Cistanche echinacoside เพิ่มแอนโดรเจนผ่านเซลล์บุผนังหลอดเลือดอย่างไร?

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เชิงนามธรรม.

Echinacoside (ECH) เป็นสารประกอบธรรมชาติที่มีผลต่อการขยายหลอดเลือดที่ขึ้นกับ endothelium ไนตริกออกไซด์ (NO) เป็น vasorelaxant ที่สำคัญที่ปล่อยออกมาจากเซลล์บุผนังหลอดเลือด เพื่อตรวจสอบกลไกระดับโมเลกุลของการผลิต NO ที่เหนี่ยวนำโดย ECH ในเซลล์บุผนังหลอดเลือด การศึกษาครั้งนี้ได้ตรวจสอบการมีส่วนร่วมของตัวรับแอนโดรเจน (AR) และวิถีฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-ไคเนส (PI3K)/โปรตีน ไคเนส บี (Akt) ใน ฟอสโฟรีเลชันของการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ที่บุผนังหลอดเลือด (eNOS) ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดจากสายสะดือของมนุษย์ (HUVECs) การใช้โพรบเรืองแสง DAF‑FM พบว่าการผลิต NO เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และ eNOS ถูกฟอสโฟรีเลตที่ Ser1177 ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นภายใต้ 0.01-10 การบำบัดด้วย ECH µM ใน HUVEC นอกจากนี้ การผลิต NO และฟอสโฟรีเลชันของ eNOS ที่เหนี่ยวนำโดย ECH นั้นลดลงเมื่อปรับสภาพด้วยนิลูตาไมด์ที่เป็นปฏิปักษ์ AR หรือเมื่อถ่ายด้วย RNA ที่รบกวน AR ขนาดเล็ก นอกจากนี้ ฟอสโฟรีเลชันที่เกิดจาก ECH ของ Akt ที่ Ser473 ถูกยกเลิกโดยเวิร์ตมันนิน 5 ไมโครโมลาร์ (ตัวยับยั้ง PI3K) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า ECH กระตุ้นการผลิต NO ผ่านการกระตุ้นที่ขึ้นกับ AR ของ eNOS ใน HUVEC และวิถีทาง PI3K/Akt อาจเกี่ยวข้องกับ eNOS phosphorylation ที่เหนี่ยวนำโดย ECH

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

Cistanche Hoffman. Et Link เป็นสมุนไพรปรสิตยืนต้นในสกุล Orobanchaceae เฮอร์บาCistanche, ลำต้นของCistanche deserticolaYC MA และCistanche tubulosa(เชงค์). Cistanche เป็นยาบำรุงที่ใช้รักษาภาวะไตบกพร่อง ความอ่อนแอ, ตกขาวผิดปกติ, และท้องผูกในวัยชรา (1) ซึ่งอาจเนื่องมาจากฮอร์โมนเพศหรือฮอร์โมนเพศที่ควบคุมได้ (2). Echinacoside (ECH; C35H46O20; น้ำหนักโมเลกุล, 786.73; รูปที่ 1) เป็นหนึ่งในฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (PhGs) ที่แยกได้จากลำต้นของ HerbaCistancheและแสดงคุณสมบัติทางชีวภาพหลายอย่าง รวมทั้งสารต้านอนุมูลอิสระ ต่อต้านริ้วรอย ต้านการอักเสบ ตับ และป้องกันระบบประสาท (3) การตรวจสอบเภสัชวิทยาสมัยใหม่ได้แสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบต่างๆ ของ HerbaCistancheซึ่งรวมถึง ECHแอคทีโอไซด์, kankanose ฝั่งลังกา F และซิสตาโนไซด์F แสดงกิจกรรม vasorelaxant (4).

