ส่วนที่ 2 Echinacoside ยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตโดยการยับยั้ง Ca2 ที่ขึ้นอยู่กับแรงดันไฟฟ้าบวกการเข้าและโปรตีน Kinase C ในหนูทดลอง Cerebrocortical Nerve Terminals

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 1

3. อภิปราย

ในการศึกษานี้ echincoside ซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์ในHerba Cistancheยับยั้ง4-การปลดปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีนในปลายประสาทเยื่อหุ้มสมองของหนูแรท กลไกพื้นฐานที่เป็นไปได้สำหรับการยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตโดยอาศัย echinacoside จะได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมและอภิปรายที่นี่

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

3.1. กลไกพื้นฐานของการยับยั้ง Echinacoside-Mediated ของการปล่อยกลูตาเมต การปลดปล่อยกลูตาเมต

เกิดจาก 4-อะมิโนไพริดีนประกอบด้วยสององค์ประกอบ: ส่วนประกอบที่เกี่ยวข้องกับ Ca2 บวกที่ขึ้นกับทางสรีรวิทยา ซึ่งผลิตขึ้นจากกระบวนการเอ็กโซไซโทซิสของถุงน้ำซินแนปส์ที่มีกลูตาเมต และส่วนประกอบที่ไม่ขึ้นกับ Ca2 plus ซึ่งเกิดจากการสลับขั้วเป็นเวลานานทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นกับเมมเบรนของสถานะคงตัวของตัวขนส่งกลูตาเมตไปทางด้านนอก ซึ่งส่งผลต่อการไหลออกของกลูตาเมตในเซลล์ ที่นี่เราสังเกตว่าเอ็กไคนาโคไซด์ไม่ได้ยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตที่ถูกกระตุ้นด้วยอะมิโนไพริดีนอย่างมีนัยสำคัญในการมีอยู่ของตัวกลางที่ปราศจาก Ca2 plus (การปลดปล่อย Ca2 บวก -อิสระ) นอกจากนี้ ข้อสังเกตเอ็กไคนาโคไซด์การยับยั้งที่เป็นสื่อกลางของ 4-การปลดปล่อยกลูตาเมตที่ถูกกระตุ้นด้วยอะมิโนไพริดีนได้รับการป้องกันอย่างมีประสิทธิผลโดย bafilomycin A1 (ซึ่งทำให้ปริมาณกลูตาเมตของถุงซิแนปติกลดลง) แต่ไม่ใช่โดย DL-TBOA (ซึ่งยับยั้งชนิดย่อยของการขนส่งกรดอะมิโนที่กระตุ้นอย่างไม่เลือกหน้า) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ส่งผลกระทบต่อการเอ็กซ์ไซโทซิสที่ขึ้นกับ Ca2 plus ของการปล่อยกลูตาเมตโดยไม่ส่งผลกระทบต่อการไหลออกของไซโตซอลิกอิสระของ Ca2 plus ของกลูตาเมตผ่านการพลิกกลับของตัวขนส่งกลูตาเมตเมมเบรนของเมมเบรนในพลาสมาของเส้นประสาท ในขั้วต่อซินแนปติก การยับยั้ง Na plus channel หรือการเปิดใช้งานช่อง K plus จะทำให้การกระตุ้นของเมมเบรนคงที่และทำให้ Ca2 plus ปรากฏขึ้นและการปลดปล่อยสารสื่อประสาทลดลง [32,33] ดังนั้น กลไกศักยภาพที่อยู่เบื้องหลังเอ็กไคนาโคไซด์- การยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตที่เป็นสื่อกลางเกี่ยวข้องกับการลดความตื่นเต้นง่ายของซินแนปโตโซม อย่างไรก็ตาม ความเป็นไปได้นี้ไม่สามารถป้องกันได้บนพื้นฐานของข้อสังเกตสองประการ: (1) 4-การสลับขั้วของศักยภาพของเมมเบรนที่กระตุ้นด้วยอะมิโนไพริดีน ซึ่งวัดด้วยสีย้อมที่มีความไวต่อเมมเบรน DiSC3(5) ไม่ได้รับผลกระทบจากการเติมเอ็กไคนาโคไซด์; และ (2) อิไคนาโคไซด์ไม่ส่งผลต่อการปลดปล่อยกลูตาเมตอิสระ 4-อะมิโนไพริดีนกระตุ้น Ca2 บวกอิสระ ซึ่งเป็นส่วนประกอบของการปลดปล่อยที่ขึ้นอยู่กับศักย์ของเมมเบรนเท่านั้น [31] หากผลกระทบไม่ได้เกิดจากการปราบปรามของ synaptosomal excitability มันอาจจะแสดงออกผ่านการลดกิจกรรมของ Cav2.2 (N-type) และ Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus channel ร่วมกับ glutamate exocytosis ใน ปลายประสาท [34–36] โดยใช้ fura-2 เราแสดงให้เห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ลดความเข้มข้นของ Ca2 plus ที่เกิดจากอะมิโนไพริดีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังแสดงให้เห็นว่าผลการยับยั้งของเอ็กไคนาโคไซด์ใน 4-การปลดปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีนลดลงจาก 42.4 เปอร์เซ็นต์ ˘ 2.3 เปอร์เซ็นต์ เป็น 12.1 เปอร์เซ็นต์ ˘ 3.9 เปอร์เซ็นต์ หลังจากได้รับสารบล็อค Cav2.2 (N-type) และ Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 บวกช่อง. นอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ยังคงยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตที่ถูกกระตุ้นด้วยอะมิโนไพริดีนอย่างมีนัยสำคัญต่อการมีอยู่ของสารยับยั้งการปลดปล่อย Ca2 ในเซลล์บวก ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการปราบปราม Cav2.2 (N-type) และ Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus channel activity พร้อมกันเป็นกลไกที่เป็นไปได้เอ็กไคนาโคไซด์-ไกล่เกลี่ยการยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมต อย่างไรก็ตาม การเปิดใช้งาน Cav2.2 (N-type) และ Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus channel ร่วมกันไม่สามารถบล็อกการกระทำของเอ็กไคนาโคไซด์อย่างสมบูรณ์. ดังนั้น ช่องทาง Ca2 plus อื่น ๆ ที่ไม่ระบุชื่อหรือวิถีทางพรีไซแนปติกอื่น ๆ อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้ง ตัวอย่างเช่น ตัวรับ GABAA มีอยู่ที่ระดับพรีซินแนปติก และการกระตุ้นของพวกมันได้รับการแสดงเพื่อยับยั้ง Ca2 บวกกับการไหลเข้าและการปล่อยกลูตาเมต [37] ในการศึกษานี้ GABAA receptor antagonists SR95531 และ bicuculline ไม่ได้ขัดขวางการยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตโดยอาศัย echinacoside ซึ่งบ่งชี้ว่าตัวรับ GABAA ไม่มีส่วนเกี่ยวข้องในการลดกิจกรรมของ Ca2 ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้าและในการยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตในภายหลัง

การป้อน Ca2 plus ผ่านช่องสัญญาณ Ca2 plus ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้ากระตุ้นโปรตีนไคเนสที่เกี่ยวข้องกับการปลดปล่อยกลูตาเมตในขั้วประสาท ซึ่งรวมถึงโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน, โปรตีนไคเนส C และโปรตีนไคเนส A ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่าสารยับยั้งโปรตีนไคเนส C ต่อต้านอย่างมีประสิทธิภาพเอ็กไคนาโคไซด์- ยับยั้งการหลั่งของกลูตาเมต อย่างไรก็ตาม ตัวยับยั้งโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน PD98059 หรือตัวยับยั้งโปรตีนไคเนส A H89 ไม่ได้ผล ยิ่งไปกว่านั้น เจ โมล. วิทย์. 2016, 17, 1006 8 ของ 13 4-ฟอสโฟรีเลชันที่เกิดจากอะมิโนไพริดีนของโปรตีนไคเนส C ลดลงในไซแนปโตโซมหลังการปรับสภาพด้วยเอ็กไคนาโคไซด์ที่ความเข้มข้นมีผลในการยับยั้งการหลั่งกลูตาเมต ดังนั้นเส้นทางการส่งสัญญาณของเอ็กไคนาโคไซด์การยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตที่เป็นสื่อกลางอาจเกี่ยวข้องกับโปรตีนไคเนสซี โปรตีนไคเนสซีเป็นระบบการส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่สำคัญซึ่งมีอยู่ในระดับพรีไซแนปติกและมีบทบาทสำคัญในการแตกตัวของสารสื่อประสาท ตัวอย่างเช่น โปรตีนซินแนปติกหลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับการค้าขายถุงน้ำดีไซแนปติกหรือการจัดหาและการแยกเซลล์ออก เช่น สารตั้งต้น C ไคเนสที่อุดมด้วยอะลานีนที่มีไมริสโทอิเลตถูกฟอสโฟรีเลตโดยโปรตีนไคเนส C [38,39] กระบวนการฟอสโฟรีเลชั่นนี้สามารถเพิ่มขึ้นได้โดยการกระตุ้นด้วย Ca2 plus entry ที่กระตุ้นการสลับขั้ว ซึ่งอำนวยความสะดวกในการปล่อยกลูตาเมต [40] ดังนั้นเราจึงสามารถคาดเดาได้อย่างสมเหตุสมผลว่าผลการยับยั้งของเอ็กไคนาโคไซด์ในการป้อน Ca2 plus ที่สังเกตพบที่นี่อาจลดการทำงานของโปรตีนไคเนส C และเป็นผลให้การปลดปล่อยกลูตาเมต

3.2. ผลการรักษา

Excitotoxicity กระบวนการทางพยาธิวิทยาที่เกิดจากการปล่อยกลูตาเมตมากเกินไปและการกระตุ้นตัวรับกลูตาเมตเป็นสาเหตุสำคัญของการตายของเซลล์ประสาทในความผิดปกติของสมองเฉียบพลันและเรื้อรัง เช่น โรคหลอดเลือดสมอง การบาดเจ็บที่สมอง โรคพาร์กินสัน และโรคอัลไซเมอร์ [13,41] และกลยุทธ์การรักษา ที่เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตอาจเป็นกลยุทธ์ในการป้องกันระบบประสาทที่มีแนวโน้มสำหรับการรักษาโรคดังกล่าวเอ็กไคนาโคไซด์ได้รับการยืนยันแล้วว่าสามารถเจาะเกราะกั้นเลือดและสมอง (BBB) ​​และแสดงผลการป้องกันระบบประสาทในรูปแบบต่างๆ ในร่างกายของความเป็นพิษต่อระบบประสาท [8,10–12,42] แม้ว่ากลไกของผลกระทบต่อระบบประสาทเหล่านี้จะไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ แต่ก็มีรายงานกลไกที่เป็นไปได้หลายอย่างรวมถึงการยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบ, การรักษาเสถียรภาพของการทำงานของไมโตคอนเดรีย, สารต้านอนุมูลอิสระ, การกำจัดอนุมูลอิสระ และการเลียนแบบการทำงานของระบบประสาท ในการศึกษาในปัจจุบัน ความสามารถของอิไคนาโคไซด์ในการลดการปล่อยกลูตาเมตจากขั้วประสาทอาจอธิบายกลไกการป้องกันระบบประสาทบางส่วนด้วย อย่างไรก็ตาม ผลกระทบนี้มีส่วนทำให้เกิดศักยภาพในการรักษาที่ชัดเจนของ echinacoside ในความผิดปกติของสมองที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษต่อสารกลูตาเมตหรือไม่ จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติม

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. เคมีภัณฑ์

Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2-AM) และ 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)] ถูกซื้อมาจาก Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) ω-conotoxin MVIIC, rottlerin,2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) มาเลอิไมด์ ( GF109203X), 5,6,7,13-เตตระไฮโดร-13-เมทิล-5-ออกโซ-12H-อินโดโล[2,3-a]ไพร์โร[3,{ {27}}c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976) และ N-[2-(p bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) ถูกซื้อมาจาก TocrisBioscience (Bristol, UK) อีชินาโคไซด์, แดนโทรลีน, DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA),7-คลอโร-5-(2-คลอโรฟีนี)-1,5-ไดไฮโดร -4,1-เบนโซไทอะซีพิน-2(3H)-หนึ่ง (CGP37157), 2-(2-อะมิโน-3-เมทอกซีฟีนิล)-4 H-1-เบนโซไพแรน-4-หนึ่ง) (PD98059), เอทิลีน ไกลคอล บิส( -อะมิโนเอทิล อีเทอร์)-N,N,N1,N1-กรดเตตระอะซิติก (EGTA) และสารทำปฏิกิริยาอื่นๆ ทั้งหมดถูกซื้อ จาก Sigma-Aldrich Co.(เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา)

4.2. สัตว์

ใช้หนู Sprague–Dawley เพศผู้อายุสองเดือน สัตว์ถูกเลี้ยงไว้ภายใต้สภาวะแวดล้อมที่ได้มาตรฐาน (22 ˘ 1 ˝C; ความชื้นสัมพัทธ์ 50 เปอร์เซ็นต์; รอบแสง/มืด 12 ชั่วโมง) และอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ไม่จำกัด สัตว์เหล่านี้ถูกฆ่าโดยการตัดหัวและเปลือกสมองถูกกำจัดอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิ 4 ˝C ขั้นตอนการทดลองได้รับการอนุมัติโดย Fu Jen InstitutionalAnimal Care and Utilization Committee (A10259) ตามแนวทางของ National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals มีความพยายามทั้งหมดเพื่อลดความทุกข์ทรมานของสัตว์และใช้สัตว์จำนวนน้อยที่สุดที่จำเป็นเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้

4.3. การเตรียม Synaptosomal

Synaptosomes ถูกทำให้บริสุทธิ์จากเปลือกสมองของหนูในการไล่ระดับ Percoll ที่ไม่ต่อเนื่องตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [43,44] โดยสังเขป เนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในตัวกลางที่มี 0.32 โมลาร์ซูโครส (pH 7.4) โฮโมจิเนตถูกปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 3000ˆ ก. (5{{25) }}00 รอบต่อนาทีในโรเตอร์ JA 25.5; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA) และ 4 ˝C และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกหมุนเหวี่ยงอีกครั้งเป็นเวลา 12 นาทีที่ 14,500ˆ g ( 11,000 รอบต่อนาทีในโรเตอร์ JA 25.5) เม็ดถูกแขวนลอยใหม่อย่างนุ่มนวลใน 0.32 โมลาร์ซูโครส (pH 7.4) และส่วนย่อยของสารแขวนลอยไซแนปโทโซม (2 มล.) ถูกวางลงบนเกรเดียนต์แบบไม่ต่อเนื่องของ Percoll 3 มล. ที่มีซูโครส 0.32 โมลาร์, EDTA 1 มิลลิโมลาร์, 0.25 มิลลิโมลาร์ DL-ไดไทโอไทรอิทอล และ 3 เปอร์เซ็นต์ , 10 เปอร์เซ็นต์ , และ 23 เปอร์เซ็นต์ Percoll (pH 7.4) หลังจากการปั่นแยกที่ 32,500ˆ g (16,500 รอบต่อนาทีในโรเตอร์ JA 20.5) เป็นเวลา 7 นาทีที่ 4 ˝C ซินแนปโตโซมถูกกู้คืนจากระหว่าง 10 เปอร์เซ็นต์และ 23 เปอร์เซ็นต์ของแถบ Percoll และถูกเจือจางในปริมาตรสุดท้าย 30 มล. ของสื่อบัฟเฟอร์ HEPES (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2¨ 6H2O, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM กลูโคสและ 10 mM HEPES (pH 7.4)) ตามการหมุนเหวี่ยงเพิ่มเติมที่ 27,000ˆ ก. (15,000 รอบต่อนาทีใน JA 25.5) เป็นเวลา 10 นาที, เม็ดไซแนปโทโซมถูกแขวนลอยใหม่ในอาหารกลางบัฟเฟอร์ HEPES 3 มล. และปริมาณโปรตีนถูกกำหนดหาโดยใช้การสอบวิเคราะห์แบรดฟอร์ด สุดท้าย 0.5 มก. ของสารแขวนลอยไซแนปโตโซมถูกเจือจางในตัวกลางบัฟเฟอร์ HEPES 10 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 3000ˆ ก. (5,000 รอบต่อนาทีในโรเตอร์ JA 20.1) เป็นเวลา 10 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้ง และเม็ดที่มีไซแนปโตโซมถูกเก็บไว้บนน้ำแข็งและใช้งานภายใน 4-6 ชั่วโมง

