ส่วนที่ 3: ตัวรับ Cannabinoid ประเภทที่ 2 ส่งเสริมพังผืดของไตผ่านการประสานสัญญาณ B-catenin

ติดต่อ: emily.li@wecistanche.com

Cistanche ดีต่อไต

อย่างไรก็ตามไม่ค่อยมีรายงานว่ามีความสัมพันธ์ระหว่าง CB2 และ β-catenin

CB2 เป็นสมาชิกของครอบครัว GPCR ก่อนหน้านี้เราพบว่า CB2 แสดงในเซลล์ท่อ ไฟโบรบลาสต์ และแมคโครฟาจ' CB2 ยังแสดงในโพโดไซต์และเซลล์ mesangial 3บทบาทของ CB2 ใน CKD คือ contro-versial ในอดีต แม้จะมีการปรับปรุง CB2 mRNA และ ligand 2-AG ภายนอกหลักในแบบจําลอง CKD แต่ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าตัวเอก CB2 สามารถไขลิ่มพังผืดของไตได้'ในทางตรงกันข้ามการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราระบุถึงบทบาทที่เป็นอันตรายของ CB2 ในพังผืดของไตผ่านการทดลองและการทดสอบที่น่าพิศวงทางพันธุกรรมด้วยตัวเอกผกผัน CB2 ที่เลือกได้มากขึ้น XL-001 ซึ่งเป็นตัวเอกผกผัน CB2 แบบใหม่ที่แสดงความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันที่แข็งแกร่งที่สุดกับตัวรับ CB2 ด้วยการเลือกที่ดีที่สุดเหนือ CB1 re-ceptor (2594 เท่า) และ Ki ที่ 0.5 nM หมายเหตุβ-catenin และเป้าหมายของมันถูกระงับโดยการระเหยทางพันธุกรรมหรือการยับยั้งทางเภสัชวิทยาของ CB2 ระบุว่า CB2 เป็นสมาชิกของครอบครัว GPCR CB2 สามารถปรับβ-catenin ได้ อย่างไรก็ตามสมมติฐานนี้จําเป็นต้องได้รับการตรวจสอบ ในการศึกษานี้เราแสดงให้เห็นว่า CB2 เป็นสื่อกลางในการกระตุ้นβ -catenin ผ่านคลื่นสัญญาณ GPCR

การศึกษาของเรายังยืนยันบทบาทที่เกิดขึ้นใหม่ของระบบ endocannabinoid ในพังผืดของไต จากเอนโด-แคนนาบินอยด์หลัก 2 ตัว anandamide (N-arachidonoylethanolamine) มีความสัมพันธ์ที่สูงกว่าสําหรับ CBl ในขณะที่ 2-AG มีความสัมพันธ์ที่คล้ายคลึงกันกับ CB1 และ CB2 (ความสัมพันธ์กับ CB1 สูงกว่าเล็กน้อย) ดังนั้น 2-AG จึงเป็นตัวเอกเอนโดแคนนาบินอยด์หลักสําหรับตัวรับ CB2 โดยเฉพาะอย่างยิ่งไตเยื่อหุ้มสมองแสดงระดับฐานที่สูงในทํานองเดียวกันของ anandamide และ2-AG; อย่างไรก็ตาม ระดับ 2-AG จะเพิ่มขึ้นในการอุดกั้นมากขึ้นพังผืดของที่ไตพร้อมกับการลดลงของระดับ anandamide ซึ่งส่งผลให้มีการเปิดใช้งานทั้ง CB2 และ CB1 'ของหมายเหตุบทบาทที่เป็นอันตรายของ CB2 ในการเกิดโรคของเกี่ยวกับไตพังผืดแสดงให้เห็นโดยวิธีการทางพันธุกรรมในการศึกษาล่าสุดของเรา'' และได้รับการยืนยันเพิ่มเติมในการศึกษาปัจจุบัน