เอ็นโดทีเลียมเป็นตัวควบคุมที่สำคัญของหลอดเลือด และไนตริกออกไซด์ (NO) เป็นปัจจัยผ่อนคลายที่สำคัญที่ปล่อยออกมาจากเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยการแพร่กระจายเข้าไปในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบ NO เปิดใช้งาน guanylate cyclase เพิ่มระดับของ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) จากนั้นกระตุ้นโปรตีนไคเนสที่ขึ้นกับ cGMP (PKGs) เพื่อส่งเสริมการผ่อนคลายของกล้ามเนื้อเรียบ (5) ก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่า ECH ที่ 350-400 µM ทำหน้าที่โดยตรงต่อกล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดและยับยั้งการเพิ่มจำนวนที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดแดงปอดในหนูทดลอง (6) ในขณะที่ 30-300 µM ECH ทำให้เกิดภาวะหลอดเลือดในหลอดเลือดแดงเฉียบพลันใน endothelium- วงแหวนที่ไม่บุบสลายในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น และเพิ่มการผลิต cGMP ในกล้ามเนื้อเรียบของ corpus cavernosum ของวงแหวนเอออร์ตาที่หดตัวโดย phenylephrine (7) โดยการเปิดช่อง NO-cGMP-PKG-BKCa ในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบ ECH 100 หรือ 300 µM ยับยั้งการหดตัวที่เกิดจาก noradrenaline ในหลอดเลือดแดงในปอดของหนูแรท โดยเฉพาะอย่างยิ่งในวงแหวน endothelium-denuded (8)เซลล์บุผนังหลอดเลือดเป็นตัวควบคุมหลักของการทำงานของหัวใจและหลอดเลือด และในหลายกรณี พบว่าการคลายตัวที่ขึ้นอยู่กับบุผนังหลอดเลือดเกิดจากสารที่ถ่ายโอนได้ เช่น NO ที่ปล่อยออกมาจากบุผนังหลอดเลือด (9) อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลต้นน้ำของการผลิต NO ที่เกิดจาก ECH ในหลอดเลือดเซลล์บุผนังหลอดเลือดต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม ในเอ็นโดทีเลียมของหลอดเลือด การสร้าง NO นั้นอาศัยการสังเคราะห์โดย endothelial NO synthase (eNOS) เป็นหลัก หลายกลุ่มได้แสดงให้เห็นว่าวิถีของฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-ไคเนส (PI3K) กระตุ้นไคเนสโปรตีนซีรีน-ทรีโอนีน ไคเนส B (Akt) ซึ่งทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชันของ eNOS โดยตรงที่ซีรีน 1177 (Ser1177) (10) ตัวรับแอนโดรเจน (AR) เป็นสมาชิกของอนุวงศ์ตัวรับนิวเคลียร์ s3 ซึ่งปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนตามรูปแบบบัญญัติ การแปล AR ไปที่ Caveolae ในเยื่อหุ้มเซลล์เกี่ยวข้องกับการควบคุมที่ไม่ใช่จีโนมของการทำงานของเซลล์บุผนังหลอดเลือดหรือการแสดงออกของยีนโดยกระตุ้นการเรียงซ้อน c-Src/PI3K/Akt ซึ่งส่งผลให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน eNOS และไม่มีการผลิต (11) ในหลอดเลือดของมนุษย์เซลล์บุผนังหลอดเลือดมีรายงานว่าฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนกระตุ้นการส่งสัญญาณ PI3K/Akt และกระตุ้นให้ไม่มีการผลิตอย่างรวดเร็วเนื่องจากการโต้ตอบโดยตรงของ AR และหน่วยย่อย p85 ของ PI3K ในระบบหัวใจและหลอดเลือด (12) มีรายงานว่า ECH ทำให้อาการที่เกี่ยวข้องกับการขาดฮอร์โมนรุนแรงขึ้นและออกฤทธิ์เหมือนแอนโดรเจนเนื่องจากมีผลผูกพันกับ AR แทนฮอร์โมนเพศชาย (2) ดังนั้น การศึกษาในปัจจุบันจึงตั้งสมมติฐานว่าวิถีทาง PI3K/Akt อาจเกี่ยวข้องกับการผลิตแบบ NO ผ่านฟอสโฟรีเลชัน eNOS ที่ขึ้นกับ AR ซึ่งเหนี่ยวนำโดย ECH จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อประเมินผลกระทบต่อไปนี้ของ ECH: i) การเหนี่ยวนำการผลิต NO และ eNOS phosphorylation; ii) การมีส่วนร่วมของ AR ในฟอสโฟรีเลชัน eNOS และ iii) การกระตุ้นวิถี PI3K/Akt ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่สะดือของมนุษย์ (HUVEC) ซึ่งเป็นแบบจำลองการทดลองที่รู้จักกันดีสำหรับการศึกษาการควบคุมการทำงานของเซลล์บุผนังหลอดเลือดและการสร้างเส้นเลือดใหม่ (13)

วัสดุและวิธีการ

สารเคมีและรีเอเจนต์ ECH (ความบริสุทธิ์ 92.5 เปอร์เซ็นต์) ได้มาจากมาตรฐานอ้างอิงยาแห่งชาติในสถาบันควบคุมอาหารและยาแห่งชาติ ซื้อแอนติบอดีต่อต้าน p-Akt (Ser473; cat. no. ab8805), Akt (cat no. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. no. ab184154) และ eNOS (cat no. ab76198) ถูกซื้อจาก Abcam . สารยับยั้งนิลูทาไมด์และ ICI 182780 ได้มาจาก Sigma-Aldrich; เมอร์ค เคจีเอเอ L-NAME ถูกซื้อจาก Adamas-Beta, Ltd. และ wortmannin ถูกซื้อจาก Pribolab

