz, CA, USA ). แอนติบอดีสำหรับ p-p38 และ p38 ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) Calcium Assay และ Osteocalcin (OC) EIA Kits ถูกซื้อจาก BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) และ Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) ตามลำดับ เพื่อกำหนดพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัม ชุดทดสอบกรดฟอสฟาเตสที่ต้านทานทาร์เทรต (TRAP) ของเมาส์ (ระบบอิมมูโนไดอาโนสติค, สกอตส์เดล, แอริโซนา, สหรัฐอเมริกา) ยังใช้เพื่อวัดระดับ TRAP5b ในซีรัม เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ได้รับสารเคมีเพิ่มเติมจาก Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) และเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการมาจาก SPL Life Sciences (Pochun, South Korea)
การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์ไขกระดูกได้มาจากกระดูกแข้งและกระดูกต้นขาของหนู ICR เพศเมียอายุ 6 สัปดาห์ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] สารแขวนลอยของไขกระดูกถูกบ่มในจานเพาะเลี้ยง 100-มม. ในการมีอยู่ของ M-CSF 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร หลังจาก 3 วัน เซลล์ยึดเกาะถูกใช้เป็นมาโครฟาจของไขกระดูก (BMM) เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดความแตกต่างของกระดูก เซลล์ไขกระดูกบางเซลล์ยังถูกบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงโดยไม่มี M-CSF และเซลล์ที่ยึดติดถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [25] เซลล์มาโครฟาจ RAW264.7 ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Eagle (DMEM) ดัดแปลงของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS) แอลกลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์ และยาปฏิชีวนะ เซลล์เหล่านี้ถูกใช้เป็นสายเซลล์คู่กันสำหรับ BMM เพื่อสำรวจผลของแอกทิโอไซด์ต่อการสร้างกระดูก
Osteoclastic Differentiation และการย้อมสี TRAP
BMM ถูกปรับสภาพก่อนด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0–50 mM) ของแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนกระตุ้นด้วย RANKL 100 ng/ml สื่อเพาะเลี้ยงถูกแทนที่ด้วยอาหารสดในวันที่ 2 และ 5 หลังจาก 7 วันของการฟักไข่ วัฒนธรรมได้รับการแก้ไขใน 4 เปอร์เซ็นต์ PBS- บัฟเฟอร์พาราฟอร์มัลดีไฮด์และย้อมด้วย TRAP โดยใช้ชุด Sigma Aldrich ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ที่เป็นบวกของ TRAP ถูกนับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง และเซลล์ที่มีนิวเคลียส 3 ตัวขึ้นไปถูกพิจารณาว่าเป็นเซลล์สร้างกระดูก เซลล์ RAW 264.7 ยังสัมผัสกับ RANKL 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตรหลังจากการปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง และหลังจาก 7 วันของการฟักตัว เซลล์ถูกแปรรูปสำหรับการย้อมสีด้วย TRAP
การวัดความมีชีวิตของเซลล์
ความมีชีวิตของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยใช้เกลือเตตตราโซเลียมที่ละลายน้ำได้ (WST)-8 รีเอเจนต์ โดยสังเขป BMM หรือเซลล์ RAW264.7 ที่เพาะเลี้ยงในตัวกลางสำหรับการเจริญเติบโตที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์และยาปฏิชีวนะได้รับการรักษาด้วยแอคทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์หรือสารประกอบฟีนอลิก เช่น เควอซิทิน ลูโทลิน อะพิจีนิน หรืออีพิกัลโลคาเทชิน-3-แกลเลต (EGCG) WST-8 รีเอเจนต์ถูกเติมเข้าไปในวัฒนธรรมหลังจาก 48 ชั่วโมงของการฟักตัว หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 4 ชั่วโมงเพิ่มเติม การดูดกลืนแสงจำเพาะของ WST-8- ถูกวัดที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA)
