Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ผ่านทางเส้นทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
Mar 06, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI YANG , QIUYAN CHEN , JIE LV , XINHUI WANG และ JINYAO LI
เชิงนามธรรม
Cistanche tubulosaมีหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ ในการศึกษานี้ ได้ทำการศึกษาฤทธิ์ต้านเนื้องอกของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ละลายน้ำได้ของ C. tubulosa (CTPG-W) ต่อมะเร็งหลอดอาหาร เซลล์ Eca-109 ถูกบำบัดด้วย CTPG-W และความอยู่รอดของเซลล์ถูกวัดโดยการสอบวิเคราะห์ MTT อะพอพโทซิส วัฏจักรของเซลล์ ศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (Δψm) และสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี ระดับของโปรตีนในวิถีอะพอพโทติกถูกตรวจพบโดยการวิเคราะห์ western blot ได้มีการพิจารณาแล้วว่า CTPG‑W ลดการมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 อย่างมีนัยสำคัญผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์และการหยุดวงจรของเซลล์ หลังการรักษาด้วย CTPG-W ค่า Δψm ของ Eca-109 ลดลงอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งสัมพันธ์กับระดับที่เพิ่มขึ้นของมะเร็งต่อมน้ำเหลือง B-cell-2 (Bcl-2) - ที่เกี่ยวข้องกับ X และระดับที่ลดลง ของ Bcl-2 ดังนั้น ระดับของ cytochrome c และ c-Jun NH2-terminal kinase เพิ่มขึ้น ซึ่งควบคุมระดับของ cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase และ cleaved-caspase-3, {{18} } และ -9 แต่ไม่ใช่ caspase-8 ในทำนองเดียวกัน ระดับของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาในเซลล์ Eca-109 แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่เด่นชัด ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG-W เหนี่ยวนำการตายแบบอะพอพโทซิสของเซลล์ Eca-109 ผ่านวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
บทนำ
มะเร็งหลอดอาหารเป็นมะเร็งชนิดที่พบได้บ่อยที่สุดประเภทหนึ่ง โดยมีอัตราการป่วยสูงสุดเป็นอันดับที่ 11 และอัตราการเสียชีวิตสูงสุดเป็นอันดับที่ 6 ของโลก และทำให้มีผู้เสียชีวิต ~439,000 รายในปี 2015 (1) อุบัติการณ์ของมะเร็งหลอดอาหารแตกต่างกันไปในแต่ละภูมิภาค โดยเอเชียตะวันออกและแอฟริกาตะวันออกและใต้มีอัตราการเกิดสูงสุด และแอฟริกาตะวันตกมีอัตราต่ำสุดในปี 2555 (1,2) ในประเทศจีน ประมาณการกรณีมะเร็งหลอดอาหารและการตายคือ 477,000 และ 375,000 ตามลำดับในปี 2015 (3) แม้ว่าอัตราการป่วยของมะเร็งหลอดอาหารจะลดลงในกลุ่มประเทศดัชนีทางสังคมและสังคมระดับกลางและระดับกลางระหว่างปี 2548 ถึง พ.ศ. 2558 แต่อัตราการเสียชีวิตยังคงสูงเนื่องจากการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (1,4) มีการใช้การผ่าตัดร่วมกับเคมีบำบัดหรือรังสีรักษาร่วมกันเพื่อรักษามะเร็งหลอดอาหาร อย่างไรก็ตาม มีรายงานว่าระหว่างปี พ.ศ. 2546 ถึง พ.ศ. 2557 อัตราการรอดชีวิต 5- ปียังคงอยู่<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
ยาสมุนไพรจีนโบราณ (CHM) ถูกใช้เพื่อรักษามะเร็งประเภทต่างๆ รวมถึงมะเร็งปอดชนิดเซลล์ไม่เล็ก (6), มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (7), มะเร็งตับ (8) เมื่อเร็ว ๆ นี้ การทดลองทางคลินิกรายงานว่าการใช้ CHM ร่วมกับเคมีบำบัดหรือการฉายรังสีรักษา ไม่เพียงแสดงให้เห็นประโยชน์หลายประการต่อคุณภาพชีวิตและบรรเทาผลข้างเคียงที่เกิดจากเคมีบำบัดหรือรังสีบำบัด (9,10) แต่ยังช่วยเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของผู้ป่วยอีกด้วย กับมะเร็งปอด ตับ กระเพาะอาหาร มะเร็งลำไส้ มะเร็งโพรงจมูก หรือมะเร็งปากมดลูก (9) อย่างไรก็ตาม มีหลักฐานที่ขัดแย้งกันเกี่ยวกับประสิทธิภาพของการรักษา CHM ต่อมะเร็งหลอดอาหาร (10,11) การศึกษาจำนวนมากระบุว่ายาสมุนไพรหรือส่วนประกอบหลายชนิดสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งหลอดอาหาร ในหลอดทดลอง และในร่างกาย รวมทั้งฟ้าทะลายโจร (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt และ Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (นวนิยาย ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) และยาต้ม Tonglian (21) Cistanche เป็น CHM ชนิดหนึ่งและทำหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ รวมถึงการต่อต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และการป้องกันระบบประสาท (22,23) การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่าCistanche tubulosa phenylethanoid ไกลโคไซด์(CTPG) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16-F10 ในหลอดทดลอง และในร่างกาย (24) อย่างไรก็ตาม ความสามารถในการละลายน้ำที่ไม่ดีของ CTPG ที่เคยใช้ก่อนหน้านี้จำกัดการพัฒนายา (24) ดังนั้น CTPG ที่ละลายน้ำได้ (CTPG-W) จึงถูกใช้และศึกษาฤทธิ์ต้านเนื้องอกต่อเซลล์มะเร็งหลอดอาหาร (Eca-109) ได้มีการพิจารณาแล้วว่า CTPG-W สามารถยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 โดยอาศัยขนาดยาผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์ผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
วัสดุและวิธีการ สัตว์.
หนู C57BL/6 เพศเมีย (6-8 สัปดาห์ ~25 ก.) ถูกซื้อจากศูนย์วิจัยสัตว์ทดลองแห่งปักกิ่ง (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และเลี้ยงในห้องควบคุมอุณหภูมิ (25˚C) แบบวงจรแสง (12/ 12) สิ่งอำนวยความสะดวกด้านสัตว์ของมหาวิทยาลัยซินเจียง (อุรุมชี ประเทศจีน) สัตว์ทุกตัวได้รับน้ำและอาหารปลอดเชื้อโรค
สายเซลล์และการเพาะเลี้ยง สายเซลล์มะเร็งหลอดอาหารของมนุษย์ (Eca-109) ได้รับการเก็บรักษาไว้โดย Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) และเพาะเลี้ยงใน RPMI{{1} } ขนาดกลาง (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) เสริมด้วยซีรั่มโคนมในครรภ์ที่ไม่กระตุ้นด้วยความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 เปอร์เซ็นต์ L -กลูตามีน (100 มิลลิโมลาร์), เพนิซิลลิน 100 U/มล. และสเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มล. ที่ 37˚C ในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์
โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) ซื้อมาจาก Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) สารประกอบหลักของ CTPG มีคุณสมบัติและวัดปริมาณโดย HPLC ตามการศึกษาก่อนหน้าของเรา (24) โดยย่อ HPLC ถูกดำเนินการบนคอลัมน์ ZORBAX SB‑C18 (250x4.6 มม.; 5 µm) ที่ 30˚C และถูกชะด้วยสารละลายกรดฟอร์มิก 0.2 เปอร์เซ็นต์ และเกรเดียนท์ของเมทานอลเริ่มต้นที่ 23 เปอร์เซ็นต์ โดยที่ 1 มล. ถูกเติมทุกนาที เป็นเวลา 45 นาที จนกระทั่งถึง 31 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างทั้งหมด 10 ไมโครลิตรถูกฉีดและตรวจพบที่ 330 นาโนเมตร มาตรฐานอิชินาโคไซด์ซื้อจาก Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) และซื้อมาตรฐานแอกทิโอไซด์จาก Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) มาตรฐานนี้ใช้ในการวิเคราะห์ส่วนประกอบของ CTPG-W
การทดสอบ MTT การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัดด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT เซลล์ Eca{{0}} ถูกฉีดวัคซีนลงในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 5x103 เซลล์ใน 100 µl RPMI{{5 }} ตัวกลาง/หลุมและเพาะเลี้ยงที่ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง, จากนั้นถูกบำบัดโดยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 200, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG-W หรือ 0.4 เปอร์เซ็นต์ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชม. DMSO