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษาด้วยยา

HUVEC ได้มาจาก ScienCell Research Laboratories Inc. และเพาะเลี้ยงในเซลล์บุผนังหลอดเลือดสื่อ (ECM; ScienCell Research Laboratories) ที่มีเซรั่มวัวในครรภ์ 5 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) และสารเสริมการเจริญเติบโตของเซลล์บุผนังหลอดเลือด 1 เปอร์เซ็นต์ (ECGS) ที่อุณหภูมิ 37˚C (คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์และ ความชื้นร้อยละ 95) (14) เมื่อไปถึงจุดบรรจบกัน เซลล์ถูกย่อยด้วยทริปซินและเคลือบใน ECM ด้วย 1 เปอร์เซ็นต์ FBS และ 1 เปอร์เซ็นต์ ECGS สำหรับการทดลองทั้งหมด HUVEC ถูกชุบที่ความเข้มข้น 1x104/มล. และเติบโตจนไปถึงการบรรจบกัน ก่อนการบำบัดด้วย ECH หรือสารกระตุ้นอื่นๆ เซลล์ถูกบ่มใน ECM ที่ปราศจากฟีนอลแดงโดยไม่มี FBS และ ECG เป็นเวลา 6 ชั่วโมงเพื่อกระตุ้นการหยุดการเจริญเติบโต ในการทดลองการยับยั้ง HUVEC ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยสารต้านหรือสารยับยั้งต่างๆ ซึ่งรวมถึง 10 µM นิลูตาไมด์, 10 µM ICI 182780, 0.5 mM L-NAME หรือ 5 µM wortmannin เป็นเวลา 30 นาที โดยมีหรือไม่มี ECH อุณหภูมิ 37˚C ในทุกกลุ่ม ซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุม DMSO ถูกใช้เป็นตัวทำละลายที่ความเข้มข้นที่เท่ากันที่ 0.001 เปอร์เซ็นต์

การวัดการผลิต NO ภายในเซลล์

การเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ของความเข้มข้น NO ของ cytosolic ใน HUVECs ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ Fluorescent NO probe DAF‑FM (Cayman Chemical Company) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (12) โดยสังเขป เซลล์ถูกโหลดด้วยไดอะซิเตต DAF‑FM 5 µM เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37˚C ในไมโครไทเทอร์สีดำและล้างด้วย PBS (pH 7.4) หลายครั้ง การเรืองแสงถูกกำหนดที่ความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อย 495 และ 515 นาโนเมตร ตามลำดับ โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทเรืองแสง (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) และกล้องจุลทรรศน์กลับด้านขนาดกะทัดรัด (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation)

การวิเคราะห์ blot แบบตะวันตก

ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (15) โมโนเลเยอร์ของเซลล์ที่ไหลมารวมกันถูกล้างสองครั้งใน PBS ที่เย็นจัดและสลายด้วยบัฟเฟอร์ RIPA (P0013D; Beyotime Institute of Biotechnology) ความเข้มข้นของโปรตีนในส่วนลอยเหนือตะกอนถูกวัดโดยใช้วิธีทดสอบกรดบิซินโชนินิก (16) ต่อจากนั้น โหลดโปรตีน 30 ไมโครกรัมต่อเลน แยกโดยใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อแผ่นโพลีไวนิลลิดีนไดฟลูออไรด์ เยื่อแผ่นถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 25˚C หลังจากการบ่มด้วยโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ต้านการเจือจาง Akt (1:1,000 การเจือจาง), p-Akt (1:500 การเจือจาง), eNOS (1:2,000 การเจือจาง) หรือ p-eNOS (1 :1,000 การเจือจาง) ที่ 4˚C ข้ามคืน เมมเบรนถูกล้างด้วย TBST (ประกอบด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween-20) 4 ครั้งเป็นเวลา ~15 นาทีต่อการล้างที่ 25˚C ต่อจากนั้น เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเปอร์ออกซิเดสที่คอนจูเกตด้วยมะรุม (1:5,000 การเจือจาง; แอนติบอดีต้านหนู, cat. no. A0216 หรือแอนติบอดีต้านกระต่าย, cat. no. A0208, Beyotime Institute ของเทคโนโลยีชีวภาพ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 25˚C และตรวจพบโดยใช้ชุดเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (cat. no. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.) วัดความเข้มของแถบความถี่โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์เจล Image J เวอร์ชัน 1.80_112 (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ)

การเตรียมและการถ่าย RNA ที่รบกวนขนาดเล็ก (si)

