ส่วนที่หนึ่งฟีนิลเอทานอลไกลโคไซด์ปกป้องยั่วยวนของกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เกิดจากการหดตัวของหลอดเลือดในช่องท้องผ่านการยับยั้ง DEmethylation ของ ECE-1 และการเพิ่มประสิทธิภาพทางเดิน PI3K / PKB / eNOS

ติดต่อ : ออเดรย์ Hu Whatsapp / hp : 0086 13880143964 อีเมล์ :audrey.hu@wecistanche.com

ฉงหลิงฟาน,1 เจียเหว่ยหวายหวาง,1 ซือเล่ยจาง, &

ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์ (CPhGs)เป็นพื้นฐานวัสดุหลักของกิจกรรมทางเภสัชวิทยาในCistanche tubulosaและมีผลทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย อย่างไรก็ตาม ยังไม่ชัดเจนว่า CPhGs หรือไม่(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) มีผล ameliorative ต่อความดันเกินพิกัดที่เกิดจากกล้ามเนื้อหัวใจยั่วยวน ในการศึกษานี้หนู SD เพศชายที่มีน้ําหนัก (200 ± 20) กรัมได้รับการจัดตั้งขึ้นแบบจําลองหัวใจยั่วยวนโดย coarctation หลอดเลือดในช่องท้อง (AAC) หลังการผ่าตัดหนูถูก gavaged กับยาที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 6 สัปดาห์ (CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) 125, 250, และ 500 มก./กก./วัน และวาลซาร์ตัน 8.3 มก./กก./วัน) Echocardiography, ดัชนีน้ําหนักหัวใจ (HWI), พื้นที่หน้าตัดของ cardiomyocytes (CSCA), พื้นที่พังผืด, พลาสมาเอนโดเธลิน 1 (ET-1) และระดับปัจจัย proinflammatory ถูกตรวจพบ ผลการวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่า CPhGs ที่แตกต่างกัน(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์)ปริมาณลดลงความหนาของผนังหลังกระเป๋าหน้าท้องซ้าย (LVPWT), เส้นผ่านศูนย์กลางปลาย diastolic หัวใจห้องล่างซ้าย (LVED), HWI, CSCA, พื้นที่พังผืด, ET-1, ปัจจัย proinflammatory, เปปไทด์ natriuretic หลอดเลือดแดง (ANP), เปปไทด์ natriuretic สมอง (BNP), เอนไซม์แปลงเอนโดเธลิน 1 (ECE-1) ระดับ mRNA, cyclooxygenase 2 (COX-2), กล่องกลุ่มการเคลื่อนไหวสูง 1 (HMGB-1) ระดับโปรตีนและระดับ ECE-1 demethylation ในขณะที่เพิ่มเศษส่วนการขับออกของกระเป๋าหน้าท้องด้านซ้าย (LVEF), การย่อเศษส่วนกระเป๋าหน้าท้องซ้าย (LVFS), ฟอสฟาติดิเลตฟอสฟาติดิลไลโนซิทอล 3-ไคเนส (p-PI3K), โปรตีนฟอสโฟรีเลตไคเนส B (p-PKB) และฟอสฟอริเลตเอ็นโดเธเลียลไนตริกออกไซด์ซินเทเทส (p-eNOS) -e ดัชนีของ CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) กลุ่ม 250 และ 500 มก./กก. แตกต่างจากกลุ่ม AAC อย่างมาก เมื่อเทียบกับกลุ่ม valsartan (AV) ดัชนีของกลุ่ม CPhGs 500 mg/kg ไม่ได้แตกต่างกันอย่างมีนัยสําคัญ สรุปได้ว่า CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) หนูยั่วยวนกล้ามเนื้อหัวใจ ameliorated โดย AAC ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้ง ECE- 1 demethylation และการเพิ่มประสิทธิภาพ PI3K / PKB / eNOS

