ส่วนที่ 2 Echinacoside เพิ่มปริมาณอสุจิในหนูโดยกำหนดเป้าหมายตัวรับแอนโดรเจนไฮโปทาลามิก

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 1

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

การอภิปราย

บันทึกทางชาติพันธุ์วิทยาและการศึกษาก่อนหน้าของเรา13 ยืนยันว่าCistanche tubulosaสารสกัดเพิ่มระดับฮอร์โมนเพศอย่างมีประสิทธิภาพและปรับปรุงคุณภาพของตัวอสุจิECHเป็นหนึ่งในสารประกอบหลักในCistanche tubulosa19,20 สามารถเพิ่มจำนวนอสุจิและเพิ่มการหลั่งของ LH และ T (รูปที่ 1) ในการศึกษานี้เราแสดงให้เห็นว่าECHถูกแจกจ่ายไปยังไฮโปทาลามัสแทนอัณฑะซึ่งบ่งบอกถึงผลกระทบทางอ้อมของ ECH ต่ออัณฑะ แท้จริงแล้ว ECH ยับยั้งการทำงานของ hypothalamic AR โดยตรง การโยกย้าย AR ไปยังนิวเคลียส และการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับแกน HPG และยังให้การป้องกันความเสียหายจากการสืบพันธุ์ที่เกิดจาก BPA

ในการศึกษาการผลิต gonadotrophin ของมนุษย์ ระดับฮอร์โมนเพศถูกควบคุมอย่างเข้มงวดโดยแกน HPG และลูปตอบรับเชิงลบ 21 กล่าวคือ การหลั่ง T เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในการตอบสนองต่อการเพิ่มขึ้นของระดับ LH ในเลือดอย่างสม่ำเสมอและต่อเนื่องเพื่อตอบสนองต่อการขาดการตอบสนองแอนโดรเจนเชิงลบต่อต่อมใต้สมองและไฮโปทาลามัส ในการศึกษาครั้งนี้ECHเพิ่มการหลั่งของ LH ในสมองและต่อมใต้สมองและการผลิตฮอร์โมนเพศชายในระดับอัณฑะและ mRNA ของ LHR และ Gnrhr ในสมองและต่อมใต้สมอง (รูปที่ 1 และรูปที่ 4) แสดงให้เห็นว่าECHอาจส่งผลต่อข้อเสนอแนะเชิงลบของแกน HPG ไม่น่าแปลกใจเลยที่ AR เองมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการป้อนกลับของระดับ T และ LH22,23 กระบวนทัศน์แกน HPG ของผู้ชายมีศูนย์กลางอยู่ที่ฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนซึ่งให้การกดขี่ความคิดเห็นเชิงลบที่ระดับของทั้งไฮโปทาลามัสและต่อมใต้สมอง24,25 การศึกษาก่อนหน้านี้ใช้ Foxg1-Cre เพื่อขจัดยีนที่น่าสนใจในต่อมใต้สมอง แต่ไม่ใช่ไฮโปทาลามัสเพื่อกำหนดความสำคัญสัมพัทธ์ของทั้งสองภูมิภาค ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ AR ในต่อมใต้สมองของหนูเมาส์ตัวผู้นั้นสามารถจ่ายได้ในเรื่องที่เกี่ยวกับการควบคุมการหลั่ง LH ที่ขึ้นกับฮอร์โมนเทสโทสเตอโรน26 ด้วยเหตุนี้ เราจึงเลือกเน้นที่ hypothalamic AR เพื่อการศึกษาต่อ