RNA สองสายยาวถูกสังเคราะห์โดย mRNA เป้าหมายของ AR และตัวรับฮอร์โมนเอสโตรเจน (ER) โดยมีลำดับที่แสดงไว้ในตารางที่ 1 เงื่อนไขสำหรับการล้มลงของ siRNA นั้นเกี่ยวข้องกับการถ่าย HUVEC ที่ 70 เปอร์เซ็นต์ที่บรรจบกันในสารที่ไม่ใช่ยาต้านจุลชีพ อาหารเลี้ยงเชื้อในจานเพาะเชื้อเคลือบคอลลาเจน 60 มม. การเปลี่ยนถ่ายของ AR-siRNA 5 นาโนเมตรหรือ 10 นาโนโมลาร์ ER -siRNA ด้วยรีเอเจนต์ Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ดำเนินการแยกกันตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ประสิทธิภาพการทรานส์เฟกชันถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ reverse transcription quantitative-PCR (RT-qPCR) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (17) สภาวะเทอร์โมไซเคิลมีดังนี้: 10 นาทีที่ 95˚C; 40 รอบของ 95˚C เป็นเวลา 5 วินาที และ 60˚C เป็นเวลา 1 นาที และเส้นโค้งการหลอมเหลวที่ 95˚C เป็นเวลา 15 วินาที, 60˚C เป็นเวลา 1 นาที และ 95˚C เป็นเวลา 15 วินาที ทำซ้ำทางชีวภาพที่เป็นอิสระสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง การทดลองที่ตามมาได้ดำเนินการ 48 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน คู่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) โดยมีลำดับต่อไปนี้: AR forward, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' และ reverse, 5'-GACTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER ไปข้างหน้า 5'‑CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' และย้อนกลับ 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA-3'; และ GAPDH ไปข้างหน้า 5'‑CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' และย้อนกลับ 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การเปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่มต่างๆ ดำเนินการโดยใช้การทดสอบ Kruskal-Wallis หรือ ANOVA แบบสองทางกับการทดสอบ post hoc ของ Tukey สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ พี<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

ผลลัพธ์

ECH ทำให้เกิด NO และ eNOS phosphorylation

ดังแสดงในรูปที่ 2A และ B ECH 1 µM เพิ่มการผลิต NO ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญใน HUVEC เมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุมเชิงลบ ในขณะที่ผลการกระตุ้นของ ECH ถูกลดทอนไปที่ระดับการควบคุมโดยการปรับสภาพด้วย L-NAME เพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุด eNOS ฟอสโฟรีเลชันถูกทดสอบที่ 60 นาทีหลังการบำบัดด้วย ECH ที่ความเข้มข้น 0, 0.01, 0 1, 1 และ 10 ไมโครโมลาร์ ผลการวิจัยพบว่า ECH ที่ความเข้มข้น 0.01-10 µM อาจกระตุ้น eNOS phosphorylation ที่ Ser 1177 อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น โดยสังเกตที่ eNOS phosphorylation สูงสุดที่ 10 µM การเหนี่ยวนำ ECH (รูปที่ 2C และ D) นอกจากนี้ eNOS phosphorylation ที่ Ser1177 ถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ western blot ที่ 0, 5, 15, 30, 60 และ 120 นาทีหลังจากการบ่มด้วย 1 µM ECH สังเกตได้ว่า eNOS phosphorylation ถูกกระตุ้นอย่างรวดเร็วโดย ECH ที่ 5 นาที และยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องจนถึง 30 นาทีของการฟักตัว (รูปที่ 2E และ F) ต่อมา แม้จะรักษาด้วย ECH แต่ขนาดสัมพัทธ์ของฟอสโฟรีเลชันของ eNOS ยังคงทรงตัวตั้งแต่ 30 นาทีเป็นต้นไป ดังนั้น ECH จึงไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของ eNOS ทั้งหมด (รูปที่ 2C และ E)

AR เป็นสื่อกลางในการผลิต NO ที่เกิดจาก ECH และฟอสโฟรีเลชั่น eNOS

การทดสอบ RT-qPCR แสดงให้เห็นว่าผลการรบกวนของ AR-siRNA-1 และ ER -siRNA-2 ประสบความสำเร็จมากที่สุดในการยับยั้งการแสดงออกของ AR และ ER ใน HUVEC ในการศึกษานี้ (รูปที่ 3 ). ต่อจากนั้น มีการใช้ตัวร้ายในการวิเคราะห์การยับยั้งการทำงานของ AR และ siRNA สำหรับการวิเคราะห์การสูญเสียฟังก์ชันของ AR เพื่อประเมินการมีส่วนร่วมของ AR ในการกระตุ้น eNOS ที่เกิดจาก ECH และ NO Production ดังแสดงในรูปที่ 4A, 1 µM ECH เพิ่มการผลิต NO ใน HUVECs (P .) อย่างมีนัยสำคัญ<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH เปิดใช้งานเส้นทาง PI3K/Akt

