ส่วนที่ 1 RNA-Seq ส่วนที่ 1 De Novo Transcriptome Assembly และการค้นพบยีนของ Cistanche Deserticola Fleshy Stem

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง

Cistanche deserticolaเป็นพืชกาฝากที่ไม่สังเคราะห์แสงโดยสมบูรณ์ มีคุณค่าทางยามาก และส่วนใหญ่จำหน่ายในทะเลทรายทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีน ก้านเนื้อแห้งของมันเป็นยาชูกำลังที่สำคัญในการแพทย์แผนจีน โดยมีบทบาทหลักในการปรับปรุงสมรรถภาพทางเพศชายและเสริมสร้างภูมิคุ้มกัน แต่มีการศึกษาเชิงกลไกเพียงเล็กน้อยส่วนหนึ่งเนื่องจากขาดทรัพยากรด้านจีโนมและทรานสคริปโตมิก

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

ผลลัพธ์

ในการศึกษานี้ เราทำการจัดลำดับการถอดรหัสเชิงลึกในก้านเนื้อของค. ทะเลทรายิโคลาและสร้างการอ่านประมาณ 80 ล้านครั้งโดยใช้การจัดลำดับคู่ของ Illumina บนแพลตฟอร์ม HiSeq2000 ด้วยการใช้แอสเซมเบลอร์ทรินิตี้ เราได้รับลำดับการถอดเสียง 95,787 รายการโดยมีความยาวการถอดเสียงตั้งแต่ 200bp ถึง 15,698bp โดยมีความยาวเฉลี่ย 950 ฐานและความยาว N50 ที่ 1,519 ฐาน มีการระบุการถอดเสียง 63,957 รายการอย่างแข็งขันด้วย FPKM น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.5 ซึ่งบันทึก 30,098 รายการมีคำอธิบายประกอบพร้อมคำอธิบายของยีนหรือคำศัพท์เกี่ยวกับยีนโดยการวิเคราะห์ความคล้ายคลึงตามลำดับกับฐานข้อมูลสาธารณะหลายแห่ง (Uniprot, NR และ Nt ที่ NCBI และ KEGG) นอกจากนี้เรายังระบุยีนของเอนไซม์สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ลิกนินและฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (PhGs) ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นส่วนประกอบสำคัญ ยีนฟีนิลอะลานีนแอมโมเนีย-ไลเอส (PAL) สี่ยีน ซึ่งเป็นเอนไซม์หลักตัวแรกในการสังเคราะห์ลิกนินและ PhG biosynthesis ถูกจำแนกโดยการเปรียบเทียบลำดับและการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ มีการเสนอเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพสองทางของ PhGs เป็นครั้งแรกด้วย

บทสรุป

โดยรวมแล้ว เราได้เสร็จสิ้นการวิเคราะห์ทั่วโลกของค. ทะเลทรายิโคลาการถอดรหัสก้านเนื้อโดยใช้เทคโนโลยี RNA-seq คอลเลกชั่นของยีนของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ลิกนินและฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ถูกระบุจากการถอดเสียงที่ประกอบและใส่คำอธิบายประกอบ และคาดการณ์ตระกูลยีนของ PAL ด้วย ข้อมูลลำดับจากการศึกษานี้จะเป็นแหล่งทรัพยากรอันมีค่าสำหรับการดำเนินการวิจัยการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ในอนาคตและการศึกษาจีโนมเชิงหน้าที่ในพืชสมุนไพรที่สำคัญนี้

บทนำ

ค. ทะเลทรายิโคลาเป็นพืชยืนต้นในทะเลทรายทั่วโลกจากตระกูล Orobanchaceae และเป็นสปีชีส์ที่ไม่สังเคราะห์แสงอย่างสมบูรณ์ และมักจะปลูกพืชโฮโลปาราซิติกใต้ดิน [1] ปรสิตอยู่บนรากของ psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopo-diaceae) [1, 2] ซึ่งส่วนใหญ่อาศัยอยู่ในทะเลทรายและกึ่งทะเลทรายเนื่องจากมีความทนทานต่อความแห้งแล้งและความเค็มสูง [1, 3]ค. ทะเลทรายิโคลาทนทานต่อสภาวะแวดล้อมที่รุนแรงและส่วนใหญ่กระจายอยู่ทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีน [4–6] โดยเฉพาะในมองโกเลียใน กานซู่ และซินเจียง ถือว่าเป็นสัตว์ป่าใกล้สูญพันธุ์ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเนื่องจากการบริโภคที่เพิ่มขึ้นโดยมนุษย์ [5, 6] C. deserticola ซึ่งมักถูกเรียกว่า Desert Ginseng เป็นที่รู้จักกันทั่วไปว่า เริ่มแรกมีการบันทึกไว้ใน Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) [11] เมื่อประมาณ 1800 ปีที่แล้ว และถือได้ว่าเป็นหนึ่งในแหล่งหลักของสมุนไพรจีน Cistanche

