PART Ⅰ:กระบวนการอักเสบปรับเปลี่ยนการแสดงออกและการแปลของ WT1 ใน Podocytes ที่นำไปสู่ความเสียหายต่อไต

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

มารีเอลา อาเรลลาโน-โรดริเกซ, PABLO ZAPATA-BENAVIDS & ET AL

บทนำ

เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน(WTI) เป็นหนึ่งในยีนหลักที่เกี่ยวข้องกับการอยู่รอดของ podocytes และการกรองไตที่ไม่มีประสิทธิภาพ กระบวนการอักเสบนำไปสู่ไตความล้มเหลวและสิ่งนี้อาจเกิดขึ้นได้จากการปรับ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน). WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) เข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัส ซึ่งเป็นโปรตีนซิงค์ฟิงเกอร์ที่มีสี่ไอโซฟอร์มหลักโดยการประกบทางเลือกใน exon 5(17AA±)และ exon 9(KTS±)(1) KTS-isoform มีความเกี่ยวพันกับ DNA มากขึ้น KTS plus ร่วมกับโปรตีน spliceosome ในไซโตพลาสซึม (2, 3).WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) มีบทบาทสำคัญในการสร้างตัวอ่อน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในอวัยวะสืบพันธุ์และไตการพัฒนา; ในผู้ใหญ่ การแสดงออกของมันถูกจำกัดไว้ที่เซลล์อวัยวะภายในเฉพาะในไต(podocytes)และจำเป็นสำหรับการบำรุงรักษาและการปรับยีนหลายชนิด เช่น podocalyxin, nephrin(NPHS1) และปัจจัยการถอดรหัสแบบกล่องคู่ (4-6) การกลายพันธุ์หรือการลดลงของการแสดงออกของ WTl อาจทำให้การแสดงออกของ nephrin และ podocalyxin ลดลง และเกี่ยวข้องกับโรคไตเช่น glomerulosclerosis(5, 7-10)

โรคไตเป็นกลุ่มอาการของไตที่พบบ่อยที่สุดในวัยเด็ก การจำแนกทางเนื้อเยื่อวิทยาคือการเปลี่ยนแปลงของไตน้อยที่สุด glomerulosclerosis ในปล้องโฟกัสและเส้นโลหิตตีบ mesangial กระจายและตามขอบเขตของการตอบสนองต่อเตียรอยด์จัดเป็นกลุ่มโรคไตที่มีความอ่อนไหวและดื้อต่อ (11) .

ผลกระทบของ cistanche: ต่อต้านการอักเสบ

การกลายพันธุ์ของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) พบได้บ่อยในเด็กที่เป็นโรคไตที่ดื้อต่อสเตียรอยด์ ซึ่งเป็นโรคที่พบได้ยากซึ่งส่งผลต่อ 10-15 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยโรคไต (12,13) ประมาณร้อยละ 80 ของเด็กที่เป็นโรคไตเป็นระยะๆ ตอบสนองต่อการรักษาด้วยสเตียรอยด์ อย่างไรก็ตาม ไม่พบการกลายพันธุ์ใน WT1 (เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ในการศึกษากลุ่มใหญ่(14) การลดการแสดงออกของกลุ่มอาการเนโฟรติกที่ดื้อต่อสเตียรอยด์และในระดับที่น้อยกว่าในผู้ป่วยโรคไตที่ไวต่อสเตียรอยด์(15) ในรูปแบบหนูของการอักเสบทั่วร่างกายที่เกิดจากไลโปโพลีแซคคาไรด์ (LPS) 24 ชั่วโมงหลังการบริหารให้ LPS, WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ถูกย้ายไปยังไซโทพลาสซึมและสัมพันธ์กับการลดลงของการแสดงออกของเนฟริน ซึ่งเป็นองค์ประกอบสำคัญสำหรับการรักษาไดอะแฟรมแบบผ่าในพอดไซต์และจำเป็นสำหรับการกรองไตที่ถูกต้อง ดังนั้นจึงแสดง WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ทำหน้าที่เป็นปัจจัยการถอดรหัสสำหรับการควบคุมยีนเนฟรินที่เพิ่มขึ้น (16)