ในการศึกษานี้ Akt phosphorylation ที่ Ser473 ได้รับการทดสอบ 60 นาทีหลังจากการฟักตัวของ ECH ที่ความเข้มข้น 0, 0.01, 0.1 , 1 และ 10 ไมโครโมลาร์ ผลลัพธ์ระบุว่า ECH (0.{10}} µM) อาจเหนี่ยวนำให้เกิด Akt phosphorylation อย่างมีนัยสำคัญ ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ p-Akt สูงสุดที่ 1 และ 10 µM ของการบำบัด ECH (รูปที่ 5A และ B) นอกจากนี้ Akt phosphorylation ถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ western blot ที่ 0, 5, 15, 30, 60 และ 120 นาทีหลังจากการเติม 1 µM ECH ไปยังการเพาะเลี้ยง HUVEC ดังแสดงในรูปที่ 5C และ D ECH เพิ่ม Akt phosphorylation อย่างรวดเร็วหลังจากการฟักไข่ 5 นาที และสังเกตระดับโปรตีนสูงสุดของ p-Akt ที่ 60 นาที ในทางตรงกันข้าม ECH ไม่ส่งผลต่อนิพจน์ Akt ทั้งหมด (รูปที่ 5A และ C) นอกจากนี้ เพื่อตรวจสอบผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นของวิถีทาง PI3K ต่อฟอสโฟรีเลชั่น eNOS นั้น HUVECs ได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วยเวิร์ทมานนินตัวยับยั้ง PI3K ก่อนการใช้ ECH พบว่า Wortmannin ลดการผลิต NO ที่เหนี่ยวนำโดย ECH ให้ถึงระดับการตรวจวัดพื้นฐาน (รูปที่ 5E) พบปรากฏการณ์ที่คล้ายกันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเมื่อตรวจสอบการเรืองแสง DAF‑FM ที่เหนี่ยวนำโดย ECH (รูปที่ 5F) นอกจากนี้ wortmannin อาจมีความสามารถในการยกเลิก eNOS phosphorylation อย่างรวดเร็วใน HUVEC (รูปที่ 5G และ H) ผลลัพธ์ดังกล่าวชี้ให้เห็นว่า ECH อาจกระตุ้น eNOS phosphorylation และไม่มีการผลิตผ่านวิถี PI3K/Akt

การอภิปราย

ECH เป็นสารประกอบธรรมชาติที่แยกได้จาก HerbaCistancheด้วยคุณสมบัติทางเภสัชวิทยาต่างๆ ก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่า ECH ออกแรงกระตุ้นการคลายตัวของหลอดเลือดที่ขึ้นกับ endothelium โดยการเปิดช่อง NO-cGMP-PKG-BKCachannels ในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด (7,8) ผลการวิจัยในปัจจุบันให้หลักฐานว่า ECH ได้ใช้ AR-dependent ของ eNOS เพื่อกระตุ้นการผลิต NO โดยมีส่วนเกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/Akt ในหลอดเลือดเซลล์บุผนังหลอดเลือด.

ในฐานะที่เป็นชั้นในสุดของผนังหลอดเลือด endothelium สามารถรับรู้และตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของการไหลเวียนของเลือดได้อย่างรวดเร็ว ส่งผลให้มีการส่งสัญญาณไปยังเซลล์กล้ามเนื้อเรียบที่อยู่เบื้องล่างเพื่อควบคุมโทนสีของหลอดเลือด (18) มีรายงานอย่างกว้างขวางว่ามีสารประกอบขยายหลอดเลือดที่เกิดจากเยื่อบุผนังหลอดเลือดหลายชนิด โดยมีสารที่เป็นต้นแบบมากที่สุด

เป็น NO ซึ่งเกิดขึ้นจากไอโซฟอร์มบุผนังหลอดเลือดของ eNOS ซึ่งส่งผลให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน (19) ภายใต้สภาวะปกติ eNOS จะยังคงไม่ทำงานเมื่อเชื่อมโยงกับคาเวลิน และเปิดใช้งานด้วยเหตุการณ์ที่ต่อเนื่องกันในเซลล์บุผนังหลอดเลือด: i) eNOS แยกตัวออกจาก Caveolin-1 และเชื่อมโยงกับ Ca2 plus /CaM; ii) โปรตีนช็อตด้วยความร้อน (HSP)90 ส่งเสริม eNOS