4.4. การปล่อยกลูตาเมต

การปล่อยกลูตาเมตได้รับการตรวจสอบโดยฟลูออไรเมทรีออนไลน์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [45,46] เม็ดไซแนปโทโซมถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลางบัฟเฟอร์ HEPES (0.5 มก./มล.) และบ่มล่วงหน้าที่ 37 ˝ซ เป็นเวลา 10 นาทีในการมีอยู่ของอัลบูมินในซีรัมของวัว 16 ไมโครโมลาร์เพื่อจับกรดไขมันอิสระใดๆ ที่ปล่อยออกมาจากไซแนปโทโซมในระหว่างการฟักตัวล่วงหน้า ปริมาณอะลิควอต 2-มล.ของไซแนปโทโซมถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวตต์กวนที่มี NADP 2 มิลลิโมลาร์บวก, 50 หน่วยของกลูตาเมตดีไฮโดรจีเนสและ 1.2 มิลลิโมลาร์ CaCl2 และฟลูออเรสเซนซ์ FL ของ NADPH ถูกวัดใน Perkin-Elmer LS{{ 14}} spectrofluorimeter (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) ที่ความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อย 340 และ 460 nm ตามลำดับ เนื่องจากไซแนปโตโซมไม่ตอบสนองต่อการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า ตัวบล็อกช่องโพแทสเซียม 4-อะมิโนไพริดีนจึงถูกใช้เพื่อกระตุ้นการปลดปล่อยกลูตาเมต 4-อะมิโนไพริดีนทำให้ศักย์ของเมมเบรนไม่เสถียรและคิดว่าจะทำให้เกิด Na ซ้ำๆ กัน บวกกับการสลับขั้วที่ขึ้นกับช่องสัญญาณ ซึ่งใกล้เคียงกับการสลับขั้วในร่างกายของขั้ว synaptic ที่นำไปสู่การกระตุ้นของช่องสัญญาณ Ca2 ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้าและการปลดปล่อยสารสื่อประสาท [47 ]. ข้อมูลได้รับในช่วงเวลา 2 วินาที มาตรฐานของกลูตาเมตจากภายนอก (5 นาโนโมล) ถูกเติมเมื่อสิ้นสุดการทดลองแต่ละครั้ง ค่าของการเปลี่ยนแปลงการเรืองแสง FL ที่เกิดจากการเพิ่มมาตรฐานถูกใช้เพื่อคำนวณกลูตาเมตที่ปลดปล่อยออกมาเป็นนาโนโมลของกลูตาเมตต่อมิลลิกรัมของโปรตีน synaptosomal (nmol/mg) ค่าการปลดปล่อยที่อ้างถึงในข้อความคือระดับที่บรรลุถึงสภาวะคงตัวหลังจากการดีโพลาไรเซชัน 5 นาที (nmol/mg/5 นาที) ข้อมูลสะสมถูกวิเคราะห์โดยใช้สเปรดชีต Lotus 1-2-3 (IBM, White Plains, NY, USA) และ MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)

4.5. ศักยภาพของเมมเบรนในพลาสมา

ศักย์ของเมมเบรนในพลาสมาถูกกำหนดหาด้วยสีย้อมที่ไวต่อเมมเบรน DiSC3(5) [48] ไซแนปโตโซมถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลางบัฟเฟอร์ HEPES และส่วนลิคอต 2 มิลลิลิตรถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวตต์ที่ถูกกวนซึ่งมี 5 ไมโครโมลาร์ DiSC3(5) ที่ 37 ˝ซ ในสเปกโตรฟลูออโรมิเตอร์ Perkin–Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, แมสซาชูเซตส์สหรัฐอเมริกา) หลังจากปล่อยให้ของผสมสมดุลเป็นเวลา 3 นาที, ฟลูออเรสเซนซ์ FL ถูกกำหนดหาที่ความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปลดปล่อยที่ 646 และ 674 นาโนเมตร ตามลำดับ ข้อมูลถูกเก็บรวบรวมในช่วงเวลา 2 วินาที ข้อมูลสะสมถูกวิเคราะห์โดยใช้ MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) และแสดงออกในหน่วยฟลูออเรสเซนต์ FL

4.6. Cytosolic Ca2 plus Concentration ([Ca2 plus ]C)

[Ca2 plus ]C ถูกวัดด้วยตัวบ่งชี้ Ca2 plus fura-2 ไซแนปโตโซม (0.5 มก./มล.) ถูกบ่มล่วงหน้าในตัวกลางบัฟเฟอร์ HEPES ที่มีฟิวรา 5 ไมโครโมลาร์-2 และ 0.1 มิลลิโมลาร์ CaCl2 เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 ˝ซ ในการทดสอบแบบกวน หลอด. หลังจากการโหลด fura-2 ไซแนปโตโซมถูกหมุนเหวี่ยงในไมโครเซนตริฟิวจ์เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 3000ˆ ก. (5000 รอบต่อนาที) เม็ดซินแนปโตโซมถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลางบัฟเฟอร์ HEPES และสารแขวนลอยซินแนปโทโซมถูกกวนในคิวเวตต์ที่มีอุณหภูมิในเครื่องสเปกโตรฟลูออโรมิเตอร์ Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) CaCl2 (1 mM) ถูกเติมหลังจาก 3 นาทีและถูกเติมเพิ่มเติมหลังจากผ่านไป 10 นาทีเพิ่มเติม ข้อมูลการเรืองแสงถูกสะสมที่ความยาวคลื่นกระตุ้นที่ 340 และ 380 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นการปล่อย 505 นาโนเมตร) ที่ช่วง 2 วินาที [Ca2 plus ]C (nM) คำนวณโดยใช้ขั้นตอนการสอบเทียบ [49] และสมการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [50] วิเคราะห์ข้อมูลสะสมโดยใช้ MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)

