ส่วนที่ 2 ERCC1 การกลายพันธุ์ขัดขวางการซ่อมแซมความเสียหายของ DNA และทำให้ตับและไตทำงานผิดปกติในผู้ป่วย

ติดต่อ:ali.ma@wecistanche.com

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 1

ตอนที่ 2

คลิกเพื่อ Cistanche NZ สำหรับโรคไต

การอภิปราย

คดีใหม่ของไบอัลเลลิกERCC1การกลายพันธุ์ มีเพียงสองคนเท่านั้นที่มีไบอัลลีลิกERCC1มีการรายงานการกลายพันธุ์จนถึงปัจจุบัน ซึ่งทั้งคู่แสดงคุณลักษณะที่เหมือน CS บุคคลที่ได้รับผลกระทบรุนแรงที่สุด (165TOR) มีตัวแปรไร้สาระ (Q158X) และตัวแปรความผิดพลาด F231L ในบรรทัดฐาน (HhH)2 ของ ERCC1 (รูปที่ S5 F) แสดงการชะลอการเจริญเติบโต พัฒนาการล้มเหลว และการหดตัว และเสียชีวิตหลังจาก ปีแรกของชีวิตจากโรคปอดบวม (Jaspers et al., 2007) บุคคลที่ได้รับผลกระทบคนที่สอง (CS20LO) มีอาการหดตัว microcephaly และ hypertonia และเป็น homozygous สำหรับตัวแปร Missense F231L และเสียชีวิตในปีที่สองของชีวิต (Kashiyama et al., 2013)

เราแจ้งความพี่น้องสองคนที่มีไบอัลเลลิกERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) และอัลลีลที่เป็นโมฆะเนื่องจากการลบ intragenic ที่สืบทอดมาจากมารดา โปรตีน ERCC1 ที่เหลือทั้งหมดที่แสดงในเซลล์จากผู้ป่วยเหล่านี้มีการแทนที่กรดอะมิโน R156W ซึ่งขัดขวางสะพานเกลือระหว่างเรซิดิว R156 ที่มีประจุบวกและเรซิดิว D129 ที่มีประจุลบที่อยู่ด้านล่างช่องจับ XPA ในโดเมนกลางERCC1. ผลกระทบของการแทนที่นี้เป็นสองเท่า: (1) ทำให้เสถียรภาพโดยรวมของ ERCC1 และ XPF มีผลผูกพันลดลงอย่างมาก และ (2) ส่งผลต่อการดำเนินการโต้ตอบกับ XPA โดยเฉพาะ (รูปที่ 9)

ลดระดับโปรตีนนิวเคลียร์ของ ERCC1 เนื่องจากการคลาดเคลื่อนบางส่วน

การวิเคราะห์ Western blot และ immunofluorescence พบว่าโดยรวมERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) ในภายนอกERCC1ตำแหน่งของเซลล์ RPE1-hTERT สิ่งที่น่าสนใจคือ การสูญเสีย ERCC1 อย่างสมบูรณ์ในหนูทำให้เสียชีวิตภายใน 4 สัปดาห์ ในขณะที่การเพิ่มระดับโปรตีนเป็นประมาณ 15 เปอร์เซ็นต์ของระดับในหนู WT จะเพิ่มช่วงอายุขัยห้าเท่า (Weeda et al., 1997) ซึ่งบ่งชี้ว่าแม้แต่ ERCC1 ในระดับต่ำ เพิ่มศักยภาพในการดำรงชีวิตอย่างมาก สอดคล้องกับการค้นพบของเรา การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ที่ผิดพลาดในโดเมนกลางของERCC1โดยทั่วไปทำให้เกิดความไม่เสถียร (Sijbers et al., 1996b) ซึ่งบ่งชี้ว่าบริเวณนี้มีความสำคัญต่อความเสถียรของโปรตีน

รายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้โครงสร้างกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็งของความยาวเต็มERCC1-XPF heterodimer (Jones et al., 2020) เปิดเผยว่าERCC1R156สารตกค้างอยู่ที่ขอบสุดของเฮเทอโรไดเมอร์ เราคาดการณ์ว่าความเทอะทะที่เพิ่มขึ้นและโครงสร้างทางอิเล็กทรอนิกส์ที่เปลี่ยนแปลงไปของการแทนที่อาร์จินีนด้วยทริปโตเฟน ไม่เพียงแต่รบกวนกระเป๋าที่มีผลผูกพัน XPA แต่ยังรบกวนส่วนต่อประสานไดเมอร์ระหว่างโดเมนกลางของ ERCC1 และโดเมนนิวคลีเอสของ XPF ทำให้เกิดความไม่เสถียรโดยทั่วไป (รูปที่ S5F). สิ่งที่น่าสนใจ ตัวแปร missense XPFR799W อยู่ที่อินเทอร์เฟซเดียวกันที่ด้าน XPF (รูปที่ S5 F) และยังส่งผลให้เกิดความไม่เสถียรและระดับโปรตีน XPF ที่ลดลงอย่างรุนแรง (Mori et al., 2018) ในบุคคลหนึ่งที่ได้รับผลกระทบ (CALIF1010) ซึ่งนำเสนอด้วยคุณสมบัติคล้าย CS และ progeroid แบบแบ่งส่วน ตัวแปร XPFR799W ได้รับการสืบทอดพร้อมกับการลบภายในในอัลลีล XPF อื่น ส่งผลให้เกิดข้อบกพร่อง NER ที่รุนแรงรวมกับข้อบกพร่องในการซ่อมแซม ICL ที่ไม่รุนแรง (Mori et al., 2018) คล้ายกับพี่น้องที่รายงานในการศึกษานี้

การแสดงออกนอกรีตของเวอร์ชันที่เหนี่ยวนำให้เกิดERCC1R156Wเป็นเวลา 24 ชั่วโมงทำให้เราสามารถเข้าถึงระดับ WT ของโปรตีนกลายพันธุ์นี้ ซึ่งส่งผลให้มีการแปลผิดในไซโตพลาสซึม ลดปฏิสัมพันธ์กับ XPF และเพิ่มปฏิสัมพันธ์กับพี่เลี้ยงที่พับโปรตีนตามที่ตรวจพบโดย MS การค้นพบทั้งหมดนี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่าERCC1R156Wถูกพับและเสื่อมสภาพบางส่วนในเซลล์ของผู้ป่วย ส่งผลให้ระดับโปรตีนนิวเคลียร์ ERCC1 ลดลง -80 เปอร์เซ็นต์ KI ของ ERCC1R156W ในเซลล์ RPE1-hTERT สนับสนุนข้อสรุปนี้

เมื่อเปรียบเทียบERCC1และระดับโปรตีน XPF ในเซลล์ PV46LD และ PV50LD กับระดับโปรตีนในเซลล์จากบุคคลที่ได้รับผลกระทบรุนแรงกว่า (165TOR และ CS20LO) เราตั้งข้อสังเกตว่าระดับเหล่านี้เทียบเท่ากันหรืออาจต่ำกว่าในเซลล์จากพี่น้องที่อธิบายไว้ในการศึกษานี้ (รูปที่ 3 C และรูปที่ S3, E และ F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013) โปรดทราบว่า CS20LO เป็น homozygous สำหรับ ERCC1F231L ในขณะที่ 165TOR นั้นต่างกันและมีการหยุดก่อนเวลาอันควรเพิ่มเติมในอีกอันหนึ่งERCC1อัลลีล (Q158X) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่านอกเหนือจากระดับโปรตีนที่ลดลงแล้ว ยังต้องพิจารณาถึงหน้าที่การทำงานของโปรตีนกลายพันธุ์ที่ยังคงแสดงออกและการรวมกันของอัลลีลที่กลายพันธุ์ทั้งสองชนิดที่จำเป็นต้องนำมาพิจารณาด้วยว่าเป็นตัวปรับศักยภาพของความรุนแรงและการแสดงออกของฟีโนไทป์