สารสกัดจากค. ทะเลทรายิโคลามีหน้าที่ทางยาที่หลากหลาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับใช้ในการปรับปรุงสมรรถภาพทางเพศ, บำรุงไต, ปกป้องตับ, กิจกรรมทางร่างกาย, เสริมสร้างความจำ, ภูมิคุ้มกัน, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ, ต้านการอักเสบ, ฤทธิ์ต้านไวรัส, ฯลฯ [7–10, 12– 15]. ส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของ C. deserticola คือ Phenylethanoid glycosides (PheGs, PhGs) [2, 9, 10, 14, 15] จนถึงปัจจุบัน phenylethanoid glycosides มากกว่า 20 ชนิดได้ถูกแยกออกจากลำต้นฉ่ำของC.deserticola[9, 14, 16]. ในหมู่พวกเขา acteoside และ echinacoside เป็นสององค์ประกอบหลักที่มีกิจกรรมทางเภสัชวิทยาที่สำคัญ [2, 16] และได้รับการบันทึกเป็นมาตรฐานคุณภาพของค. ทะเลทรายิโคลาในเภสัชตำรับจีน (ฉบับปี พ.ศ. 2548 และ พ.ศ. 2553) องค์ประกอบทางเคมีสามประการของ PhGs ได้แก่ กรดอินทรีย์ แซคคาไรด์ และฟีนิลทานอยด์ อย่างไรก็ตาม รายละเอียดเกี่ยวกับวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟีนิลทานอยด์ยังคงไม่ค่อยเข้าใจในC.deserticola.

แม้จะมีความสำคัญในเชิงพาณิชย์และการแพทย์ของC.deserticolaข้อมูลจีโนมและทรานสคริปโทมิกของสายพันธุ์นี้มีจำกัดมาก ไม่มี EST ในฐานข้อมูล NCBI และข้อมูลจีโนมที่สมบูรณ์สำหรับสปีชีส์นี้ยังคงไม่พร้อมใช้งาน ยกเว้นลำดับจีโนมของคลอโรพลาส [1] ข้อมูลทรานสคริปโทมิกที่จำกัดขัดขวางการศึกษากลไกสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PhG เทคโนโลยี RNA-seq สามารถสร้างลำดับของส่วนที่แสดงออกของจีโนมเป้าหมาย [17] และระบุยีน [18] โดยใช้แพลตฟอร์มเทคโนโลยี NGS (เช่น Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq และ Roche 454) กำลังเป็นที่นิยมมากขึ้นในการถอดเสียงแบบถอดเสียง [19–22] เนื่องจากเป็นวิธีที่ประหยัดและทรงพลังด้วยความละเอียดสูงและช่วงไดนามิกที่กว้าง [23–25] โดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื่องจากมีข้อได้เปรียบในการสำรวจการถอดเสียงที่มีปริมาณน้อย [26]. เนื่องจากข้อดีหลายประการ RNA-seq จึงน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่แบบจำลองซึ่งมีทรัพยากรทางพันธุกรรมจำกัด [27–29] แต่ไม่มีการวิจัยโดยละเอียดของ C. deserticola transcriptome โดย RNA-seq

ในการศึกษานี้ เราจัดลำดับการถอดรหัสต้นกำเนิดสำหรับ C. deserticola โดยใช้แพลตฟอร์ม Illumina Hiseq2000 และได้รับข้อมูลดิบ 7.9G โดยการประกอบและการทำหมายเหตุประกอบ เราขุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของ PhG และยีนที่รับผิดชอบในการสังเคราะห์ลิกนินทางชีวภาพทั้งหมด

การวิเคราะห์ RNA-seq ของเราสร้างครั้งแรกค. ทะเลทรายิโคลาการถอดรหัสฉันทามติและให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับความเข้าใจที่ครอบคลุมเกี่ยวกับคุณค่าทางยาของค. เดซิติโกลานอกจากนี้ วิธีการที่อธิบายไว้ในที่นี้ยังสามารถนำไปใช้อย่างกว้างขวางกับทรานสคริปโทมโปรไฟล์เพื่ออำนวยความสะดวกในการค้นพบยีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการสังเคราะห์ส่วนประกอบทางยาเฉพาะในพืชสมุนไพรอีกชนิดหนึ่งที่มีทรัพยากรจีโนมจำกัดมาก

Cistancheมีหลายหน้าที่

วัสดุและวิธีการ

การรวบรวมวัสดุจากพืช

ลำต้นฉ่ำสดสำหรับค. ทะเลทรายิโคลาในขั้นตอนการขุดได้รวบรวมจากฐานโรงงานในเมือง BayanHot ของ Alexa League ในมองโกเลียในทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีน ได้รับใบอนุญาตรวบรวมจากเจ้าของ (HongKui CongRong Group) ของฐานโรงงาน ตัวอย่างบัตรกำนัลถูกฝากไว้ใน Core Genomic Facility ที่ Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences หลังจากทำความสะอาด เนื้อเยื่อต้นกำเนิดที่ชุ่มฉ่ำถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ และแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว จากนั้นเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกว่าจะนำไปแปรรูปต่อไป

การแยก RNA การสร้างไลบรารี cDNA และการจัดลำดับ Illumina

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากลำต้นอวบน้ำโดยใช้ TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., California, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่างที่เป็นผลลัพธ์ถูกบำบัดด้วย DNase I เพื่อกำจัดจีโนม DNA ใดๆ ออก RNA ที่สกัดออกมาถูกหาปริมาณโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies) และตรวจสอบความสมบูรณ์โดยใช้การเสื่อมสภาพของอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสด้วยการย้อมสีเอทิเดียมโบรไมด์ ตัวอย่าง RNA ที่มีอัตราส่วน A260/A280 ระหว่าง 1.9 ถึง 2.1 อัตราส่วน RNA 28S:18S สูงกว่า 1.0 และหมายเลขความสมบูรณ์ของ RNA (RIN) น้อยกว่าหรือเท่ากับ 8.5 ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ในภายหลัง