ถูกใช้เป็นตัวควบคุมตัวทำละลาย (800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG-W ที่มี DMSO 0.4 เปอร์เซ็นต์) ซิสพลาติน (20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ต่อมา ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งหลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 225 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และสารละลาย MTT 100 ไมโครลิตร (0.5 มก./มล. ในตัวกลาง RPMI-1640 ที่ไม่มี FBS) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มที่ 37˚C เป็นเวลา 3 ชม. ผลึกฟอร์มาซานที่ถูกก่อรูปถูกละลายใน 200 ไมโครลิตร DMSO ค่าความหนาแน่นของแสง (OD) วัดที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท 96-หลุม (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ความมีชีวิตของเซลล์สัมพัทธ์คำนวณตามสูตร: ความมีชีวิตของเซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ )=(ODtreated/ODuntreated)x100 เปอร์เซ็นต์ สัณฐานวิทยาของเซลล์ Eca-109 สังเกตได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัว (กำลังขยาย x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)
สำหรับการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้าม หนูเมาส์ C57BL/6 ถูกการุณยฆาตโดยการเคลื่อนตัวของปากมดลูก และม้ามถูกแยกออก สารแขวนลอยแบบเซลล์เดียวถูกสร้างขึ้นและเซลล์ม้ามถูกเพาะเข้าไปในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 1x105 เซลล์/หลุมในตัวกลาง 100 µl RPMI-1640 และจากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน (0, 200, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG-W เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมงที่ 37˚C โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ การเพิ่มจำนวนของ splenocytes ถูกวัดโดย MTT assay ตามโปรโตคอลที่กล่าวถึงข้างต้น ดัชนีกระตุ้น=ODtreated/ODuntreated
การวัดการตายของเซลล์และวัฏจักรของเซลล์ เซลล์ Eca{{0}} เพาะเลี้ยงในจานขนาด 60 มม. ที่ความหนาแน่น 2.5x105 เซลล์/จาน เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน ({{31} }, 200, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG-W หรือ DMSO 0.4 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกรวบรวมและย้อมสีด้วย Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection kit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ตัวอย่างถูกรวบรวมโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) และวิเคราะห์โดย FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) เพื่อวิเคราะห์ผลของ CTPG-W ต่อวัฏจักรเซลล์ 2.5x105 Eca-109 เซลล์ถูกเพาะในจานเพาะเลี้ยง 60 มม. และบำบัดด้วย CTPG-W (0, 100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มล.) หรือ 0.4 เปอร์เซ็นต์ DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ทั้งหมดถูกเก็บเกี่ยวและล้างสองครั้งด้วย PBS ที่เย็นจัด (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) จากนั้นตรึงในเอทานอลที่เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง 70 เปอร์เซ็นต์ ที่อุณหภูมิ 4˚C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นจัด เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การย้อมสี PI/RNase 300 µl (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การกระจายรอบเซลล์ถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ ModFit LT 3.0 โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur)