นอกจากนี้ จำนวนการศึกษาที่เพิ่มขึ้นได้แสดงให้เห็นว่า AR แสดงออกในเซลล์บุผนังหลอดเลือดในเนื้อเยื่อของมนุษย์จำนวนหนึ่ง ซึ่งแสดงให้เห็นบทบาทที่เป็นไปได้สำหรับแอนโดรเจนและสิ่งที่คล้ายคลึงกัน ซึ่งกระทำผ่านกระบวนการที่ใช้ AR-mediated ในการปรับสภาวะสมดุลของเซลล์บุผนังหลอดเลือดของมนุษย์ (21) ในเส้นทาง PI3K/Akt ที่ไม่ใช่แบบคลาสสิก AR อาจเปิดใช้งาน PI3K โดยการโต้ตอบโดยตรงกับหน่วยย่อยการกำกับดูแล PI3K p85 (22) การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่า AR antagonist หรือ AR siRNA ลดการผลิต NO และ eNOS phosphorylation ที่เกิดจาก ECH ใน HUVECs มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าเอสโตรเจนกระตุ้น eNOS phosphorylation และกระตุ้นการผลิต NO ผ่านการกระตุ้น ER แบบคลาสสิกในเซลล์บุผนังหลอดเลือด (23) และการบริหาร ECH ช่วยเพิ่มการแสดงออกของ ER ในมดลูก (24) อย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ ผลของ AR นั้นเด่นชัดกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ ER ต่อการกระตุ้น eNOS ที่เกิดจาก ECH และ NO Production นอกจากนี้ยังพบว่า ECH ทำให้เกิด NO เฉียบพลันภายในไม่กี่นาทีผ่านการกระตุ้น eNOS ที่เกี่ยวข้องกับ AR ใน HUVEC ซึ่งสอดคล้องกับลักษณะที่ไม่ใช่จีโนมของการตอบสนองในเซลล์บุผนังหลอดเลือด AR เกี่ยวข้องกับโปรตีนนั่งร้าน รวมถึง HSP90, HSP70 และ kinase Src ในไซโตพลาสซึม และสามารถขนส่งไปยังเมมเบรนจาก AR complex ภายใน 5 นาทีของการรักษาด้วยฮอร์โมนเทสโทสเตอโรน (23) ตามกลยุทธ์ 'การตกปลาเป้าหมาย' HSP90 ถูกระบุว่าเป็นเป้าหมายที่จับคู่ PhGs ซึ่งบ่งชี้ว่า ECH อาจอำนวยความสะดวกในการแยก AR ออกจากโปรตีนนั่งร้าน (25) การศึกษาอื่นเสนอแนะว่า ในมลรัฐ ECH อาจรวมกับกระเป๋า AR ที่กรดอะมิโน Met-894 และ Val-713 และยับยั้งการขนส่งของ AR ของไซโตพลาสซึมไปยังนิวเคลียส (26) อย่างไรก็ตาม กลไกพื้นฐานที่ ECH ทำหน้าที่เป็นสื่อกลางในการโยกย้าย AR ของไซโตพลาสซึมไปยังเมมเบรนนั้นจำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม ดังนั้น จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่ออธิบายกลไกที่ ECH บรรลุการเปิดใช้งาน eNOS ที่ขึ้นกับ AR และอาจเกี่ยวข้องกับการจับกับ HSP90 ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดในหลอดเลือดได้อย่างไร

ทางเดิน PI3K/Akt เป็นหนึ่งในลำดับการส่งสัญญาณที่สำคัญที่สุด การกระตุ้นซึ่งเกิดจากการผลิตฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล-3,4,5-ทริสฟอสเฟตเพื่อจับโดเมนความคล้ายคลึงกันของขั้ว N ของ Ser/ Thr kinase Akt. สิ่งนี้อำนวยความสะดวกในการสรรหา Akt ไปยังพลาสมาเมมเบรน (27) วิถีของ PI3K/Akt อาจมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการผ่อนคลายที่ไม่ขึ้นกับ NO ซึ่งเหนี่ยวนำโดย ECH การศึกษานี้เปิดเผยว่าการผลิต NO ที่เกิดจาก ECH ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเซลล์ถูกบ่มด้วยเวิร์ทมานนินตัวยับยั้ง PI3K รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า 15 มก./กก. ECH เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/Akt ในเซลล์ไขกระดูกที่ถูกกดทับด้วย 5-fluorouracil (28) ในการศึกษานี้ สารยับยั้ง PI3K ลดฟอสโฟรีเลชั่น eNOS ที่เกิดจาก ECH ที่ Ser1177 อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ กิจกรรม Akt ถูกควบคุมอย่างเด่นชัดโดยวิถีการกำกับดูแลต้นน้ำ โดยเฉพาะฟอสโฟรีเลชันที่ขึ้นกับ PI3K ที่ Ser473 (20) ในการศึกษานี้ ECH กระตุ้น Akt phosphorylation ที่ Ser473 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ในทำนองเดียวกัน การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า ECH 5, 10 หรือ 20 µM มีผลป้องกันโรคหัวใจต่อการรักษา anoxia/reperfusion ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาโดยการเพิ่มการควบคุม p-Akt และ SLC8A3 (29) ระเบียบการถอดรหัสของยีน Akt ส่วนใหญ่ยังไม่ทราบ (30); ดังนั้นการศึกษาในปัจจุบันจึงมุ่งเน้นไปที่ผลกระทบด้านกฎระเบียบหลังการถอดเสียงของ ECH ต่อ Akt เมื่อพิจารณาจากข้อค้นพบดังกล่าวแล้ว อนุมานได้ว่าการประยุกต์ใช้ ECH กับ HUVEC อาจนำไปสู่การกระตุ้นการทำงานของวิถี PI3K/Akt ซึ่งฟอสโฟรีเลต eNOS และทำให้ไม่มีการผลิตเพิ่มขึ้นในเวลาต่อมา

