ส่วนที่ 1: ฤทธิ์ต้านการอักเสบ สารต้านอนุมูลอิสระ การให้ความชุ่มชื้น และการสร้างภูมิคุ้มกันของ Quercetin 3-O- -D-Glucuronide ใน Keratinocytes ของมนุษย์และเซลล์เมลาโนมาผ่านการกระตุ้นเส้นทาง NF-κB และ AP-1

ติดต่อสอบถามเพิ่มเติมได้ที่tina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: เควอซิทิน3-O- -D-glucuronide(Q-3-G) คอนจูเกตกลูโคโรไนด์ของเควอซิทินได้รับการรายงานว่ามีต้านการอักเสบคุณสมบัติของมาโครฟาจที่กระตุ้นไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ เช่นเดียวกับคุณสมบัติต้านมะเร็งและต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งแตกต่างจากเควอซิทินซึ่งได้รับการอธิบายอย่างกว้างขวางว่ามีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยามากมายรวมถึงผลในการปกป้องผิวหนัง ประโยชน์ทางเภสัชวิทยาและกลไกของ Q-3-G ในผิวหนังยังคงต้องได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่การกำหนดลักษณะคุณสมบัติในการปกป้องผิวหนัง รวมทั้งคุณสมบัติต้านการอักเสบและต้านอนุมูลอิสระของความเครียดที่เกิดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจาก Q-3-ต่อ UVB หรือ H2O2- ผลของความชุ่มชื้น และการเกิด antimelanogenesisกิจกรรมโดยใช้เซลล์เคราติโนไซต์ของมนุษย์ (HaCaT) และเซลล์มะเร็งผิวหนัง (B16F10) Q-3-G down-ควบคุมการแสดงออกของยีนและไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ เช่น ไซโคลออกซีเจเนส-2 (COX-2) และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก (TNF)- ใน H2O หรือ UVB- เซลล์ HaCaT ที่ฉายรังสี นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่า O-3-Gexhibits มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยใช้การวิเคราะห์การขับอนุมูลอิสระ โฟลว์ไซโตเมตรี และการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียสอีรีทรอยด์ 2- แฟกเตอร์ 2 (Nrf2) Q-3-G ลดการผลิตเมลานินในเซลล์ B16F10 ที่กระตุ้น -melanocyte-stimulating ( -MSH) ผลกระทบของความชุ่มชื้นและกลไกของ Q-3-G ได้รับการตรวจสอบโดยการประเมินยีนที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยความชุ่มชื้น เช่น ทรานส์กลูตามิเนส-1(TGM-1), filaggrin(FLG) และการสังเคราะห์กรดไฮยาลูโรนิก (มี)-1 นอกจากนี้ Q-3-G ยังเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของ c-Jun, Jun N-terminal kinase (JNK), Mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase 4(MKK4) และ TAK1 ที่เกี่ยวข้องกับ MAPK/AP เส้นทาง -1 และฟอสโฟรีเลชั่นของ IkB , IkB kinase(IKK)- , Akt และ Src ที่เกี่ยวข้องกับเส้นทาง NF-kB เมื่อนำมารวมกัน เราได้แสดงให้เห็นว่า Q-3-G มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ สารต้านอนุมูลอิสระ การให้ความชุ่มชื้น และการสร้างภูมิคุ้มกันในเซลล์เคราตินและเซลล์เมลาโนมาของมนุษย์ผ่านวิถีทาง NF-kB และ AP-1

คีย์เวิร์ด: เควอซิทิน 3-O- -D-glucuronide;การป้องกันรังสียูวี; ให้ความชุ่มชื้น; การเกิด antimelanogenesis; AP-1; NF-kB

1. บทนำ

ผิวหนัง ซึ่งเป็นอวัยวะที่ใหญ่ที่สุดของร่างกาย เป็นเกราะป้องกันที่มีบทบาทสำคัญในการปกป้องร่างกายจากสภาพแวดล้อมภายนอกและปัจจัยที่สร้างความเสียหาย เช่น รังสีอัลตราไวโอเลต จุลินทรีย์ที่ติดเชื้อ และสารเคมีอันตราย บาเรียนี้ยังควบคุมความสมดุลของอิเล็กโทรไลต์และอุณหภูมิของร่างกาย และป้องกันการสูญเสียความชื้น [1,2] ผิวหนังของมนุษย์ประกอบด้วยสามชั้น: หนังกำพร้า, ผิวหนังชั้นหนังแท้ที่มีอวัยวะ และเนื้อเยื่อใต้ผิวหนัง [3] ชั้นหนังกำพร้ามีบทบาทสำคัญในการรักษาอุณหภูมิของร่างกาย