การทดสอบการสลายกระดูก
BMM (16105 เซลล์/มล.) ถูกแขวนลอยใน a-MEM ที่มี 50 ng/ml M-CSF และ 100 ng/ml RANKL จากนั้นแบ่งผ่าน 24-หลุมที่เคลือบด้วยแคลเซียมฟอสเฟตนาโนคริสตัล (OAAS{{6}) }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, South Korea) ที่ความหนาแน่น 26104 เซลล์/ซม2 โดยมีและไม่มีแอกทีโอไซด์ หลังจากการฟักไข่เป็นเวลา 7 วัน เซลล์ถูกกำจัดออกจากเพลตที่มีโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 5 เปอร์เซ็นต์ และสังเกตการก่อตัวของหลุมภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบนำแสง พื้นที่ดูดซับยังถูกวัดโดยเครื่องวิเคราะห์ภาพและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของค่าควบคุม
การวิเคราะห์ Western Blot
โปรตีนไลเซตทั้งหมดถูกเตรียมในบัฟเฟอร์สลายตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [26] โปรตีน Cytosolic และนิวเคลียสถูกเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] ปริมาณโปรตีนที่สกัดเท่ากันถูกแยกโดย SDS-PAGE 12–15 เปอร์เซ็นต์ และซับลงบนเยื่อแผ่นโพลีไวนิลไดฟลูออไรด์ บล็อตถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4uC ก่อนการบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิในบัฟเฟอร์การขัดขวางเป็นเวลา 1 ชั่วโมง รอยเปื้อนเป็น
พัฒนาด้วยเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) และสัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA)
การทดสอบกิจกรรม MAPK
เซลล์ถูกปรับสภาพด้วยแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นกระตุ้นด้วย RANKL อีก-30 นาที กิจกรรมของ MAPK ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบอิมมูโนเมตริก เช่น ชุดทดสอบไคเนส p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), ชุดทดสอบเอนไซม์ p-ERK (การออกแบบการทดสอบ) และชุดทดสอบ ELISA แบบแซนวิช p-SAPK/JNK (เทคโนโลยีการส่งสัญญาณมือถือ, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา). ขั้นตอนทั้งหมดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต และวัดค่าการดูดกลืนแสงโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท
การทดสอบการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้า (EMSA)
ปฏิกิริยาการจับดีเอ็นเอ-โปรตีนถูกดำเนินการเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง โดยมีโปรตีน 10-15 มก. ในบัฟเฟอร์ 20 มล. ที่มี BSA 1 มก./มล. โพลี 0.5 มก./มล. (dI-dC) กลีเซอรอล 5 เปอร์เซ็นต์ , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 30,000 cpm ของ [a-32P] โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลาก dCTP และชิ้นส่วน Klenow ของ DNA พอลิเมอเรส ตัวอย่างถูกแยกบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 6 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งถูกทำให้แห้งและสัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (บริษัท Eastman Kodak) เป็นเวลา 12–24 ชั่วโมงที่ 270uC ลำดับไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ซึ่งจำเพาะสำหรับ NF-kB คือ 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 และ 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB Luciferase Assay