การวิเคราะห์ศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (Δψm) และชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ในการวิเคราะห์ Δψm เซลล์ Eca{{0}} ถูกบำบัดด้วย CTPG-W (0, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ DMSO 0.4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C ด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ และย้อมด้วยชุดทดสอบศักยภาพเมมเบรนของไมโตคอนเดรียด้วย JC-1 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37˚C . หลังจากการล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์การล้าง JC-1 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตัวอย่างถูกแขวนลอยใหม่ด้วยบัฟเฟอร์การล้าง JC‑1 300 ไมโครลิตร และวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur) การเรืองแสงของสีย้อม JC‑1 ในเซลล์ Eca‑109 ยังพบเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัว (กำลังขยาย x200; Nikon Eclipse Ti‑E) สำหรับการวิเคราะห์ ROS เซลล์ Eca-109 ถูกบำบัดด้วย CTPG-W (0, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 2, 4, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง และย้อมด้วยชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา Assay Kit (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 37˚C หลังจากล้างสามครั้งด้วย PBS เย็นจัด ตัวอย่างถูกรวบรวมโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur) และวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ FlowJo 7.6
2,2‑diphenyl‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระ ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระของ CTPG-W ถูกกำหนดหาด้วยการสอบวิเคราะห์อนุมูลอิสระ DPPH ตามโปรโตคอลที่เผยแพร่โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย เนื่องจากเมทานอลถูกแทนที่ด้วยเอทานอลเพื่อละลาย DPPH (25,26) สำหรับการวัดในสภาวะคงตัว 150 µl DPPH (100 มิลลิโมล/ลิตร) ในเอทานอลถูกผสมกับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ใน 50 ไมโครลิตร PBS และฟักในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตรวจพบการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรในการมีอยู่และไม่มีอยู่ของ CTPG-W ใช้วิตามินซีทั้งหมด 50 ไมโครลิตรเป็นตัวควบคุมเชิงบวก กิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH คำนวณโดยใช้สูตร: Scavenging ( เปอร์เซ็นต์ )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100 โดยที่ Ablank คือการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุม (ไม่มี DPPH) ตัวอย่างคือการดูดกลืนแสงของตัวอย่างและ A0 คือการดูดกลืนแสงของ PBS ที่มี DPPH
การวิเคราะห์ blot แบบตะวันตก เซลล์ Eca{{0}} ถูกบำบัดด้วย CTPG-W (0, 200, 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ DMSO 0.4 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C ด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ การล้างต่อไปนี้สองครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกสลายในบัฟเฟอร์ Radioimmunoprecipitation Assay Lysis (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. ปักกิ่ง ประเทศจีน) เป็นเวลา 20 นาทีบนน้ำแข็ง หลังจากการปั่นแยกที่ 10,000 xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4˚C, supernatants ถูกรวบรวมและตรวจพบความเข้มข้นของโปรตีนด้วยชุดกรด bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการตามคำอธิบายก่อนหน้านี้ของเรา (24) แอนติบอดีต้านแคสเปส-7 (แมวหมายเลข D120077), แคสเปส-8 (แมวหมายเลข D155240), แคสเปส-9 (หมายเลขแมว D220078), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองบีเซลล์{ {24}} (Bcl-2)-associated X (Bax) (cat. no. D220073) and Bcl-2 (cat. no. D260117) และ anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) ) (cat. no. D111050) และ anti-rabbit IgG-HRP (cat. no. D110058) ซื้อมาจาก BBI Life Sciences (Shanghai, China) ซื้อแอนติบอดีต้านแคสเปส-3 (หมายเลขแมว E-AB-10050) และแคสเปสออกฤทธิ์-3 (หมายเลขแมว E-AB-22115) จาก Elabscience ( อู่ฮั่น ประเทศจีน) แอนติบอดีต้านแคสเปสอื่นๆ-7 (ประเภทที่ 9492), โพลี (ADP-ไรโบส) โพลีเมอเรส (PARP) (ประเภทที่ 9542), ไซโตโครม c (ประเภทที่ AC909), c-Jun NH{ {48}}terminal kinase (JNK) (cat. no. 9252S) และ -actin (cat. no. 58169) ได้รับจาก Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิทั้งหมดถูกเจือจางที่ 1:1,000 แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มที่ 4˚C ข้ามคืนและแอนติบอดีทุติยภูมิถูกบ่มที่ 37˚C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ตรวจพบโปรตีนเป้าหมายโดยใช้ชุดทดสอบเคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต
การวิเคราะห์ทางสถิติ. นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวกับการทดสอบภายหลังของ Tukey และวิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 50 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ในกลุ่มการบำบัดและควบคุม ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน พี<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa phenylethanoid ไกลโคไซด์(ซีทีพีจี)
ผลลัพธ์
CTPG‑W ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ Eca‑109 ส่วนประกอบของ CTPG-W มีคุณสมบัติและวัดปริมาณโดย HPLC (รูปที่ 1) ซึ่งเปรียบเทียบกับมาตรฐานของเอไคนาโคไซด์และแอคทีโอไซด์ ตามเวลาการกักเก็บสูงสุดและพื้นที่จุดสูงสุด CTPG-W มีอิชินาโคไซด์ 39.16 เปอร์เซ็นต์และแอคทีโอไซด์ 2.44 เปอร์เซ็นต์ ประการแรก ผลของ CTPG-W ต่อความมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 ถูกกำหนดหาด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT CTPG-W ถูกละลายใน DMSO ที่ 200 มก./มล. และเจือจางด้วยตัวกลาง RPMI-1640 ที่มี FBS ที่ถูกระงับความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์เพื่อให้มีความเข้มข้นที่ระบุ เซลล์ Eca-109 ถูกบำบัดด้วย CTPG-W และความอยู่รอดของเซลล์ถูกวิเคราะห์ด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT ที่จุดเวลาที่ระบุ การรักษาด้วย CTPG‑W ช่วยลดความมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและเวลา (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ Eca‑109 ในการตรวจสอบว่า CTPG-W ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ Eca-109 ผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์หรือเนื้อร้ายหรือไม่ เซลล์ถูกบำบัดด้วย CTPG-W ที่มีความเข้มข้นต่างกัน หลังจาก 24 ชม. อะพอพโทซิสและเนื้อร้ายของเซลล์ Eca-109 ถูกตรวจพบด้วยการย้อมสี Annexin V/PI ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 3A เซลล์ Annexin V-/PI plus ถูกปิดล้อมเป็นเซลล์เนื้อตาย และเซลล์ Annexin V plus /PI plus และ Annexin V plus /PI- ถูกปิดล้อมเป็นเซลล์อะพอพโทติก CTPG-W ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ Eca-109 ในขั้นต้นในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา แม้ว่าเซลล์ Eca ที่เป็นเนื้อตายก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้การบำบัดด้วย CTPG-W 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W กระตุ้นการหยุดวงจรของเซลล์ที่เฟส S ในเซลล์ Eca‑109 การรบกวนของวัฏจักรเซลล์มะเร็งจะยับยั้งการเติบโตของเซลล์และส่งเสริมการตายของเซลล์ (27) การกระจายของวัฏจักรเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ตรวจพบด้วยการย้อมสี PI หลังการบำบัดด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่าเซลล์ในระยะ S เพิ่มขึ้น และเซลล์ในระยะ G0/G1 บ่งชี้การลดลงโดยรวมอย่างมีนัยสำคัญเมื่อทำการบำบัด