ในเซลล์มะเร็งปอด A459 ที่รักษาด้วย tumor necrosis factor-alpha (TNFa) การโยกย้ายของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) มีการสังเกตโปรตีนต่อไซโตพลาสซึม ซึ่งบ่งชี้ว่าสิ่งเร้าการอักเสบสามารถเปลี่ยนแปลงการแปลตำแหน่งภายในเซลล์และหน้าที่การถอดรหัส (17) ฟอสฟอรีเลชั่นอาจมีบทบาทในการปรับกิจกรรมการกำกับดูแลการถอดรหัสของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ผ่านการรบกวนการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ รวมถึงการยับยั้ง WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) การจับดีเอ็นเอ(18)โดยฟอสโฟรีเลชั่นที่อาศัยโปรตีนไคเนสที่อาศัย cAMP ของ Ser-365 และ Ser-393 ในโดเมนซิงค์ฟิงเกอร์ (19)

แบคทีเรียเป็นผลมาจากการตอบสนองต่อการอักเสบอย่างเป็นระบบและมีลักษณะเฉพาะโดยการปล่อยไซโตไคน์ทั้งโปรและต้านการอักเสบที่เกิดจากการติดเชื้อ อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันเป็นเรื่องปกติในผู้ป่วยวิกฤตเมื่อมีการอักเสบเฉียบพลันและมีความเชื่อมโยงอย่างมากต่อการลุกลามของความเสียหายของไตเรื้อรัง (20,21) มีหลักฐานว่าการอักเสบมีบทบาทสำคัญในการทำลายอวัยวะต่างๆ ได้แก่ไต(22) ในงานนี้ เราประเมินผลของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบต่อการปรับ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) การแสดงออกและการโยกย้ายไปยังไซโตพลาสซึม

ประโยชน์ของ cistanche tubulosa: antit-cncer และ anti-เนื้องอก

วัสดุและวิธีการ

โมเดลสัตว์. หนูเมาส์ BALB/c เพศเมีย (8-10 สัปดาห์) ได้รับมาจากฮาร์แลนด์เม็กซิโก(เม็กซิโกซิตี้ เม็กซิโก) หนูถูกขังอยู่ในกรงภายใต้อุณหภูมิห้องควบคุม ความชื้น และแสง (วัฏจักรแสง-มืด 12/12 ชม.) ด้วยน้ำและอาหาร libitum.LPS ของ Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mexico) และหนูตัวเดียว การฉีด LPS ถูกบริหารให้ที่ขนาดยา 8 มก./กก. ในช่องท้อง (16); ใช้น้ำเกลือเพื่อควบคุมหนูที่ไม่ผ่านการบำบัด หนูถูกสังเวยด้วยการฉีดสารละลายโซเดียม เพนโทบาร์บิทัล 200 มก./กก. ในช่องท้อง ที่ 12,24,36,48 และ 72 ชม. โดยมี n=5 ในแต่ละช่วงเวลา จากนั้นไตเก็บเนื้อเยื่อและเลือด เก็บปัสสาวะก่อนนำไปสังเวยสัตว์

หนูสองตัวสำหรับไตฉีด LPS 1 มก./กก. ทุก 2 วัน เพื่อกระตุ้นให้เกิดโรคเรื้อรังไต บาดเจ็บเป็นตัวควบคุมเชิงบวก (21) การทดลองทั้งหมดดำเนินการตามการอนุมัติล่วงหน้าจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของคณะวิทยาศาสตร์ชีวภาพ (CEIBA-2016-034)

ไตคำอธิบาย จากไตของหนู BALB/c ชิ้นเนื้อเยื่อหนา 250-300 um ถูกเตรียมด้วยเครื่องตัดเนื้อเยื่อ Krumdieck (การวิจัยและพัฒนา Alabama, Munford, AL, USA) ที่ 4 องศาโดยมีบัฟเฟอร์ไหลคงที่ของ Krebs Henseleit bicarbonate (KB) ที่ถูกเติมอากาศด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ชิ้นที่เก็บเกี่ยวในบัฟเฟอร์ KB ที่ 4 องศาดีกรีไตเอ็กซ์แพลนท์ถูกเคลือบในเพลท 12-หลุมที่มีสื่อ/F12 ดัดแปลงของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์และสารต้านเชื้อราและยาปฏิชีวนะ 5 เปอร์เซ็นต์ และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส โดยมี CO 5 เปอร์เซ็นต์ และกวนผสมที่ 25 รอบต่อนาที สิ่งสกัดถูกบำบัดด้วย TNFa(R& D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml ของ interleukin 1 (IL1 ; R & D Systems) และ 100 ng/ml ของ LPS และวิเคราะห์ที่ 6, 12 และ 24 ชั่วโมงต่อมา