แม้ว่ารายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า CB2 แสดงโดยทั้งเซลล์อักเสบและโพโดไซต์ในระดับฐานสูง 8 CB2 และลิแกนด์ภายนอกหลัก 2-AG นั้นถูกควบคุมจริง ๆ หลังจาก UUO และ IRI.7 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพังผืดของไตของหนูและไตที่หลากหลาย CB2 ส่วนใหญ่แสดงออกในเยื่อบุผิวท่อไตเช่นเดียวกับในไฟโบรบลาสต์คั่นระหว่างหน้าและเม็ดเลือดขาว (รูปที่ 2; 2) รูปเสริม S1) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของ CB2 เป็นลักษณะทางพยาธิวิทยาทั่วไปใน fibrotic kid-neys ในการศึกษาในสัตว์ของเราเราใช้การเรืองแสงในการผสมพันธุ์ในแหล่งกําเนิดของ CB2 เพื่อระบุรูปแบบการแสดงออกเนื่องจากต้นทุนต่ํา การย้อมสีพบว่า CB2 ส่วนใหญ่แสดงในเยื่อบุผิวแบบท่อ เหตุผลที่อยู่เบื้องหลังความคลาดเคลื่อนนี้อาจอยู่ที่ความไวของเทคนิคการผสมข้ามพันธุ์แบบเรืองแสงในแหล่งกําเนิดในการตรวจจับ mRNA ที่มีปริมาณมากและเวลาเปิดรับแสงสําหรับการถ่ายภาพ เราสังเกต CB2 ไม่เพียง แต่ในเยื่อหุ้มเซลล์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงบริเวณไซโตพลาสซึมแบบท่อด้วยซึ่งแนะนําตัวรับภายในช่องภายในเซลล์เช่นเอนโดโซมและไลโซโซม 6ความจําเพาะของการเรืองแสงในการทดสอบการผสมพันธุ์ในแหล่งกําเนิดได้รับการยืนยันด้วยแอนติบอดี CB2 หลักและทั้งคู่ได้รับการตรวจสอบในหนูน็อคเอาท์ CB2 (รูปที่ S1 เสริม) ที่น่าสนใจคือเราสังเกตเห็นการก่อตัวของ HETEROdimer ของ CB2 กับ CB1 ใน UUO ที่ได้รับผลกระทบไตและการเปลี่ยนแปลงเซลล์ท่อที่เกิดจากปัจจัยการเจริญเติบโตβ (รูปที่ S4 เสริม) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าผลการกระตุ้นของเซลล์เหล่านี้อาจเสริมฤทธิ์กัน อย่างไรก็ตาม นิพจน์ CB1 ไม่ได้รับผลกระทบจาก AM1241 หรือ XL-001 ซึ่งเพิ่มความซับซ้อนให้กับกลไกเพิ่มเติม ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้เกี่ยวกับผลการยับยั้งร่วมกันของ CB2 และ CB1 'ควรทําการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบผลกระทบที่เชื่อมโยงถึงกันซึ่งเป็นการสอบสวนที่อยู่นอกเหนือขอบเขตของการศึกษาในปัจจุบัน อย่างไรก็ตามการค้นพบก่อนหน้านี้และปัจจุบันของเราเปิดเผยอย่างสม่ําเสมอว่าการปิดล้อมของ CB2 เป็นกลยุทธ์การแทรกแซงการรักษา po-tential เพื่อป้องกันพังผืดของไต นอกเหนือจากการแจ้งผู้ป่วยโรคไตเรื้อรังแล้วการค้นพบของเรายังให้คําเตือนด้านสุขภาพแก่กลุ่มที่เติบโตอย่างรวดเร็ว

รูปที่ 10| ตัวรับ Cannabinoid ชนิดที่ 2 (CB2) เป็นเป้าหมายปลายน้ําของβ -catenin (β-cat) (ก) การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์พบว่ามีไซต์ที่มีผลผูกพันกับปัจจัย T-cell (TCF) (TBSs) ในบริเวณโปรโมเตอร์ของยีน CB2 ของมนุษย์และเมาส์ ลําดับและตําแหน่งของ TBSs putative ในยีน CB2 จะถูกเน้น (สีแดง) ในขณะที่ลําดับฉันทามติ TBS จะได้รับที่ด้านล่างของแผงนี้ (ข) ตัวแทน chromatin immunoprecipitation (ChlP) ผลการทดสอบแสดงผลการผูกของ TCF หรือปัจจัยการผูกตัวเพิ่มต่อมน้ําเหลือง (LEF) -1 ไปยังภูมิภาคโปรโมเตอร์ยีน CB2 มนุษย์ไตเซลล์ท่อใกล้เคียง (HKC) -8 เซลล์ถูกถ่ายทอดด้วยพลาสมิดการแสดงออกβ -catenin (pFlag-β-cat) หรือ pcDNA3 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ ysates ตกตะกอนด้วยแอนติบอดีต่อ TCF, LEF-1, histone H3 หรือ lgG nonimmune และการทดสอบชิปจะดําเนินการสําหรับโปรโมเตอร์ยีน CB2 ไลเสตเจือจางทั้งหมดถูกใช้เป็นดีเอ็นเออินพุตจีโนมทั้งหมด (ค) การนําเสนอกราฟิกของระดับ CB2 mRNA เซลล์ HKC-8 ถูกถ่ายทอดด้วยพลาสมิด pFlag-β-cat หรือ pcDNA3 RNA ทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณ*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">ของผู้บริโภคเอนโดแคนนาบินอยด์เพื่อวัตถุประสงค์ทั้งเพื่อการพักผ่อนหย่อนใจและยา การใช้หนักเรื้อรังอาจนําไปสู่การเปิดใช้งานตัวรับ CB1 และ CB2 อย่างต่อเนื่องซึ่งอาจส่งผลเสียต่อตัวรับไตสุขภาพ.