สรุปได้ว่า ECH เป็นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่แยกได้จากHerba Cistanche. กลไกที่เป็นไปได้ซึ่งอยู่ภายใต้การผลิต NO ที่เกิดจาก ECH ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดอาจรวมถึงสิ่งต่อไปนี้ (รูปที่ 6): i) ECH ทำหน้าที่เป็นลิแกนด์เชิงหน้าที่ของ AR ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยัง Caveolae ในเยื่อหุ้มเซลล์ ii) PI3K จับกับโดเมนที่ไม่ชอบน้ำของ Akt ที่ Ser473 และอำนวยความสะดวกในการจัดหา Akt ให้กับเยื่อหุ้มเซลล์ iii) การจัดหาน้ำตก PI3K/Akt ทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่น eNOS ที่ขึ้นกับ AR และ iv) การสร้าง NO ถูกสื่อกลางโดย eNOS ในเซลล์บุผนังหลอดเลือด. การสังเกตว่า ECH ไม่ก่อให้เกิดการผลิตใดๆ ผ่านฟอสโฟรีเลชันที่ขึ้นกับ AR ของ eNOS โดยมีส่วนร่วมของวิถีทาง PI3K/Akt อาจช่วยให้เข้าใจผลของยา vasorelaxant ของ ECH มากขึ้น นอกจากนี้ ECH ที่มุ่งเป้าไปที่วิถี NO ที่ได้มาจากบุผนังหลอดเลือดอาจเนื่องมาจากผลกระทบที่ไม่ใช่จีโนม ดังนั้น การศึกษาในปัจจุบันอาจช่วยอธิบายกลไกที่ ECH ใช้ผลทางเภสัชวิทยาในการป้องกันโรคหัวใจและหลอดเลือด

ผู้เขียน:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU และ XIN LIU

ศูนย์วิจัยวิศวกรรมอาหารและสุขภาพ กระทรวงศึกษาธิการ คณะวิชาวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต

Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong 510275, PR China

ได้รับวันที่ 1 พฤษภาคม 2019; ยอมรับเมื่อ 10 ธันวาคม 2019

อ้างอิง

1. ค่าคอมมิชชั่นเภสัชตำรับจีน:Cistanche เฮิร์บา. ใน: Pharmacopoeia of the People's Republic of China 1. chin. เมดิ. วิทย์. กด, ปักกิ่ง, หน้า 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X และ Zhang X:เอ็กไคนาโคไซด์และCistanche tubulosa(Schenk) R. wight ameliorate bisphenol A ที่เกิดจากอัณฑะและความเสียหายของตัวอสุจิในหนูผ่านแกนอวัยวะสืบพันธุ์ควบคุมเอนไซม์สเตียรอยด์ เจ เอทโนฟาร์มาคอล 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B และ Ma X:เอ็กไคนาโคไซด์ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่ประเมินค่าไม่ได้ในการรักษาโรคทางระบบประสาทและความผิดปกติอื่นๆ โมเลกุล 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S และ Muraoka O: Phenylethanoid aminoglycosides และ acylated oligosugars ที่มีกิจกรรม vasorelaxant จากCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S และ Murad F: Nitric oxide กระตุ้น guanylate cyclase และเพิ่มระดับ guanosine 3':5'-cyclic monophosphate ในการเตรียมเนื้อเยื่อต่างๆ Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wren TN, Lu dX, Zhou Y และ Ge RL: ฤทธิ์ต้านการแพร่กระจายของเชื้อเอ็กไคนาโคไซด์ในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดแดงปอดในหนูภายใต้ภาวะขาดออกซิเจน เจ Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ และ Tu PF:เอ็กไคนาโคไซด์กระตุ้นการคลายตัวที่ขึ้นกับเอนโดธีเลียมในวงแหวนหลอดเลือดของหนูแรทผ่านทางวิถี NO-cGMP แพลนตา เมด 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y และ Ge RL:เอ็กไคนาโคไซด์กระตุ้น vasorelaxation หลอดเลือดแดงปอดของหนูโดยการเปิดช่อง NO-cGMP-PKG-BKca และลด ca ภายในเซลล์^{2 บวก}ระดับ Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y และ Higashi Y: การประเมินการขยายตัวของหลอดเลือดที่ไม่ขึ้นกับ endothelium: จากวิธีการไปจนถึงมุมมองทางคลินิก เจ ไฮเปอร์เทนส์ 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J และ ding Q: ผลการป้องกันของอนุพันธ์สังเคราะห์ - องค์ประกอบใหม่บนหลอดเลือดดำสายสะดือของมนุษย์เซลล์บุผนังหลอดเลือดต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน: การมีส่วนร่วมของสารต้านอนุมูลอิสระและเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3k/Akt/eNOS/NO เภสัชชีวการแพทย์ 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y และ Okabe T: Src kinase-mediated androgen receptor-dependent ที่ไม่ใช่จีโนมของสัญญาณที่นำไปสู่การสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ที่บุผนังหลอดเลือด . ชุมชน Biochem Bioph Res 424: 538-543, 2012