โปรตีนในปัสสาวะ เก็บตัวอย่างปัสสาวะในแต่ละช่วงเวลาข้างต้น วัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบ DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) และประเมินอัลบูมินูเรียโดยใช้โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส และอิงตามขนาดวงของเซรั่มอัลบูมินในวัว (16)

โปรอักเสบไซโตไคน์ ระดับของ IL6, IL1 และ TNFa ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์แซนวิช (PeproTech, เม็กซิโกซิตี้, เม็กซิโก)

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณ (qPCR) RNA ทั้งหมดแยกได้จากเนื้อเยื่อไตโดยใช้ Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต cDNA แบบสายเดี่ยวถูกสังเคราะห์โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยใช้ High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) กับการทดสอบการแสดงออกของยีน TaqMan การทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์เปรียบเทียบถูกดำเนินการสำหรับแต่ละตัวอย่างในสามเท่า ไพรเมอร์สำหรับ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ถูกส่งต่อ:5-TCTGCGGG AGCCCAATACAG-3'; ย้อนกลับ:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3'; และโพรบ FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ; โปรโตคอลดำเนินการ 95 องศาเป็นเวลา 10 นาที 40 รอบที่ 94 องศา เป็นเวลา 30 วินาที และ 64 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที นิพจน์สัมพัทธ์ของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) คำนวณยีนโดยใช้สมการ 2-AACT(23) กับยีน glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Applied Biosystems) ที่ใช้เพื่อทำให้เป็นมาตรฐาน

สารสกัด cistanche รักษาโรคไต

การแสดงออกของ nephrin mRNA ถูกกำหนดด้วย cDNA 3 ไมโครกรัมและไพรเมอร์ต่อไปนี้: ไปข้างหน้า: 5'-CCCCAACATCG ACTCACTT-3'และย้อนกลับ:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'ที่ 94 องศาเป็นเวลา 30 วินาที,60 องศาองศาเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาทีเป็นเวลา 30 รอบ (372 bp) (16) สำหรับนิพจน์ของ GAPDH ไพรเมอร์ที่ใช้คือ: Forward:5'-ACCACAGTCATGCCATCAC-3',reverse:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3' โดยมีเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาต่อไปนี้: 94 องศาสำหรับ 40 วินาที, 60 องศาสำหรับ 30 วินาที และ 72 องศาสำหรับ 40 วินาทีสำหรับ 35 รอบ (452 ​​bp) การแสดงออกของ WT1 (เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน): ไปข้างหน้า 5'-CACATGAGAGAGAGAGCCCCTTCATGTG-3', ย้อนกลับ 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'ที่ 94 องศาเป็นเวลา 40 วินาที, 64 องศาเป็นเวลา 30 วินาที และ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาที สำหรับ 35 รอบ (160 bp) การแสดงออกของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) isoforms KTS±และ 17 AA±(F2-R2 primers เพื่อตรวจจับ 17 AA plus /-and F3-R3 เพื่อตรวจจับ KTS plus /-splicing isoforms) ดำเนินการโดย PCR ทั่วไปตาม Oji et .al.(24). การกำหนดการแสดงออกของ -actin ดำเนินการตาม Lauxet al (25). สังเกตผลิตภัณฑ์โดยใช้โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับ KTS±isoform และเจล agarose 2 เปอร์เซ็นต์สำหรับ 17AA±isoform

อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ดิไตจากหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย LPS และกลุ่มควบคุมได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์และผ่านกรรมวิธีสำหรับการย้อมสีฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน อิมมูโนฮิสโตเคมี และอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