ERCC1R156W: ผลกระทบที่แตกต่างกันต่อเส้นทางการซ่อมแซม DNA ที่ขึ้นกับ ERCC1-

การแสดงออกของ ERCC1R156W-GFP ในเซลล์ ERCC1-KO ที่ระดับใกล้เคียงกับ ERCC1WT ทำให้เราสามารถคลี่คลายผลกระทบของการแทนที่กรดอะมิโนต่อความคงตัวของโปรตีนจากผลกระทบต่อการทำงานของโปรตีน ในขณะที่โปรตีน ERCC1R156W ที่กลายพันธุ์มีความบกพร่องอย่างรุนแรงในปฏิกิริยาที่เกิดจากรังสียูวีกับ XPA และปลา และล้มเหลวในการแปลตำแหน่งอย่างมีประสิทธิภาพไปยังตำแหน่งของรอยโรค DNA ที่เกิดจากรังสียูวี เรายังคงตรวจพบกิจกรรมการซ่อมแซมจำนวนมาก (∼40 เปอร์เซ็นต์) ในการตรวจ UDS การอยู่รอดของโคลน และการทดสอบ NER ในหลอดทดลอง การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าโปรตีน ERCC1 ที่กลายพันธุ์ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์เพียงเล็กน้อยกับคอมเพล็กซ์ NER เท่านั้น ยังคงสามารถรองรับการทำงานของ NER ในระดับมาก (∼40 เปอร์เซ็นต์) ภายในเซลล์ การค้นพบนี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่าระดับการแสดงออกที่ต่ำของ ERCC1 (∼20 เปอร์เซ็นต์) รวมกับกิจกรรม GGR ที่หลงเหลือของโปรตีนกลายพันธุ์ที่ยังคงแสดงออกอยู่นั้นให้การปกป้องที่เพียงพอเพื่อป้องกันไม่ให้ PV46LD และ PV50LD พัฒนา XP แบบฟูลโบลว์ แท้จริงแล้ว กิจกรรม GGR ที่ตกค้างยังคงถูกตรวจพบภายใต้สภาวะที่ละเอียดอ่อนกว่าในการทดสอบ UDS เมื่อเปรียบเทียบกับไฟโบรบลาสต์จากผู้ป่วย XP-A ที่ได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงและมีแนวโน้มเป็นมะเร็ง อย่างไรก็ตาม ผู้ป่วยทั้งสองรายยังคงมีความเสี่ยงที่จะเป็นมะเร็งผิวหนัง จึงแนะนำให้ป้องกันจากแสงแดด กิจกรรมตกค้างในเซลล์ PV46LD และ PV50LD มีความคล้ายคลึงหรือต่ำกว่ากิจกรรมการซ่อมแซมที่เราตรวจพบในเซลล์ 165TOR หรือ CS20LO (รูปที่ 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013) ความรุนแรงทางคลินิกจึงไม่สัมพันธ์กับกิจกรรม NER แต่น่าจะเกิดจากบทบาทของ ERCC1 ภายนอก NER ที่มีความสำคัญในระหว่างการพัฒนา

แม้จะมีการค้นพบของเราว่า ERCC1R156W แสดงปฏิสัมพันธ์ที่ลดลงกับ SLX4 และได้รับคัดเลือกอย่างมีประสิทธิภาพน้อยกว่าไปยังไซต์ของการเหนี่ยวนำ ICL ในท้องถิ่น การวิเคราะห์เพิ่มเติมพบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ ERCC1R156W ได้รับผลกระทบเพียงเล็กน้อยในการสนับสนุนการซ่อมแซม ICL เมื่อแสดงออกทางนอกระบบใน ERCC1- เซลล์ KO อย่างไรก็ตาม ผลกระทบต่อการซ่อมแซม ICL นั้นรุนแรงน้อยกว่าผลกระทบของการแทนที่ R156W บน NER ซึ่งเมื่อรวมกับการค้นพบก่อนหน้านี้ว่าการซ่อมแซม ICL นั้นต้องการโปรตีน ERCC1 น้อยกว่าการซ่อมแซมรอยโรค DNA เฉพาะของ NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b) อาจอธิบายผลกระทบเล็กน้อยต่อการซ่อมแซม ICL ได้เป็นอย่างดี ในไฟโบรบลาสต์ของผู้ป่วยซึ่งมีระดับ ERCC1 ลดลงอย่างมาก เราตรวจพบความไวปานกลาง รวมถึงการแตกของโครโมโซมที่เพิ่มขึ้นเมื่อสัมผัสสาร MMC ที่กระตุ้น ICL แม้ว่าจะรุนแรงกว่าเซลล์จากผู้ป่วย FA ที่รวมอยู่ในคู่ขนานมาก ที่สำคัญ ทั้ง PV46LD และ PV50LD ไม่ได้แสดงสัญญาณที่ชัดเจนของลักษณะทางคลินิกที่คล้ายกับ FA ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรตีนกลายพันธุ์ ERCC1R156W ให้การป้องกันที่เพียงพอต่อการโหลด ICL ภายนอกที่ต่ำในผู้ป่วยเหล่านี้

การขาด ERCC1 ทำให้ตับและไตบกพร่อง

หนูเมาส์ที่เป็น KO สำหรับ ERCC1 หรือ XPF เพื่อแสดงการวิ่งที่รุนแรง (เช่น ตัวเล็กกว่าและอ่อนแอกว่าหนู WT) และตายก่อน 4 สัปดาห์แรกของชีวิตเนื่องจากตับวายอย่างรุนแรง (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997) การแสดงออกเฉพาะตับของ ERCC1 ในหนูเหล่านี้แก้ไขขนาดที่เล็กกว่าบางส่วนและยืดอายุขัยได้ถึง 12 สัปดาห์ แต่ยังเปิดโปงรุนแรงความผิดปกติของไตและภาวะไตวายเป็นสาเหตุการตายรอง (Selfridge et al., 2001) หนู KO จำเพาะสำหรับ XP หรือ FA ไม่แสดงโรคตับ บ่งบอกว่าฟีโนไทป์นี้ไม่ได้เกิดจากข้อบกพร่องในการซ่อมแซม NER หรือ ICL เป็นไปได้ว่าความซ้ำซ้อนบางส่วนระหว่างเส้นทางทั้งสองนี้ ซึ่งหายไปใน ERCC1-KO หนูที่บกพร่องในทั้งสองวิถี สามารถอธิบายฟีโนไทป์นี้ได้ ตามแนวคิดนี้ เซลล์ตับและเซลล์ท่อไตใกล้เคียงกลายเป็นโพลิพลอยด์ในหนู ERCC1-KO และสะสม p53 ในระดับสูง (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) บ่งชี้ว่าการสะสมของความเสียหายของ DNA ภายนอกในอวัยวะเหล่านี้ อาจเกิดขึ้น อย่างไรก็ตาม ลักษณะที่แน่นอนของรอยโรคของ DNA ที่เกิดภายในนี้ยังคงไม่ชัดเจน

ที่น่าสนใจคือ หนูที่มีการปิดการใช้งานร่วมกันของการซ่อมแซม NER และ ICL จะไม่แสดงความผิดปกติของตับ ซึ่งบ่งชี้ว่าความซ้ำซ้อนระหว่างเส้นทางการซ่อมแซม DNA เหล่านี้ไม่ใช่คำอธิบายเพียงอย่างเดียว และหน้าที่เพิ่มเติมของ ERCC1-XPF นอกเส้นทางการซ่อมแซม DNA เหล่านี้มีส่วนสนับสนุน ต่อการด้อยค่าของตับ (Mulderrig and Garaycoechea, 2020). เป็นไปได้ว่า ERCC1-XPF เกี่ยวข้องกับเส้นทางการซ่อมแซม DNA เพิ่มเติมที่จัดการกับความเสียหายของ DNA ภายในร่างกาย ตัวอย่างเช่น ERCC1-XPF เพิ่งแสดงให้เห็นเมื่อเร็วๆ นี้เพื่อดำเนินการกับโครงสร้างดีเอ็นเอทางเลือก เช่น Z-DNA ซึ่งในระหว่างนั้น ERCC จะทำงานร่วมกับโปรตีนซ่อมแซมที่ไม่ตรงกันมากกว่าปัจจัยการซ่อมแซม NER หรือ ICL (McKinney et al., 2020) นอกจากนี้ ERCC1-XPF แสดงให้เห็นว่าเกี่ยวข้องกับเส้นทางย่อยของการซ่อมแซมการตัดตอนฐานร่วมกับลานเกลียว RECQ1 (Woodrick et al., 2017)

พี่น้องสองคน (PV46LD และ PV50LD) ในการศึกษานี้แสดงความล้มเหลวในการเจริญเติบโต ความสูงสั้น และการขาดไขมันใต้ผิวหนัง ซึ่งชวนให้นึกถึงขนาดที่เล็กที่พบในหนู ERCC1-KO (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) นอกจากนี้ พี่น้องทั้งสองยังได้พัฒนาความบกพร่องของตับด้วยภาพ cholestatic ที่โดดเด่นซึ่งนำไปสู่การปลูกถ่ายตับแบบออร์โธโทปิกก่อนอายุ 9 ขวบ การแทรกแซงนี้ป้องกันการเสียชีวิตก่อนวัยอันควรได้อย่างชัดเจน แต่ไม่ได้ช่วยปรับปรุงความล้มเหลวในการเจริญเติบโต ดังที่เห็นได้ชัดจากการเติบโตของน้ำหนัก ส่วนสูง และเส้นรอบวงศีรษะหลังการปลูกถ่ายต่ำกว่า centile ที่สาม

สิ่งที่น่าสนใจคือ มีรายงานโรคตับในกระแสน้ำดีเป็นลักษณะทั่วไปในผู้ป่วยโรค CS ของอียิปต์ โดยแนะนำว่าควรติดตามอย่างใกล้ชิดในผู้ป่วยโรค CS จากภูมิหลังทางชาติพันธุ์อื่น ๆ เพื่อดูว่านี่เป็นลักษณะทั่วไปมากกว่าที่เคยรู้จักหรือไม่ (Abdel Ghaffar et al. , 2554). แม้ว่าจะไม่มีการอธิบายความผิดปกติของตับในผู้ป่วย XP แต่ก็มีบางกรณีของ cytolysis ตับ (การสลายเซลล์หรือการระเบิด) ในผู้ป่วย FA (Masserot-Lureau et al., 2012) ซึ่งอาจแตกต่างจากความผิดปกติของตับที่สังเกตได้ใน ERCC 1- พี่น้องที่ขาดแคลน การตรวจชิ้นเนื้อของตับจากพี่น้องที่มีอายุมากกว่า (PV50LD) เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของตับด้วยการขยายตัวของนิวเคลียสและความแปรปรวนตามที่ระบุไว้ใน ERCC1-หนูที่มีข้อบกพร่อง (รูปที่ S1 D; N´uñez et al., 2000 ).