แม้ว่ารายงานก่อนหน้านี้จะแสดงให้เห็นว่า β-arrestin 1 มีบทบาทในพังผืดของไตและการกระตุ้นของ β-catenin"เราชี้แจงกลไกการทํางานของเส้นทาง CB2/β-catenin β-arrestin 1-mediated โดยละเอียด เราพบว่าβ-arrestin 1 มีมากกว่า β-arrestin 2 ในหนู IRI (ไม่แสดงข้อมูล) เป็นที่ทราบกันดีว่า β-arrestin 1 มีหน้าที่ในการกระตุ้น GPCR และการส่งสัญญาณปลายน้ําผ่าน Src, AKT, ไคเนสโปรตีนที่ควบคุมด้วยสัญญาณนอกเซลล์ (ERK1/2) และไคเนสอื่น ๆ2การเปิดใช้งาน Src สามารถไกล่เกลี่ยเส้นทางโปรพังผืดได้หลายเส้นทาง เช่น ตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังและตัวแปลงสัญญาณสัญญาณและตัวกระตุ้นการถอดความ (STAT)3" เราไม่สามารถแยกความเป็นไปได้ที่เส้นทางเหล่านี้ยังเป็นเส้นทางปลายน้ําของ CB2 อย่างไรก็ตามการสังเกตของเราชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณβคาเทนินเป็นสื่อกลางโดยคอมเพล็กซ์ β-arrestin 1/Src ที่เกิดจาก CB2 นอกจากนี้ β-arrestin 1 ยังเป็นตัวควบคุมจุดตรวจหลักและทําหน้าที่เป็นโปรตีนนั่งร้านเพื่อเริ่มการกระตุ้นβ-catenin โดยการย้ายตําแหน่งไปยังนิวเคลียส การค้นพบนวนิยายอีกเรื่องหนึ่งคือ CB2 เป็นเป้าหมายของ β-catenin เป้าหมายหลายประการของ β-catenin ได้รับการระบุก่อนหน้านี้ CB2 ในการศึกษานี้ ดังนั้นจึงเป็นที่น่าสังเกตว่าเส้นทาง CB2 / β-catenin ดูเหมือนจะสร้างลูปการเปิดใช้งานซึ่งกันและกันซึ่งร่วมมือกันกระตุ้นการเกิดโรคของพังผืดในไต

โดยสรุปผลการวิจัยของเราชี้ให้เห็นว่า CB2 ที่แสดงออกอย่างผิดปกติมีส่วนเกี่ยวข้องอย่างยิ่งต่อการเกิดพังผืดของไตผ่านการกระตุ้นβ -catenin ที่เกิดจาก β-arrestin 1 β-catenin กระตุ้นการแสดงออกของ CB2 ซึ่งอํานวยความสะดวกในการเปิดใช้งานตัวรับและการส่งคลื่นสัญญาณ ผลลัพธ์เหล่านี้ (i) แสดงให้เห็นถึงเส้นทาง CB2 /β-catenin แบบใหม่ที่ส่งเสริมพังผืดของไตและ (ii) เกี่ยวข้องกับว่าการยับยั้ง CB2 หรือ β-arrestin 1 แบบกําหนดเป้าหมายอาจป้องกันพังผืดผ่านการยับยั้งลูปการกระตุ้นซึ่งกันและกัน