4.7. ซับตะวันตก

ไซแนปโตโซมถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์สลาย (บัฟเฟอร์ 10 มิลลิโมลาร์ HEPES, pH 7.4), 1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 และของผสมตัวยับยั้งโปรตีเอส ไลเซตถูกทำให้กระจ่างโดยการหมุนเหวี่ยง และความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ปริมาณโปรตีนที่เท่ากันถูกแยกโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส เยื่อหุ้มถูกปิดกั้นด้วยน้ำเกลือ Tris-buffered ที่มีนมไขมันต่ำ 5 เปอร์เซ็นต์ และฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เหมาะสม (phospho-protein kinase C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, USA) ค้างคืนที่ 4 ˝C. หลังจากล้างสามครั้งในน้ำเกลือ Tris-buffered จากนั้นเมมเบรนก็ได้รับการรักษาด้วยแอนติบอดีต่อกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสรอง (1:3000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างเยื่อเมมเบรนอย่างน้อยสามครั้งด้วยน้ำเกลือ Tris-buffered และแสดงภาพโดยใช้ระบบเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham, Buckinghamshire, UK) ส่วนย่อยของตัวอย่างถูกโหลดและโพรบด้วยแอนติบอดีต้าน PKC สำหรับการตรวจหา PKC เป็นตัวควบคุมการโหลด ระดับของการแสดงออกหรือฟอสโฟรีเลชันถูกประเมินโดยความหนาแน่นของแถบซึ่งถูกหาปริมาณโดยการวัดความหนาแน่น Densitometricquantifification ของวงดนตรีถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Syngene (Synoptics, Cambridge, UK)

4.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลได้มาจากการเตรียมซินแนปโตโซมเดี่ยวและไม่เป็นอิสระจากกัน เพื่อทดสอบความสำคัญของผลกระทบของยากับกลุ่มควบคุม การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้านได้ถูกนำมาใช้ เมื่อจำเป็นต้องมีการเปรียบเทียบเพิ่มเติม (เช่น การรักษาครั้งที่สองส่งผลต่อการทำงานของ echinacoside หรือไม่) จะใช้ ANOVA แบบทางเดียวตามด้วยการทดสอบของ Tukey การวิเคราะห์เสร็จสมบูรณ์ผ่านซอฟต์แวร์ SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ˘ SEM ความสำคัญได้รับการประเมินที่ p < 0.05="">

5. สรุปผลการวิจัย

นี่เป็นงานวิจัยชิ้นแรกที่แสดงให้เห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ยับยั้งการหลั่งกลูตาเมตจากไซแนปโตโซมในสมองของหนูโดยการลด Ca2 บวกการไหลเข้าผ่านช่อง Cav2.2 และ Cav2.1 และการยับยั้งการปลดปล่อยนี้น่าจะขึ้นอยู่กับการปราบปรามของวิถีโปรตีนไคเนส C อย่างน้อยก็ในบางส่วน การค้นพบนี้มีค่าเพราะให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับกลไกการออกฤทธิ์ของอิชินาโคไซด์ในสมอง

รับทราบ:งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากกระทรวงวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (MOST 103-2320-B-030-001 MY3)

ผลงานของผู้เขียน:Tzu Yu Lin และ Su Jane Wang คิดและออกแบบการทดลอง Cheng Wei Lu ทำการทดลอง Cheng Wei Lu และ Shu Kuei Huang วิเคราะห์ข้อมูล ซูเจนหวางเขียนบทความ

ผลประโยชน์ทับซ้อน:ผู้เขียนประกาศไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

ความขัดแย้งทางผลประโยชน์: ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

อ้างอิง

1. ตู, PF; วัง, บี.; เดยามะ, ต.; จาง ZG; Lou, การวิเคราะห์ ZC ของ phenylethanoid glycosides ของเฮอร์บา ซิสแทนเช่โดย RP-HPLC แอคต้า ฟาร์มา. บาป. 1997, 32, 294-300.

2. Dalby-Brown, L.; บาร์เร็ตต์, เอช.; แลนด์โบ อลาสกา; เมเยอร์ AS; Molgaard, P. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเสริมฤทธิ์กันของอัลคาไมด์ อนุพันธ์ของกรดคาเฟอีน และเศษพอลิแซ็กคาไรด์จาก Echinacea purpurea ต่อการเกิดออกซิเดชันในหลอดทดลองของไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำของมนุษย์ เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2005, 53, 9413-9423. [CrossRef] [PubMed]

3. Dapas, B.; Dall'Acqua, S.; บูลลา, อาร์.; Agostinis, C.; Perissutti, B.; อินเวอร์นิซซี่, S.; Grassi, G.; Voinovich, D. Immunomodulation โดยใช้น้ำเชื่อมสมุนไพรที่มีสารสกัดจากราก Echinacea ที่ได้มาตรฐาน: การศึกษานำร่องในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีของมนุษย์เกี่ยวกับการแสดงออกของยีน cytokine ไฟโตเมดิซีน 2014, 21,1406-1410. [CrossRef] [PubMed]

4. เขา WJ; ฝาง TH; Tu, PF ความคืบหน้าการวิจัยเกี่ยวกับกิจกรรมทางเภสัชวิทยาของ echinacoside จีน เจ. ชิน. มาเตอร์ เมดิ. 2552, 34, 476-479.