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.สัตว์

หนู SPF SD ตัวผู้ 70 ตัวมีน้ําหนัก 200 ± 20 กรัม (10 ตัวต่อกลุ่ม) จัดทําโดยศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (อุรุมชี ประเทศจีน) หมายเลขใบอนุญาตการผลิตสัตว์คือ SYXK(XIN)2016-0003 และหมายเลขใบรับรองคือ SCXK(XIN)2016-002 -e study ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ของโรงพยาบาลแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (หมายเลขอนุมัติ 20180223-183) -ey ได้รับการบํารุงรักษาด้วยการเข้าถึงน้ําและอาหารฟรีในกรงพลาสติกและเก็บไว้ในวงจรแสง / มืด 12 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 22 ± 2 ° C และความชื้น 45-55% ในศูนย์สัตว์ทดลองของเรา

2.2 วัสดุ

CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) ซึ่งมีเนื้อหาของ echinacea มากกว่า 40% และแอคทีโอไซด์มากกว่า 16% ซื้อจาก Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan ซื้อจากปักกิ่ง Novartis Pharma Co., Ltd. Carboxymethylcellulose sodium (CMC-Na) จัดหาโดย Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. และ CPhG ถูกยุบใน 0.5% CMC-Na

ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche

2.3 การบีบตัวของหลอดเลือดในช่องท้อง (AAC)

หลังจากถูกดมยาสลบด้วยโซเดียมเพนโทบาร์บิทัล 2.5% (2.5 มล./กก.) (เมอร์ค, ดาร์มสตัดท์ซิตี้, เฮสเซิน, เยอรมนี) หนูถูกโกนและอุ่นบนแผ่นความร้อน - en ช่องท้องของหนูถูกเปิดออกเป็นเวลา 2 ซม. ตรงกลางของช่องท้องในสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้ออวัยวะภายในหน้าท้องถูกผลักไปทางด้านขวาและหลอดเลือดแดงใหญ่ในช่องท้องถูกสัมผัสอย่างเต็มที่ที่ 0.5 ซม. เหนือหลอดเลือดแดงไตขวา เข็มหมายเลข 8 ถูกลิเกตด้วยลวดหมายเลข 2 ขนานกับช่องท้องที่กําลังเย็บ [18] หลอดเลือดแดงใหญ่ในช่องท้องของหนูในกลุ่มหลอกถูกแยกออกจากกันโดยไม่มีการโกหกและไม่มีกลุ่มควบคุมสําหรับการผ่าตัด -e วันหลังการผ่าตัด AC 125 มก. / กก., AC 250 มก. / กก. และ AC 500 มก. / กก. ถูกป้อนด้วย CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche)โดย gavage; กลุ่ม AV ถูกเลี้ยงด้วย valsartan โดย gavage; กลุ่ม AAC และกลุ่มหลอกลวงไม่ได้รับการเลี้ยงดูด้วย CPhGs หรือ valsartan วันละครั้งเป็นเวลา 42 วันติดต่อกัน ปริมาณยาถูกกําหนดขึ้นบนพื้นฐานของการอ้างอิงก่อนหน้านี้และการทดลองเบื้องต้น [8]

2.4. เอคโคคาร์ดิโอกราฟี

หกสัปดาห์หลังจาก AAC หนูถูกดมยาสลบด้วยโซเดียม pentobarbital 2.5% และทํา echocardiography (Philips HD11 XE, อัมสเตอร์ดัม, เนเธอร์แลนด์) LVPWT, LVED, LVEF และ LVFS ถูกวัดสี่ครั้งเพื่อคํานวณค่าเฉลี่ยเป็นตัวบ่งชี้สุดท้าย

2.5. ดัชนีฮาร์ทเวท (HWI)