สาเหตุที่สองของการเสียชีวิตในหนู ERCC1-KO ที่มีการแสดงออกจำเพาะต่อตับของ ERCC1 นั้นรุนแรงไตล้มเหลว(Selfridge et al., 2001). พี่น้องทั้งสองยังแสดงความผิดปกติของไตด้วยคุณสมบัติที่บ่งบอกถึงความผิดปกติของท่อส่วนต้นที่นำไปสู่ความก้าวหน้าไตการด้อยค่า. อย่างไรก็ตาม การทำงานของท่อจะเสถียรหลังจากการปลูกถ่ายตับ แต่ไตการทำงานต้องมีการตรวจสอบอย่างต่อเนื่อง ฟีโนไทป์ของไตของหนู ERCC1- KO ที่มีท่อพองซึ่งมีสารโปรตีนรั่วซึ่งสอดคล้องกับท่อทูบูโลพาที (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997)—มีความคล้ายคลึงกัน ของผู้ป่วยที่อธิบายไว้ในการศึกษาของเรา นอกจากนี้ ยังมีรายงานการด้อยค่าของไตและในบางกรณี ความล้มเหลวใน XP/CS แบบรวม (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) รวมทั้ง CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988) ในขณะที่ความสัมพันธ์ระหว่าง FA กับความผิดปกติทางโครงสร้างของไตhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) ที่เสียชีวิตเมื่ออายุ 37 ปี (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. ผู้ป่วยที่มีข้อบกพร่องในโปรตีนซ่อมแซมการตัดตอนนิวคลีโอไทด์ที่มีปฏิสัมพันธ์ ERCC1 หรือ XPF แสดง xeroderma pigmentosum ที่มีอาการเสื่อมทางระบบประสาทอย่างรุนแรงในช่วงปลาย . [บทคัดย่อ] J. Invest.Dermatol. 127:S92). แม้ว่าจะไม่มีรายงานความบกพร่องของตับ แต่ผู้ป่วยรายนี้พัฒนาสมองลีบอย่างรุนแรงเมื่ออายุ 15 ปี ซึ่งพัฒนาไปสู่การเสื่อมของระบบประสาทที่ก้าวหน้าด้วยภาวะสมองเสื่อม มีการสังเกตอาการสมองฝ่อเล็กน้อยในพี่น้องทั้งสองเมื่ออายุ 13 และ 11 ปี ซึ่งบ่งชี้ว่าควรติดตามพัฒนาการทางระบบประสาทของพี่น้องทั้งสองอย่างระมัดระวัง

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>ค; Jaspers และคณะ, 2007; Niedernhofer et al., 2006) นำเสนอด้วยฟีโนไทป์ที่มีการทับซ้อนกันบางส่วนกับพี่น้องที่รายงานที่นี่ รวมถึงความไวแสงที่ไม่มีมะเร็งผิวหนัง รูปร่างสั้น การขาดไขมันใต้ผิวหนัง พัฒนาการล่าช้า และภาวะไตไม่เพียงพอ (Niedernhofer et al., 2006) แตกต่างจากพี่น้องที่รายงานไว้ที่นี่ เด็กชายคนนี้แสดงลักษณะ progeroid ปล้องที่เด่นชัด แต่มีภาพตับที่อ่อนกว่ามากโดยไม่มี cholestasis พี่น้องที่รายงานในที่นี้แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของ ERCC1 แบบไบอัลเลลิกสามารถทำให้เกิดสเปกตรัมของฟีโนไทป์ ตั้งแต่ที่มักพบใน CS ไปจนถึงฟีโนไทป์ที่ประกอบด้วยรูปร่างเตี้ยที่อ่อนกว่า ความไวแสง และตับที่รุนแรงและไตการด้อยค่าอาจเป็นเพราะผลกระทบอย่างรุนแรงต่อ NER และผลกระทบพร้อมกันต่อการซ่อมแซม ICL ซึ่งอาจส่งผลต่ออวัยวะเหล่านี้โดยเฉพาะ

วัสดุและวิธีการ

ขั้นตอนทั้งหมดที่ดำเนินการในการศึกษานี้เป็นไปตามมาตรฐานทางจริยธรรมและได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของมนุษย์ของโรงพยาบาลเด็กรอยัล เมลเบิร์น วิกตอเรีย ออสเตรเลีย (HREC36291C) และคณะกรรมการบริการจริยธรรมการวิจัยแห่งชาติของสหราชอาณาจักร ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ-นิวคาสเซิล และนอร์ธ ไทน์ไซด์ 2. ผู้ป่วยได้รับคัดเลือกเข้าร่วมโครงการ Undiagnosed Diseases สำหรับผู้ป่วยเด็กที่สันนิษฐานว่าเป็นโรค Mendelian "กำพร้า" เก็บตัวอย่างน้ำลายหรือเลือดจากผู้ป่วยและสมาชิกในครอบครัวเพื่อสกัดจีโนมหลังจากได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร ผู้ปกครองอนุญาตให้แสดงรูปถ่ายของพี่น้องที่ได้รับผลกระทบโดยไม่ได้แก้ไขในรูปที่ 1 ก.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T ถูกระบุในบุคคลที่ได้รับผลกระทบทั้งสองใน exon 4 จาก 8 ของยีน ERCC1 ในการสอบสวนเบื้องต้นของข้อมูล exome ในบุคคลที่ได้รับผลกระทบทั้งสอง ตัวแปรนี้ดูเหมือนจะอยู่ในสถานะ homozygous แต่มีอยู่ในสถานะ heterozygous ในพ่อและไม่มีอยู่ในแม่ แนะนำให้ลบอัลลีลของมารดาที่เป็นไปได้ ตัวแปร missense มีอยู่ในฐานข้อมูล gnomAD ที่ความถี่ 0.01 เปอร์เซ็นต์ (22 heterozygotes ไม่มี homozygotes) และไม่เคยมีการรายงานมาก่อนในบุคคลที่ได้รับผลกระทบ ตัวแปร missense ถูกฝากไว้ในฐานข้อมูล LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 และ http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) และฐานข้อมูล ClinVar ( รหัสรูปแบบ: 978472)

การตรวจจับการลบโดย qPCR

เพื่อตรวจจับการลบออก จีโนม DNA ถูกสกัดจากลิมโฟไซต์/เซลล์เยื่อบุผิว และบริเวณที่เกี่ยวข้องของยีน ERCC1 ถูกขยายใน qPCR qPCR ดำเนินการโดยใช้โพรบและไพรเมอร์เฉพาะ (แสดงอยู่ในตาราง S1) ที่ออกแบบโดยใช้ Universal ProbeLibrary Assay Design Center (โรช) และสังเคราะห์โดย Sigma-Aldrich ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบให้รวมบริเวณที่ถูกลบใน exon 4 และบริเวณภายในยีนที่ไม่ถูกลบออกในฐานะของตัวควบคุม (exon 5) qPCR แบบมัลติเพล็กซ์โดยใช้ LightCycler R 480 Probes Master Reaction mix (Roche) ถูกดำเนินการตามโปรโตคอลของผู้ผลิตเพื่อขยายและหาปริมาณบริเวณยีน ERCC1 โดยใช้ยีน CFTR (exon 27) เป็นมาตรฐานภายใน (ตาราง ส1). qPCR ดำเนินการบนอุปกรณ์ LightCycler R 480 (Roche) และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ LightCycler R 480 เวอร์ชัน 1.5.0 (Roche) มีการปฏิบัติตามแนวทาง American College of Medical Genetics สำหรับการตีความความแปรผันของลำดับ

การตรวจจับตัวแปร missense โดย Sanger sequencing

จีโนม DNA ถูกแยกออกโดยการแขวนตะกอนเซลล์อีกครั้งในบัฟเฟอร์ไลเซตทั้งเซลล์ (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} }.เจลาติน 1 มก./มล. 0.45 เปอร์เซ็นต์ ทวีน-20 และ 0.45 เปอร์เซ็นต์ NP-40) ที่มีโปรตีนเค 0.1 มก./มล. (EO0491; ThermoFisher Scientific) และฟักเป็นเวลา 1 h ที่ 56 องศา ตามด้วย 10- นาทีการหยุดการทำงานของโปรตีน Proteinase K ที่ 96 องศา เศษของ∼1 kb ซึ่งขยายจากการกลายพันธุ์ของ missense ถูกขยาย PCR (ไพรเมอร์การจัดลำดับแสดงอยู่ในตาราง S1) ตามด้วยการจัดลำดับ Sanger โดยใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้าหรือย้อนกลับ

เส้นเซลล์

เซลล์ไฟโบรบลาสต์ถูกสร้างขึ้นจากการตรวจชิ้นเนื้อผิวหนังจากทั้งบุคคลและผู้ปกครองที่ได้รับผลกระทบ สายพันธุ์ของเซลล์ทั้งหมด (แสดงอยู่ในตาราง S2) ได้รับการเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาในบรรยากาศของอินเดียม CO2 5 เปอร์เซ็นต์ (Thermo Fisher Scientific) ที่เสริมด้วยเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (ซิกมา-อัลดริช) และ FBS 10 เปอร์เซ็นต์ (Bodinco BV) ทุกสายเซลล์ได้รับการทดสอบเป็นประจำสำหรับการติดเชื้อมัยโคพลาสมา