มาโครฟาจ RAW264.7 ในเพลต24-หลุมถูกทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์นักข่าว kB-luciferase 0.8 มก. โดยใช้ Lipofectamine 2000 2 มล. (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ที่ 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย RANKL โดยมีและไม่มีแอกทีโอไซด์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ lysis ของตัวรายงาน 100 มล
(โปรเมก้า, แมดิสัน, วิสคอนซิน, สหรัฐอเมริกา). ตัวอย่างโปรตีนในปริมาณที่เท่ากันถูกใส่ลงในไมโครเพลท 96-หลุมและผสมกับซับสเตรตลูซิเฟอเรส วัดการเรืองแสงโดยใช้ไมโครเพลทลูมิโนมิเตอร์ (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ในการทดลองนี้ เปปไทด์ตัวยับยั้ง NF-kB ที่ซึมผ่านได้ (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) ถูกใช้เป็นตัวยับยั้ง kB เชิงบวก
การวัดไซโตไคน์
BMM หรือเซลล์ RAW264.7 ถูกกระตุ้นด้วย RANKL ต่อหน้าแอคทีโอไซด์ในเพลตเพาะเลี้ยง 24-หลุม หลังจากการบ่ม 48 ชั่วโมง สารเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงถูกรวบรวมและประเมินโดย ELISA โดยใช้ชุดเครื่องมือ OptEIATM จำเพาะของ TNF-a-, IL-1b- และ IL-6- ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
Real-Time Reverse transcription-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
การแสดงออกของ mRNA ของมาร์คเกอร์เกี่ยวกับกระดูก เช่น c-Fos, NFATc1 และ TNF-a ถูกกำหนดหาโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ โดยสรุป RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากมาโครฟาจด้วยรีเอเจนต์ Trizol ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Invitrogen) cDNA ถูกสังเคราะห์ด้วย RNA ทั้งหมด 1 มก. โดยใช้ SuperScript Reverse Transcriptase II และไพรเมอร์ (Invitrogen) Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ถูกใช้เพื่อตรวจจับการสะสมของผลิตภัณฑ์ PCR ระหว่างการปั่นจักรยานด้วยระบบตรวจจับลำดับ ABI 7500 (Applied Biosystems) หลังจากการเสียสภาพที่ 95uC เป็นเวลา 10 นาที PCR มีค่าเท่ากับ
ดำเนินการโดยใช้สี่สิบ 3-รอบของการเปลี่ยนสภาพที่ 95uC เป็นเวลา 15 วินาที การหลอมที่ 60uC เป็นเวลา 1 วินาที และการขยายที่ 72uC เป็นเวลา 30 วินาที ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดถูกดำเนินการอย่างน้อยสามเท่า และระดับการแสดงออกถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับยีนการดูแลทำความสะอาด HPRT ในปฏิกิริยาเดียวกัน การศึกษานี้ใช้ลำดับไพรเมอร์เดียวกันกับที่อธิบายไว้ในที่อื่น [7]
การวัด ROS ภายในเซลล์
สารละลายสต็อกของ 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Germany) ถูกเตรียมใน DMSO และเก็บไว้ที่ 220uC ในที่มืด โดยสรุป BMM (106 เซลล์/มล. ในเพลต 6-หลุม) ถูกเพาะเลี้ยงด้วย 50 ng/ml M-CSF เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0– 10 mM) ของแอคทีโอไซด์2 ชั่วโมงก่อนการกระตุ้นด้วย RANKL 100 ng/ml หลังจากการบ่มร่วม 1 ชั่วโมง เซลล์เหล่านี้ถูกบ่มในเวลาต่อมาด้วย DCFH-DA 25 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 30 นาที การเรืองแสงสีเขียวของ 2979-dichlorofluorescein (DCF) ถูกบันทึกที่ 515 nm (FL 1) โดยใช้ระบบ FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) และ 10000 เหตุการณ์ถูกนับต่อตัวอย่าง
การชักนำให้เกิดโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการตัดรังไข่
หนู ICR เพศเมีย (อายุ 6 สัปดาห์) ถูกใช้สำหรับการศึกษานี้ หนูได้รับการผ่าตัดหลอก (Sham, n =10) หรือการผ่าตัดรังไข่ออก (OVX, n=20) ภายใต้การดมยาสลบ หนึ่งสัปดาห์หลังการผ่าตัด หนู OVX ถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มละ 10 ตัว: OVX ทวิภาคีและ OVX ทวิภาคีเสริมด้วย 200 มล.