เพื่อกำหนดตำแหน่งของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ในหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย LPS,{{0}}ส่วนเนื้อเยื่อไตที่มีความหนา um ที่ถูกติดบนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ถูกนำมาใช้ ตัวอย่างถูกล้างให้สะอาด ซึมผ่านด้วยไทรทัน X-100 [ไทรทัน 0.1 เปอร์เซ็นต์ที่มีโซเดียมซิเตรต 1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS)] และล้างด้วย PBS สามครั้ง เนื้อเยื่อถูกปิดกั้นด้วยซีรั่มโคนมของทารกในครรภ์ 20 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เป็นเวลา 30 นาทีและฟักที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืนด้วยโมโนโคลนัลแอนติบอดีต่อ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)เจือจาง 1:100 ในซีรัมของวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ใน PBS หลังจากการล้างด้วย PBS การมีอยู่ของแอนติบอดีที่ถูกผูกไว้ถูกระบุโดยการย้อมสีด้วย IgG Texas Red sc ที่ต้านหนูเมาส์ของแพะ-2979(เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ) สไลด์ทาทับด้วย 4',6-diamidino-2-phenylindole สุดท้าย สไลด์ได้รับการติดตั้งและตรวจสอบในเชิงคุณภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Olympus BX61W1 โดยมีวัตถุประสงค์ในการแช่น้ำ 40x และซอฟต์แวร์ Fluoview 4.0a (Olympus, Tokyo, Japan)

อิมมูโนฮิสโตเคมี เพื่อกำหนดฟอสโฟรีเลต (p)-WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ในพอดไซต์จากหนูเมาส์ที่ได้รับการบำบัดด้วย LPS โพลีโคลนัลแอนติบอดีจนถึง p-WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ใช้ซีรีน 393,sc-12933 และ 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA） สไลด์ที่มีส่วน 4-μm ของเนื้อเยื่อไตถูกล้างและซึมผ่าน อิมมูโนฮิสโตเคมีดำเนินการโดยใช้ Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต สไลด์ถูกตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่มีวัตถุประสงค์ในการแช่น้ำมัน 100 เท่า (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Germany) .

หยดตะวันตก โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกด้วย 200 ul ของบัฟเฟอร์ lysis (ไทรตัน 1 เปอร์เซ็นต์, NaCl 150 มิลลิโมลาร์, 25 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl pH 7.6) และความเข้มข้นถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบ DC โปรตีน (Bio-Rad) แยกโปรตีน (50 ไมโครกรัม) โดยใช้โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส 12 เปอร์เซ็นต์ และวิเคราะห์โดยเวสเทิร์นบล็อตติงด้วย WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) [F6] แอนติบอดี sc-7585(เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ) ตัวอย่างถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้แอนติ-GAPDH(AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA) โปรตีนถูกแสดงภาพโดยใช้ Lumi-Light Western Blotting system sc-2048(เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ)

ประโยชน์ของ cistanche: ปกป้องไต

ผลลัพธ์

การเหนี่ยวนำของไตความเสียหายในหนู BALB/c โดย LPS เป็นที่ทราบกันดีว่าการบาดเจ็บของ podocyte นั้นสัมพันธ์กับการเพิ่มโปรตีนในปัสสาวะ กำหนดอัลบูมินและโปรตีนทั้งหมดในปัสสาวะโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโตรโฟรีซิสและชุดทดสอบ DC โปรตีน (Bio-Rad) มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p=0001) ของอัลบูมินในปัสสาวะ 12 ชั่วโมงหลังการรักษาด้วย LPS โดยเพิ่มขึ้นสูงสุดที่ 24 ชั่วโมง(215.87±1.41 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (15.53) ±5.0 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) (รูปที่ 1A) สังเกตความเข้มข้นของโปรตีนในปัสสาวะทั้งหมดจนถึงจุดสูงสุดที่ 36 ชั่วโมง(26.02±2.43 มก./มล.) และสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (p=0.01) ดังแสดงในรูปที่ 1 ความเสียหายของไตที่เกิดจาก LPS ถูกวิเคราะห์โดยเนื้อเยื่อวิทยา ที่ 24 ชั่วโมงหลังการรักษา glomerulonephritis โฟกัสพบในเนื้อเยื่อไตโดยพบความเสียหายมากที่สุดที่ 36 ชั่วโมง เพิ่มขนาดของโกลเมอรูลัสด้วย mesangial การเพิ่มจำนวนเซลล์ เมื่อผ่านไป 48 ชั่วโมง โกลเมอรูลัสจะค่อยๆ ฟื้นตัวจนกระทั่ง 72 ชั่วโมง ดังแสดงในรูปที่ 1C