CTPG‑W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W ลดลง Δψm และกระตุ้นการปลดปล่อยไซโตโครมค อะพอพโทซิสสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย (28,29) สมาชิกโปรและต้านอะพอพโทซิสของตระกูลโปรตีน BCL-2 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มยล (30,31) หลังการบำบัดด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง Δψm ถูกประเมินโดยใช้การย้อมสี JC‑1 การรวม JC‑1 (การเรืองแสงสีแดงที่ตรวจพบใน FL‑2) จะสลายตัวเป็นโมโนเมอร์ (ตรวจพบการเรืองแสงสีเขียวใน FL-1) เมื่อ Δψm ลดลง (32) ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5A ความถี่ของ FL-1 บวก FL-2-/ บวกเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งบ่งชี้ว่า Δψm ของเซลล์ Eca-109 ลดลง การเปลี่ยนแปลงการเรืองแสงในเซลล์ Eca-109 ยังถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัว (รูปที่ 5B) ด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ CTPG‑W การเรืองแสงสีแดงลดลงและการเรืองแสงสีเขียวเพิ่มขึ้น ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลจากโฟลว์ไซโตเมทรี นอกจากนี้ยังพบว่าระดับของ cytochrome c ใน cytosol เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 5C) ซึ่งเป็นผลมาจากการลดลงของ Δψm สิ่งนี้ตอกย้ำข้อสรุปที่ได้จากจำนวนที่เพิ่มขึ้นของ FL-1 บวก FL-2-/ บวกเซลล์ที่ Δψm ลดลงอันเป็นผลมาจากการบำบัดด้วย CTPG-W มีรายงานว่า JNK สามารถควบคุมการกระตุ้นของตระกูลโปรตีน BCL-2 ที่ทำให้เกิดการปลดปล่อยไซโตโครม c (33-35) นอกจากนี้ยังถูกกำหนดด้วยว่าระดับของ JNK ถูกควบคุมอย่างโดดเด่นหลังจากการบำบัดด้วย CTPG-W (รูปที่ 5C) ผลลัพธ์ระบุว่า CTPG-W อาจกระตุ้นการตายของเซลล์ Eca-109 ผ่านวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
ผลกระทบของ CTPG‑W ต่อการสร้าง ROS ภายในเซลล์ ROS สามารถลด Δψm เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (36) เพื่อตรวจสอบว่า CTPG-W สามารถเพิ่มการผลิต ROS ได้หรือไม่ เซลล์ Eca-109 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W เซลล์ถูกรวบรวมที่จุดเวลาที่ระบุและย้อมด้วย DCFH-DA การผลิต ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ถูกกำหนดหาโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 6A, 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG-W เพิ่มการผลิต ROS อย่างมีนัยสำคัญจาก 2-6ชม. และลดลงจาก 12-24 ชม. นอกจากนี้ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG‑W เพิ่มการผลิต ROS อย่างมีนัยสำคัญจาก 12-24 ชั่วโมง นอกจากนี้ 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG-W ไม่ได้เปลี่ยนแปลงการผลิต ROS อย่างเด่นชัด การเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกของการผลิต ROS อาจเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ Eca-109 นอกจากนี้ยังถูกกำหนดหาว่า CTPG-W มีการออกฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ (รูปที่ 6B) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการผลิต ROS ที่ลดลงในเซลล์ Eca-109 ที่บำบัดด้วย CTPG-W 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรหลังจาก 12 ชั่วโมง
CTPG‑W ควบคุมกิจกรรมของ caspase‑3, caspase‑7, caspase‑9 และ PARP การปล่อยไซโตโครมคเนื่องจากการลดลง Δψm สามารถกระตุ้นแคสเปสโปรตีเอสเพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (29,30,37) หลังการบำบัดด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การกระตุ้นของ caspase-3, 7, 8, 9 และ PARP ถูกตรวจพบโดยการวิเคราะห์ western blot เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับของแยก-caspase-9, แยก-caspase-7, แยก-caspase-3 และ แยก-PARP แต่ไม่ใช่ระดับของแยก-caspase{{ 20}}, ถูกเพิ่มการควบคุมโดยการบำบัดด้วย CTPG ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 7) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG-W ลด Δψm และส่งเสริมการปลดปล่อยไซโตโครมซีเพื่อกระตุ้นแคสเปสที่กระตุ้นการตายของเซลล์ Eca-109