การทำให้เป็นอมตะ Fibroblast ด้วย hTERT

ไฟโบรบลาสต์ WT (48BR) และ PV50LD ถูกทำให้เป็นอมตะโดยนิวคลีโอเฟกชันของ p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) โดยใช้ Amaxa Nucleofector (โปรแกรม U23) อิเล็กโทรโพเรชันแต่ละอันประกอบด้วยไฟโบรบลาสต์ 400000 และพลาสมิดดีเอ็นเอ 2.5 ไมโครกรัม หลังจากอิเล็กโตรโพเรชัน เซลล์ถูกเพาะในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 25-cm2 ที่มี DMEM 5 มล. และ FBS 10 เปอร์เซ็นต์ หลังจาก 2 วัน อาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วยอาหารที่มีนีโอมัยซิน 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

/streptomycin (Sigma-Aldrich) และ 10 เปอร์เซ็นต์ FBS (Bodinco BV) ทุกสายเซลล์ได้รับการทดสอบเป็นประจำสำหรับการติดเชื้อมัยโคพลาสมา

โครงสร้างพลาสมิด

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>การกลายพันธุ์ของ T ใน ERCC1 ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ทับซ้อนกันถูกแทรกเป็นส่วนของ NheI และ AgeI เพื่อสร้าง CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus มากมาย ERCC1WT และ ERCC1R156W ถูกแทรกเป็นชิ้นส่วน NheI และ AgeI ลงใน pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 เพื่อสร้าง pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPและ pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. การกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ถูกนำมาใช้เพื่อแนะนำการกลายพันธุ์แบบจุดใน pMacro Bac-XPF-ERCC1WT โดยใช้ชุดการกลายพันธุ์ของ KOD-plus (Toyobo) ตามที่อธิบายไว้ในโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยใช้ไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ S1 ลำดับทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับ Sanger

การสร้างเซลล์ KO

ไลน์เพื่อสร้าง KOs เดี่ยว, U2OS(FRT) และ RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) เซลล์ถูกแปลงสภาพร่วมกับ pLV-U6g-PPB ซึ่งเข้ารหัส RNA ไกด์จากศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยไลเดน/ซิกมา - ไลบรารี RNA ไกด์เดี่ยว (sgRNA) ของ Aldrich (ดูตาราง S3 สำหรับพลาสมิดและตาราง S4 สำหรับลำดับ sgRNA) ที่กำหนดเป้าหมายยีน ERCC1 ร่วมกับการเข้ารหัสเวกเตอร์การแสดงออก Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) โดยใช้ Lipofectamine 2000 (อินวิโทรเจน). เซลล์ U2OS(FRT) ที่ทรานส์เฟกถูกเลือกบนพูโรมัยซิน (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 3 วันและเคลือบที่ความหนาแน่นต่ำ หลังจากที่แต่ละสำเนาพันธุ์ถูกแยกออก RPE ที่ทรานส์เฟก1-hTERTcells ถูก FACS คัดแยกบน BFP/GFP และเคลือบที่ความหนาแน่นต่ำ หลังจากนั้นแต่ละสำเนาพันธุ์ถูกแยกออก โคลน KO ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ Western blot การไม่มีการรวม Cas9 / การแสดงออกที่เสถียรได้รับการยืนยันโดย Western blot

การสร้างเส้นเซลล์ที่เสถียร

โคลน ERCC1 KO เดียวในพื้นหลัง U2OS(FRT) (ดูตาราง S2) ถูกใช้เพื่อแสดง ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP หรือ GFP-NLS อย่างเสถียรโดย cotransfection ของ pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid ที่เข้ารหัสเหล่านี้ cDNA (2 ไมโครกรัม) ร่วมกับ pOG44plasmid ซึ่งเข้ารหัส Flp recombinase (0.5 ไมโครกรัม) ประชากรเซลล์โพลีโคลนัลได้รับหลังจากการคัดเลือกบนพูโรมัยซิน 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และบลาสซิซิดิน เอส 4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร การแสดงออกของโปรตีน ERCC1 ที่แท็ก GFP หรือ GFP-NLS ถูกเหนี่ยวนำโดยการเติมด็อกซีไซคลิน 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

การสร้างสายเซลล์ KI

เพื่อสร้าง KI ที่เป็นโฮโมไซกัส เซลล์ RPE{{0}}hTERT ถูกบำบัดก่อนเป็นเวลา 30 นาทีด้วยตัวยับยั้ง DNA-PK 1 µM (NU7441) เพื่อยับยั้งการซ่อมแซม DSB ที่มีแนวโน้มว่าจะเกิดข้อผิดพลาดและเพิ่มการใช้การซ่อมแซมที่ขึ้นกับความคล้ายคลึงกัน ต่อมา 350,000 เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์นิวคลีโอเฟกเตอร์ 20 ไมโครลิตร (V4XP-3032; Lonza) โดยมีพลาสมิด 4.5 ไมโครกรัมที่มี Cas9 และ sgRNA กำหนดเป้าหมายยีน ERCC1 (ดูตาราง S3 สำหรับพลาสมิดและตาราง ลำดับ S4 forsgRNA) และ DNA ผู้ให้สายเดี่ยว 100 µM ซึ่งมีการกลายพันธุ์ของผู้ป่วยตลอดจนการกลายพันธุ์แบบเงียบเพื่อทำลายตำแหน่ง PAM เพื่อป้องกันการตัดใหม่โดย Cas9 และการกลายพันธุ์แบบเงียบเพื่อแนะนำไซต์การจำกัด HindIII เพื่ออำนวยความสะดวกในการตรวจคัดกรอง KI โคลน เซลล์ถูกอิเล็กโตรโพเรชันโดยใช้หน่วยนิวคลีโอเฟกเตอร์ Amaxa 4D-X (ลอนซา) โดยใช้โปรแกรม EA-104 หลังจากอิเล็กโตรโพเรชัน เซลล์ถูกชุบที่ความหนาแน่นต่ำในตัวกลาง McCoy ด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ วันรุ่งขึ้น สื่อถูกแทนที่ด้วย DMEM (10 เปอร์เซ็นต์ FBS และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin/streptomycin) และเซลล์ได้รับอนุญาตให้สร้างโคโลนี แยกและขยายอาณานิคมประมาณ 400 แห่ง จีโนม DNA ถูกแยกออก และชิ้นส่วนซึ่งรวมถึงการกลายพันธุ์ที่นำเข้ามาและตำแหน่งการจำกัดที่นำเข้า (HindIII) ถูกขยายโดย PCR ที่ซ้อนกัน (ดูตาราง S1 สำหรับไพรเมอร์) ชิ้นส่วน PCR ถูกย่อยด้วย HindIII (NEB) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นแยกจากกันโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส สำเนาพันธุ์ที่มีไซต์การจำกัด HindIII ที่นำมาใช้ถูกวิเคราะห์โดยการจัดลำดับ Sanger (ดูตาราง S1 สำหรับไพรเมอร์) เราได้โคลน KI homozygous สองตัวจาก 400 โคลนที่ถูกแยกออกมา ซึ่งสอดคล้องกับประสิทธิภาพของ KI ที่ ∼0.5 เปอร์เซ็นต์

การถ่ายโอน Lentiviral

สำหรับการถ่ายยีนเลนติไวรัส mVenus-ERCC1WT หรือ mVenus ERCC1R156W ถูกแทรกเข้าไปใน pLenti-CW เวกเตอร์ของเลนติไวรัส57-TO HEK293T ถูกถ่ายด้วยเวกเตอร์ที่เข้ารหัสการหลอมรวม ERCC1, VSV-G, RRE และ REV โดยใช้ JetPEI (Sigma Aldrich) เพื่อผลิตไวรัส ส่วนลอยเหนือตะกอนที่ประกอบด้วยไวรัสถูกรวบรวมหลังจาก 24 ชั่วโมงและกรองด้วยตัวกรอง 0.44-µm ไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิ PV46LD และ PV50LD ถูกทรานส์ดิวซ์ทางไวรัสต่อหน้าโพลีเบรน (Sigma-Aldrich) เซลล์ถูกเลือกด้วยพูโรมัยซิน 15 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร การแสดงออกของโปรตีน ERCC1 ที่แท็ก mVenus ถูกเหนี่ยวนำโดยการเติมด็อกซีไซคลิน 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

การทดสอบการอยู่รอดของโคลนิก

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >ได้คะแนน 20 เซลล์ ทำการทดลองการเอาชีวิตรอดซ้ำแล้วซ้ำอีกอย่างน้อยสองครั้ง

ภูมิคุ้มกันสำหรับ Co-IP

เซลล์ถูกบำบัดด้วยการจำลองหรือฉายรังสี UV-C (20 J/m2) และเก็บเกี่ยวหลังจาก 1 ชั่วโมง เม็ดเซลล์ถูกสลายเป็นเวลา 20 นาทีบนน้ำแข็งในบัฟเฟอร์ EBC-150 (ทริส 50 มิลลิโมลาร์, pH 7.5, 150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 0.5 เปอร์เซ็นต์ NP-40,2 มิลลิโมลาร์ MgCl2 และตัวยับยั้งโปรตีเอส ค็อกเทล [โรช]) เสริมด้วยเบนโซเนสนิวเคลียส 500 U/มล. (โนวาเจน) เซลล์ไลเซตถูกบ่มเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมงที่ 4 องศาด้วยเม็ดบีด GFP-Trap A(โครโมเทค) จากนั้นล้างลูกปัดหกครั้งด้วยบัฟเฟอร์ EBC-150 (ทริส 50 มิลลิโมลาร์, pH 7.5, 150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 0.5 เปอร์เซ็นต์ NP-40, EDTA 1 มิลลิโมลาร์, และค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอส) และต้มในLaemmli-SDS บัฟเฟอร์ตัวอย่าง

หยดตะวันตก

เซลล์ถูกปั่นลง ล้างด้วย PBS และต้มเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์ Laemmli (40 มิลลิโมลาร์ Tris, pH 6.8, SDS 3.35 เปอร์เซ็นต์, กลีเซอรอล 16.5 เปอร์เซ็นต์, 0.0005 เปอร์เซ็นต์ Bromophenol Blue และ 0.05 เอ็ม ไดไทโอไทรอิทอล) แยกโปรตีนด้วยเจล Criterion XT Bis-Tris แบบ 4 เปอร์เซ็นต์ –12 เปอร์เซ็นต์ (#3450124; Bio-Rad) ใน NuPAGE MOPsrunning buffer (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) และซับลงบนเยื่อโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (IPFL00010; EMD Millipore ). เมมเบรนถูกปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์การปิดกั้น (MB-070-003; แผ่นดินหิน) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงตรวจสอบเมมเบรนด้วยแอนติบอดี (แสดงไว้ในตาราง S5) ตามที่ระบุไว้ ระบบ Odyssey CLx (LI-COR Biosciences) ใช้สำหรับการตรวจจับ

การทดสอบการกู้คืนอาร์เอ็นเอ (RRS)

30,000 เซลล์ถูกเพาะบนฝาครอบแก้ว 12-มม. ในเพลต 24-หลุมใน DMEM ที่มี FBS 1 เปอร์เซ็นต์ หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกฉายรังสีด้วย UV-C ที่ขนาดยา 6 J/m2 และบ่มในตัวกลางที่ปรับสภาพสำหรับช่วงเวลาที่ต่างกัน ({{20}} ชั่วโมง, 3 ชั่วโมงและ 18 ชั่วโมง) หลังจากการฟักไข่ การถอดเสียงที่เกิดขึ้นใหม่จะถูกติดฉลากโดยการฟักเซลล์ด้วย 400 µM 5-ethynyl-uridine (CLK-N002-10; Jena Bioscience) ซึ่งถูกทำให้เห็นภาพด้วยการผสม Click-iT ที่ประกอบด้วย 50 mM Tris buffer, pH 8.0, 60 µM Atto Azide (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-ascorbic acid (A0278; Sigma-Aldrich) และ 0.1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีด้วย PBS และติดตั้งบนสไลด์ไมโครสโคป (Thermo Fisher Scientific) โดยใช้ Aqua Polymount (Brunschwig)

อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

สำหรับการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ เซลล์ 250,000 เซลล์ถูกเพาะบนฝาครอบแก้วขนาด 18-มม. ในวันถัดไป เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยการทำให้ซึมผ่านด้วย{{10}}.5 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกบำบัดด้วยไกลซีน 100 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อสกัดกั้นกลุ่มอัลดีไฮด์ที่ไม่ทำปฏิกิริยา ล้างด้วย PBS และปรับสมดุลในบัฟเฟอร์สำหรับล้าง (PBS ที่มี BSA 0.5 เปอร์เซ็นต์และ Tween 0.05 เปอร์เซ็นต์-20; Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 10 นาที ขั้นตอนของแอนติบอดีและการล้างอยู่ในบัฟเฟอร์สำหรับล้าง แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ DAPI เป็นเวลา 5 นาที แอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิแสดงไว้ในตารางที่S5 เซลล์ถูกบ่มด้วย DAPI 0.1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และติดตั้งโดยใช้ Aqua Polymount

การย้อมสี H2AX

200,000 เซลล์ถูกเพาะบนแผ่นปิดแก้ว 18-มม. ในจาน 24-หลุมที่มี DMEM (10 เปอร์เซ็นต์ FBS และ 1 เปอร์เซ็นต์ P/S) วันรุ่งขึ้น เซลล์สัมผัสกับ IR โดยเครื่องกำเนิดเอ็กซ์เรย์ YXlon International (200 KV, 4 mA; อัตราขนาดยา 2 Gy/นาที) ที่จุดเวลาที่ระบุ เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 3 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เป็นเวลา 10 นาทีและย้อมสำหรับ H2AX เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (ดูด้านบน) รูปภาพถูกวัดปริมาณโดยใช้มาโครที่สร้างขึ้นเองใน ImageJ ซึ่งเปิดใช้งานการวิเคราะห์อัตโนมัติและวัตถุประสงค์ของจำนวนจุดโฟกัสต่อเซลล์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Typas et al., 2015)

การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์คงที่

รูปภาพของตัวอย่างคงที่ได้มาจากกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมุมกว้าง Zeiss AxioImagerM2 หรือ D2 ที่ติดตั้ง 63× PLAN APO (รูรับแสงตัวเลข 1.4 [NA]) วัตถุประสงค์ในการแช่น้ำมัน (Zeiss) และหลอดไฟเมทัลฮาไลด์ HXP 120 ที่ใช้สำหรับการกระตุ้น ตรวจพบหลอดฟลูออเรสเซนต์โดยใช้ตัวกรองต่อไปนี้สำหรับ DAPI (ตัวกรองการกระตุ้น: 350/50 นาโนเมตร กระจกไดโครอิก: 400 นาโนเมตร ตัวกรองการแผ่รังสี: 460/50 นาโนเมตร) Alexa 555 (ตัวกรองการกระตุ้น: 545/25 นาโนเมตร กระจกไดโครอิก: 565 นาโนเมตร ; ตัวกรองการปล่อยมลพิษ: 605/70 นาโนเมตร) หรือ Alexa 647 (ตัวกรองการกระตุ้น: 640/30 นาโนเมตร; กระจกไดโครอิก: 660 นาโนเมตร; ตัวกรองการปล่อยก๊าซ: 690/50 นาโนเมตร) รูปภาพถูกบันทึกโดยใช้ซอฟต์แวร์ ZEN 2012 และวิเคราะห์ใน ImageJ

การฉายรังสีไมโครเลเซอร์ยูวี

เซลล์เติบโตบนแผ่นปิด 18-mm ควอตซ์ (UV-C) หรือแก้ว (UV-A) และวางไว้ในห้องแม่เหล็ก Chamlide CMB ซึ่งสื่อการเจริญเติบโตถูกแทนที่ด้วย CO2-Leibovitz L{ อิสระ {4}} สื่อ (Thermo Fisher Scientific) รางเลเซอร์ UV-C ถูกสร้างขึ้นโดยใช้โซลิดสเตต 266-mm yttrium Aluminium Garnet laser (กำลังเฉลี่ย 5 mW อัตราการทำซ้ำสูงสุด 10 kHz และความยาวพัลส์ 1 ns) ก่อนการฉายรังสี UV-Amicro เซลล์ถูกไวด้วย 6 ไมโครโมลาร์ไตรออกซ์ซาเลนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อสร้าง ICL หรือด้วย 15 ไมโครโมลาร์ BrdU เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อสร้าง DSB รางเลเซอร์ UV-A ถูกสร้างขึ้นโดยโซลิดสเตต 355-nm Yttrium Aluminium Garnet laser ที่ปั๊มด้วยไดโอด (กำลังเฉลี่ย 14 mW และอัตราการทำซ้ำสูงถึง 200 Hz) เลเซอร์ทั้งสองถูกรวมเข้ากับระบบส่องสว่างเฉพาะจุด UGA-42-Caliburn/2L (Rapp OptoElectronic)

การฉายรังสีระดับไมโครถูกรวมเข้ากับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตในห้องสิ่งแวดล้อมที่ตั้งค่าไว้ที่ 37 องศาบนกล้องจุลทรรศน์แบบไวด์ฟิลด์ฟลูออเรสเซนซ์ Zeiss Axio Observer 7 แบบออล-ควอทซ์ทั้งหมด โดยใช้วัตถุประสงค์ในการแช่กลีเซอรอลด้วยกลีเซอรอลฟิลเตอร์ขนาด 100× (1.2NA) (UV-C) ) หรือวัตถุประสงค์การแช่น้ำมัน Plan-Neofluar 63× (1.25 NA) (UV-A) ระบบเลเซอร์เชื่อมต่อกับกล้องจุลทรรศน์ผ่าน TriggerBox และตัวกรองความหนาแน่นเป็นกลาง (ND-1) จะบล็อกแสงเลเซอร์ได้ 90 เปอร์เซ็นต์ AnHXP 120-V หลอดเมทัลฮาไลด์ถูกใช้สำหรับการกระตุ้น รูปภาพได้มาใน Zeiss ZEN และวัดปริมาณใน ImageJ

การทดสอบการแตกหักของโครโมโซม

2 × 1{{20}}6 ไฟโบรบลาสต์ถูกเพาะในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 175-cm2 ที่มี DMEM (10 เปอร์เซ็นต์ FBS) และเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาในการมีอยู่หรือไม่มี MMC 50 นาโนโมลาร์ หลังจาก 48 ชั่วโมง, 600 ไมโครลิตรของดีมีคอลซีน (10 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร) ถูกเติมไปยังขวดเพาะเชื้อแต่ละขวด และเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลาเพิ่มเติม 30 นาทีที่ 37 องศาเพื่อเพิ่มสมรรถนะสำหรับเมตาเฟส จากนั้นเซลล์ถูกทริปซิไนซ์และแขวนลอยใหม่ใน 75 มิลลิโมลาร์ KCL และบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกปั่นลง แขวนลอยใหม่ในสารตรึง 10 มล. (เมทานอล 75 เปอร์เซ็นต์และกรดอะซิติก 25 เปอร์เซ็นต์) บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และหมุนเหวี่ยง เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในสารตรึง 10 มล. และฟักเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนนี้ถูกทำซ้ำ และสุดท้าย เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในการตรึง 0.5–1.0 มล. สารแขวนลอยของเซลล์ถูกปล่อยลงบนสไลด์และปล่อยให้แห้ง สไลด์ถูกย้อมเป็นเวลา 5 นาทีในสารละลาย Giemsa 3 เปอร์เซ็นต์ ล้างในน้ำประปา และปล่อยให้แห้ง สไลด์ได้รับการเข้ารหัส และจากแต่ละวัฒนธรรมที่เข้ารหัส มีการตรวจสอบ 50 metaphases สำหรับความเสียหายของโครโมโซม หลังจากให้คะแนน สไลด์จะถูกถอดรหัส และวิเคราะห์ผลลัพธ์ตามที่นำเสนอ (Stoepker et al., 2011)

UDS

180,000 เซลล์ถูกเพาะบนฝาครอบแก้ว 18-มม. ในเพลต 12-หลุมใน DMEM ที่มี FBS 1 เปอร์เซ็นต์ หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกฉายรังสีเฉพาะที่ผ่านตัวกรอง 5-µm ที่มี 30 J/m2 UV-C ต่อมาเซลล์ถูกติดฉลากด้วยพัลส์ด้วย 20 µM EdU (VWR) และ 1 µM5-ฟลูออโร-ดีออกซียูริดีน (Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงหรือ 4 ชั่วโมง หลังจากการติดฉลาก เซลล์ถูกไล่ตามตัวกลางด้วยไทมิดีน 10 ไมโครโมลาร์ใน DMEM โดยไม่มีอาหารเสริมเป็นเวลา 30 นาทีและตรึงไว้เป็นเวลา 15 นาทีด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 3.7 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เซลล์ถูกซึมผ่านเป็นเวลา 20 นาทีใน PBS ด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์ Triton-X100 และปิดกั้นใน 3 เปอร์เซ็นต์ BSA (Thermo Fisher Scientific) ใน PBS EdU ที่ผนวกรวมเข้ากับ Attoazide Alexa Fluor 647 โดยใช้เคมี Click-iT ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Invitrogen) หลังจากการคัปปลิ้ง เซลล์ถูกโพสต์ฟิกซ์ด้วย 2 เปอร์เซ็นต์ฟอร์มาลดีไฮด์เป็นเวลา 10 นาทีและต่อมาถูกบล็อกด้วยไกลซีน 100 มิลลิโมลาร์ ดีเอ็นเอถูกทำให้เสียสภาพด้วย 0.5 โมลาร์ NaOH เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยการสกัดกั้นด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ BSA เป็นเวลา 15 นาที ต่อมา เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต้านไซโคลบิวเทน ไพริมิดีน ไดเมอร์ (ดูตารางที่ S5) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และ DAPI เป็นเวลา 5 นาที เซลล์ถูกติดตั้งใน Polymount (Brunschwig)

การเก็บข้อมูล MS

MS ถูกดำเนินการตามหลักที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Salas Lloret et al., 2019) การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการบนระบบ EASY-nLC 1000 (Proxeon) ที่เชื่อมต่อกับ Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ผ่านแหล่งกำเนิดไอออนนาโนอิเล็กโตรสเปรย์ Q-Exactive ถูกควบกับ 25-ซม. ซิลิกาอิมิตเตอร์ (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) ในบ้านที่บรรจุด้วยลูกปัด AQ 1.9 µm C18-AQ (Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, เยอรมนี) ตัวอย่างถูกรันในการเกรเดียนท์ของโครมาโตกราฟีขั้นต่ำ 40- นาทีจาก 0 เปอร์เซ็นต์ถึง 30 เปอร์เซ็นต์ของอะซีโตไนไตรล์ และจากนั้นเพิ่มขึ้นเป็น 95 เปอร์เซ็นต์ของอะซีโตไนไตรล์ก่อนการปรับคอลัมน์ใหม่ด้วยอัตราการไหล 200 NL/นาที แมสสเปกโตรมิเตอร์ทำงานในโหมดการรับที่ขึ้นกับข้อมูลด้วยวิธีเจ็ดอันดับแรกและช่วงการสแกน 300–1,600 m/z สเปกตรัม MS สแกนแบบเต็มได้มาที่ค่าเป้าหมาย 3 × 106 และความละเอียด 70000 และบันทึกสเปกตรัมมวลการตีคู่การชนกันที่สูงกว่า (MS/MS) ที่ค่าเป้าหมายที่ 105 และ ด้วยความละเอียด 35,000 ช่องหน้าต่างแยก 2.2 m/z และพลังงานการชนปกติ 25 เปอร์เซ็นต์ เป้าหมายการควบคุมอัตราขยายอัตโนมัติขั้นต่ำคือ 104 เวลาในการฉีด MS1 และ MS2 สูงสุดคือ 250 และ 120 มิลลิวินาทีตามลำดับ มวลไอออนของสารตั้งต้นของไอออนที่สแกนถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ MS/MS แบบไดนามิกเป็นเวลา 30 วินาที ไอออนที่มีประจุ 1 และสูงกว่า 6 ถูกแยกออกจากการกระตุ้นการวิเคราะห์ MS2

การวิเคราะห์ข้อมูล MS ข้อมูลดิบทั้งหมดถูกวิเคราะห์โดยใช้ MaxQuant (เวอร์ชัน 1.6.6.0) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Tyanova et al., 2016a) เราทำการค้นหากับโปรตีโอมอ้างอิง UniProt ที่ย่อยด้วยซิลิกาสำหรับ Homo sapiens รวมถึงลำดับตามรูปแบบบัญญัติและลำดับไอโซฟอร์ม (27 พฤษภาคม 2019) การค้นหาฐานข้อมูลดำเนินการตามการตั้งค่ามาตรฐานโดยมีการแก้ไขดังต่อไปนี้ ใช้การย่อยอาหารด้วย Trypsin/P ซึ่งช่วยให้เกิดรอยแยกที่พลาดไปสี่ส่วน ออกซิเดชัน (M) และอะเซทิล (โปรตีนระยะ N) ยอมให้เป็นการดัดแปลงแบบแปรผันด้วยจำนวนสูงสุดสามตัว คาร์บามิโด-เมทิล (C) ถูกปิดใช้งานเป็นการดัดแปลงแบบตายตัว เปิดใช้งานการวัดปริมาณแบบไม่มีฉลาก (LFQ) โดยไม่อนุญาตให้ใช้ Fast LFQ ข้อมูลเอาต์พุต Max-Quant ได้รับการประมวลผลเพิ่มเติมโดยใช้แพลตฟอร์มการคำนวณของ Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b) ค่าความเข้มของ LFQ ถูกเปลี่ยนรูป log2 และสารปนเปื้อนและโปรตีนที่อาจเกิดขึ้นที่ระบุโดยเปปไทด์แบบเฉพาะตำแหน่งหรือแบบย้อนกลับถูกกำจัดออก ตัวอย่างถูกจัดกลุ่มในหมวดหมู่การทดลอง และโปรตีนที่ไม่ได้ระบุในสี่ในสี่ซ้ำในกลุ่มอย่างน้อยหนึ่งกลุ่มก็ถูกกำจัดออกไปเช่นกัน ค่าที่หายไปถูกกำหนดโดยใช้ค่าที่กระจายตามปกติโดยมีการเปลี่ยนเกียร์ลง 1.8 (log2) และความกว้าง 0.3 แบบสุ่ม (log2) โดยพิจารณาจากค่าเมทริกซ์ทั้งหมด การวิเคราะห์ทางสถิติ (t-tests) ถูกดำเนินการเพื่อกำหนดว่าโปรตีนใดได้รับการเสริมสร้างอย่างมีนัยสำคัญ แปลงภูเขาไฟถูกสร้างขึ้น และตารางผลลัพธ์การวิเคราะห์ทางสถิติได้รับการประมวลผลเพิ่มเติมใน Microsoft Excel ข้อมูล MS proteomics ถูกฝากไปยัง ProteomeXchange Consortium ผ่านที่เก็บพันธมิตร PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) พร้อมตัวระบุชุดข้อมูล PXD017940

การทำให้บริสุทธิ์ของรีคอมบิแนนท์ ERCC1-XPF

การผลิต Baculovirus ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยใช้โครงสร้าง pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin และ Sch¨ arer, 2002) ERCC1WT และ ERCC1R156W ถูกแสดงร่วมกับ XPFWT จากบาคูโลไวรัสตัวเดียวในเซลล์แมลง Sf9 เฮเทอโรไดเมอร์ถูกทำให้บริสุทธิ์เหนือความสัมพันธ์ของนิกเกิล การยกเว้นตามขนาด และโครมาโตกราฟีของเฮปารินตามที่อธิบายไว้ (Enzlin และ Sch¨ arer, 2002) ERCC1-XPF ถูกชะออกจากคอลัมน์เฮปารินที่ NaCl ประมาณ 600 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้นของโปรตีนอยู่ในช่วง 0.1 ถึง 0.2 มก./มล.

การทดสอบนิวเคลียส

ซับสเตรตแบบวงลำต้น (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC)ที่มีสีย้อมเรืองแสง Cy5 (5{17}} pmol) ที่ 39 เทอร์มินี (IDT) ถูกอบอ่อนในบัฟเฟอร์การอบอ่อน 100-µl (10 mM Tris, pH 7.5 และ 50 mM NaCl) โดยให้ความร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาทีและค่อยๆ เย็นลงในช่วง 2 ชั่วโมง 200 fmol ของซับสเตรตอบอ่อนถูกใช้ในปฏิกิริยา 20-µl ที่มี 25 mM HEPES, pH8.0, 2 mM MgCl2, กลีเซอรอล 10 เปอร์เซ็นต์, 0.5 mM -mercaptoethanol, 0.1 มก./มล. BSA, 40 มิลลิโมลาร์ NaCl และโปรตีน 0–40 นาโนโมลาร์ ปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 30 องศาเป็นเวลา 30 นาทีและหยุดโดยการเติม 10 ไมโครลิตร90 เปอร์เซ็นต์ ฟอร์มาไมด์/10 มิลลิโมลาร์ EDTA หลังจากให้ความร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาทีและทำให้เย็นลงบนน้ำแข็ง บรรจุตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง 15 ไมโครลิตรลงบนเจลพอลิอะคริลาไมด์ที่ทำให้เสียสภาพ 15 เปอร์เซ็นต์ เจลถูกเรียกใช้ที่ 30 mA เป็นเวลา 30 นาที และแถบถูกมองเห็นได้ด้วยการเรืองแสงโดย Typhoon RGB(Amersham Biosciences)

การทดสอบ NER ในหลอดทดลอง

สารสกัดจากเซลล์ที่ขาด XPF (XP2YO) และพลาสมิดที่มีรอยโรค dG-AAF เฉพาะไซต์ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . สำหรับแต่ละปฏิกิริยา 2 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ซ่อมแซม (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM phosphocreatine และ 1.8 มก. / ml BSA, pH สุดท้าย 7.8), 0.2 µl ของ creatine phosphokinase buffer (2.5 mg/ml creatine phosphokinase จากกล้ามเนื้อกระต่าย [Sigma Aldrich], 10 mM glycine, pH 9.0 และ 50 เปอร์เซ็นต์ glycerol), 3 µl ของเซลล์ที่ขาด XPF สารสกัด, NaCl (จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 70 มิลลิโมลาร์) และโปรตีน ERCC1-XPF ที่บริสุทธิ์ในปริมาตรรวม 9 ไมโครลิตร ถูกอุ่นล่วงหน้าที่ 30 องศาเป็นเวลา 10 นาที พลาสมิด 1 ไมโครลิตรที่มี dG-AAF (50 นาโนกรัม/ไมโครลิตร) ถูกเติมไปยังแต่ละปฏิกิริยา และปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 30 องศาเป็นเวลา 45 นาที จากนั้น ของผสมของปฏิกิริยาถูกทำให้เย็นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที, ที่ตามด้วยการเติม 0.5 ไมโครลิตรของสายเสริม 1 ไมโครโมลาร์ d(GGGGCATGTGGCGCCGGTATAGC TACGTAGCTC) และของผสมของปฏิกิริยาถูกทำให้เสียสภาพโดยการให้ความร้อนที่ 95 องศา เป็นเวลา 5 นาที หลังจากการหลอมที่อุณหภูมิห้อง 15 นาที ส่วนผสมของลำดับ 1 ไมโครลิตร (ที่มี 0.13 U ของลำดับและ 2.0 µCi [ -32P] dCTP สำหรับแต่ละปฏิกิริยา) ถูกเติม หลังจากการบ่มล่วงหน้าที่ 37 องศาเป็นเวลา 3 นาที, 1.2 ไมโครลิตรของของผสมดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต (50 ไมโครโมลาร์ dCTP, 100 ไมโครโมลาร์ dTTP, 100 ไมโครโมลาร์ dATP และ 100 ไมโครโมลาร์ dGTP) ถูกเติม ของผสมของปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 12 นาที และปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเติมสีย้อมใส่ 8 ไมโครลิตร (ฟอร์มาไมด์ 80 เปอร์เซ็นต์และ EDTA 10 มิลลิโมลาร์) ตัวอย่างถูกให้ความร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที ทำให้เย็นบนน้ำแข็ง และบรรจุลงบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ทำให้เสียสภาพ 14 เปอร์เซ็นต์ เจลถูกเรียกใช้ที่ 45 W เป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง และแสดงแถบสีโดยใช้ PhosphorImager(Typhoon RGB)

วัสดุเสริมออนไลน์

รูปที่ S1 แสดงค่าทางห้องปฏิบัติการของการทำงานของตับและไตในพี่น้อง 1 และพี่น้อง 2 รูปที่ S2 แสดงข้อมูลการจัดลำดับจีโนมที่ยืนยันการกลายพันธุ์ที่ผิดพลาดและการลบภายในในยีน ERCC1 รูปที่ S3 แสดงการแสดงออกของโปรตีนของ ERCC1 และ XPF ในไฟโบรบลาสต์ของผู้ป่วย รูปที่ S4 แสดงโปรตีนรีคอมบิแนนท์ ERCC1 และ XPF ที่บริสุทธิ์ และ Co-IP ของ ERCC1WT และ ERCC1R156W รูปที่ S5 แสดงภาพกล้องจุลทรรศน์ของ UDS จุดโฟกัส H2AX และตำแหน่งของการกลายพันธุ์ของผู้ป่วยใน ERCC1-XPF ตารางที่ S1 มีลำดับของไพรเมอร์และโพรบทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ ตารางที่ S2 แสดงรายการเซลล์ทั้งหมดที่ทดสอบในการศึกษานี้ ตารางที่ S3 แสดงรายการพลาสมิดทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการศึกษานี้ ตารางที่ S4 จัดให้มีลำดับ sgRNA ของการศึกษา และตารางที่ S5 แสดงแอนติบอดี ตารางที่ S6 จัดให้มีจำนวนเซลล์ที่ใช้สำหรับการหาปริมาณในรูป Data S1 แสดงไฟล์ Western blot ที่ไม่ได้ครอบตัดทั้งหมด

รับทราบ

ผู้เขียนรับทราบทั้งพี่น้องและผู้ปกครองที่มีส่วนร่วมในบทความนี้ Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Netherlands) สำหรับ thepLenti-CW57-TO-GFP lentiviral expression vector และคำแนะนำในการสร้าง KI เซลล์ Joachim Goedhart (มหาวิทยาลัยอัมสเตอร์ดัม อัมสเตอร์ดัม เนเธอร์แลนด์) สำหรับ mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, เนเธอร์แลนด์) สำหรับสารยับยั้ง DNA-PK, Wim Vermeulen และ Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Netherlands) สำหรับให้ เซลล์ 165TOR, Tomoo Ogi (มหาวิทยาลัยนาโกย่า ประเทศญี่ปุ่น) สำหรับการจัดหาเซลล์ CS20LO, Alan Lehman (มหาวิทยาลัย Sussex, UK) สำหรับการจัดหาเซลล์ CSL16NG และ CSL16NG hTERT และ Joost Schimmel (LUMC, Leiden, เนเธอร์แลนด์) สำหรับคำแนะนำในการสร้างเซลล์ KI .