รูปที่ 1 ผลของการอักเสบของระบบต่อไตความเข้มข้นของอัลบูมินในปัสสาวะ (A) และโปรตีนในปัสสาวะ (B) เป็นเครื่องหมายของความเสียหายของไตในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ C: ภาพตัวแทนของเนื้อเยื่อวิทยาไตของหนูเมาส์ (การย้อมสีฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน) ในช่วงเวลาต่างๆ (12,24,36,48 และ 72 ชั่วโมง) หลังการฉีดไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ โดยเปรียบเทียบแบบจำลองของการอักเสบเรื้อรัง กำลังขยาย 100 เท่า แตกต่างอย่างเห็นได้ชัดที่: *n<><0,0]><0.00>

การผลิตไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ TNFa และ IL1 ในซีรัมจากหนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS เพื่อยืนยันความเสียหายของไตเกิดขึ้นโดย LPS ระดับไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบถูกวัดโดยการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ การเพิ่มขึ้นของ TNFa และ I1 สังเกตพบหลังจาก 12 ชั่วโมง(3.6±0.9 ng/ml, 11.9±5ng/ml) และสูงถึง 36h(4.44±0.1 ng/ml,18 ±0.9 ng/ml ตามลำดับ)ของการบำบัดด้วย LPS ซึ่งเริ่มลดลงหลังจากนั้น (รูปที่ 2A และ B) การแสดงออกของ IL6 เพิ่มขึ้นที่ 12 ชั่วโมง(49.5 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) และ 36 ชั่วโมง(23.5 นาโนกรัม/มิลลิลิตร)หลังการบำบัด, ซึ่งสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2C)

รูปที่ 2 ระยะเวลาของระดับของโปรอักเสบไซโตไคน์เนื้องอกเนื้อร้าย factor-alpha(TNFa)(A), อินเตอร์ลิวคิน 1 (LL1 )(B) และ IL6(C) ในซีรัมจากหนูเมาส์หลังการบริหารให้ไลโปโพลีแซคคาไรด์ในช่องท้อง แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่: *p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05,**p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.01 และ ***p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001 .

การแสดงออกของยีน WTI ในเนื้อเยื่อไตจากหนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS เพื่อที่จะตอบคำถามสำคัญของเราว่า WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ถูกมอดูเลตโดยกระบวนการอักเสบ และสิ่งนี้มีผลกับไต การแสดงออกทั้งหมดของ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) ตรวจหายีนในตัวอย่างไตจากหนูที่มีการอักเสบทั่วร่างกายในช่วงเวลาต่างๆ ของการอักเสบ WT1(เนื้องอกของ Wilm-1 ยีน) mRNA ต่ำกว่าตลอดเวลาที่วิเคราะห์โดยเทียบกับกลุ่มควบคุม โดยมีการแสดงออกสัมพัทธ์ต่ำสุดที่ 36 ชั่วโมงและสูงสุดที่ 12 ชั่วโมงหลังจากการเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบทั่วร่างกายดังแสดงในรูปที่ 3A นอกจากนี้ ได้มีการพิจารณาว่าการรักษาด้วย LPs ทำให้เกิดการดัดแปลงการแสดงออกของ exon5 (17 AA±) ของไอโซฟอร์มและ KTS±ของ WTI โดย PCR ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าไม่มีการควบคุมการแสดงออกของไอโซฟอร์มเหล่านี้เนื่องจากพฤติกรรมเดียวกันถูกสังเกตพบในกลุ่มควบคุมโดยไม่มีการบำบัดตลอดกระบวนการอักเสบทั่วร่างกายที่เหนี่ยวนำโดย LPS (รูปที่ 3B) โปรตีน WT1 แสดงให้เห็นโดยการบล็อทแบบตะวันตกลดลงตลอดกระบวนการอักเสบ โดยมีการฟื้นตัวเล็กน้อยที่ 36 ชั่วโมงหลังการรักษา อย่างไรก็ตาม ปริมาณของ WT1 น้อยกว่ากลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 3C และ D)