ไลบรารี RNA-seq ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Illumina Tuseq RNA Sample Preparation Kits Poly(A) บวก RNA ถูกแยกออกจาก RNA ทั้งหมดโดยใช้เม็ดบีด Dynal oligo(dT)25 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ บัฟเฟอร์การแตกแฟรกเมนต์ถูกเพิ่มเพื่อแยก mRNA ออกเป็นชิ้นส่วนสั้นๆ cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์โดยใช้ส่วนย่อยสั้นๆ เหล่านี้เป็นเทมเพลต พร้อมด้วย SuperScript III reverse transcriptase และ N6 random hexamer primer จากนั้นจึงสังเคราะห์ cDNA สายที่สองโดยใช้บัฟเฟอร์, dNTPs, RNaseH และ DNA polymerase I ผลลัพธ์ cDNA แบบสองสายที่ได้รับการทดสอบสุดท้ายจะถูกซ่อมแซมโดยใช้ T4 DNA polymerase, DNA polymerase I Klenow fragment และ T4 polynucleotide kinase และผูกกับ อะแดปเตอร์ที่ใช้ T4 DNA ligase ชิ้นส่วนที่ผูกกับตัวปรับต่อถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดสกัด Quick PCR และชะด้วยบัฟเฟอร์ EB หลังจากการวิเคราะห์โดยใช้อะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ชิ้นส่วนที่เหมาะสมถูกเลือกเป็นแม่แบบสำหรับการขยาย PCR การจัดลำดับของไลบรารี cDNA ที่เป็นผลลัพธ์ดำเนินการด้วยระบบ Illumina HiSeq 2000

Transcripts de novo assembly และการหาปริมาณการแสดงออกของยีน

การอ่านแบบ Raw ที่สร้างจากการเรียงลำดับถูกทำความสะอาดโดยการลบลำดับของอะแด็ปเตอร์ (ATCTCGTATGCCGTC) โดยใช้วิธีการภายในองค์กร จากนั้นเราจึงดำเนินกระบวนการกรองคุณภาพต่ำที่เข้มงวด ประการแรก ฐานที่มีคะแนนคุณภาพ Phred ต่ำกว่า 20 จะถูกตัดออกจากส่วนท้ายของลำดับที่ 3 จนกว่าจะรวมเป็นหนึ่งฐานที่มีคุณภาพสูงกว่า (น้อยกว่าหรือเท่ากับ 20) หากความยาวของการอ่านสั้นกว่า 50bp จะถูกละทิ้ง ประการที่สอง การอ่านจะถูกกรองเพิ่มเติมโดยเกณฑ์ที่ฐาน 70 เปอร์เซ็นต์ในการอ่านครั้งเดียวมีคะแนนคุณภาพสูง ( น้อยกว่าหรือเท่ากับ 20) ประการที่สาม ใช้การอ่านแบบปลายคู่เท่านั้นสำหรับการประกอบเพิ่มเติม การประกอบทรานสคริปต์ของ De novo ดำเนินการโดยใช้ Trinity release_20130216 [30] ซึ่งประกอบด้วยโมดูลซอฟต์แวร์ที่ต่อเนื่องกันสามโมดูล: Inchworm, Chrysalis และ Butterfly พารามิเตอร์แอสเซมบลีถูกตั้งค่าดังนี้:—seqType fq—JM 300G —min_contig_length 200—CPU 20—inchworm_cpu 20—bflyCPU 20

ในการหาปริมาณการถอดเสียงที่มากมาย การอ่านแบบคู่ที่เรียงลำดับตามลำดับถูกจัดตำแหน่งใหม่ให้สอดคล้องกับบันทึกที่ประกอบขึ้นโดยใช้สคริปต์ในทรินิตี้ [31] การอ่านที่แมปใช้สำหรับการหาปริมาณโดยซอฟต์แวร์ RSEM (RNA-Seq โดย Expectation Maximization) [32] ความอุดมสมบูรณ์ของยีนหรือไอโซฟอร์มแสดงโดยแฟรกเมนต์ต่อกิโลเบสของทรานสคริปต์ต่อล้านค่าแฟรกเมนต์แมป (FPKM) การถอดเสียงที่มีค่า FPKM เท่ากับหรือมากกว่า 0.05 ถูกกำหนดเป็นแสดง

คำอธิบายประกอบการทำงานของใบรับรองผลการเรียนที่แสดงออก

เนื่องจากไม่มีชุดคำอธิบายประกอบของยีนของ C. deserticola ยกเว้นสำหรับจีโนมคลอโรพลาส [1] เราใส่คำอธิบายประกอบการถอดเสียงโดยเปรียบเทียบกับ Genbank Nt, Genbank Nr และ TAIR10_ pep_20101214_ชุดข้อมูลที่อัปเดตแยกกันโดยใช้โปรแกรม BLAST (E< =="" 1e-20).="" meanwhile,="" all="" expressed="" transcripts="" were="" translated="" into="" potential="" proteins="" according="" to="" orf="" prediction="" by="" transdecoder="" [30]="" and="" predicated="" for="" the="" conserved="" domains="" based="" on="" the="" pfam="" database="">