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

ในฐานะที่เป็นตัวรับฮอร์โมนนิวเคลียร์สเตียรอยด์ กิจกรรมของ AR ถูกควบคุมโดยสเตียรอยด์ลิแกนด์ T ซึ่งมีผลผูกพันซึ่งจะเริ่มต้นการโยกย้ายนิวเคลียร์และหน้าที่การกำกับดูแลการถอดรหัสของ AR27 ในการศึกษานี้ เราพบว่าECHการรักษายับยั้งการเคลื่อนย้าย AR จากไซโตพลาสซึมไปสู่นิวเคลียสในมลรัฐ (รูปที่ 3) นอกจากนี้ จากการศึกษา PK พบว่าECHสามารถเจาะทะลุไปยังไฮโปทาลามัสได้อย่างชัดเจนมากกว่าไปยังอัณฑะ ซึ่งบ่งชี้ว่ามี ECH มากกว่าที่ข้ามผ่าน Blood-Brain Barrier ซึ่งอาจผ่านทางเอนโดไซโทซิส แทนที่จะเป็น Blood Testis Barrier นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นโดยทางอ้อม ELISA ว่าความสามารถในการรวมของ ECH และ AR ที่บอกว่า ECH สามารถผูกกับ AR ได้โดยตรง สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยผลลัพธ์ของการสอบวิเคราะห์การเทียบท่าของโมเลกุลที่บ่งชี้ว่ามีตำแหน่งการจับสมมุติฐานสำหรับ ECH อยู่ที่ Met-894 และ Val-713 ในกระเป๋า AR (รูปที่ 5D) สิ่งนี้สนับสนุนการค้นพบของผู้อื่นที่ AR มีส่วนร่วมในการควบคุมลูปฟีดเชิงลบและการลดลงของปฏิสัมพันธ์ AR-T ในสมองส่งผลให้มีการหลั่ง LH เพิ่มขึ้น23,28,29

Steroidogenesis เป็นกระบวนการที่ควบคุมอย่างเข้มงวดและจำเป็นสำหรับการพัฒนาของการสร้างสเปิร์มโดยมีส่วนร่วมของโปรตีน steroidogenic (StAR)30 และเอ็นไซม์สเตียรอยด์ เช่น CYP11A1, CYP17A1, 3 -hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3 ) และ 17 -hydroxysteroid dehydrogenase (HSD17 ) ซึ่งเปลี่ยนคอเลสเตอรอลเป็นฮอร์โมนเพศชาย31. เราแสดงให้เห็นว่าระดับ mRNA ของยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์เหล่านี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญด้วยECHการรักษาในขณะที่การแสดงออกของ Star mRNA ไม่เปลี่ยนแปลง นี่แสดงว่าECHไม่มีผลต่อการถ่ายโอนคอเลสเตอรอลไปยังเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรีย ในขณะที่อาจมีบทบาทในการส่งเสริมการเปลี่ยนคอเลสเตอรอลเป็นฮอร์โมนเพศชาย จึงสามารถสรุปได้ว่าECHการรักษาช่วยเพิ่มจำนวนอสุจิโดยการเพิ่มการสังเคราะห์และการหลั่งฮอร์โมนเทสโทสเตอโรน

เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันของECHเกี่ยวกับการบาดเจ็บของอสุจิ bisphenol A (BPA) ซึ่งเป็นสารก่อกวนต่อมไร้ท่อภายนอกโดยทั่วไป ถูกใช้เป็นแบบอย่างของความเสียหายต่อการสืบพันธุ์ของผู้ชายในหนูทดลอง32ECHการรักษาสามารถกู้คืนจำนวนอสุจิ การเคลื่อนไหวของตัวอสุจิ ระดับ T และ LH ที่ลดลงโดย BPA (รูปที่ 6A, B) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งบ่งชี้ว่า ECH สามารถลดอาการบาดเจ็บของตัวอสุจิได้

เมื่อเทียบกับสารเคมีที่สังเคราะห์ขึ้นเพื่อการบำบัดทดแทนฮอร์โมนECHเป็นสารประกอบที่ไม่ใช่ฮอร์โมนตามธรรมชาติที่ส่งผลต่อการตอบสนองเชิงลบต่อแกน HPG ซึ่งจะเป็นการเพิ่มการหลั่งของ LH, T และคุณภาพของสเปิร์ม เส้นทางกลไกนี้อาจปกป้องระบบสืบพันธุ์เพศชายและดังนั้นECHถือได้ว่าเป็นสารป้องกันการสืบพันธุ์ตามธรรมชาติที่อาจเกิดขึ้นได้ อย่างไรก็ตาม กฎข้อบังคับของฮอร์โมนนั้นซับซ้อนและมักจะนำไปสู่ผลที่เป็นระบบ ตามที่ระบุในรูปที่ 7 ECH เพิ่มการหลั่ง T และ LH และยับยั้งการกระตุ้น AR ซึ่งอาจนำไปสู่ผลที่ตามมาต่อสุขภาพหรือวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับโรคอื่นๆ เช่น โรคกระดูกพรุน33 และภาวะซึมเศร้าในผู้ชาย34 ดังนั้น ผลกระทบที่ครอบคลุมของ ECH ควรเพิ่มเติม สอบสวน

เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราระบุว่าECHจับกับ AR ในมลรัฐและยับยั้งการถ่ายโอน AR จากไซโตพลาสซึมไปยังนิวเคลียส ข้อมูลของเราแนะนำว่า ECH จับกับไซต์ในกระเป๋า AR ที่กรดอะมิโน Met-894 และ Val-713 นี้อาจอธิบายการเพิ่มขึ้นของระดับ T และ AR เป็นการตอบสนองอย่างเป็นระบบต่อระดับฮอร์โมนที่สมดุลโดยการส่งเสริมการหลั่ง LH และการเพิ่มการผลิต T และจำนวนอสุจิในภายหลัง (รูปที่ 8)

วิธีการ

คำชี้แจงจริยธรรม

การศึกษานี้ดำเนินการตามแนวทางปฏิบัติสำหรับสัตว์ทดลองที่จัดตั้งขึ้นโดยกระทรวงวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (ปักกิ่ง ประเทศจีน) อย่างเคร่งครัด ระเบียบวิธีการทดลองทั้งหมดได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสถาบันเทคโนโลยีอันยาง

สัตว์ทดลอง.

หนูคุนหมิงสายพันธุ์แท้อายุสี่สัปดาห์ (22 ก–25 ก.) ได้มาจากศูนย์สัตว์ของมหาวิทยาลัยแพทย์ทหารแห่งที่สี่ (ซีอาน ประเทศจีน) สัตว์ Te ถูกเลี้ยงไว้ภายใต้สภาวะควบคุมที่อุณหภูมิ 22 องศา ± 2 องศา , ความชื้น 70 เปอร์เซ็นต์ ± 4 เปอร์เซ็นต์ ด้วยการปั่นจักรยานในที่มืดเป็นเวลา 12 ชั่วโมง และสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้โดยเสรี

ทดลองรักษา.

การทดลองที่ 1 สุ่มแบ่งหนูออกเป็นหกกลุ่ม โดยแบ่งเป็นหนูเจ็ดกลุ่มในแต่ละกลุ่ม (n=7)ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, China) ได้รับการดูแลโดยใช้ท่อในกระเพาะอาหาร และให้ฮอร์โมน testosterone propionate (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, China) โดยการฉีดเข้ากล้ามวันละครั้งเป็นเวลา 14 วัน ตามการออกแบบการทดลองต่อไปนี้: กลุ่มควบคุม: น้ำเกลือปกติ (10มล./กก.), กลุ่ม ECH(L) (5 มก./กก.), กลุ่ม ECH(M) (20 มก./กก.),ECH(H) กลุ่ม (80 มก./กก.), TP (15 มก./กก.) และเอนซาลูตาไมด์ (ตัวยับยั้ง AR วันละครั้งทุกวัน ๆ เป็นเวลา 14 วัน; 20 มก./กก.; CAS: 915087-33-1; อะลาดิน เซี่ยงไฮ้ จีน)

หลังจากการรักษา 2 สัปดาห์ หนูทดลองถูกทำให้หมดความรู้สึกด้วยไดเอทิล อีเทอร์ เพื่อเก็บตัวอย่างเลือดเพื่อวิเคราะห์ระดับฮอร์โมน จากนั้นหนูจะถูกผ่าเพื่อแยกไฮโปทาลามัส เอนเซฟาลอน บวกกับต่อมใต้สมอง อัณฑะ และคอดาอีพิดิไดมิส ตัวอย่างของ cauda epididymis ถูกใส่ในน้ำเกลือปกติที่มี BSA 5 เปอร์เซ็นต์สำหรับการประเมินคุณภาพของตัวอสุจิ และ hypothalamus, encephalon plus pituitary และอัณฑะถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ −80 องศาเพื่อทำการตรวจสอบต่อไป