สารสกัดจาก Cistanche tubulosa
การอภิปราย
CHM แบบดั้งเดิมสามารถกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งหลอดอาหารผ่านวิถีทางที่แตกต่างกัน ซึ่งรวมถึงตัวรับความตายภายนอก วิถีความเครียดของไมโทคอนเดรียภายในและเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (29) การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า CTPG ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักของ C. tubulosa ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16-F10 ผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์ผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย (24) ในการศึกษานี้ ได้ทำการศึกษาฤทธิ์ต้านเนื้องอกของ CTPG-W ต่อเซลล์ Eca-109 และพบว่า CTPG-W ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109 ทำให้เกิดการตายของเซลล์ และหยุดวงจรเซลล์ ลด Δψm เพิ่มการปลดปล่อย cytochrome c และ caspases ที่เปิดใช้งาน CTPG และ CTPG-W สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์และการหยุดวงจรของเซลล์ในเซลล์มะเร็ง อย่างไรก็ตาม กลไกที่แม่นยำนั้นแตกต่างกันเนื่องจากส่วนประกอบต่างๆ ของ CTPG (อิชินาโคไซด์ 26.64 เปอร์เซ็นต์, แอคทีโอไซด์ 10.19 เปอร์เซ็นต์, ไอโซแอคทีโอไซด์ 1.71 เปอร์เซ็นต์) และ CTPG-W (อิชินาโคไซด์ 39.16 เปอร์เซ็นต์ และแอกทีโอไซด์ 2.44 เปอร์เซ็นต์) CTPG จับเซลล์ B16-F10 ที่ระยะ G0/G1 แต่ CTPG-W จับเซลล์ Eca-109 ที่เฟส S (24) การผลิต ROS เพิ่มขึ้นตามขนาดยาโดย CTPG แต่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในลักษณะที่ขึ้นกับเวลาโดยการใช้ CTPG‑W ขนาดสูง ซึ่งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในช่วงเริ่มต้นของการบำบัดด้วย CTPG-W (2-6 ชั่วโมง) และ ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 12 ชั่วโมง เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม สาเหตุที่เป็นไปได้คือองค์ประกอบหลักของ CTPG-W คือ echinacoside ผลการศึกษาจำนวนหนึ่งรายงานว่าอิชินาโคไซด์สามารถยับยั้งการผลิต ROS และการตายของเซลล์ที่เกิดจาก ROS เพื่อออกฤทธิ์ในการป้องกันระบบประสาทและการต่อต้านริ้วรอย (38-40) ในทำนองเดียวกัน กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระถูกสังเกตพบในการศึกษานี้ ดังนั้นจึงมีการคาดการณ์ว่าส่วนประกอบบางอย่าง รวมทั้ง verbascoside, iso-verbascoside และ salidroside ในปริมาณสูงของ CTPG-W อาจทำให้ ROS เกิดการตายของเซลล์ Eca-109 ได้ทันที (41,42) และหลังจากนั้น ROS ถูกกำจัดโดย echinacoside อีกสาเหตุที่เป็นไปได้สำหรับความแตกต่างในการผลิต ROS โดย CTPG และ CTPG-W คือมีการใช้สายพันธุ์ของเซลล์ที่แตกต่างกันในการศึกษานี้และการศึกษาก่อนหน้านี้ (24) Dong et al (43) รายงานว่า echinacoside สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ SW480 ของมนุษย์ผ่านการสร้างความเสียหายของ DNA ออกซิเดชันโดยไม่มีระดับ ROS เพิ่มขึ้น
การบำบัดด้วย CTPG-W ลดลง Δψm และทำให้เกิดการปลดปล่อยไซโตโครม c ซึ่งส่งเสริมการแตกแยกของแคสเปส-9 (28) อย่างสม่ำเสมอ ระดับของแคสเปสแยก-9ถูกปรับเพิ่มขึ้นโดยการบำบัดด้วย CTPG-W ต่อจากนั้น caspase ที่ใช้งานอยู่-9 สามารถกระตุ้น caspase-3 เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (44) ระดับของแคสเปสแบบแยกส่วน-3 ยังเพิ่มการควบคุมโดยการบำบัดด้วย CTPG-W อย่างไรก็ตาม แคสเปส-8 ไม่ถูกกระตุ้นโดย CTPG-W ซึ่งบ่งชี้ว่าวิถีของตัวรับความตายภายนอกไม่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกิดจาก CTPG-W การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG-W กระตุ้นการตายของเซลล์ Eca-109 ผ่านการกระตุ้นวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