สารออกฤทธิ์แอกทีโอไซด์ในcistanche

Gene Ontology และหมายเหตุประกอบเส้นทาง KEGG

โดยการจัดลำดับความคล้ายคลึงกันของลำดับกับฐานข้อมูล Uniprot (http://www.uniprot.org/) จะได้รับคำอธิบายประกอบ Gene Ontology (GO) ของการถอดเสียงที่ประกอบเข้าด้วยกันโดยใช้ไฟล์การเชื่อมโยงที่ดาวน์โหลดจาก (ftp://ftp.ebi.ac. uk/pub/databases/GO/goa/UNIPROT/gene_association. goa_uniprot.gz) การจัดกลุ่มคำศัพท์ GO ของยีนที่แสดงออกนั้นดำเนินการโดยใช้สคริปต์ที่กำหนดเอง และเราใส่คำอธิบายประกอบของยีนที่ระดับที่สี่สำหรับหมวดหมู่ CC, BP ​​และ MF แยกกัน

ข้อมูลเส้นทาง KEGG ถูกกำหนดสำหรับลำดับโปรตีนที่คาดการณ์ไว้ทั้งหมดโดยใช้เครื่องมือออนไลน์ KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34] ลำดับในรูปแบบ Fasta ถูกส่งไปยังคำขอ KAAS และดาวน์โหลดไฟล์ผลลัพธ์ของข้อมูลเส้นทางทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับ C. deticola stem transcriptome ชุดข้อมูลยีนของสิ่งมีชีวิตในพืช 13 ชนิดใน KEGG ใช้สำหรับทำหมายเหตุประกอบโดยใช้วิธี BBH (bi-directional best hit)

การวิเคราะห์ RT-qPCR

หลังจากการย่อยด้วย DNase I ประมาณ 5ug ของ RNA ทั้งหมดถูกแปลงเป็น cDNA สายแรกผ่านปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับด้วยไพรเมอร์ oligo(dT)15 และ NoScript Reverse Transcription System (Promega) จากนั้น ผลิตภัณฑ์ cDNA ถูกเจือจาง 10-พับด้วยน้ำปราศจากไอออนที่ปราศจากนิวคลีเอสก่อนใช้เป็นแม่แบบใน PCR แบบเรียลไทม์ cDNA เฉพาะถูกขยายโดย GoTaq 2-Step RT-qPCR System (Promega) ในปริมาตร 20 ul การขยาย PCR เกิดขึ้นต่อรูปแบบที่อุณหภูมิการหลอม 60 องศา ด้วยระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ 7500 (Applied Biosystems) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาณการถอดรหัสสัมพัทธ์คำนวณโดยวิธีเกณฑ์รอบเปรียบเทียบที่มียีน "comp10579_c0" เป็นมาตรฐานภายใน โดยใช้ซอฟต์แวร์ 7500 Manager

คู่ไพรเมอร์สำหรับ RT-PCR ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ออนไลน์ (http://primer3.ut.ee/) และมีรายชื่ออยู่ในชุดข้อมูล S1

ผลลัพธ์

การจัดลำดับ RNA และการประกอบการถอดรหัสของ C. deserticola ลำต้นเนื้อ

ต้นกำเนิดของ C. deserticola ถูกใช้อย่างกว้างขวางเป็นยาชูกำลังที่สำคัญตามประเพณีในประเทศจีนและญี่ปุ่นเป็นเวลาหลายปี เพื่อให้ได้ภาพรวมทั่วโลกของการแสดงออกของยีนในต้นกำเนิดเนื้อ C. deserticola เราได้รวบรวมตัวอย่างต้นกำเนิด C. deserticola ของฐานพืชเดียวกันในปี 2013 และ 2014 ตามลำดับ RNA ทั้งหมดถูกสกัดและ polyA บวก RNA ถูกทำให้บริสุทธิ์สำหรับการสร้างไลบรารี RNA-seq ที่ปลายคู่ 79,433,734 และ 86,019,176 อ่านข้อมูลคู่ที่สอดคล้องกับเกือบ 8 พันล้านและ 8.6 พันล้านฐานของลำดับโดยใช้การจัดลำดับ Illumina HiSeq 2000

แพลตฟอร์มใน 2013-ปีและ 2014-ปีตัวอย่าง (ตารางที่ 1) หลังจากลบลำดับของอแด็ปเตอร์และกรองการอ่านคุณภาพต่ำ (ดูรายละเอียดในวิธีการ) การอ่านคู่ปลายคุณภาพสูง 64,831,040 ในตัวอย่าง 2013-ปี ถูกใช้สำหรับแอสเซมบลีทรานสคริปต์ของใหม่ การใช้แอสเซมเบลอร์ลำดับทรินิตี้ [30], 51,719 ยีนและ 95,787 ลำดับการถอดเสียงถูกสร้างขึ้นด้วยความยาวการถอดเสียงตั้งแต่ 200 bp ถึง 15,698 bp ความยาวเฉลี่ยของการถอดเสียงประกอบคือ 950 ฐาน และความยาว N50 คือ 1,519 ฐาน จำนวนการถอดเสียงที่มีความยาวต่างกันเปิดเผยว่า 57.32 เปอร์เซ็นต์ของการถอดเสียงที่ประกอบกันนั้นอยู่ที่ประมาณ 500-bp หรือนานกว่านั้น (รูปที่ 1A) การอ่านแบบคู่คุณภาพสูงในตัวอย่าง 2014-ปี ถูกแมปกับทรานสคริปต์ที่ประกอบแล้ว นอกจากนี้ เราพบว่าหมายเลขการถอดรหัสสำหรับยีนที่ประกอบกันแต่ละยีนมีความหลากหลายและ 69 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่มีไอโซฟอร์มที่แสดงออกหนึ่งตัว ในขณะที่ 31 เปอร์เซ็นต์ของยีนแสดงการถอดเสียงสองอย่างหรือมากกว่า (รูปที่ 1B)