PBS ที่มีแอคทีโอไซด์ 1 มิลลิโมลาร์ (กลุ่ม AC) Acteoside ในช่องปากได้รับการบริหารทุกๆ 3 วันเป็นเวลา 8 สัปดาห์หลังการผ่าตัดและ
ปริมาณ PBS เท่ากันถูกบริหารให้กับกลุ่ม Sham และ OVX หลังจาก 1 วันของการบริหารครั้งสุดท้าย หนูถูกสังเวย จากนั้นจึงวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัมและ3-โครงสร้างกระดูกเชิงมิติ
การกำหนดพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัม
เก็บตัวอย่างเลือดโดยการเจาะหัวใจและเก็บซีรัมโดยการหมุนเหวี่ยง ตัวอย่างซีรัมถูกเก็บไว้ที่ 280uC เพื่อวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมี ระดับซีรัมของ IL-1b และ IL-6 ถูกประเมินโดยใช้ชุดเครื่องมือ ELISA ตามที่อธิบายข้างต้น ในขณะที่กิจกรรมของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบสีทางชีวเคมีที่วัดปริมาณของ p -ไนโตรฟีนอลที่ผลิตจากสารตั้งต้น p-nitrophenol ฟอสเฟต ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [27] ในการประมาณค่าไบโอมาร์คเกอร์ของการสร้างกระดูกและการสลายของกระดูก ระดับซีรั่ม OC แคลเซียม และ TRAP5b ก็ถูกกำหนดตามคำแนะนำของผู้ผลิตเช่นกัน
การวิเคราะห์โครงสร้างกระดูกและพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยา
กระดูกต้นขาของหนู (กลุ่ม Sham, OVX และ AC) ถูกผ่าและเติมด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาสำหรับการทดสอบทางกล วัดความแข็งแรงทางกลของกระดูกโคนขาตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [28] ภาระการแตกหักถูกบันทึกเป็นแรงสูงสุดในหน่วยนิวตัน ณ จุดที่แกนกลางของกระดูกโคนขาขวาหัก นอกจากนี้ กระดูกโคนขาแบบเบาของสัตว์แต่ละตัวยังได้รับการวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาโดยใช้ระบบไมโครคอมพิวเตอร์เอกซ์เรย์ (micro-CT) (ระบบเอ็กซ์เรย์ไมโครโฟกัส SkyScan 1076 เมืองคอนติช ประเทศเบลเยียม) โดยสังเขป กระดูกในที่เก็บฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ถูกทำให้แห้งอย่างผิวเผินบนกระดาษทิชชู่ก่อนที่จะห่อด้วยพลาสติก ''ฟิล์มติด'' หรือพาราฟิล์ม เพื่อป้องกันไม่ให้แห้งระหว่างการสแกน กระดูกที่ห่อด้วยพลาสติกแต่ละชิ้นถูกวางในหลอดพลาสติก/โพลีสไตรีนโฟมซึ่งติดตั้งในแนวตั้งในแนวนอนในห้องตัวอย่างเครื่องสแกน 1076 สำหรับ
ภาพไมโครซีที การสแกนดำเนินการโดยใช้แรงดันแหล่งจ่าย 100 kV และกระแสไฟแหล่ง 140 mA ที่มีความละเอียด 35 มม.