5. เติ้ง, ม.; จ้าว JY; ตู, PF.; เจียง, วาย; หลี่ ZB; Wang, YH Echinacoside ช่วยชีวิตเซลล์ประสาท SHSY5Y จากการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNFalpha ยูโร เจ. ฟาร์มาคอล. 2004, 505,11-18. [CrossRef] [PubMed]

6. คู KA; สูง SH; ปาร์ค เจเอช; คิม SH; ลี KY; Kim, YC กิจกรรมป้องกันระบบประสาทในหลอดทดลองของ phenylethanoid glycosides จาก Callicarpa dichotoma แพลนตา เมด. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

7. วัง YH; ซวน ZH; เทียน, เอส.; Du, GH Echinacoside ป้องกัน6-การทำงานผิดปกติของไมโตคอนเดรียที่กระตุ้นด้วยไฮดรอกซีโดปามีนและการตอบสนองต่อการอักเสบในเซลล์ PC12 ผ่านการลดการผลิต ROS ชัดเจน อาหารเสริมตาม ทางเลือก เมดิ. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

8. จู, ม.; ลู ซี.; Li, W. การได้รับ echinacoside ชั่วคราวนั้นเพียงพอที่จะกระตุ้นการส่งสัญญาณ Trk และปกป้องเซลล์ประสาทจาก rotenone เจ. นิวโรเคม. 2013,124, 571-580. [CrossRef] [PubMed]

9. เกิง X.; เทียน, X.; ตู, พี.; Pu, X. ผลกระทบต่อระบบประสาทของ echinacoside ในรูปแบบ MPTP ของเมาส์ของโรคพาร์กินสัน ยูโร เจ. ฟาร์มาคอล. 2007, 564, 66-74. [CrossRef] [PubMed]

10. เหวย LL; เฉิน H.; เจียง, วาย; ตู, PF.; จง, ม.; ดู เจ.; หลิว, F.; วังแอล.; Liu, CY ผลของ echinacoside ต่อระดับ histiocentral ของมวลที่ใช้งานในหนูที่มีการอุดตันของหลอดเลือดแดงในสมองส่วนกลาง ไบโอเมด สิ่งแวดล้อม วิทย์. 2012, 25, 238-244. [ผับเมด]

11. วู CR; หลิน HC; Su, MH กลับรายการโดยสารสกัดจากน้ำของCistanche tubulosaจากพฤติกรรมบกพร่องในแบบจำลองหนูที่เป็นโรคอัลไซเมอร์: ความเกี่ยวข้องสำหรับการสะสมอะไมลอยด์และการทำงานของสารสื่อประสาทส่วนกลาง อาหารเสริม BMC ทางเลือก เมดิ. 2014, 14, 202. [CrossRef] [PubMed]

12. จ้าว คิว; เกา เจ.; หลี่, ว.; Cai, D. Neurotrophic และ neurorescue effects ของ Echinacoside ในรูปแบบเมาส์ MPTP กึ่งเฉียบพลันของโรคพาร์กินสัน ความละเอียดของสมอง 2010, 1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

13. Meldrum, BS Glutamate เป็นสารสื่อประสาทในสมอง: การทบทวนสรีรวิทยาและพยาธิวิทยา เจ. นุ. 2000, 130, 1007S-1015ส. [ผับเมด]

14. ลี, ดี.; ชิม, มิสซิสซิปปี; คิม, KY; โน วายเอช; คิม, เอช.; คิม, SY; ไวน์เรบ, อาร์เอ็น; Ju, WK Coenzyme Q10 ยับยั้ง excitotoxicity ของกลูตาเมตและการเปลี่ยนแปลงไมโตคอนเดรียที่เน้นความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในรูปแบบเมาส์ของโรคต้อหิน สำรวจ จักษุแพทย์. วิส. วิทย์. 2014, 55, 993-1005. [CrossRef] [PubMed]

15. Choi, DW Calcium และอาการบาดเจ็บที่เส้นประสาท excitotoxic แอน. นิวยอร์ก อเคด วิทย์. 1994, 747,162-171. [CrossRef] [PubMed]

16. เลา เอ.; Tymianski, ตัวรับ M. Glutamate, ความเป็นพิษต่อระบบประสาทและการเสื่อมของระบบประสาท ฟลูเกอร์ส โค้ง. 2010, 460, 525-542. [CrossRef] [PubMed]

17. แซทเลอร์ อาร์.; Tymianski, M. กลไกระดับโมเลกุลของการตายของเซลล์ประสาทที่เป็นพิษต่อตัวรับกลูตาเมต มล. นิวโรไบโอล. 2001, 24, 107-129. [ข้ามอ้างอิง]

18. Schauwecker, PE Neuroprotection โดยตัวรับกลูตาเมตคู่อริกับการตายของเซลล์ excitotoxic ที่ชักนำให้เกิดการชักในสมองที่แก่ชรา ประสบการณ์ นิวโรล. 2010, 224, 207-218. [CrossRef] [PubMed]

19. Yeganeh, F.; Nikbakht, F.; บามันปุ้ย; ส.; Rastegar, K.; Namavar, R. Neuroprotective effects ของ NMDA และ group I metabotropic glutamate receptor antagonists ต่อ neurodegeneration ที่เกิดจาก homocysteine ​​ในหนูแรทฮิปโปแคมปัส: ในการศึกษาในร่างกาย เจ โมล. ประสาทวิทยา 2013, 50, 551-557. [CrossRef] [PubMed]

20. Doble, A. บทบาทของ excitotoxicity ในโรค neurodegenerative: นัยสำหรับการรักษา ฟา. เธอ. 1999, 81,163-221. [ข้ามอ้างอิง]