วิธีการที่กระชับ

สําหรับวิธีการโดยละเอียด โปรดดูวิธีการเพิ่มเติม

แบบจําลองสัตว์

หนูตัวผู้ C57BL/6 ถูกซื้อจากศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์ภาคใต้ (กวางโจว ประเทศจีน) สําหรับรุ่น IRI หัวขั้วทวิภาคีถูกตัดด้วยที่หนีบ microaneurysm เป็นเวลา 32 นาทีที่ 37.5 ° C ในช่วงขาดเลือดและระยะเวลาการกู้คืน โมเดล UUO ก่อตั้งขึ้นโดยสาม ligating ท่อไตซ้ายด้วยผ้าไหม 4-0 หลังจากแผลตรงกลางช่องท้อง สําหรับรุ่น UIRI ก้านดอกด้านซ้ายถูกตัดเป็นเวลา 35 นาทีโดยใช้ที่หนีบโป่งพองขนาดเล็กและ contralateralไตถูกถอดออก 1 วันก่อนการเสียสละ สําหรับแบบจําลองโรคไตที่เกิดจากกรดโฟลิกหนูตัวผู้ C57BL / 6 ได้รับการรักษาด้วยกรดโฟลิกผ่านการฉีดเข้าช่องท้องเพียงครั้งเดียวที่ 25 มก. / กก. น้ําหนักตัว การแสดงออกในร่างกายของ Wnt1 หรือ CB2 หรือการน็อคดาวน์ของ β-arrestin 1 ในหนูนั้นดําเนินการโดยวิธีการจัดส่งยีนตามอุทกพลศาสตร์",5 การออกแบบการทดลองโดยละเอียดแสดงในรูปที่ 5a, 7a และ 9a การทดลองในสัตว์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ที่มหาวิทยาลัยการแพทย์ภาคใต้กวางโจวประเทศจีน คู่ผสมพันธุ์ของหนู null CB2 (CB2/) อายุ 6-8 สัปดาห์ในพื้นหลัง C57BL /6N ซื้อจาก Cyagen Biosciences (หมายเลขสต็อก KOCMP-21582-Cnr2; ไซยาเกนไบโอไซเอนซ์, กวางโจว, จีน). การขาดตัวรับ CB2 ได้รับการยืนยันโดยการถอดความย้อนกลับ -PCR

ตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อไตของมนุษย์และการเพาะเลี้ยงเซลล์

มนุษย์ไตส่วน (3 μm) ได้มาจากการตรวจชิ้นเนื้อไตที่ดําเนินการที่โรงพยาบาลหนานฟางและโรงพยาบาลประชาชนเขต Huadu มหาวิทยาลัยการแพทย์ภาคใต้กวางโจวประเทศจีน การตรวจชิ้นเนื้อควบคุมปกติได้มาจาก nontumorไตเนื้อ เยื่อของผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งไต การศึกษาที่เกี่ยวข้องกับส่วนไตของมนุษย์ดําเนินการโดยได้รับความยินยอมจากผู้ป่วยที่ได้รับแจ้งและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสถาบันที่โรงพยาบาลหนานฟางและโรงพยาบาลประชาชนอําเภอหัวตู เซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของมนุษย์ (HKC-8) จัดทําโดย Dr. Lorraine C. Racusen (มหาวิทยาลัย Johns Hopkins, บัลติมอร์, MD) เศษส่วนนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึมถูกแยกออกด้วยชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ (BestBio, เซี่ยงไฮ้, จีน)

การกําหนดระดับครีเอตินินในซีรัมและยูเรียไนโตรเจนในเลือด

ระดับครีเอตินินและยูเรียไนโตรเจนในเลือดถูกกําหนดโดยเครื่องวิเคราะห์เคมีอัตโนมัติ (เครื่องวิเคราะห์เคมี AU480, Beckman Coulter, แอตแลนตา, GA)

การผสมพันธุ์ในแหล่งกําเนิด

โพรบ CB2 ถูกซื้อจาก Boster Technology, หวู่ฮั่น, จีน.ไตส่วน (8 μm) ได้รับการแก้ไขด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 4% และประเมินโดยการย้อมสีเรืองแสงของ CB2 โดยใช้ชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, China)

การย้อมสีทางเนื้อเยื่อวิทยาและอิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์

พาราฟินฝังอยู่ไตส่วนถูกย้อมสีโดยใช้การย้อมสีไทรโครมของกรด Schiff และ Masson เป็นระยะเพื่อระบุท่อที่ได้รับบาดเจ็บและตรวจสอบการสะสมของคอลลาเจน รอยโรคถูกวัดปริมาณโดยใช้เทคนิคโดยใช้คอมพิวเตอร์ช่วย การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ดําเนินการในส่วนพาราฟินและแช่แข็งตามลําดับ แอนติบอดีอธิบายไว้ในวิธีการเสริม