แบบจำลองสามมิติของกระดูก trabecular ของกระดูกโคนขาถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้ SkyScan CT Analyzer เวอร์ชัน 1.11 พารามิเตอร์ทางโครงสร้าง เช่น ความหนาแน่นของมวลกระดูก trabecular (BMD, g/cm3), เปอร์เซ็นต์ปริมาตรของกระดูก (ปริมาตรกระดูก (BV)/ปริมาตรของเนื้อเยื่อ (TV), เปอร์เซ็นต์ ), ความหนา (Tb.Th, มม.), การแยกตัว (Tb.Sp. , มม.) และจำนวน (Tb.N, 1/mm) จากนั้นจึงวัด
การทดสอบการสร้างความแตกต่างของกระดูกและการทำให้เป็นแร่ เซลล์ไขกระดูกที่เพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยง {{{{10}}}}หลุม ได้รับการบำบัดด้วย DAG (10 นาโนโมลาร์ เดกซาเมทาโซน กรดแอสคอร์บิก 50 มิลลิโมลาร์ และบี-กลีเซอโรฟอสเฟต 20 มิลลิโมลาร์) ใน มีแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ หลังจาก 2 สัปดาห์ของการแยกความแตกต่าง เซลล์ถูกตรึงด้วยเอธานอล 70 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) ที่เย็นจัดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและย้อมด้วย alizarin red S 0.2 เปอร์เซ็นต์ในน้ำกลั่นเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่เซลล์ถูกกำจัดและทำให้แห้งด้วยอากาศ แผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์ได้รับการประเมินโดยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว (Nikon TS100, Japan) ในการหาปริมาณของสีย้อมสีแดง คราบนั้นถูกชะด้วยแอซีทิล ไพริดิเนียม คลอไรด์ 10 เปอร์เซ็นต์โดยการเขย่าเป็นเวลา 20 นาที และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 560 นาโนเมตร ปริมาณแคลเซียมที่สะสมอยู่ในชั้นเซลล์ยังวัดโดยใช้ชุดแคลเซียมซี (Wako Chemical Inc. โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต นอกจากนี้ การแสดงออกของเครื่องหมาย mRNA ที่จำเพาะต่อกระดูก เช่น ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับ runt-2 (Runx2), osterix, bone sialoprotein (BSP) และ OC ถูกกำหนดโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ ไพรเมอร์ Oligonucleotide ของเครื่องหมายเหล่านี้ได้รับการออกแบบด้วยขนาดผลิตภัณฑ์น้อยกว่า 200 bp โดยใช้ Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [27]
cistanche acteoside ช่วยเพิ่มการสร้างกระดูก
ผลลัพธ์
Acteoside ยับยั้งการสร้าง Osteoclast โดย Macrophages ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ
เพื่อตรวจสอบผลของแอกทิโอไซด์ต่อการสร้างความแตกต่างของ BMM ในเซลล์สร้างกระดูก เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0– 20 mM) ของแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 7 วันต่อหน้า 50 ng/ml M- CSF และ 100 ng/ml อันดับ Acteoside ลดจำนวนเซลล์สร้างกระดูกในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา เมื่อเซลล์ถูกปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จำนวน osteoclast ลดลง 43 เปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่เสริมด้วย M-CSF และ RANKL (รูปที่ 1A) รูปที่ 1B แสดงความแตกต่างของ osteoclast ที่อาศัย RANKL และการยับยั้งโดยการบำบัดร่วมกับแอกทิโอไซด์ สอดคล้องกับผลลัพธ์นี้ การปรับสภาพด้วยแอกทิโอไซด์ลดการสร้างความแตกต่างที่กระตุ้นด้วย RANKL ของเซลล์ RAW264.7 และการสร้างเซลล์สร้างกระดูก (รูปที่ 1C และ D) เมื่อเปรียบเทียบศักยภาพในการต้านการเสื่อมสภาพของแอกทิโอไซด์บน BMM กับศักยภาพในการต้านการเสื่อมของกระดูกของสารประกอบฟีนอลิกหลายชนิดที่ความเข้มข้นเท่ากัน (10 mM) ลูเทโอลินแสดงฤทธิ์สูงสุด (รูปที่ 2A) อย่างไรก็ตาม ลูเทโอลิน เควอซิทิน หรือเอพิจีนินเองทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลง (รูปที่ 2B) สารประกอบทั้งหมดยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ osteoclastic โดยมาโครฟาจ RAW264.7 ด้วยกิจกรรมสัมพัทธ์ต่อไปนี้: luteolin เควอซิทิน=อะพิเจนิน
Cistanche acteoside ยับยั้ง Osteoclast