งานนี้ได้รับทุนจาก Leiden University Medical CenterResearch Fellowship และ Nederlandse Organisatie voor เรา tenschappelijk Onderzoek VIDI ให้ทุน (ALW.016.161.320) แก่ MSLuijsterburg ซึ่งเป็น European Research Council เริ่มต้น (310913) แก่ ACO Vertegaal ทุน KWF Kankerbestrijding YoungInvestigator ( 11367 ถึง R. Gonz´alez-Prieto ทุน KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) แก่ MA Rooimans และทุนจากสถาบัน Korean Institute for Basic Science (IBS-R022-A1) และ National สถาบันมะเร็ง (P01CA092584) ถึง ODSch arer

ผลงานของผู้เขียน: K. Apelt สร้างเซลล์ KO, เซลล์ KI และเส้นเซลล์ที่เสถียร ดำเนินการ Western blot และ immunostainings สำหรับการแสดงออกของ ERCC1 และ XPF, การถ่ายทอด lentiviral, การอยู่รอดของโคลน (UV, MMC, IR), การทดลอง Co-IP สำหรับการวิเคราะห์ Western blot, การทดลอง UDS, การทดลอง Co-IP สำหรับ MS และการย้อมสี H2AX; และเขียนกระดาษ A. Kragten ดำเนินการ UDS, RRS และ immunostainings หลังจาก UV ในพื้นที่ AP Wonder gem สร้างเซลล์ KO และ KI และทำการทดลอง UDS, Western blot และการจัดลำดับ Sanger เพื่อยืนยันการกลายพันธุ์ missense SM White ให้คำปรึกษาแก่ผู้ป่วย วิเคราะห์ข้อมูล exome ตรวจชิ้นเนื้อ สร้างไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิ และเขียนคำอธิบายผู้ป่วยทางคลินิก S. Lunke และ BT Wilson สร้างข้อมูล NGS S. Pantaleoและ D. Flanagan ดำเนินการ qPCR เพื่อตรวจสอบการลบ C.Quinlan เขียนคำอธิบายทางคลินิกของไต W. Hardikarเขียนคำอธิบายทางคลินิกของตับ MA Rooimans และ R.MF Wolthuis สร้างไฟโบรบลาสต์ 48BR และ PV50LD ที่ถูกทำให้เป็นอมตะ hTERT และทำการทดสอบการแตกหักของโครโมโซมที่เกิดจาก MMC R. Gonzalez-Prieto และ ACO Vertegaal วิเคราะห์การทดลอง MS ทั้งหมด WW Wiegant และ H. vanadium ทำการเอาชีวิตรอดจากโคลนในเซลล์ U2OS (IR) J.-E.Yeo และ HS Kim ทำให้โปรตีนรีคอมบิแนนท์บริสุทธิ์และทำการทดสอบนิวคลีเอสและการทดสอบ NER ในหลอดทดลอง OD Sch¨arerดูแลงาน NER ในหลอดทดลอง ซึ่งมีส่วนช่วยในการตีความโครงสร้างของอัลลีล R156W และแก้ไขบทความ MS Luij sterburg ดูแลโครงการและเขียนบทความ

อ้างอิง

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky และ SM Elsayed พ.ศ. 2554. Cholestasis ในผู้ป่วยโรค Cockayne และเสนอแนะเกณฑ์การแก้ไขสำหรับการวินิจฉัยทางคลินิก เด็กกำพร้าเจ Dis. หายาก 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown และ PJ McHugh 2017. RPA กระตุ้นเอ็นโดนิวคลีเอส XPF-ERCC1 เพื่อเริ่มต้นการประมวลผลการเชื่อมโยงขวางระหว่างสายดีเอ็นเอ EMBO จ. 36: 2047–2060

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson และ RS Nairn พ.ศ. 2543 บทบาทของ ERCC1 ในการกำจัดหางยาวที่ไม่เท่ากันระหว่างการรวมตัวใหม่ที่เป็นเป้าหมาย EMBO จ. 19:5552–5561.

Ahmad, A. , AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers และ LJ Niedernhofer 2008. ERCC1-เอ็นโดนิวคลีเอส XPF ช่วยซ่อมแซม DNA ที่แตกเป็นสองเส้น มล. เซลล์. ไบโอล. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, และคณะ 2010. การแปลผิดตำแหน่งของนิวคลีเอส XPF-ERCC1 มีส่วนช่วยในการซ่อมแซม DNA ที่ลดลงในผู้ป่วย XP-F ป.ล. เจเนท 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. โรคโลหิตจาง Fanconi และการวินิจฉัย มุตตา. ความละเอียด 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa และ N. Tebib 2017. การมีส่วนร่วมของไตใน 2 พี่น้องที่เป็นโรคค็อกเคน อิหร่าน. เจ. โรคไต. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski และ RD Wood พ.ศ. 2536 แก้ไขร่วมกันของ ERCC1, ERCC4 และ xeroderma pigmentosum group F DNA ซ่อมแซมข้อบกพร่องในหลอดทดลอง EMBO จ. 12:3685–3692

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol , et al. 2013. การกลายพันธุ์ใน ERCC4 ที่เข้ารหัสเอ็นโดนิวคลีเอส XPF ที่ซ่อมแซม DNA ทำให้เกิดโรคโลหิตจาง Fanconi เป็น. เจ. ฮุม. ยีนต์. 92:800–806.

Ceccaldi, R. , P. Sarangi และ AD D'Andrea 2016 เส้นทางโรคโลหิตจาง Fanconi: ผู้เล่นใหม่และฟังก์ชั่นใหม่ แนท. รายได้โมล เซลล์ไบโอล. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers และ JH Hoeijmakers พ.ศ. 2541 องค์ประกอบโครงสร้าง DNA ที่จำเป็นสำหรับกิจกรรมเอนโดนิวคลีเอสของ ERCC1-XPF เจ. ไบโอล. เคมี. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers และ JH Hoeijmakers 1998ข. การทำแผนที่ของโดเมนอันตรกิริยาระหว่างโปรตีนซ่อมแซมของมนุษย์ ERCC1 และ XPF กรดนิวคลีอิก 26:4146–4152.

นาร์/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg และ SJ Verbeek พ.ศ. 2538 เพิ่มความไวต่อรังสีอัลตราไวโอเลตบีและสารก่อมะเร็งในหนูที่ไม่มียีน XPA ของยีนซ่อมแซมการตัดตอนดีเอ็นเอ ธรรมชาติ. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ และ KH Kraemer พ.ศ. 2555 ฉายแสงบนซีโรเดอร์มา พิกเมนต์โกซัม เจ. ลงทุน. เดอร์มาทอล 132:785–796.

Enzlin, JH และ OD Schrer พ.ศ. 2545 บริเวณที่ใช้งานของเอ็นโดนิวคลีเอสการซ่อมแซมดีเอ็นเอ XPF-ERCC1 ก่อให้เกิดรูปแบบนิวคลีเอสที่ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูง EMBO จ. 21:2045–2053.

Funaki, S. , S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada และ H. Kitamura พ.ศ. 2549 กลุ่มอาการค็อกเคนที่มีอาการไตอักเสบเฉียบพลันแบบเฉียบพลัน ปทุม. อินเตอร์ 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer และ OD Schrer 2005. การรวมเฉพาะไซต์ของ N- (deoxyguanosine-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) ลงในโอลิโกนิวคลีโอไทด์โดยใช้การสังเคราะห์ดีเอ็นเอ 'อ่อนมาก' ที่ดัดแปลง กรดนิวคลีอิก 33:1961–1969.

Gregg, SQ, AR Robinson และ LJ Niedernhofer 2011. ผลทางสรีรวิทยาของข้อบกพร่องใน ERCC1-เอ็นโดนิวคลีเอสการซ่อมแซมดีเอ็นเอ XPF การซ่อมแซมดีเอ็นเอ (Amst.). 10:781–791.

Guo, C. , Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. พ.ศ. 2558 การขาด XRCC4 ในมนุษย์ทำให้เกิดฟีโนไทป์ทางระบบประสาทที่ทำเครื่องหมายไว้ แต่ไม่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องอย่างโจ่งแจ้ง เจ. คลินิกภูมิแพ้. อิมมูนอล 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, และคณะ 2020. การสูญเสีย ZBTB24 บั่นทอนการเข้าร่วม end-join และ class-switch ที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันในผู้ป่วย ICF syndrome เจ. เอ็กซ์พี. เมดิ. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij-makers และ W. Vermeulen 2542. การกระทำของเอ็นโดนิวคลีเอสการซ่อมแซมดีเอ็นเอ ERCC1/XPF ในเซลล์ที่มีชีวิต. ศาสตร์. 284:958–961. ชม.

วิทยาศาสตร์284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, ผู้ผลิต JH Hoeij และ W. Vermeulen พ.ศ. 2550 ผู้ป่วยรายแรกที่รายงานภาวะขาด ERCC1 มีอาการ Cerebro-oculofacio-skeletal syndrome โดยมีข้อบกพร่องเล็กน้อยในการซ่อมแซมการตัดตอนนิวคลีโอไทด์และพัฒนาการล้มเหลวอย่างรุนแรง เป็น. เจ. ฮุม. ยีนต์. 80:457–466.

Joenje, H. , AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald และ F. Arwert 1997. หลักฐานสำหรับยีนโรคโลหิตจาง Fanconi อย่างน้อยแปดตัว เป็น. เจ. ฮุม. ยีนต์. 61:940–944.

Jones, M. , F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch และ NQ McDonald 2020 โครงสร้าง Cryo-EM ของเอ็นโดนิวคลีเอส XPF-ERCC1 เผยให้เห็นว่าการมีส่วนร่วมของจุดแยก DNA ขัดขวางโครงสร้างที่ถูกยับยั้งโดยอัตโนมัติได้อย่างไร แนท. คอมมูนิตี้ 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau และ VA Bohr 2017. กลุ่มอาการค็อกเคน: ลักษณะทางคลินิก ระบบแบบจำลอง และวิถีทาง ริ้วรอยก่อนวัย วิ. 33:3–17.002

Kashiyama, K. , Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. ความผิดปกติของนิวคลีเอส ERCC1-XPF ส่งผลให้เกิดอาการทางคลินิกที่หลากหลายและทำให้เกิดกลุ่มอาการค็อกเคน, ซีโรเดอร์มารงควัตถุและโรคโลหิตจาง Fanconi เป็น. เจ. ฮุม. ยีนต์. 92:807–819.