การทดลองที่ 2 สุ่มแบ่งหนูออกเป็น 10 กลุ่ม กลุ่มละ 5 ตัวECH(20มก./กก.) ถูกบริหารให้ทางปากและหนูเมาส์ในแต่ละกลุ่มถูกดมยาสลบด้วยไดเอทิล อีเทอร์ที่จุดเวลา 0.5 h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h, 4h, 6h, 9h, และ 12 ชั่วโมงหลังการให้ยาเพื่อเก็บตัวอย่าง เก็บพลาสม่าและหัวใจถูกเปิดเผย การให้น้ำเกลือปกติเข้าไปในช่องด้านซ้ายโดยใช้เครื่องฉีดจนกว่าตับและปอดจะลวก รวบรวมไฮโปธาลามิและอัณฑะ 10 อันเพื่อกำหนดความเข้มข้นของเนื้อเยื่อของ ECH

การทดลองที่ 3 สุ่มแบ่งหนูออกเป็น 4 กลุ่ม กลุ่มละ 7 กลุ่มECHและ BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, China) ถูกบริหารให้โดยใช้สายยางในกระเพาะอาหารวันละครั้งเป็นเวลา 6 สัปดาห์ตามการออกแบบการทดลองต่อไปนี้: กลุ่มปกติ (น้ำมันข้าวโพด, 10 มล./กก., bw/d) , กลุ่มแบบจำลอง: กลุ่ม BPA (BPA 200 มก./กก., bw/d, น้ำมันข้าวโพด) และกลุ่มทดลอง: กลุ่ม BPA บวก ECH (BPA 200 มก./กก.; ECH 20 มก./กก.) หลังจาก 42 วันของการรักษา หนูทดลองถูกวางยาสลบด้วยไดเอทิล อีเทอร์ และเก็บตัวอย่างเลือดเพื่อวิเคราะห์ระดับฮอร์โมน Te testis และ cauda epididymis ถูกแยกและรวบรวม ใช้หลอดน้ำอสุจิสำหรับการประเมินคุณภาพของตัวอสุจิ และอัณฑะถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ −80 องศาเพื่อทำการตรวจสอบต่อไป

การกำหนดคุณภาพของตัวอสุจิ การเตรียมสารแขวนลอยตัวอสุจิ Cauda epididymides ถูกสับเป็นน้ำเกลือปกติ 5 มล. มี BSA 5 เปอร์เซ็นต์และฟักเป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 องศาเพื่อให้เนื้อหากระจายไปในตัวกลาง จำนวนอสุจิ: ตามวิธีการที่อธิบายโดย Yokoi (2003) สารแขวนลอยของอสุจิที่เจือจาง (1:10; v/v; ตัวอสุจิแขวนลอย/10 เปอร์เซ็นต์เมทานอล) ถูกถ่ายโอนไปยังห้องนับแต่ละห้องของฮีโมไซโตมิเตอร์ และได้รับอนุญาตให้ยืนเป็นเวลา 5 นาที แล้วนับด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Nikon, Instruments Inc., Japan) ด้วยกำลังขยาย X200 ความอยู่รอดของอสุจิ: สารแขวนลอยของตัวอสุจิทั้งหมด 20μL ผสมกับคราบ eosin-nigrosin ในปริมาณเท่ากันเป็นเวลา 2 นาที; สเปิร์มที่ไม่เปื้อนถูกนับด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่กำลังขยาย 200 เท่า การเคลื่อนที่ของอสุจิ: แขวนสเปิร์มทั้งหมด 10 ไมโครลิตรลงบนสไลด์แก้ว และบันทึกว่าเคลื่อนที่หรือไม่เคลื่อนที่ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่กำลังขยาย 200 เท่า

การกำหนดระดับฮอร์โมน ระดับของฮอร์โมนเทสโทสเตอโรน (T) และ LH ถูกหาปริมาณในซีรัม เอนเซฟาลอนบวกกับต่อมใต้สมอง และอัณฑะ homogenates โดยใช้ชุดตรวจทางภูมิคุ้มกัน (RIA) (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพปักกิ่งชิโน-สหราชอาณาจักร ปักกิ่ง ประเทศจีน) โดยย่อ แอนติบอดีต้านฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนหรือแอนติ-LH IgG (100 ไมโครลิตร) และ 125-แอนติบอดีต้านเมาส์ที่คอนจูเกต I ถูกเติมลงในตัวอย่างหรือมาตรฐาน (100 ไมโครลิตร) และผสมบนเครื่องโยกข้ามคืนที่ 4 องศา หลังจากล้างสามครั้งด้วย PBS-Tween 20 (500 ไมโครลิตร) ของผสมถูกหมุนเหวี่ยง (3500 รอบต่อนาที/นาที) ที่ 4 องศาเป็นเวลา 15 นาที ค่า CPM ของตะกอนถูกประเมินโดยเครื่องมือ radioimmunoassay (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, China) และคำนวณความเข้มข้นของ T และ LH ตามสูตรของมาตรฐาน เส้นโค้ง ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันของ Te T และ LH คือ 2.8 เปอร์เซ็นต์ และ 3.2 เปอร์เซ็นต์ ในกลุ่มตัวอย่าง และ 2.1 เปอร์เซ็นต์ และ 2.8 เปอร์เซ็นต์ ในกลุ่มมาตรฐาน ตามลำดับ