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y และ Okabe T: การกระตุ้นที่ขึ้นอยู่กับตัวรับแอนโดรเจนของการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ของบุผนังหลอดเลือดในหลอดเลือดเซลล์บุผนังหลอดเลือด: บทบาทของฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-วิถีไคเนส/แอคท์ ต่อมไร้ท่อ 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F และ Reno F: การเพิ่มจำนวนและการย้ายถิ่นที่ไม่ขึ้นกับวิตามินดีใน HUVEc เจ เตียรอยด์ Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X และ Xu X: การแสดงออกของโปรตีน uncoupling มากเกินไป 2 ยับยั้งการตายของเซลล์สายสะดือที่เกิดจากกลูโคสในระดับสูงเซลล์บุผนังหลอดเลือด. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z และ Bing S: Icariin ชะลอการเกิด homocysteineเซลล์บุผนังหลอดเลือดภาวะชราภาพที่เกี่ยวข้องกับการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/AKT-eNOS Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ และ Klenk dc: การวัดโปรตีนโดยใช้กรด bicinchoninic ชีวเคมีทางทวารหนัก 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H และ Liu X: การสังเคราะห์ Triterpenoid และการตอบสนองการถอดรหัสที่เกิดจากไนตริกออกไซด์ในการหมักเห็ดหลินจือแช่น้ำ.กระบวนการ Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY และ Gutterman dd: hyperpolarization ที่ได้รับจาก Endothelium และการขยายตัวของหลอดเลือดหัวใจ: บทบาทที่หลากหลายและบูรณาการของกรด epoxyeicosatrienoic ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และรอยต่อของช่องว่าง จุลภาค 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK และ Gutterman dd: การสื่อสารเป็นกุญแจสำคัญ: กลไกของการส่งสัญญาณระหว่างเซลล์ในการขยายหลอดเลือด J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A จาก B และการอภิปราย R: การตรวจจับสภาพแวดล้อมไมโคร Endothelium ที่นำไปสู่การขยายหลอดเลือดของไนตริกออกไซด์: การทบทวนสัญญาณประสาทและชีวกลศาสตร์ ไนตริกออกไซด์ 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS และ Smith GJ: ตัวรับแอนโดรเจนในมนุษย์เซลล์บุผนังหลอดเลือด. เจ เอ็นโดครินอล 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H และ Gui YT: การกระทำที่ไม่ใช่จีโนมของแอนโดรเจนเป็นสื่อกลางโดยฟอสโฟรีเลชั่นอย่างรวดเร็วและการควบคุมการค้ามนุษย์ที่รับแอนโดรเจน เซลล์ Physiol Biochem 43: 223‑236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP และ Ghedini Pc: การเปิดใช้งานเส้นทาง PI3K / Akt ที่เป็นสื่อกลางโดยตัวรับฮอร์โมนเอสโตรเจนสำหรับ estrone- กระตุ้นการกระตุ้นหลอดเลือดของสัญญาณ cGMP Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z และ Li P: ฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนของเอ็กไคนาโคไซด์ในหนูที่ตัดรังไข่ Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y และ Tu PF: การระบุเป้าหมายทางเภสัชวิทยาและการวิเคราะห์ประสิทธิภาพของ phenylethanoid glycosides จากCistanchesHerba ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์ 'การตกปลาเป้าหมาย' คาง ตราด ยาสมุนไพร 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM และ Zhang X:เอ็กไคนาโคไซด์เพิ่มปริมาณอสุจิในหนูโดยกำหนดเป้าหมายตัวรับฮอร์โมนแอนโดรเจน hypothalamic ตัวแทนวิทย์ 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J และ Woodgett JR: โปรตีน kinase B (c-Akt): ตัวกลางไกล่เกลี่ยของ phosphatidylinositol 3-การกระตุ้นไคเนส Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y และ Qian J:เอ็กไคนาโคไซด์ปรับปรุงการทำงานของเม็ดเลือดใน 5-หนูเมาส์กดประสาทที่เกิดจาก FU วิทย์ชีวิต 123: 86-92, 2015.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W และ Zhou H: ผลการป้องกันของเอ็กไคนาโคไซด์กับการบาดเจ็บที่ขาดออกซิเจน/การกลับเป็นเลือดในเซลล์ H9c2 ผ่านการควบคุม p-AKT และ SLc8A3 ที่เพิ่มขึ้น เภสัชชีวการแพทย์ 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P และ Su Y: บทบาทสำคัญของ Akt ต่อการทำงานของหัวใจและหลอดเลือด Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.