การหาปริมาณนิพจน์และคำอธิบายประกอบการใช้งานของการถอดเสียงที่ประกอบเข้าด้วยกัน

ความอุดมสมบูรณ์ของยีนหรือการถอดเสียงถูกหาปริมาณโดยใช้แพ็คเกจ RSEM ซึ่งการอ่านตามลำดับถูกจัดแนวใหม่กับยีนที่ประกอบหรือลำดับการถอดเสียงโดยใช้ Bowtie และการอ่านที่แมปเหล่านั้นใช้สำหรับการหาปริมาณ ค่า FPKM สำหรับแต่ละยีนหรือการถอดเสียงถูกคำนวณ และสุดท้าย เราระบุการถอดเสียงอย่างแข็งขัน 63,957 และ 52,857 (ค่า FPKM น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.5) ในตัวอย่างลำต้นเนื้อ C. Deserticola ใน 2{{17} }13 และ 2014 ตามลำดับ การถอดเสียง 44,776 รายการ (70.01 เปอร์เซ็นต์ในตัวอย่าง 2013-ปี, 84.71 เปอร์เซ็นต์ในตัวอย่าง 2014-ปี) ถูกแสดงออกมาในสองสำเนา และความสัมพันธ์ (ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สัน: 0.91979) ของข้อมูลนิพจน์คือ แสดงในรูป S1 ข้อมูลดิบการจัดลำดับถูกอัปโหลดไปยังฐานข้อมูล NCBI SRA (หมายเลขภาคยานุวัติ: SRX857402 และ SRX858938) เราใช้ยีนที่แสดงออกซึ่งระบุในตัวอย่าง 2013-ปีสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม ข้อมูลคำอธิบายประกอบการทำงานสำหรับการถอดเสียงแบบถอดเสียงทั้งหมดได้มาจากสองวิธี ประการแรก การถอดเสียงที่แสดงออกทั้งหมดถูกจัดแนวกับนิวคลีโอไทด์ที่รู้จัก (ไม่ใช่ GenBank) และฐานข้อมูลลำดับเปปไทด์ (GenBank nr และเปปไทด์ Arabidopsis) แยกกันโดยอัลกอริทึม BLAST จาก 63,957 ฉบับแสดงการถอดเสียง

29,220 (45.7 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกใส่หมายเหตุประกอบและแสดงให้เห็นความคล้ายคลึงกับลำดับในฐานข้อมูลหัวเรื่องใดๆ ในสามฐานข้อมูลที่มีการตัดค่า E-value 1e-20 ในขณะเดียวกัน ขอบเขตการเข้ารหัสผู้สมัครสำหรับลำดับการถอดเสียงที่แสดงทั้งหมดถูกคาดการณ์โดยใช้ซอฟต์แวร์ TransDecoder และ ORF ที่ยาวที่สุดสำหรับการถอดเสียงแต่ละรายการใช้สำหรับการค้นหาโดเมน Pfam เป็นผลให้มีการถอดเสียง 21,358 (33.4 เปอร์เซ็นต์) ตามฐานข้อมูล Pfam โดยรวมแล้ว การถอดเสียง 30,098 (47.1 เปอร์เซ็นต์) ถูกจับคู่อย่างมีนัยสำคัญกับยีนที่รู้จักในฐานข้อมูลสาธารณะโดยรวมวิธีการทั้งสองข้างต้น รายการการถอดเสียงที่สมบูรณ์พร้อมคำอธิบายประกอบของฟังก์ชันแสดงไว้ในข้อมูลเพิ่มเติม (ชุดข้อมูล S2)

เราสำรวจการถอดเสียงที่แสดงออกมากที่สุด 20 อันดับแรก (ตารางที่ 2) ซึ่งสอดคล้องกับร้อยละ 18.99 ของการอ่านลำดับทั้งหมด และพบว่าส่วนใหญ่เป็นยีนที่ตอบสนองต่อสิ่งมีชีวิต

สิ่งเร้าความเครียด Dehydrin (DHNs) ซึ่งเป็นกลุ่มของโปรตีนความเครียดที่ชอบน้ำและทนต่อความร้อนซึ่งมีกรดอะมิโนที่มีประจุจำนวนมากที่อยู่ในกลุ่มที่ 2 Late Embryogenesis Abundant (LEA) เป็นยีนที่แสดงออกมากที่สุด ทรานสคริปท์ Dehyrin ที่แตกต่างกันสามตัว (comp28713_c0_seq1/2/4) ถูกตรวจพบอย่างสูงในก้านที่เป็นเนื้อซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการปกป้องเซลล์จากความเสียหายที่เกิดจากความเครียดจากภัยแล้ง ยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียดอื่นๆ เช่น โปรตีนช็อตจากความร้อน โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค และเมทัลโลไธโอนีนก็พบว่ามีการแสดงออกอย่างมาก ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับสภาพแวดล้อมการอยู่รอดที่รุนแรงของมัน นอกจากนี้ ยีนที่เป็นส่วนประกอบบางตัวซึ่งรวมถึงยีน 26S ไรโบโซม RNA RNA (comp22329_c2_seq1), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการพักตัวของออกซิน/การพักตัว (comp20999_c0_seq1), แฟกเตอร์ ADP-ไรโบซิเลชัน (comp20499_ c0_seq1) ถูกคัดลอกอย่างมากเช่นกัน