การกำหนดการแสดงออกของยีนด้วย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ Total RNA แยกได้จากอัณฑะแช่แข็งและเอนเซฟาลอน บวกกับเนื้อเยื่อต่อมใต้สมองโดยใช้ชุด RNA Simple Total RNA (Tiangen, Beijing, China) PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (q RT-PCR) ดำเนินการสำหรับการประยุกต์ใช้ cDNA โดยใช้ 2×SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) ขั้นตอน PCR ประกอบด้วย 95 องศาเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วย 35 รอบ 95 องศาเป็นเวลา 15 วินาที 58 องศาเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาที การวิเคราะห์เส้นโค้งหลอมเหลวดำเนินการกับผลิตภัณฑ์ PCR เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์และความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ เส้นโค้งการแยกตัวถูกดำเนินการสำหรับแต่ละเพลตเพื่อยืนยันการผลิตผลิตภัณฑ์เดียว คำนวณความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของแต่ละ mRNA ไพรเมอร์ PCR ที่ใช้สำหรับการศึกษาแสดงไว้ในตารางที่ 2

หยดตะวันตก สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของ AR การสกัดและแยกโปรตีนไซโตพลาสมิกและนิวเคลียสได้ดำเนินการโดยใช้ชุดสกัดโปรตีนไซโตพลาสซึมและนิวเคลียร์ (Beyotime, Nanjing, China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นของ Te ของโปรตีนไซโตพลาสซึมและนิวเคลียสได้รับการประเมินโดยใช้ Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, China) ตัวอย่างโปรตีน (80ug) ถูกรันบนเจล SDS-PAGE 12 เปอร์เซ็นต์และ 5 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF หลังจากการปิดกั้น เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต้าน AR IgG (1:1,000; ไบออส; ปักกิ่งประเทศจีน) และแอนติบอดีต้าน GAPDH ของหนูเมาส์ (1:1,000; Wuhan Boster ชีวภาพ

เทคโนโลยี หวู่ฮั่น ประเทศจีน) หรือแอนติบอดีโพลีโคลนัลต้านลามินบี1 ของเมาส์ เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เมมเบรนถูกล้างสามครั้งด้วย TBST และบ่มด้วยแอนติบอดีต้านเมาส์ IgG ของกระต่ายที่คอนจูเกต HRP (1:5,000; Bioss; Beijing China) สัญญาณถูกแสดงภาพโดยใช้ ChemiDoc Imaging System (ถนน-3,500 เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน)

การทดสอบโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

เก็บเลือดในหลอดแก้วเฮปาริไนซ์ พลาสมาถูกแยกออกโดยการหมุนเหวี่ยงทันทีที่ 6,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และเก็บไว้ที่ -20 องศาสำหรับการทดลองต่อไป ตัวอย่างไฮโปทาลามัสและอัณฑะจากแต่ละจุดเวลาถูกรวมกลุ่มและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเมทานอล หลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 10,{5}}รอบต่อนาทีที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที, ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทำให้เข้มข้นโดย N2 และส่วนที่เหลืออยู่ถูกละลายใน 50 ไมโครลิตรของเมทานอลและกรองผ่านตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตร ของเหลวกรองตัวอย่างสิบไมโครลิตรถูกฉีดเข้าไปในระบบ HPLC เพื่อการวิเคราะห์ เส้นโค้งมาตรฐานประกอบด้วยตัวอย่างที่มี ECH 50, 100, 250, 500 และ 750 ng/mL (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, China) ตัวอย่างการควบคุมคุณภาพพลาสมาที่ถูกแทงด้วย ECH 75ng/mL (ต่ำ), 150 ng/mL (ปานกลาง) และ 300 ng/mL (สูง) ของ ECH ถูกเตรียมตามความเหมาะสมเพื่อวัดความแม่นยำและความแม่นยำของวิธีการ

โครมาโตกราฟีถูกดำเนินการด้วยระบบ HPLC (D2{{10}}00 ซีรีส์ Elite, Hitachi, Japan) ควบคู่กับเครื่องตรวจจับ UV (L-2400, Hitachi, Japan) ทำการแยกในคอลัมน์ Termo-C18 (250 มม. × 4.6 มม. id, 4.6 µm อนุภาค) ที่ 25 องศา เฟสเคลื่อนที่เป็นเกรเดียนท์ที่เตรียมจากกรดฟอสฟอริก 0.1 เปอร์เซ็นต์ที่มีไตรเมทิลลามีน 0.04 เปอร์เซ็นต์ (ส่วนประกอบ A) และเมทานอล (ส่วนประกอบ B) การไล่ระดับสีเชิงเส้นเป็นดังนี้: 70–90 เปอร์เซ็นต์ A ตลอด 0-2 นาที, 60–70 เปอร์เซ็นต์ A ในช่วง 2-6 นาที, 55–60 เปอร์เซ็นต์ B ตลอด 6–8 นาที จากนั้นกลับสู่ 90 เปอร์เซ็นต์ A ที่ ทันที 8 นาที อัตราการไหลคือ 0.8 มล./นาที เครื่องตรวจจับรังสียูวีทำงานที่ 332 นาโนเมตร พื้นที่พีคได้รับการประเมินเป็นการวัดเชิงวิเคราะห์

การศึกษาเภสัชจลนศาสตร์ในหนูทดลอง การแทรกซึมของ ECH ไปยังไฮโปทาลามัสและอัณฑะต้องได้รับการวิเคราะห์ทางเภสัชจลนศาสตร์ด้วยซอฟต์แวร์ยาและสถิติ (ยาและสถิติ คณะกรรมการวิชาชีพเภสัชวิทยาทางคณิตศาสตร์ของจีน) พารามิเตอร์ทางเภสัชจลนศาสตร์ถูกกำหนดโดยใช้วิธีการแบบไม่แบ่งส่วนตามทฤษฎีโมเมนต์ทางสถิติ พารามิเตอร์ทางเภสัชจลนศาสตร์เบื้องต้นรวมถึงค่าคงที่เวลาสูงสุด (Tmax), ความเข้มข้นสูงสุด (Cmax), ค่าคงที่อัตราการกำจัด (Ke), ค่าครึ่งชีวิตที่กำจัด (T0.5), พื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC{ {4}}–12), ปริมาณการกระจายที่ชัดเจน (Vc) และระยะห่าง (CL) ได้รับมาสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม อัตราส่วนสมอง/พลาสมาคำนวณจากค่า AUC0-t สำหรับพลาสมาและสมอง

การสังเคราะห์และการระบุ ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) ECH ทั้งหมด 9.8 มก. และบิวเทนไดออล แอนไฮไดรด์ 1.0 มก. ถูกละลายในไพริดีน 2 มล. ผสมเป็นเวลา 12 ชั่วโมงด้วยการกวนที่อุณหภูมิห้อง ของผสมถูกทำให้เข้มข้นโดย N2 และเรซิดิวถูกรวมกับ N-ไฮดรอกซีซัคซินิไมด์ (NHS) 10.8 มก. และไดไซโคลเฮกซิลคาร์โบไดอิไมด์ (DCC) 19.3 มก. และละลายใน 4 มล., N-ไดเมทิลฟอร์มาไมด์ (DMF) เป็นเวลา 12 ชม. ด้วยการกวนที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 2,000 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศา , ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเติมไปยัง 5 มล. ของ PBS โดยที่ 14.4 มก. โอวัลบูมิน (OVA) ถูกละลาย ของผสมใหม่ถูกกวนผสมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4 องศา จากนั้น สารละลายปฏิกิริยาถูกฟอกเพื่อต้าน PBS เป็นเวลาสามวัน การมีอยู่ของ ECH-OVA ได้รับการยืนยันโดย UV spectra (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) ที่ความยาวคลื่นตั้งแต่ 190 ถึง 400 นาโนเมตร รวมถึงการทำให้ PAGE เสื่อมสภาพ

ELISA ทางอ้อม (iELISA) ไมโครไทเทอร์เพลตถูกเคลือบด้วย ECH-OVA (2 ไมโครกรัม/100 ไมโครลิตร) และบ่มข้ามคืนที่ 4 องศา จานถูกล้างสามครั้งด้วย PBST และสองครั้งด้วย PBS และ 5 เปอร์เซ็นต์ PBSM (PBS ที่มีนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์) ถูกเติมเพื่อปิดกั้นตำแหน่งที่ไม่ถูกผูกไว้ที่ 37 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากล้างเพลตด้วย PBST และ PBS แล้ว บ่อน้ำถูกแบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม กลุ่มทดลอง 1 ไมโครกรัม AR โปรตีนทั้งหมด/100μL; กลุ่มบวก แอนติบอดีต้าน OVA ของกระต่าย (1:1,000); กลุ่มเชิงลบ, อัลบูมินในซีรัมวัว 1 มก.; และกลุ่มว่างที่มี PBS หลังจากการบ่มเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง เพลตถูกล้างและ 100 ไมโครลิตร/หลุมของ IgG ที่คอนจูเกต HRP ของกระต่าย (1:1,000) ถูกเติมไปยังกลุ่มบวก 100 ไมโครลิตร/หลุมของสารต้าน AR ถูกเติม ( 1:1,000) ให้กับกลุ่มอื่นๆ หลังจากการบ่มเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง, IgG ที่คอนจูเกต HRP ของกระต่าย (1:5,000) ของกระต่ายถูกเติมลงในเพลต หลังจากการฟักไข่ที่ 37 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จานถูกล้างสามครั้งด้วย PBST และสองครั้งด้วย PBS จากนั้นเติม TMB และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้องและเติม 2 โมลาร์ H2SO4 เพื่อหยุดปฏิกิริยา อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

การเทียบท่าระดับโมเลกุล ทำการศึกษาการเทียบท่าระดับโมเลกุลเพื่อตรวจสอบโหมดการจับของสารประกอบ ECH กับตัวรับแอนโดรเจนของมนุษย์ (AR) โดยใช้ Autodock vina 1.1.2 (//vina.scripps.edu) โครงสร้างสามมิติ (3D) ของ AR (PDB ID: 2YHD) ถูกดาวน์โหลดจาก Protein Data Bank (http://www. rcsb.org/pdb/home/hone.do) โครงสร้าง 3 มิติของ ECH ได้มาจากซอฟต์แวร์ ChemBioDraw Ultra 14.0 และ ChemBio 3D Ultra 14.0 แพ็คเกจ AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) ถูกใช้เพื่อสร้างไฟล์อินพุตการเทียบท่า ตารางการค้นหาของ AR ถูกระบุว่าเป็น center x: 36.141, center y: 8.513, และ center z: 21.304 โดยมี size size x: 15, size y: 15 และ size z: 15. ค่าของความละเอียดถี่ถ้วนถูกกำหนดเป็น 20. สำหรับการเทียบท่า Vina พารามิเตอร์เริ่มต้นจะถูกใช้หากไม่มีการกล่าวถึง ท่าที่ให้คะแนนดีที่สุดซึ่งตัดสินโดยคะแนนการเทียบท่าของ Vina ได้รับการคัดเลือกและวิเคราะห์ด้วยสายตาโดยใช้ซอฟต์แวร์ PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org) การวิเคราะห์ข้อมูลและวิธีการทางสถิติ

การวิเคราะห์ข้อมูลและวิธีการทางสถิติ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ SPSS 190 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ใช้ ANOVA ทางเดียวเพื่อเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มต่างๆ ได้ทำการทดสอบเปรียบเทียบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มโดย Tukey ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน±ค่าเฉลี่ย (SD) โดยใช้ซอฟต์แวร์ Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Sofware, Inc, California, USA)

จรรยาบรรณและยินยอมให้เข้าร่วม ได้รับการอนุมัติทางจริยธรรมสำหรับการศึกษาครั้งนี้จากคณะกรรมการจริยธรรมของสถาบันเทคโนโลยีอันยาง