PARP มีบทบาทสำคัญในความเสถียรของจีโนมและสามารถแยกออกได้โดยแคสเปสที่ทำงานอยู่ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แคสเปส-3 และ -7 (45) พิจารณาแล้วว่าการบำบัดด้วย CTPG-W กระตุ้นแคสเปส-3 และ -7 ซึ่งอาจตัดแยก PARP เพื่อยับยั้งการซ่อมแซมดีเอ็นเอและทำให้เกิดการตายของเซลล์
นอกจากนี้ CTPG-W ยังยับยั้งการเติบโตของเซลล์มะเร็งตับของมนุษย์ BEL-7404 โดยขึ้นกับขนาดยาและเวลา (ข้อมูลที่ไม่ถูกเผยแพร่) โดยขึ้นกับขนาดยาและเวลา แม้ว่า CTPG-W จะยับยั้งการเติบโตของเซลล์ Eca-109 และ BEL-7404 แต่ก็ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามซึ่งอาจเกิดจากเนื้อหาของโพลีแซคคาไรด์ (~50 เปอร์เซ็นต์ ) ใน CTPG-W (46) ). ในทำนองเดียวกัน การศึกษาจำนวนหนึ่งรายงานว่าพอลิแซ็กคาไรด์สามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้าม (46-49) ในรูปแบบเมาส์ พบว่า CTPG‑W เพิ่มดัชนีม้ามอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม แต่ไม่ส่งผลต่อน้ำหนักตัวและดัชนีอวัยวะอื่นๆ รวมถึงหัวใจ ตับ ไต และปอด (ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่) แสดงว่า CTPG-W ไม่มีผลต่อเซลล์ปกติ
โดยรวมแล้ว ข้อมูลระบุว่า CTPG-W ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ Eca-109 โดยการเหนี่ยวนำของอะพอพโทซิสผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย
ประโยชน์ของ cistanche: ต่อต้านการตายของเซลล์
รับทราบ
ผู้เขียนขอขอบคุณ Dr. Jianhua Yang (วิทยาลัยแพทยศาสตร์เบย์เลอร์) สำหรับการขัดเกลาต้นฉบับ
เงินทุน
การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนโดยแผนห้าปีที่ 13 สำหรับโครงการประมูลชีววิทยาวินัยหลัก (หมายเลข 17SDKD0202), มหาวิทยาลัยครูซินเจียง และห้องปฏิบัติการหลักของการสมัครและข้อบังคับเกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพในสภาพแวดล้อมพิเศษในซินเจียง (หมายเลข XJTSWZ-2017-04) แก่ JL และทุนมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติจีน (หมายเลข 31760260) แก่ XW
ความพร้อมใช้งานของข้อมูลและวัสดุ
ข้อมูลและวัสดุที่ใช้และวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษาปัจจุบันมีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องตามคำขอที่สมเหตุสมผล
ผลงานของผู้เขียน
CF, AA, YY และ QC ทำการทดลอง LX, JLv และ XW วิเคราะห์ข้อมูลและตัวเลขที่เตรียมไว้ JinyuL และ JinyaoL ออกแบบโครงการและเขียนต้นฉบับ
การอนุมัติจริยธรรมและการยินยอมให้เข้าร่วม
การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองกับสัตว์ของห้องปฏิบัติการ Xinjiang Key ด้านทรัพยากรชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์ (การอนุมัติหมายเลข BRGE-AE001; มหาวิทยาลัยซินเจียง)
ความยินยอมของผู้ป่วยสำหรับการเผยแพร่
ไม่สามารถใช้ได้.
การแข่งขันความสนใจ
ผู้เขียนประกาศว่าพวกเขาไม่มีส่วนได้เสียในการแข่งขัน
อ้างอิง
Wu CR, Lin HC และ Su MH: การกลับรายการโดยน้ำสารสกัดจาก Cistanche tubulosaจากพฤติกรรมบกพร่องในแบบจำลองหนูที่เป็นโรคอัลไซเมอร์: ความเกี่ยวข้องสำหรับการสะสมอะไมลอยด์และการทำงานของสารสื่อประสาทส่วนกลาง BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J และ Zhang F:Phenylethanoid glycosides จาก Cistanche tubulosaยับยั้งการเติบโตของเซลล์ B16-F10 ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกายโดยการเหนี่ยวนำของอะพอพโทซิสผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย เจ มะเร็ง 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME และ Berset C: การใช้วิธีอนุมูลอิสระเพื่อประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