รูปที่ 3 ผลของ lipopolysaccharide (LPS) ต่อการแสดงออกของยีน Wilms'tumor I (WT1) ในเนื้อเยื่อไตจากหนูที่มีการอักเสบอย่างเป็นระบบA: การแสดงออกสัมพัทธ์ของ WTI mRNA.B: การแสดงออกสัมพัทธ์ของไอโซฟอร์ม KTS±และ 17IAA±ของ WT1.C: ระดับของโปรตีน WTI โดยการสร้างภูมิคุ้มกันบกพร่องหลังการรักษาด้วย LPS และ D: ความหนาแน่นของอิมมูโนบล็อตติงสำหรับ WT1 แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญที่:**p น้อยลง มากกว่าหรือเท่ากับ 0.01 และ ***p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001

ฟอสฟอรีเลชันและการแปล WTI ในการตรวจชิ้นเนื้อไตของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS เหตุการณ์สำคัญในการปรับโปรตีน WTI หลังการแปลคือฟอสโฟรีเลชั่นของกรดอะมิโน 393 ซึ่งชักนำการเคลื่อนตัวของโปรตีนไปยังไซโตพลาสซึม กำหนดหาฟอสฟอริเลชันและโลคัลไลเซชันของ WT1 ในตัวอย่างไตจากหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย LPS ฟอสฟอรีเลชันของ WT1 ถูกวิเคราะห์โดยฮิสโตเคมี ซึ่งบ่งชี้ว่ามีฟอสโฟรีเลต WT1 ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ในส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อไต โดยเริ่มตั้งแต่ 12 ชั่วโมงหลังจากการชักนำให้เกิดการอักเสบทั่วร่างกายและคงไว้จนถึง 72 ชั่วโมง WT1 ถูกฟอสโฟรีเลตที่กรดอะมิโน 393 และ 363 ดังแสดงในรูปที่ 4A ตำแหน่งของโปรตีน WT1 ถูกวิเคราะห์โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ตำแหน่งของ WT1 ในพอดไซต์ในตัวอย่างไตจากหนูเมาส์ที่ได้รับการบำบัดด้วย LPS ส่วนใหญ่เป็นไซโทพลาซึม ในขณะที่ในพอดไซต์จากตัวอย่างกลุ่มควบคุม ตำแหน่งไม่ชัดเจน (รูปที่ 4B)

รูปที่ 4 ฟอสฟอรีเลชันและการแปลของ Wilms'tumor I (WTI) ในตัวอย่างไตจากหนูที่ได้รับไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ตอบ: การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับฟอสโฟรีเลต (p) -WTI แสดงการเพิ่มขึ้นของฟอสโฟรีเลตที่ซีรีน 393 และ 363 เริ่ม 12 ชั่วโมงหลังการให้ LPS (กำลังขยาย 100 เท่าบนกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง) B: การแปล WTI โดย immunofluorescence ในไต; ตัวอย่างที่แสดงการแปลตำแหน่งนิวเคลียร์เล็กน้อยของ WT1(สี่เหลี่ยม) 36 ชั่วโมงหลังการให้ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (กำลังขยาย 40 เท่าบนกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล)DAP1:4,6-Diamidino-2-phenylindole

การปรับการแสดงออกของ WTI และเนฟรินในไตจากหนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS ตำแหน่ง WT1 ในเซลล์มีอิทธิพลต่อกิจกรรมทางชีวภาพ มีรายงานว่า cytoplasmic WT1 ไม่ได้ดำเนินกิจกรรมการถอดรหัส ด้วยเหตุนี้ การแสดงออกของ WT1 และ nephrin mRNA จึงถูกวิเคราะห์โดย PCR ในตัวอย่างไตจากหนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS (รูปที่ 5A)PCR บ่งชี้ว่า nephrin mRNA ลดลงจาก 24 เป็น 48 ชั่วโมง โดยเพิ่มขึ้นที่ 72 ชั่วโมง (รูปที่ 5B) ) ในขณะที่การแสดงออกของ WTI mRNA เพิ่มขึ้นที่ 12 ชั่วโมงและหลังจากนั้นลดลงในช่วงเวลาวิกฤตของการอักเสบและความเสียหายของไต (24 และ 36 ชั่วโมง) และ (รูปที่ 5B)