การจำแนกหน้าที่ของการถอดเสียงที่แสดงทั้งหมดตามยีนออนโทโลยีและฐานข้อมูล KEGG

คำอธิบายประกอบของ Gene Ontology (GO) ได้มาจากไฟล์คำอธิบายประกอบ Uniprot และการเชื่อมโยงข้อมูลประจำตัว โดยรวมแล้ว การถอดเสียง 20,907 ครั้ง คิดเป็นร้อยละ 32.69 ของลำดับการแสดงทั้งหมด ถูกกำหนดให้เป็น 1,745 เงื่อนไขการใช้งาน จากเงื่อนไข GO ที่ใช้งานได้ทั้งหมด การกำหนดให้กับกระบวนการทางชีววิทยาประกอบด้วยส่วนใหญ่ (1,116, 63.95 เปอร์เซ็นต์) ตามด้วยองค์ประกอบเซลล์ (329, 18.85 เปอร์เซ็นต์) และการทำงานของโมเลกุล (300, 17.20 เปอร์เซ็นต์) หน้าที่ที่ได้รับมอบหมายของทรานสคริปต์ที่แสดงออกมานั้นครอบคลุมหมวดหมู่ GO ที่หลากหลาย และคำศัพท์ GO 10 อันดับแรกที่มีการถอดเสียงที่มีคำอธิบายประกอบมากที่สุดอยู่ในตารางที่ 3 และเราจัดเตรียมการแจกแจงทรานสคริปต์ที่แสดงทั้งหมดไว้ในสามหมวดหมู่ของยีน Ontology (ฟังก์ชันโมเลกุล ส่วนประกอบเซลลูลาร์ และกระบวนการทางชีวภาพ) ในไฟล์เสริม (ชุดข้อมูล S3) คำศัพท์ GO ที่เกี่ยวข้องกับฟังก์ชันการจับและกิจกรรม Transferase ถูกแสดงอย่างเด่นชัดในหมวดหมู่ฟังก์ชันระดับโมเลกุล เกี่ยวกับฟังก์ชันการจับ การจับกับไอออนบวก (4,394 การถอดเสียง) แสดงถึงความอุดมสมบูรณ์มากที่สุด รองลงมาคือการจับนิวคลีโอไทด์/นิวคลีโอไซด์ (โดยเฉลี่ย 3,404 การถอดเสียง) และการจับโปรตีน (2,422 การถอดเสียง) ในขณะที่อยู่ในกลุ่มกิจกรรมทรานส์ฟอร์เรส ส่วนใหญ่เป็นกลุ่มที่มีการถ่ายโอนฟอสฟอรัส (2,256 การถอดเสียง, 65.77 เปอร์เซ็นต์ ) ในบรรดาหมวดหมู่องค์ประกอบเซลล์ การถอดเสียงอยู่ในเซลล์มากกว่า (โดยเฉลี่ย 10,581 การถอดเสียง) ในขณะที่ในหมวดหมู่กระบวนการทางชีววิทยา การถอดเสียงมีส่วนเกี่ยวข้องมากขึ้นในกระบวนการเมแทบอลิซึมของพอลิเมอร์ชีวภาพ (โดยเฉลี่ย 6,683 การถอดเสียง) ตามด้วยกฎระเบียบของกระบวนการเซลล์ (4,841 การถอดเสียง) การแสดงออกของยีน (4,678 การถอดเสียง) และการขนส่ง (3,512 การถอดเสียง)

เพื่อทำการขุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของลิกนินและ PhG ลำดับของโปรตีนที่มีศักยภาพที่ไม่ซ้ำซ้อนจำนวน 21,358 ลำดับถูกค้นหาโดยเทียบกับลำดับยีนของสิ่งมีชีวิตในพืช 13 ชนิดในฐานข้อมูล KEGG และพวกเขาถูกกำหนดให้กับวิถีทาง KEGG 275 อย่างโดยมีการโจมตีอย่างน้อย 5 ครั้ง เส้นทาง 10 อันดับแรกที่มีลำดับที่ตรงกันมากที่สุดถูกระบุไว้ในตารางที่ 4 เส้นทางส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมแทบอลิซึมเบื้องต้น เช่น เมแทบอลิซึมของกรดอะมิโนหรือโปรตีน (ko01230, ko04141 และ ko04120) เมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต (ko01200 และ ko00500) และนิวคลีโอไทด์ หรือเมแทบอลิซึมของนิวคลีโอไซด์ (ko03018, ko00230 และ ko00240) นอกจากนี้ ยังมีวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมอีก 27 วิธี (รูปที่ 2) เช่น การสังเคราะห์กระดูกสันหลังเทอร์พีนอยด์ การสังเคราะห์ฟีนิลโพรพานอยด์ การสังเคราะห์ทางแคโรทีนอยด์ การสังเคราะห์ไอโซควิโนลีน อัลคาลอยด์ และการสังเคราะห์ทางโทรเพน พิเพอริดีน และไพริดีน อัลคาลอยด์ ผลลัพธ์เหล่านี้ให้ข้อบ่งชี้เพิ่มเติมว่ากระบวนการเมแทบอลิซึมที่กำลังดำเนินอยู่ในเนื้อเยื่อต้นกำเนิด C. Deserticola การถอดเสียงที่แสดงทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางของ KEGG ถูกระบุไว้ในไฟล์เสริม (ชุดข้อมูล S4) แม้ว่าจะมีวิถีทางที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง C. deserticola และพืชอื่นๆ เช่น ข้าว [35] (ชุดข้อมูล S5) เป้าหมายหลักของเราในการศึกษานี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อเปิดเผยโปรไฟล์การถอดรหัสทั้งหมดของต้นกำเนิด C. deserticola และเพื่อแสดงภาพ เส้นทางที่เกี่ยวข้องของการสังเคราะห์ PhGs ซึ่งอาจเป็นประโยชน์สำหรับแนวทางการเพาะปลูก