21. Muir วิธีการรักษาโดยใช้กลูตาเมต KW: การทดลองทางคลินิกกับคู่อริ NMDA สกุลเงิน ความคิดเห็น ฟา. 2006, 6, 53-60. [CrossRef] [PubMed]

22. กอนซาเลซ เจซี; Egea, เจ.; เดลคาร์เมน Godino, M.; เฟอร์นันเดซ-โกเมซ, เอฟเจ; ซานเชซ-ปรีเอโต เจ.; Gandia, L.; การ์เซีย เอจี; จอร์แดน เจ.; Hernandez-Guijo, JM Neuroprotectant minocycline กดดันสารสื่อประสาท glutamatergic และ Ca2 บวกกับการส่งสัญญาณในเซลล์ประสาท hippocampal ยูโร เจ. ประสาทวิทยา. 2007, 26, 2481-2495. [CrossRef] [PubMed]

23. ลู CW; หลิน TY; Wang, SJ Memantine กดดันการปลดปล่อยกลูตาเมตผ่านการยับยั้ง Ca2 ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้าบวกกับการเข้าและโปรตีน kinase C ในขั้วเส้นประสาทสมองในหนู: กลไกที่ไม่ขึ้นกับตัวรับ NMDA นิวโรเคม. อินเตอร์ 2010, 57,168-176. [CrossRef] [PubMed]

24. วัง เอสเจ; Sihra, TS Noncompetitive metabotropic glutamate 5 receptor antagonist (E)-2-methyl-6- styryl-pyridine (SIB1893) ยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตผ่านการยับยั้ง Ca2 ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้า บวกกับการเข้าสู่ขั้วเส้นประสาทสมองของหนู (synaptosomes) เจ. ฟาร์มาคอล. ประสบการณ์ เธอ. 2004, 309, 951-958. [CrossRef] [PubMed]

25. ดังก์ลีย์ ประชาสัมพันธ์; จาร์วี พ.ศ.; ฮีธ เจดับบลิว; คิดด์, จีเจ; Rostas, JA วิธีการแยกไซแนปโตโซมอย่างรวดเร็วบน Percoll gradients ความละเอียดของสมอง 1986, 372,115-129. [ข้ามอ้างอิง]

26. อาราค, ก.; หลี่ N.; ดอยล์, RT; Haydon, PG SNARE กลูตาเมตที่ขึ้นกับโปรตีนจาก astrocytes เจ. ประสาทวิทยา. 2000, 20, 666-673. [ผับเมด]

27. Dunlop, J. วิธีการรักษาโดยใช้กลูตาเมต: การกำหนดเป้าหมายระบบการขนส่งกลูตาเมต สกุลเงิน ความคิดเห็น ฟา. 2006, 6,103-107. [CrossRef] [PubMed]

28. บวบอาร์.; Ronca-Testoni, S. sarcoplasmic reticulum Ca2 plus channel/ryanodine receptor: การปรับโดยเอฟเฟกต์ภายนอก ยา และโรค ฟา. รายได้ 1997, 49,1-51. [ผับเมด]

29. แฟน, วาย.; หลี่ เจ.; จาง YQ; เจียง LH; จาง YN; Yan, CQ โปรตีน kinase C เดลต้าเป็นสื่อกลางต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ของ 6-Hydroxydopamine ผ่านการกระตุ้นไคเนส 1/2 ที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์อย่างยั่งยืนในเซลล์ PC12 นิวโรล. ความละเอียด 2014, 36, 53-64. [CrossRef] [PubMed]

30. Gschwendt, M.; มุลเลอร์, เอช.เจ.; Kielbassa, K.; ซัง, อาร์.; Kittstein, W. ; Rincke, G.; Marks, F. Rottlerin สารยับยั้งโปรตีนไคเนสแบบใหม่ ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด คอมมูนิตี้ 1994, 199, 93-98. [CrossRef] [PubMed]

31. นิโคลส์ ดีจี; สีห์รา TS; Sanchez-Prieto, J. การปลดปล่อยกลูตาเมตขึ้นกับแคลเซียมและเป็นอิสระจากไซแนปโตโซมที่ถูกตรวจสอบโดยฟลูออโรเมทรีแบบต่อเนื่อง เจ. นิวโรเคม. 2530, 49, 50-57. [CrossRef] [PubMed]

32. Nicoll, RA การมีเพศสัมพันธ์ของตัวรับสารสื่อประสาทกับช่องไอออนในสมอง วิทยาศาสตร์ 1988, 241, 545-551. [CrossRef] [PubMed]

33. วู แอลจี; Saggau, P. การยับยั้ง Presynaptic ของการปล่อยสารสื่อประสาทที่ถูกกระตุ้น เทรนด์ Neurosci 1997, 20, 204-212. [ข้ามอ้างอิง]

34. เทิร์นเนอร์ ทีเจ; Dunlap, K. ลักษณะทางเภสัชวิทยาของช่องแคลเซียม presynaptic โดยใช้การวัดทางชีวเคมีย่อยของการสร้างเซลล์ประสาท synaptosomal เภสัชวิทยาทางระบบประสาท 1995, 34, 1469-1478 [ข้ามอ้างอิง]

35. Millan, C.; Sanchez-Prieto, J. Differential coupling ของช่องแคลเซียมชนิด N- และ P / Q กับกลูตาเมตเอ็กโซไซโทซิสในเยื่อหุ้มสมองของหนู ประสาทวิทยา เลตต์. 2002, 330, 29-32. [ข้ามอ้างอิง]

36. Vazquez, E.; Sanchez-Prieto, J. การปรับ Presynaptic ของการปล่อยกลูตาเมตกำหนดเป้าหมายช่องแคลเซียมที่แตกต่างกันในขั้วเส้นประสาทสมองของหนู ยูโร เจ. ประสาทวิทยา. 1997, 9, 2009-2018. [CrossRef] [PubMed]

37. ยาว, พี; เมอร์เซอร์, A.; เบกัม, อาร์.; สตีเฟนส์ จีเจ; สีห์รา TS; Jovanovic, JN Nerve Terminal ตัวรับ GABAA เปิดใช้งานการส่งสัญญาณที่ขึ้นกับ Ca2 plus / Calmodulin เพื่อยับยั้ง Ca2 ที่มีรั้วรอบขอบชิดพร้อม Influx และ Glutamate Release เจ. ไบโอล. เคมี. 2009,284, 8726-8737. [CrossRef] [PubMed]

38. เทิร์นเนอร์ เจอาร์; มุม เจเอ็ม; สีดำ ED; โจยาล เจแอล; กระสอบ DB; Madara กฎระเบียบที่ขึ้นกับ JL PKC ของการดื้อต่อเยื่อบุผิว: บทบาทของ MLC และ MLC kinase เป็น. เจ. ฟิสิออล. 1999, 277, ค554-C562. [ผับเมด]

39. วอห์น PF; วอล์คเกอร์ เจเอช; Peters, C. การควบคุมการหลั่งสารสื่อประสาทโดยโปรตีนไคเนส C. Mol นิวโรไบโอล. 1998, 18, 125-155. [CrossRef] [PubMed]

40. คอฟฟี่ ET; สีห์รา TS; นิโคลส์ ดีจี; Pocock, JM Phosphorylation ของ synapsin I และ MARCKS ในขั้วประสาทถูกสื่อกลางโดย Ca2 plus entry ผ่านช่อง Ca2 plus ที่ไวต่อ Aga-GI ซึ่งประกอบกับกลูตาเมตเอ็กโซไซโทซิส FEBS เลตต์ 1994, 353, 264-268. [ข้ามอ้างอิง]

41. โอเบรโนวิช ทีพี; Urenjak, J. เปลี่ยนการส่งผ่านกลูตาเมตริกในความผิดปกติของระบบประสาท: จากกลูตาเมตนอกเซลล์สูงไปจนถึงประสิทธิภาพของซินแนปติกที่มากเกินไป โปรแกรม นิวโรไบโอล. 1997, 51, 39-87. [ข้ามอ้างอิง]

42. จาง ดี.; หลี่เอช.; Wang, JB Echinacoside ยับยั้งการสั่นของอะไมลอยด์ของ HEWL และป้องกันพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจาก Ap อินเตอร์ เจ. ไบโอล. แมคโครโมล 2015, 72, 243-253. [CrossRef] [PubMed]

43. หลิน TY; ลู CW; วัง CC; ลู เจเอฟ; Wang, SJ Hispidulin ยับยั้งการหลั่งของกลูตาเมตในขั้วประสาทสมองของหนู ท็อกซิคอล แอปพลิเค ฟา. 2012, 263, 233-243. [CrossRef] [PubMed]

44. ช้าง CY; หลิน TY; ลู CW; หวง SK; วัง YC; ชู, เอสเอส; Wang, SJ Hesperidin ยับยั้งการปลดปล่อยกลูตาเมตและออกแรงป้องกันระบบประสาทต่อ excitotoxicity ที่เกิดจากกรด kainic ในฮิบโปแคมปัสของหนู พิษวิทยา 2015,2015,157-169. [CrossRef] [PubMed]

45. นิโคลส์ ดีจี; Sihra, TS Synaptosomes มีสระ exocytotic ของกลูตาเมต ธรรมชาติ 1986, 321, 772-773. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​วัง CC; คูโอ JR; Wang, SJ Dimebon, ยาต้านฮีสตามีน, ยับยั้งการหลั่งกลูตาเมตในขั้วเส้นประสาทสมองของหนู ยูโร เจ. ฟาร์มาคอล. 2014, 734, 67-76. [CrossRef] [PubMed]

47. Tibbs, GR; แบร์รี่ AP; ฟาน มิกเฮม, เอฟเจ; แมค-มาฮอน HT; Nicholls, DG ศักยภาพในการดำเนินการซ้ำๆ ในขั้วประสาทที่แยกได้ต่อหน้าของ 4-aminopyridine: ผลต่อ Ca2 plus ที่ปราศจากไซโตซอลและการปล่อยกลูตาเมต เจ. นิวโรเคม. 1989,53,1693-1699. [CrossRef] [PubMed]

48. อเคอร์แมน KE; สกอตต์, แอลจี; ไฮกกิลา JE; Heinonen, E. การพึ่งพาไอออนิกของศักย์ของเมมเบรนและการตอบสนองที่เชื่อมโยงกับรีเซพเตอร์กลูตาเมตในไซแนปโตเนอโรโซมตามที่วัดด้วยสีย้อมไซยานีน DiSC2(5) เจ. นิวโรเคม. 2530, 48, 552-559. [CrossRef] [PubMed]

49. สีห์รา TS; โบโกเนซ อี.; Nicholls, DG Localized Ca2 plus entry มีผลต่อการดีฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีน ฟอสโฟรีเลชั่น และการปล่อยกลูตาเมต เจ. ไบโอล. เคมี. 1992, 267,1983-1989. [ผับเมด]

50. Grynkiewicz, G.; โพนี่, ม.; Tsien, RY ตัวบ่งชี้ Ca2 plus รุ่นใหม่พร้อมคุณสมบัติการเรืองแสงที่ดีขึ้นอย่างมาก เจ. ไบโอล. เคมี. 1985, 260,3440-3450. [ผับเมด]