Keratinocytes ซึ่งเป็นองค์ประกอบที่มีอยู่มากมายในผิวหนังชั้นนอกนั้นจะมีปฏิสัมพันธ์กับเซลล์อื่นอย่างแน่นหนาผ่าน desmosomes และรอยต่อที่แน่นหนาซึ่งทำให้เกิดอุปสรรคทางเคมีกายภาพที่มีประสิทธิภาพ[4] แม้ว่าผิวหนังจะทำหน้าที่เป็นเกราะป้องกัน แต่รังสีอัลตราไวโอเลต (UV) มีผลอย่างมากต่อเซลล์ส่วนใหญ่ รวมทั้ง keratinocytes ซึ่งเป็นชั้นนอกของผิวหนัง รังสียูวีสามารถทำให้เกิดริ้วรอยแห่งวัย ผิวถูกทำลาย ริ้วรอย และรอยดำ ซึ่งถือเป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญที่สุดประการหนึ่ง [5]แสงยูวีประกอบด้วยช่วงความยาวคลื่นสามช่วง: UVA(320-400 นาโนเมตร), UVB (280-320 นาโนเมตร) และ UVC (200-280 นาโนเมตร) ข้างเคียงกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) ซึ่งทราบกันดีอยู่แล้วว่ามีส่วนทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน UVB สามารถนำไปสู่การผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) ผ่านการกระตุ้นของเอนไซม์ที่สร้าง ROS [6] การสะสมของ ROS ที่ควบคุมไม่ได้ในเซลล์รวมถึง keratinocytes ได้รับการอธิบายว่าทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงออกซิเดชันกับไขมัน โปรตีน กรดนิวคลีอิก และโมเลกุลภายในเซลล์อื่นๆ ที่นำไปสู่ความเสียหายต่อผิวหนังประเภทต่างๆ และกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับความชรา เช่น การตายของเซลล์ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการอักเสบ [7,8] นอกจากนี้ เป็นที่ทราบกันดีว่าการตอบสนองต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีอิทธิพลต่อความเสียหายของส่วนประกอบต่างๆ ของเซลล์ [9] เซลล์ผิวที่เสียหายยังสามารถนำไปสู่การตอบสนองต่อการอักเสบ ส่งผลให้ผิวหนังได้รับความเสียหายเรื้อรัง [10] UVB หรือ H2O2-ประเภทหนึ่งที่ทำลายผิวผ่านกระบวนการทางชีววิทยาคือการแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบ เช่น ไซโคลออกซีเจเนส-2 (COX-2) และไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ [11] ดังนั้นการพัฒนาผลการป้องกันผิวที่ปลอดภัย แข็งแกร่ง และมีประสิทธิภาพมากขึ้นจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการป้องกันและปิดกั้นโรคที่เกี่ยวข้องกับ UVB หรือ H2O2 ซึ่งเป็นสื่อกลางที่ทำร้ายผิว

ความชุ่มชื้นของผิวยังมีบทบาทสำคัญในการรักษาการทำงานตามปกติ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง stratum corneum (SC) มีผลป้องกันการสูญเสียน้ำ [12] ปริมาณน้ำของ stratum corneum มีส่วนในการลอกผิวและการเจริญเติบโตที่เหมาะสม ในขณะที่น้ำใน SC ไม่เพียงพอจะส่งเสริมการสะสมและความผิดปกติของ corneocytes [12,13] ในขั้นตอนสุดท้ายของการสร้างความแตกต่างของเคราติโนไซต์ พลาสมาเมมเบรนและออร์แกเนลล์ของเซลล์จะหายไป จากนั้นแคลเซียมที่ไหลเข้าจะเหนี่ยวนำทรานส์กลูตามิเนส (TGM) เพื่อเชื่อมขวางกับโปรตีนอื่นๆ การขาดหรือสูญเสีย TGM-1 ทำให้เกิดการเชื่อมขวางที่บกพร่องของการห่อหุ้มเซลล์ Lamella ichthyosis เป็นตัวอย่างของโรคที่เกิดจากการสูญเสีย TGM-1 นอกจากนี้ filaggrin (FLG) ซึ่งเป็นเมทริกซ์เคราตินที่ก่อตัวขึ้น มีบทบาทในการสร้าง SC เนื่องจากทำหน้าที่เป็นโครงเพื่อจับโปรตีนและไขมันจากซองจดหมายที่เป็นเนื้อเดียวกัน [14] โดยเร่งปฏิกิริยาเชื่อมขวางของ g-glutamyl lysine, ATGMs และเมมเบรน -เอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง ให้ความสมบูรณ์แก่ SCs [15] นอกจากนี้ กรดไฮยาลูโรนิก (HA) ยังเป็นชนิดของปัจจัยความชื้นตามธรรมชาติ (NMF) ที่เกี่ยวข้องกับการกักเก็บความชื้นในผิวหนังและแสดงรายละเอียดที่ชัดเจนในการเสื่อมสภาพของผิวที่แท้จริง เป็นสารนำส่งยา และเป็นส่วนประกอบที่สำคัญของเมทริกซ์นอกเซลล์ [16,17]. HA มีบทบาทในการเพิ่มความชุ่มชื้นของผิวโดยควบคุมยีนสังเคราะห์กรดไฮยาลูโรนิก (HAS) นอกจากนี้ กรดเรติโนอิก (วิตามินเอ) ยังควบคุม HA ในผิวหนังชั้นนอกได้อย่างมีประสิทธิภาพ [17] TGM-1, FLG และ HAS-12,3 เป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต NMF [18] นอกจากนี้ การกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัส เช่น โปรตีนกระตุ้น-1(AP-1) และปัจจัยนิวเคลียร์ (NF)-kB มีส่วนเกี่ยวข้องในการผลิตสารก่อการอักเสบที่เพิ่มประสิทธิภาพเกราะป้องกันผิวและความชุ่มชื้นของผิว ผ่านเส้นทาง AP-1 และ NF-kB[19] เอ็นไซม์ส่งสัญญาณต้นน้ำในวิถี AP-1 รวมถึงไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นการทำงานของไมโตเจน (MAPK) เช่น ไคเนสที่ปลาย N ของ c-Jun (JNK), ไคเนสควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ (ERK) และ p38 ในขณะที่ Src Akt, IkB -kinase (IKKo/ ) และ KBO(IkBa) เป็นของเส้นทาง NF-KB [20. ผิวหนังยังผลิตเมลานินในชั้นผิวหนังชั้นนอก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเมลาโนไซต์ ซึ่งเป็นแหล่งสำคัญของเมลานิน ซึ่งมีส่วนในการกำหนดสีผิวและการสร้างเม็ดสี [21] การฉายรังสี UVB และฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ (o-MSH) สามารถกระตุ้นการหลั่งเมลานิน ดังนั้นจึงกระตุ้นการสร้างเม็ดสี [22. ในระหว่างการสร้างเมลาโนเจเนซิส -MSH จะกระตุ้นโปรตีนไคเนส A (PKA), โปรตีนปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) และองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์ (CREB) [23] หนึ่งในหน้าที่ของเมลานินถือเป็นการป้องกันความเสียหายของผิวหนังจากรังสียูวีรวมถึงแสงแดด อย่างไรก็ตาม การผลิตเมลานินที่มากเกินไปหรือการขาดสารเมลานินที่เกิดจากความชรา ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ และการสัมผัสรังสียูวี ทำให้เกิดกระ ฝ้า เลนติจีนในวัยชรา และความผิดปกติอื่นๆ สุขภาพ [24]. ดังนั้นการควบคุมการสร้างเม็ดสีจึงเป็นที่ต้องการเพื่อรักษาทั้งสุขภาพและรูปลักษณ์ของร่างกายมนุษย์

เควอซิทินเป็นฟลาโวนอยด์ประเภทฟลาโวนอยด์ที่ได้รับการจัดสรรเด่น มีอยู่ในผัก ผลไม้ เครื่องดื่ม และพืชสมุนไพร [25] ด้วยเหตุนี้ เควอซิทินจึงได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางถึงประโยชน์ทางเภสัชวิทยา ได้แก่ ต้านการอักเสบ ต้านหลอดเลือดสารต้านอนุมูลอิสระ, ต้านมะเร็ง และคุณสมบัติในการปกป้องผิวหนัง และเกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี [24,26-29] อย่างไรก็ตาม งานหลายชิ้นที่ใช้วิธีการที่ละเอียดอ่อนและเชื่อถือได้ได้แสดงให้เห็นว่าเควอซิทินไม่ถูกตรวจพบในพลาสมา [30-33] และแทบจะไม่พบในสมอง [34,35] เควอซิทิน ซึ่งโดยทั่วไปแสดงในรูปของไกลโคไซด์ ถูกดูดซึมได้ดีและส่วนใหญ่ไฮโดรไลซ์และเผาผลาญในลำไส้เล็ก ลำไส้ใหญ่ ตับ และไตเป็นเมตาบอไลต์แบบคอนจูเกต [30,36-38] เฉพาะสารคอนจูเกตเช่น glucuronide หรือ sulfate (methylated หรือ unmethylated ตามลำดับ) แทนที่จะตรวจพบ quercetin aglycone หรือ glycosides ในเลือดหมุนเวียน 3/-methyl-quercetin-3-glucuronide, quercetin-3-glucuronide, and quercetin-3'-sulfate ถูกระบุว่าเป็นสารเมแทบอไลต์ที่สำคัญในพลาสมาหลังจาก 1.5 ชั่วโมงจากการบริโภคหัวหอมทอด[30, 32]. เมแทบอไลต์ของ quercetin เหล่านี้ก่อตัวขึ้นในลำไส้เล็กและตับโดยเอนไซม์เปลี่ยนรูปทางชีวภาพรวมถึง UDP-glucuronyltransferases อันเป็นผลมาจากการเผาผลาญเฟส II [29,39,40] มีรายงานด้วยว่าสารคอนจูเกตของเควอซิทินสะสมในพลาสมาของมนุษย์ในช่วงความเข้มข้น 10-'ถึง 10- องศา M หลังจากการรับประทานหัวหอมพร้อมอาหารเป็นระยะๆ เป็นเวลา 1 สัปดาห์[41] ค่าครึ่งชีวิตของสารเควอซิทินค่อนข้างสูง ที่ประมาณ 11 ถึง 28 ชั่วโมง [29] เนื่องจากสารประกอบเหล่านี้ถูกมองว่าเป็นรูปแบบหลักของสารเมตาบอไลต์เควอซิทินแบบคอนจูเกต การศึกษาโดยเน้นที่กิจกรรมทางชีววิทยาของฟลาโวนอลโดยใช้สารคอนจูเกตเหล่านี้จึงเป็นสิ่งสำคัญ ซึ่งทำให้เราต้องศึกษากิจกรรมทางชีววิทยาของเมตาบอไลต์เควอซิทินที่ควบคู่กัน เมแทบอไลต์ของกลูโคโรไนด์ที่มีมากที่สุดแห่งหนึ่งที่พบในพลาสมาและเนื้อเยื่อส่วนใหญ่ รวมทั้งตับ ไต และสมองคือ quercetin 3-O- -D-glucuronide(Q-3-G)(รูปที่ 1) [31,35,40,42,43] ซึ่งอาจสร้างกิจกรรมที่คล้ายกัน แข็งแกร่งกว่า หรืออ่อนแอกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสารประกอบหลักในแบบจำลองที่แตกต่างกัน Q-3-G ถูกส่งไปยังเนื้อเยื่อเป้าหมายผ่านพลาสมาเพื่อออกฤทธิ์ทางชีวภาพ [39] O-3-G ยังแสดงให้เห็นว่าเป็นสารที่มีประสิทธิภาพในพลาสมาของหนูหลังการให้เควอซิทินทางปาก [43] ในการศึกษาอื่นๆ พบว่า Q-3-เมแทบอไลต์ที่มี G สะสมอยู่ในเส้นเลือดใหญ่หลังการให้สารอาหารที่อุดมด้วยเคอร์ซิติน และได้รับการระบุว่าเป็นหลักการออกฤทธิ์ที่ตรวจพบในเลือดมนุษย์ตั้งแต่ 0{{48} } ไมโครเมตร【44】. นอกจากนี้ Q-3-G ยังสามารถพบได้ในไวน์ [45] และในพืชสมุนไพร เช่น Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis และถั่วเขียว [46-49].Q-3-G ได้รับการอธิบายว่าเป็นส่วนประกอบต้านการอักเสบภายใต้สภาวะที่กระตุ้นด้วย LPS และแสดงคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระในเลือด [50-52] อย่างไรก็ตาม เมื่อเทียบกับประวัติการใช้ที่ยาวนานและการศึกษาเกี่ยวกับเควอซิทินในวงกว้าง การศึกษาของ Q-3-G ยังคงต้องศึกษาต่อไป ดังนั้น Q-3-G จึงถูกเลือกให้เป็นตัวแทนของสารเมตาบอไลต์ของเควอซิทินในฐานะผู้เล่นในร่างกายของเควอซิทิน นอกจากนี้ บทบาทของ Q-3-G ต่อผลการปกป้องผิวหนังยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างครบถ้วน ในการศึกษานี้ โดยใช้การประเมินในหลอดทดลองแบบต่างๆ เราตรวจสอบผลการป้องกันผิวของ Q-3-G ต่อ UVBor H2O2- ที่เกิดจากความเครียดและการอักเสบที่เกิดจากออกซิเดชัน ความชุ่มชื้นของผิวใน HaCaT (สายเซลล์เคราตินในมนุษย์) เซลล์ และฤทธิ์ต้านการเกิดมะเร็งในเซลล์ B16F10 (สายเซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู)

2. ผลลัพธ์

2.1.ฤทธิ์ต้านการอักเสบและต้านอนุมูลอิสระของ Q-3-G ต่อ UVB หรือ H2O2-เซลล์ HaCaT ที่กระตุ้น

เนื้อเยื่อผิวหนังสามารถถูกทำลายได้ด้วยรังสียูวี รังสียูวีกระตุ้นปัจจัยที่เป็นอันตรายหลายประการ รวมถึงความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การตายของเซลล์ apoptotic การอักเสบ และการเสื่อมสภาพของผิว ในการพิจารณากิจกรรมป้องกันรังสียูวีของ Q-3-G ในขั้นต้น เราประเมินว่า Q-3-G มีผลใดๆ ต่อความอยู่รอดของเซลล์ของเคราติโนไซต์ของมนุษย์หรือไม่ ด้วยการใช้ 3-(4-5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-243 tetrazolium bromide (MTT) assay เราได้ตรวจสอบผลกระทบของพิษต่อเซลล์ ของ O-3-G ในเซลล์ HaCa ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2a ไม่มีการรบกวนที่มีนัยสำคัญต่อความอยู่รอดของเซลล์ที่ความเข้มข้น 25-20 uM โดย Q-3-G ซึ่งบ่งชี้ว่า O-3-G ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์จนถึง 20 µM และไม่ทำร้าย keratinocytes ซึ่งเป็นชั้นผิวเผินของเซลล์ผิวหนัง ต่อไป เราประเมินผลการปกป้องผิวจาก Q-3-G ในเซลล์ HaCaT ที่สัมผัสกับ UVB หลังจากการฉายรังสี UVB ที่ 30 mJ/cm² Q-3-G จะป้องกัน HaCaTcells อย่างมีนัยสำคัญจากการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย UVB ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น (รูปที่ 2b) ตามข้อตกลงกับการทดสอบ MTT การใช้กล้องที่เชื่อมต่อกับกล้องจุลทรรศน์เพื่อจับภาพลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ HaCaT, Q-3-G ป้องกันการตายของเซลล์เนื่องจากเซลล์ HaCaT ที่ฉายรังสี UVB ที่ความเข้มข้น 10 μM (รูปที่ 2c) . จำนวนเซลล์ HaCaT ภายใต้แต่ละสภาวะคือ 482 สำหรับกลุ่มที่ไม่บำบัด, 91 สำหรับกลุ่ม UVB 30 mJ/cm-,276 สำหรับกลุ่ม UVB 30 mJ/cm²บวก 5μM O-3-G และ 320 สำหรับ UVB 30 mJ/cm² บวก 10μM Q-3-G Group (รูปที่ 2d) ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่า Q-3-G ยับยั้งความเสียหาย HaCaT ที่เกิดจาก UVB และช่วยปกป้องผิวจากการฉายรังสี UVB

การเกิดขึ้นและการกำเริบของการอักเสบในร่างกายบางครั้งกระตุ้นมาโครฟาจและปล่อยไซโตไคน์บางส่วน การอักเสบเป็นสัญลักษณ์ของความเครียดออกซิเดชัน เราตรวจสอบผลต้านการอักเสบของ Q-3-G ต่อการอักเสบที่เกิดจาก UVB หรือ HO2- เป็นที่ทราบกันดีว่า UVB สามารถส่งเสริมความเสียหายของ DNA และการอักเสบในเซลล์ผิวหนัง 【10】 เราฉายรังสีเซลล์ HaCaT ด้วย UVB 30mJ/cm² และบ่มเซลล์ HaCaT ด้วย H2O2(500 uM) เราใช้การทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ mRNA ของเอนไซม์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ COX-2 และไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ TNF- ดังที่แสดงโดยผลลัพธ์ในรูปที่ 2e,f ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ของ O-3-G ยับยั้งการแสดงออกของ mRNA ของ COX-2 และ TNF- อย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น Q-3-G ระงับการตอบสนองต่อการอักเสบที่เกิดขึ้นในเซลล์ HaCaT หลังจากการฉายรังสี UVB หรือ H2O2

เราใช้ 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) และ 2,2-diphenyl-lpicrylhydrazyl(DPPH) radical scavenging assays—-ระบบแบบจำลองที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย เพื่อตรวจสอบกิจกรรมการขับสารในหลอดทดลองของสารประกอบธรรมชาติ—เพื่อประเมินคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของ Q-3-G ที่ความเข้มข้นต่างกัน เซลล์ HaCaT ถูกบำบัดด้วย Q-3-G ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นจาก 2.5-40 ไมโครโมลาร์ในการมีอยู่ของ DPPH และผลลัพธ์แสดงกิจกรรมการขับที่มีนัยสำคัญที่มากกว่า 2.5 uM(รูปที่ 2g) . การทดสอบ ABTS ยังแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงผลกระทบของ Q-3-G ต่อการขับอนุมูลอิสระในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นด้วยค่า IC50 ที่ 1.75 ไมโครโมลาร์ (รูปที่ 2 ชั่วโมง) แอสคอร์บิกแอซิด (AA) ซึ่งเป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก แสดงผลสารต้านอนุมูลอิสระได้ดีที่สุดในการทดสอบทั้ง DPPH และ ABTS มีรายงานว่าอีรีทรอยด์ปัจจัยนิวเคลียร์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2) ซึ่งเป็นหนึ่งในยีนที่ขึ้นกับสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) ซึ่งได้รับรายงานเพื่อควบคุม oxidoreductase ที่ป้องกันและสารตั้งต้นของนิวคลีโอฟิลิกของมัน ซึ่งจะช่วยส่งเสริมเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อขจัดความเสียหายและซ่อมแซม ระบบ [53] ต่อไป เราตรวจสอบระดับการแสดงออกของ Nrf2 ในเซลล์ HaCaT ที่ฉายรังสี UVB การเสริมความแข็งแกร่งให้กับการค้นพบข้างต้น O-3-G ได้เพิ่มระดับการแสดงออกของ Nrf2 จากการฉายรังสี UVB อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น สูงถึง 10 uM(Figure2i) ซึ่งบอกเป็นนัยว่า Q-3- G แสดงผลการต้านอนุมูลอิสระทั้งทางเคมีและทางชีววิทยาด้วยคุณสมบัติการขับอนุมูลอิสระและเพิ่มผลการป้องกันของการส่งสัญญาณ ARE ที่ขึ้นกับ Nrf2- ตามลำดับ นอกจากนี้ เรายังดำเนินการ ROS flow cytometry โดยใช้ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) ในสภาวะ UV สารต้านอนุมูลอิสระเป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายในการปราบปรามแรงกดดันของเซลล์โดยการยับยั้งการผลิต ROS [54] ผลการศึกษาพบว่าการบำบัดด้วย Q-3-G ที่ความเข้มข้น 5 และ 10 ไมโครโมลาร์ลดระดับของ ROS ที่เหนี่ยวนำโดย UVB (รูปที่ 2j) เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้บอกเป็นนัยว่า Q-3-แสดงคุณสมบัติในการปกป้องผิวหนัง เช่น ฤทธิ์ต้านการอักเสบและสารต้านอนุมูลอิสระต่อ H2O หรือความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบที่เกิดจาก UVB ในเซลล์ HaCaT

2.2.ผลแอนไทม์ลาโนเจเนซิสใน B16F10 และผลการให้ความชุ่มชื้นในเซลล์ HaCaT ของ Q-3-G

เพื่อตรวจสอบผลของ O-3-G ต่อการสร้างเมลาโนมา เซลล์เมลาโนมาได้รับการรักษาด้วย -MSH เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อคัดหลั่งเมลานินในเซลล์ B16F10 เมื่อใช้การทดสอบ MTT เรายืนยันในตอนแรกว่า Q-3-G ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ B16F10 ที่ความเข้มข้นสูงถึง 20 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 48 ชั่วโมง (รูปที่ 3a) ผลลัพธ์นี้แสดงให้เห็นว่า สำหรับการประเมินครั้งต่อไปว่าผลกระทบของ O-3-G ใน B16F10 ไม่ได้เกิดจากการตายของเซลล์ ต่อไป เราประเมิน B16F10 ด้วย Q-3-Gand -MSH เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อตรวจสอบผลกระทบของ Q-3-G ต่อการสร้างเม็ดสี ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3b, Q-3-G ยับยั้งการหลั่งเมลานินอย่างมีนัยสำคัญ อาร์บูตินกลุ่มควบคุมเชิงบวกยังช่วยลดการหลั่งเมลานินอย่างมีนัยสำคัญ

โมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับความชื้นของผิวหนังคือกรดไฮยาลูโรนิก (HA) ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ HA ซึ่งกระจายอยู่ทั่วหนังกำพร้าและหนังแท้เป็น NMF ที่ช่วยเพิ่มความชุ่มชื้นของผิว [55] เราใช้การทดสอบ PCR แบบถอดความแบบย้อนกลับ (RT-PCR) เพื่อตรวจสอบระดับการถอดรหัสของ HAS-1 หลังจาก 12 ชั่วโมงด้วยความเข้มข้นของ Q-3-G สูงถึง 30 uM HAS ส่งเสริมการสะสมของ HA ขนาดกลางภายใน keratinocytes [12] ดังแสดงในรูปที่ 3c การแสดงออกของ HAS-1 เพิ่มขึ้นโดยการรักษาด้วย Q-3-G สูงถึง 10 μM นอกจากปัจจัยความชุ่มชื้นแล้ว เรายังตรวจสอบการแสดงออกของ FLG และ TGM{{ 13}}. เราใช้เรตินอลเป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ระดับการถอดรหัสของ FLG และ TGM-1 เพิ่มขึ้นอย่างเด่นชัดหลังการรักษาด้วย Q-3-G ที่ความเข้มข้นสูงถึง 10 ไมโครโมลาร์ (รูปที่ 3d) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า Q-3-G มีฤทธิ์ในการให้ความชุ่มชื้นแก่ผิวหนังในเซลล์ HaCaT นอกจากนี้ การใช้ SB203580 (ตัวยับยั้ง p38), SP600125(ตัวยับยั้ง JNK), UO126(ตัวยับยั้ง ERK) และอ่าว11-7082 (ตัวยับยั้ง NF-kB) เราได้ตรวจสอบการมีส่วนร่วมของเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK และ NF-kB ในการให้ความชุ่มชื้น แฟกเตอร์ของ Q-3-เซลล์ HaCaT ที่บำบัดด้วย G จากการแสดงออกของยีนที่เหนี่ยวนำโดย O-3- G ทั้งระดับของ TGM-1 และ FLG ลดลงโดยการรักษาด้วย SP600125 ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง JNK (รูปที่ 3e) ซึ่งบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมี JNK เพื่อเพิ่มการแสดงออก ของ TGM-1 และ FLG ในแง่ของการให้ความชุ่มชื้นแก่ผิวของ O-3-G นอกจากนี้ การแสดงออกของ FLG ยังลดลงโดย Bay11-7082 ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง IKK และ IkB ซึ่งแนะนำว่ากลไกทางเภสัชกรรมของ Q-3-G อาจเป็นของวิถีการส่งสัญญาณ NF-kB

2.3. เส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการให้ความชุ่มชื้นของ Q-3-G ผ่านการเปิดใช้งาน AP-1 และ NF-kB

จากผลลัพธ์ของ mRNA ก่อนหน้านี้ เราตั้งสมมติฐานว่าการมีส่วนร่วมของ AP-1 และการส่งสัญญาณ NF-kB ต่อเอฟเฟกต์ความชุ่มชื้นของ Q-3-G สามารถเกิดขึ้นได้ในระดับโปรตีนเช่นกัน ด้วยการใช้ Western blot assay เราตรวจสอบฟอสโฟรีเลชั่นของโมเลกุลต้นน้ำของ AP-1 และ NF-kB อย่างแรก ในวิถี AP-1 ฟอสโฟรีเลชั่นของ c-Jun เพิ่มขึ้นหลังจากการฟักตัวของเซลล์ HaCaT ด้วย Q-3-G เป็นเวลา 24 ชั่วโมง(รูปที่ 4a) ระดับของ p-INK ยังเพิ่มขึ้นหลังการบำบัดด้วย Q-3-G ที่ความเข้มข้น 2.5,5 และ 10 ไมโครโมลาร์ รูปแบบทั้งหมดของ JNK ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 4b) เราตรวจสอบฟอสโฟรีเลชั่นของ MKK4 และ TAK-1 เพิ่มเติม ซึ่งเป็นตัวควบคุมต้นน้ำของ JNK ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3c หลังจากการบำบัดเซลล์ HaCaT ด้วย O-3-G ระดับโปรตีนของ p-MKK4 และ p-TAK1 ก็ถูกปรับเพิ่มขึ้นเช่นกัน

นอกจากการส่งสัญญาณ NF-kB แล้ว Q-3-G ยังเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของ p50 และ p65 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยของ NF-kB(รูปที่ 4c) นอกจากนี้ เราประเมินการเปิดใช้งาน IKK และ IkBa ซึ่งเพิ่มขึ้น Q-3-G สูงถึง 10 uM เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4d) ในที่สุด เราได้กำหนดการกระตุ้นโมเลกุลต้นน้ำที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-kB ฟอสโฟรีเลชันของ Src และ Akt (Ser473) ถูกทำให้เพิ่มขึ้นโดยการบำบัดด้วย O-3-G(รูปที่ 4e) โดยรวม ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าผลการปกป้องผิวหนังของการกระตุ้น Q-3-G เป้าหมาย TAK1 และ Src โดยการเพิ่มระดับโปรตีน ดังนั้นจึงควบคุมกิจกรรมของ AP-1 และ NF-kB ตามลำดับ

2.4.ผลกระทบของ Q-3-G ต่อการเปิดใช้งานการถอดเสียงของ AP-1 และ NF-kB

เราตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของเซลล์ของ Q-3-G ในเซลล์ไตของตัวอ่อน HEK293T ของมนุษย์โดยการทดสอบ MTT (รูปที่ 4f) ความมีชีวิตของเซลล์ HEK293T ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษาด้วย Q-3-G (2.5-20 μM) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา

เราใช้การทดสอบลูซิเฟอเรสเพื่อพิจารณาว่า Q-3-G สามารถมอดูเลตการสอบวิเคราะห์โปรโมเตอร์ NF-kB และ AP-1 ได้หรือไม่ เรายืนยันว่า O-3-G เพิ่ม AP-1-การออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสที่เป็นสื่อกลาง (รูปที่ 4g)และการออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสที่อาศัย NF-kB (รูปที่ 4h) ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่าการเปิดใช้งาน AP-1 และการเปิดใช้งาน NF-KB เป็นเป้าหมายทางเภสัชวิทยาที่สำคัญของ Q-3-G

คลิกลิงค์เพื่อรับข้อมูลเพิ่มเติม:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html