หลังจาก echocardiography หนูถูกประหารชีวิตโดยการเก็บเลือดจากหลอดเลือดแดงใหญ่ในช่องท้อง -e หัวใจของหนูถูกนําออกจากหน้าอกและชั่งน้ําหนักหลังจากถูกล้างด้วยน้ําเกลือปกติ (4 ° C) 3 ครั้งและระบายด้วยกระดาษกรองที่สะอาด -e HWI คํานวณผ่านสูตรต่อไปนี้: น้ําหนักตัวของน้ําหนักตัวหัวใจ HWI (1)

2.6. การย้อมสีเฮมาทอกซีลิน-อีโอซินและแมสซอน

-e myocardium จากกระเป๋าหน้าท้องด้านซ้ายได้รับการแก้ไขโดย 4% paraformaldehyde ฝังอยู่ในพาราฟินตัดขวางที่มีความหนาของส่วน 4 μm แห้งในเตาอบที่ 60 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงแล้วย้อมด้วย hematoxylin-eosin หรือ Masson (Solaibio, ปักกิ่ง, จีน) -e โครงสร้างของกล้ามเนื้อหัวใจถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์เฟสคอนทราสต์กลับหัว (Leica, แฟรงค์เฟิร์ต, เยอรมนี) ซอฟต์แวร์ Image J ถูกใช้ในการคํานวณ CSAC และพื้นที่พังผืด

2.7. การทดสอบตัวดูดซับภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA)

เลือดเอออร์ติกในช่องท้องถูกสกัดจากหนูและวางไว้ในท่อต้านการแข็งตัวของเลือดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องแล้วหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็ว 3000 รอบ / นาที -e supernatant ถูกดูดซึมด้วยปิเปต (Eppendorf, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี) และเก็บไว้ที่ 80 ° C สําหรับการทดสอบ พลาสมา ET-1, interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), ปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอกαการแพทย์เสริมและการแพทย์ทางเลือกตามหลักฐาน

(TNF-α) (Bioss, ปักกิ่ง, จีน) และ cyclooxygenase 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, China) ระดับหนูถูกตรวจพบตามคําแนะนําของชุด ELISA

2.8. PCR เฉพาะเมทิลเลชั่น

ดีเอ็นเอถูกสกัดจากเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจห้องล่างซ้ายของหนูโดยชุดสกัดดีเอ็นเอ (Tiangen Biotech, ปักกิ่ง, จีน) ค่าการดูดซับ -e (ค่า A) เท่ากับ OD260/OD280 (1.8∼1.9) ดีเอ็นเอจีโนม 20 ไมโครลิตร (500 pg-1 μg) ถูกดัดแปลงด้วยกรดซัลฟิวริกโดย Methylation-Gold Kit (ZYMO, ออเรนจ์เคาน์ตี้, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) -e MSP ระบบปฏิกิริยาคือ 25 μL ซึ่งรวมถึงเทมเพลตดีเอ็นเอดัดแปลงซัลไฟต์ 3.0 μL, 2.5 μL ของบัฟเฟอร์ 10 ×, 2.5 μL ของ dNTPs 2.5 มม., ไพรเมอร์ 1.0 μL ของไพรเมอร์ 10 μm, 0.1 μL ของ Hotstar Taq DNA polymerase (TAKARA Biotechnology) และ 14.9 μL ของ ddH2O -ere มีทั้งหมด 45 รอบ: การเสื่อมสภาพที่ 95 ° C การหลอมที่ 55 ° C และการขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที หลังจาก PCR ผลิตภัณฑ์ 5 μL ถูกคั่นด้วยอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลอะกาโรส 2% -e DNA ได้รับการรักษาโดย M. Sssl methyltransferase (นิวอิงแลนด์ไบโอแล็บส์, อิปสวิช, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกของเมทิลเลชั่น และดีเอ็นเอของกลุ่มควบคุมปกติถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกของดีเมทิลเลชัน ในที่สุดเจล agarose ก็ถูกถ่ายภาพและวิเคราะห์โดยระบบถ่ายภาพเจล Bio-Rad -e ระดับ demethylation คํานวณผ่านสูตรต่อไปนี้:

ไพรเมอร์ทั้งหมดที่ออกแบบใน Methprimer (ระบบชีวภาพประยุกต์, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) และสังเคราะห์โดย Sangon Biotech (เซี่ยงไฮ้, จีน) อยู่ในตารางที่ 1

2.10. บลอตตะวันตก

โปรตีนถูกสกัดจากกล้ามเนื้อหัวใจห้องล่างซ้ายด้วย Ripa Buffffer (วิทยาศาสตร์) และเพิ่มสารยับยั้งโปรตีเอส ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกําหนดโดยวิธี BCA (Solarbio, ปักกิ่ง, จีน) โปรตีนถูกถ่ายที่ 50 ไมโครกรัมและเสียสภาพที่ 100 ° C เป็นเวลา 5 นาที โปรตีนถูกคั่นด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE, Beyotime, เซี่ยงไฮ้, จีน) แล้วถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) โดยอุปกรณ์อิเล็กโทรฟอเรติก (Bio-Rad, CA, USA) หลังจากถูกปิดกั้นด้วย BSA 3% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน PI3K, แอนติบอดี antiphospho-PI3K, แอนติบอดี antieNOS, anti-phospho-eNOS (1:1000, Bioss, ปักกิ่ง, จีน), แอนติบอดีต่อต้าน COX-2, แอนติบอดีต่อต้าน HMGB-1 (1: 1000, โปรตีนเทค, ชิคาโก, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) และแอนติบอดีต่อต้าน ECE-1 (1: 2000, Signalway Antibody, College Park, MD, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ° C วันรุ่งขึ้นหลังจากล้างด้วย TBST 3 ครั้งเยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วย IgG ป้องกันกระต่ายแพะที่มีฉลาก HRP (1: 25000, 1 ชั่วโมง, จงซานจินเฉียว, เซี่ยงไฮ้, จีน) ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากถูกล้างด้วย TBST 3 ครั้ง เยื่อหุ้มเซลล์ถูกมองเห็นโดย Pierce™ ECL Western Blotting Substrate และถ่ายภาพโดยใช้ FluorChem Imaging System (Protein Simple, USA) ซึ่งถูกทําให้เป็นมาตรฐานเป็น β-actin เป็นการควบคุมภายใน

ประโยชน์ของฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จากซิสตันเช่

ประโยชน์ของ cistanche

3. ผลลัพธ์

3.1. CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) ปรับปรุงการทํางานของหัวใจในหนูหลังจาก AAC

-e rats ได้รับ gavage จากวันหลังจาก AAC -e กลุ่มควบคุมเชิงบวก (AV) ได้รับ gavage ด้วย valsartan 8.3 mg/kg/d และกลุ่ม CPhGs (AC) ได้รับ gavage ด้วย CPhGs 125, 250 และ 500 mg/kg/d ตามลําดับ หลังจากการใช้ยาอย่างต่อเนื่องหกสัปดาห์หนูได้ทํา echocardiography ภายใต้การดมยาสลบโซเดียมเพนโทบาร์บิทัล 2.5% หนูสองตัวเสียชีวิตหลังจาก AAC: หนึ่งในกลุ่มแบบจําลองเสียชีวิตในวันที่สามหลังจาก AAC จากอาการบวมน้ําที่ปอด อีกหนึ่งใน AC 500 มก. / กก. เสียชีวิตในวันหลังการผ่าตัดสงสัยว่าเกิดจากความเครียดจากการผ่าตัด ดังแสดงในรูปที่ 2 เมื่อเทียบกับกลุ่มหลอก LVED, LVEF และ LVFS ในกลุ่ม AAC ลดลงอย่างมีนัยสําคัญ แต่ LVPWT ในกลุ่ม AAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ เมื่อเทียบกับกลุ่ม AAC แล้ว LVED, LVEF และ LVFS เพิ่มขึ้นและ LVPWT ลดลงเหลือองศาที่แตกต่างกันในแต่ละกลุ่มปริมาณ AC สําหรับ LVPWT ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สําคัญในกลุ่ม AC 125 มก. / กก. แต่พบในกลุ่ม AC 250 และ 500 มก. / กก. เมื่อเทียบกับกลุ่ม AV แล้ว LVPWT และ LVED ในกลุ่ม AC 125 มก./กก. พบว่ามีความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญ ในขณะที่ LVPWT, LVED, LVFS และ LVFS ในกลุ่ม AC 250 และ 500 มก./กก. ไม่ได้

3.2. CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) ลดพื้นที่ HWI, CSAC และพังผืดในหนูหลังจาก AAC

-en เราชั่งน้ําหนักหัวใจของหนูแต่ละตัวเพื่อคํานวณ HWI และนําเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจสําหรับการย้อมสี HE และ Masson เพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงของพื้นที่หน้าตัด (CSAC) และพื้นที่พังผืดใน cardiomyocytes ดังแสดงในรูปที่ 3(a), 3(d) และ 3(e) เมื่อเทียบกับกลุ่มหลอก น้ําหนักหัวใจ (HW) และ HWI ในกลุ่ม AAC ลดลงอย่างมาก เมื่อเทียบกับกลุ่ม AAC กลุ่ม HW และ HWI ในกลุ่ม AC250 และ 500 มก. / กก. ลดลงอย่างมีนัยสําคัญ เมื่อเทียบกับกลุ่ม AV, HW และ HWI เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญในกลุ่ม AC 125 มก./กก. แต่ไม่ได้อยู่ในกลุ่ม AC 250 และ 500 มก./กก. ในรูปที่ 3(b) และ 3(f ) เมื่อเทียบกับกลุ่มหลอกผลการย้อมสี Masson แสดงให้เห็นว่าพื้นที่พังผืดในกลุ่ม AAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ สําหรับบริเวณพังผืดพบว่ามีการลดลงอย่างมีนัยสําคัญในกลุ่ม AC 125, 250 และ 500 มก. / กก. เมื่อเทียบกับกลุ่ม AAC ในขณะที่กลุ่ม AC 125 และ 250 มก. / กก. เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญและพบว่ากลุ่ม AC 500 มก. / กก. ลดลงอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับกลุ่ม AV ในรูปที่ 3(c) และ 3(g) ผลการย้อมสี HE แสดงให้เห็นว่า CSAC ในกลุ่ม AAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับในกลุ่มหลอก เมื่อเทียบกับกลุ่ม AAC กลุ่ม CSAC ในกลุ่ม AC 250 และ 500 มก. / กก. ลดลงอย่างมีนัยสําคัญ เมื่อเทียบกับที่ในกลุ่ม AV, อย่างไรก็ตาม, CSAC ได้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญในกลุ่ม AC 125 และ 250 มก./กก., และไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญในกลุ่ม AC 500 มก./กก.

3.3. CPhGs(ฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จาก cistanche) ลดระดับ mRNA ของยีนยั่วยวนของกล้ามเนื้อหัวใจในเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจของหนูหลังจาก AAC

ANP, BNP และ myosin βโซ่หนัก (β-MHC) เป็นปัจจัยยั่วยวนหัวใจที่สําคัญ [19, 20] เราตรวจพบระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของยีนยั่วยวนหัวใจทั้งสามนี้ในเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจ ดังแสดงในรูปที่ 4 เมื่อเทียบกับกลุ่มหลอกระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ ANP, BNP และ mRNA β-MHC ในกลุ่ม AAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ อย่างไรก็ตามเมื่อเทียบกับกลุ่ม AAC ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของยีนยั่วยวนของกล้ามเนื้อหัวใจทั้งสามยีนใน AC 250 การแพทย์เสริมและการแพทย์ทางเลือกตามหลักฐาน 5

ประโยชน์ของฟีนิลทาโนอิลด์ไกลโคไซด์จากซิสตันเช่