ยีนของผู้สมัครเข้ารหัสเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ลิกนิน

ลิกนินเป็นพอลิเมอร์บนบกตามธรรมชาติที่มีมากเป็นอันดับสองในอาณาจักรพืช โดยประกอบด้วยหนึ่งในสามของวัสดุที่พบในผนังเซลล์พืช [36, 37] ในฐานะองค์ประกอบสำคัญของผนังเซลล์ ลิกนินช่วยในการขนส่งทางน้ำ ให้การสนับสนุนทางกลและความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และป้องกันเชื้อโรคและสัตว์กินพืช [38–40] บทบาทของลิกนินเหล่านี้มีค่ามากในการสนับสนุนการแข็งตัวของอวัยวะเพศใต้ดินของค. ทะเลทรายิโคลาในทะเลทราย ในการศึกษานี้ เรานำเสนอภาพที่สมบูรณ์ของเส้นทางการสังเคราะห์ลิกนินในค. ทะเลทรายิโคลา(รูปที่ 3) ซึ่งลิกนินโมโนเมอร์ถูกสังเคราะห์ทางชีวเคมีจากฟีนิลอะลานีนผ่านปฏิกิริยาทางเอนไซม์หลายชุด รวมถึงกระบวนการไฮดรอกซิเลชัน เมทิลเลชัน การรีดิวซ์ และกระบวนการออกซิเดชันพอลิเมอไรเซชัน ตรวจพบเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ลิกนินสำหรับรูปแบบที่สังเคราะห์ขึ้นส่วนใหญ่สามรูปแบบในหลอดเลือด

เนื้อเยื่อ (p-hydroxyl-phenyl (H), guaiacyl (G) และ syringyl (S) ลิกนิน) และ 5-ไฮดรอกซิล-guaiacyl ลิกนินซึ่งถูกระบุเฉพาะใน COMT (กรดคาเฟอีน 3-O-เมทิลทรานส์เฟอเรส, EC 2.1.1.68) พืชขาด (เช่น ล้มลง) [41, 42]

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) เป็นเอนไซม์หลักตัวแรกในวิถีทางสังเคราะห์ของลิกนิน (รูปที่ 3) ซึ่งเปลี่ยนฟีนิลอะลานีนเป็นกรดซินนามิกโดยการไม่ทำให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน [43, 44] การอ่าน PAL ทั้งหมด 6,297 รายการถูกจัดลำดับและมีการรวบรวมการถอดเสียง PAL 7 รายการในค. ทะเลทรายิโคลา(ตารางที่ 5). จากการเปรียบเทียบความคล้ายคลึงของลำดับ เราพบว่า 4 ในนั้น (comp28550_c1_seq1/2/3/5) มีความคล้ายคลึงกันมากกว่า 95 เปอร์เซ็นต์กับลำดับ mRNA ที่รู้จักของ C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|) ในขณะที่ comp28550_c1_seq4 และ comp25940_c0_seq1 มีความคล้ายคลึงกัน 77 เปอร์เซ็นต์และ 82 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ การทำนาย ORF เปิดเผยว่าทรานสคริปต์ 5 รายการมีศักยภาพในการเข้ารหัสโปรตีนและมีโดเมนไลเอสกรดอะมิโนอะโรมาติก (PF00221.14) ในหมู่พวกมัน มีเพียงการถอดรหัสคอมพ์28550_c1_seq4 เท่านั้นที่สามารถเข้ารหัสลำดับโปรตีนที่สมบูรณ์ของเรซิดิวกรดอะมิโน 718 ตัว มีรายงานว่า PAL ถูกเข้ารหัสโดยตระกูล multigene ขนาดเล็กในพืชส่วนใหญ่ เช่น 4 ใน Arabidopsis thaliana [39, 45] 5 ใน Populus trichocarpa [46, 47] 3 ใน Scutellaria baicalensis [48] และ 7 Cucumis sativus [43, 49] เป็นต้น การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของเราแนะนำว่ามี 4 ยีนเข้ารหัส PAL ใน C.deserticola และเราตั้งชื่อพวกมันว่า CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 และ CdPAL4 ตามลำดับ (S2 รูป) 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) และ trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) เป็นเอนไซม์สองตัวที่ทำหน้าที่เปลี่ยนกรดซินนามิกไปเป็น p- coumaroyl-CoA ใน สองคำสั่งย้อนกลับ นอกจากนี้ยังอยู่ในกระดูกสันหลังและค่า FPKM ของนิพจน์คือ 39.57 และ 51.93 ตามลำดับ

ลิกนินทั้งสี่ชนิดถูกสังเคราะห์ทางชีวเคมีโดยวิถีทางที่แตกต่างกันซึ่งถูกควบคุมโดยเอ็นไซม์หลักสามตัว, ซินนาโมอิล-โคเอ รีดักเตส (CCR, EC 1.2.1.44), ชิกิเมต โอ-ไฮดรอกซีซินนามิก- เมทิลทรานสเฟอเรส (HCT, EC 2.3.1.133) และเฟอร์เลต{{11 }}ไฮดรอกซีเลส (F5H, EC 1.14.-.-) CCR ถูกรายงานว่าเป็นจุดควบคุมของวิถีทางลิกนิน [50, 51] ซึ่งเร่งปฏิกิริยา X-CoA (X รวมทั้ง p- coumaroyl, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl และ sinapoyl) เป็น Y-aldehyde (Y ซึ่งรวมถึง p-coumar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl และ sinap) ในขณะที่ HCT เร่งปฏิกิริยา p-coumar-oyl-CoA ไปเป็น p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid เอนไซม์ทั้งสอง เช่นเดียวกับสวิตช์ ควบคุมการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของลิกนิน P-hydroxyl-phenyl หรือลิกนินอีกสามประเภท

F5H เป็นสวิตช์สาขาอีกตัวหนึ่งที่ควบคุมไซริงิลลิกนินและ 5-ไฮดรอกซิล-กวาเอซิล ลิกนิน เอนไซม์ที่สำคัญอื่นๆ ได้แก่ กรดคาเฟอีน 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) และ cinnamyl-alcohol dehydrogenase ( CAD, EC 1.1.1.195) ก็ถูกตรวจพบเช่นกัน ข้อมูลการแสดงออกโดยละเอียดแสดงอยู่ในตารางที่ 6 ยีนของเอนไซม์เหล่านี้ที่ระบุในการศึกษานี้จะเป็นแหล่งทรัพยากรอันมีค่าสำหรับการศึกษาจีโนมเชิงหน้าที่ในพืชสมุนไพรที่สำคัญนี้ ยีน 10 ยีนที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสังเคราะห์ลิกนินในตารางที่ 6 ได้รับการคัดเลือกสำหรับการตรวจสอบ RT-qPCR เพื่อยืนยันผลลัพธ์ของ RNA-seq ของเรา (รูปที่ 4) และสหสัมพันธ์สูง (ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สัน: 0.90343) บ่งชี้ความถูกต้องสูงและความสามารถในการทำซ้ำของการวิเคราะห์การถอดรหัสของเรา . ชุดข้อมูล S1 แสดงรายการลำดับไพรเมอร์ที่ใช้ในการวิเคราะห์นี้

Cistancheมีผลมากมาย

ยีนของผู้สมัครเข้ารหัสเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของ PhGs

Phenylethanoid glycosides (PhGs) เป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นส่วนผสมหลักในค. ทะเลทรายิโคลาพร้อมกิจกรรมเสริมสมรรถภาพทางเพศ ขับอนุมูลอิสระ และชะลอวัย [7–10] องค์ประกอบทางเคมีสามประการของ PhGs ได้แก่ กรดอินทรีย์ แซคคาไรด์ และฟีนิลเอทานอล อะไกลคอน (รูปที่ 3) กรดอินทรีย์รวมทั้งกรด caffeic กรด ferulic และกรด coumaric เป็นผลิตภัณฑ์ของวิถีการสังเคราะห์ฟีนิลโพรพานอยด์ ส่วนประกอบของแซคคาไรด์รวมทั้งกลูโคสและแรมโนสเป็นผลิตภัณฑ์ของวิถีการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรต เช่น เมแทบอลิซึมของแป้งและซูโครส เมแทบอลิซึมของน้ำตาลอะมิโนและนิวคลีโอไทด์ เมแทบอลิซึมของฟรุกโตสและแมนโนส เป็นต้น อย่างไรก็ตาม เส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพของส่วนฟีนิลเอธานอลยังไม่ชัดเจน ในที่นี้ เราเสนอเส้นทางการสังเคราะห์ฟีนิลเอทานอลที่เป็นไปได้สองวิธีตามข้อมูลลำดับของเรา หนึ่งคือรายงานกรดคาเฟอีนหรือทางเดินกรด ferulic หรือที่เรียกว่าเส้นทางกรดซินนามิกซึ่งคล้ายกับทางเดินกระดูกสันหลังสังเคราะห์ลิกนิน อีกวิธีหนึ่งขึ้นอยู่กับเส้นทางการเผาผลาญของฟีนิลอะลานีน (รูปที่ 3) ซึ่งฟีนิลอะลานีนถึงฟีนิลเอธานอลได้มาจาก 'วิถีแห่งเอนลิช' ซึ่งพบครั้งแรกในยีสต์เมื่อหนึ่งศตวรรษก่อน และได้รับการตรวจสอบในดอกพิทูเนีย [52, 53] มะเขือเทศ [ 54] และลุกขึ้น [55, 56] ยีนของเอนไซม์สี่ตัวเข้ารหัส aspartate/tyrosine aminotransferase, histidinolphosphate aminotransferase และ primary-amine oxidase ซึ่งมีหน้าที่ในการเปลี่ยนฟีนิลอะลานีนเป็นฟีนิลเอธานอลถูกตรวจพบในลำต้นของ C. deserticola ผลิตภัณฑ์ของฟีนิลเอธานอลอาจถูกออกซิไดซ์เพิ่มเติมโดยโมโนออกซีเจเนสหรือเมทิลเลตโดยเมทิลทรานสเฟอเรสไปเป็นอนุพันธ์ (ฟีนิลเอธานอล อะไกลคอน) ซึ่งมีส่วนร่วมในการสังเคราะห์ PhG โดยสรุป มีการเสนอเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพแบบสมมุติสองทางของ phenylethanol aglycon สำหรับ C. deserticola แต่ยังต้องการการศึกษาเพิ่มเติมในเพิ่มเติม