รูปที่ 5. การวิเคราะห์การแสดงออกของ nephrin (NPHS1) และ Wilms'tumor 1(WT1) mRNAตอบ: ในการวิเคราะห์การแสดงออกของ mRNA NPHSI และ WTI ลดลงที่ 24,36 และ 48 ชั่วโมงหลังจากการเหนี่ยวนำการอักเสบทั่วร่างกายโดยใช้ไลโปโพลีแซคคาไรด์ B: การหาปริมาณของแถบที่แสดงใน A โดย densitometry และทำให้เป็นมาตรฐานโดยการแสดงออกถึง glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

การปลูกถ่ายไตที่รักษาด้วย TNFa และ IL1 จะปรับการแสดงออกของ WTI และ nephrin เพื่อตรวจสอบว่าไซโตไคน์ปรับการแสดงออกของ WT1 หรือไม่ การปลูกถ่ายไตได้รับการเพาะเลี้ยงและบำบัดด้วยไซโตไคน์ TNFa และ IL1 เป็นเวลา 6,12 และ 24 ชั่วโมงเพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของ WT1 และเนฟรินโดย PCR การแสดงออกของ Nephrin mRNA ลดลงและการแสดงออกของ WTI mRNA เพิ่มขึ้นที่ 24 ชั่วโมงในการกำจัดไตที่บำบัดด้วย TNFa และ ILlb (รูปที่ 6)

รูปที่ 6 การวิเคราะห์การแสดงออกของ nephrin (NPHS1) และ Wilms'tumor 1 (WT1) mRNA ในการตรวจไตตอบ: ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ NPHSi และ WTI ในช่วงเวลาต่างๆ ในการตรวจไตที่สัมผัส 10 ng/ml ของ tumor necrosis factor-alpha (TNF ) และ 20 nglml ของ interleukin 16 (IL16)B: การแสดงออกสัมพัทธ์ที่ได้รับโดยใช้การวิเคราะห์ densitometric ของ ผลิตภัณฑ์สัญญาณ แถบถูกหาปริมาณโดยการทำให้เป็นมาตรฐานเป็นกลีซาลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส

การโลคัลไลซ์เซชั่นของ WTI ในการปลูกถ่ายไตโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ เพื่อตรวจสอบว่า TNFa และ IL มีส่วนรับผิดชอบต่อการเปลี่ยนแปลงในการแปลตำแหน่งโปรตีน WT1 หรือไม่ การปลูกถ่ายไตของหนูเมาส์ถูกบำบัดด้วย TNFa และ L1 และ LPS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ใน explants ที่รักษาด้วย ILlb และ LPS พบว่าการแปลนิวเคลียส/ไซโตพลาสซึมของโปรตีน WTl นั้นชัดเจน และใน explants ที่บำบัดด้วย TNFa พบว่าการโลคัลไลเซชันของโปรตีน WT1 ของไซโตพลาสซึมถูกสังเกตพบ ในขณะเดียวกัน ในการควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัด ส่วนใหญ่พบการโลคัลไลเซชันนิวเคลียร์ของ WT1 (รูปที่ 7)

รูปที่ 7 การแปลตำแหน่งของโปรตีน Wilms'tumor 1(WTI) โดย immunofluorescence โดยใช้ Red TX (WT1) และ 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(นิวเคลียส) ในพอดไซต์จากการปลูกถ่ายไตที่บำบัด ด้วย l0 ng/ml ของ tumor necrosis factor-alpha (TNFa), 20 ng/ml ของ interleukin 16(L1B) และ lipopolysaccharide (LPS)การโลคัลไลซ์เซชั่นนิวเคลียร์ของ WTas ที่ลดลงที่แสดงในสิ่งปลูกถ่ายที่บำบัดด้วย TNFa เมื่อเทียบกับการโลคัลไลเซชันนิวเคลียร์/ไซโตพลาสซึมของ WTI ภายใต้การบำบัดด้วย IL1 และ LPS กำลังขยาย 40×.

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅱