นิวเคลียส Antigen–reactive CD4D T Cells ขยายใน Active Systemic Lupus Erythematosus, ผลิต Effector Cytokines และบุกไต

ติดต่อ: ali.ma@wecistanche.com

Dimas Abdirama et al

Cistanche DHT สำหรับโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

โรคลูปัสระบบเม็ดเลือดแดงเป็นระบบและเรื้อรังแพ้ภูมิตัวเองโรคโดดเด่นด้วยการสูญเสียความทนทานต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์ด้วยปฏิกิริยาอัตโนมัติCD4Dทีเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรค อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับความจำเพาะของตัวรับตั้งแต่ตรวจพบ autoantigen-specificCD4Dทีเซลล์เป็นสิ่งที่ท้าทายอย่างยิ่ง เราขอนำเสนอบทวิเคราะห์ของCD4Dทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์โดยใช้วิธีการเสริมสองวิธี: ไลบรารีทีเซลล์และการเพิ่มสมรรถนะของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจน ความถี่ของนิวเคลียสแอนติเจนจำเพาะCD4Dทีเซลล์สัมพันธ์กับความรุนแรงของโรค ทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติเหล่านี้ผลิตเอฟเฟกเตอร์ไซโตไคน์ เช่น อินเตอร์เฟอรอน-จี อินเตอร์ลิวคิน-17 และอินเตอร์ลิวคิน-10 เมื่อเทียบกับเลือด เซลล์เหล่านี้อุดมไปด้วยปัสสาวะของผู้ป่วยโรคไตอักเสบลูปัส (active lupus nephritis) ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการแทรกซึมของการอักเสบไต. ดังนั้น คุณลักษณะที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้เหล่านี้สนับสนุนบทบาทของเซลล์ CD4D T ที่จำเพาะต่อแอนติเจนนิวเคลียร์ในโรคลูปัส erythematosus

โรคลูปัสระบบเม็ดเลือดแดง(SLE) เป็นโรคภูมิต้านตนเองที่เป็นระบบและเรื้อรัง โดยมีลักษณะเฉพาะโดยสูญเสียความทนทานต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์เนื่องจากการกำจัดของเสียทางชีวภาพอย่างมีข้อบกพร่อง เช่น วัสดุ apoptotic ที่มีไรโบนิวคลีโอโปรตีนและนิวคลีโอโซม1 ออโตแอนติบอดีที่ต่อต้านแอนติเจนของนิวเคลียร์เป็นลักษณะของ SLE และมักเกิดขึ้นก่อนเปิดเผย โรค.²นอกจากนี้ เซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติมีส่วนเกี่ยวข้องในการเกิดโรคของ SLE โดยการส่งเสริมการผลิต autoantibody โดยเซลล์ B และเผยแพร่ความเสียหายของอวัยวะโดยตรงในอวัยวะเป้าหมายที่อักเสบ³แม้ว่าจะมีการรายงานการตรวจพบทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์แล้วก็ตาม แต่หลักฐานการมีอยู่ของพวกมันยังคงเป็นเส้นรอบวงมาจนถึงตอนนี้ และปัจจุบันยังไม่ชัดเจนว่าพวกมันมีปฏิสัมพันธ์กันอย่างไรในการเกิดโรค^4–9การทำความเข้าใจว่าเซลล์เหล่านี้มีส่วนร่วมในภูมิต้านทานผิดปกติอย่างไรจะมีความสำคัญต่อการออกแบบการรักษาที่มีประสิทธิภาพ

การตรวจหา T เซลล์ที่จำเพาะต่อ autoantigen ถูกขัดขวางโดยความถี่ที่ต่ำเป็นพิเศษของพวกมันในการไหลเวียนของเลือด10 การศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับรายการเพลง CD4þ T-cell ที่ไร้เดียงสาของมนุษย์ได้ใช้เทคโนโลยีที่ใช้เตตระเมอร์เพื่อให้ข้อมูลที่แม่นยำเกี่ยวกับการตอบสนองของ T-cell ต่อเอพิโทปของแอนติเจนจำเพาะ ; อย่างไรก็ตาม วิธีนี้ต้องการความรู้ล่วงหน้าเกี่ยวกับชนิดแอนติเจนของเม็ดเลือดขาวในมนุษย์ของผู้บริจาค^11–13เทคนิคทางเลือกเพื่อตรวจหาและแจกแจงประชากรทีเซลล์หายากพร้อม ๆ กันที่มีปฏิกิริยาต่อแอนติเจนที่ต่างกันโดยปราศจากความรู้ล่วงหน้าเกี่ยวกับชนิดของแอนติเจนของเม็ดเลือดขาวของมนุษย์ได้รับการพัฒนาโดยใช้คลังของพอลิโคลนัลทีเซลล์¹⁴และโดยการเพิ่มปริมาณของซีดี154-ซึ่งแสดงออกทีเซลล์หลังการกระตุ้นด้วยแอนติเจนที่ชื่อว่า ARTE (การเพิ่มปริมาณทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจน)¹⁵

เซลล์ CD4þ T ส่วนใหญ่ทำหน้าที่ผ่านการหลั่งของไซโตไคน์เมื่อกระตุ้นแอนติเจน¹⁶และโดยการแพร่กระจายการอักเสบของเนื้อเยื่อเช่นในโรคไตอักเสบลูปัส (LN) ซึ่งเป็นหนึ่งในภาวะแทรกซ้อนที่ร้ายแรงที่สุดของ SLE^17,18

การวิเคราะห์รายการ T-cell ที่มีอยู่ในการตัดชิ้นเนื้อไตจากผู้ป่วย LN เผยให้เห็น oligoclonality ของไต-แทรกซึมเซลล์ CD4þ T ซึ่งบ่งชี้ถึงการสะสมของ T เซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนในการอักเสบไต.¹⁹การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราเผยให้เห็น T เซลล์ในปัสสาวะในผู้ป่วยที่มี LN ที่ใช้งานอยู่เป็นตัวบ่งชี้ biomarker ที่แม่นยำซึ่งคล้ายกับฟีโนไทป์ของเซลล์ในไต^20,21แม้ว่าเซลล์เหล่านี้ถูกทำให้สมบูรณ์สำหรับ CXC คีโมไคน์รีเซพเตอร์ 3 และ CC คีโมไคน์รีเซพเตอร์ 5 ซึ่งแสดงออกถึงทีเซลล์ที่บ่งชี้จำนวนเซลล์ทีเฮลเปอร์เซลล์ 1 (Th1) และมี CD154þ ทีเซลล์ที่บ่งชี้ว่ามีการพบแอนติเจนเมื่อเร็วๆ นี้^22,23ความจำเพาะของแอนติเจนที่มีต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์ยังคงไม่ชัดเจน ในการศึกษานี้ เรานำเสนอการวิเคราะห์ของ CD4þ ทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์ในบุคคลที่มีสุขภาพดีทั้งหมด 17 คน¹² อาสาสมัครที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งานและ 20 คนที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่โดยใช้ไลบรารี T-cell และเทคนิค ARTE เพื่อวิเคราะห์ความถี่ของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติในเลือดและปัสสาวะของผู้ป่วย LN รวมถึงการผลิตไซโตไคน์

ผลลัพธ์

ทีเซลล์ CD4D T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์จะถูกขยาย SLE ที่ไม่ใช้งานตามที่กำหนดโดยใช้คลัง T-cell และ ARTE

เนื่องจากความไวทางทฤษฎีสูงในการตรวจหาทีเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนที่หายาก คลังของเซลล์ CD4þ ที่ขยายแล้วจึงถูกสร้างขึ้นและสอบปากคำสำหรับปฏิกิริยาต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์ ห้องสมุด T-cell ที่ขยายจากผู้ป่วย 12 รายที่มี SLE และกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี 6 กลุ่มได้รับการกระตุ้นด้วยแอนติเจนของนิวเคลียร์ตามรูปแบบบัญญัติ SmD1, RNP70, ฮิสโตน, Ro และ La ต่อหน้าเซลล์ที่สร้างแอนติเจนตามด้วยการวัดเซลล์ การเพิ่มจำนวนในการตอบสนองต่อการกระตุ้นแอนติเจน (รูปที่เสริม S1A) เนื่องจากการระเบิดของ T-cell ที่ขยายแล้วตอบสนองต่อแอนติเจนต่างกัน คะแนน z ที่จำเพาะของผู้ให้ถูกใช้เป็นเกณฑ์การงอกขยายและระดับของดัชนีการกระตุ้น (การตอบสนองของเซลล์ที่ถูกกระตุ้นที่สัมพันธ์กับเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้น) ต่อ superantigen Staphylococcus enterotoxin B (SEB ) ทำหน้าที่เป็นเกณฑ์การรวม (รูปเพิ่มเติม S1B–D) นอกจากแอนติเจนของนิวเคลียร์แล้ว เรารวมทรานส์ไทเรตินเป็นออโตแอนติเจนกลุ่มควบคุมที่ไม่เกี่ยวข้อง (ผู้ป่วย n ¼ 8 รายที่มี SLE; n ¼ 5 กลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี) (รูปที่ 1a) การตรวจหาเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนได้รับการตรวจสอบโดยท้าทายชุดของจุลภาคที่มีคะแนนบวกกับแอนติเจนตามลำดับ และวิเคราะห์การแสดงออกของเครื่องหมายกระตุ้นทีเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจน CD154 และอินเตอร์เฟอรอน (IFN)-g โดยใช้เพื่อนไซโตเมตรี24 (รูปที่เสริม ส1อี). โดยใช้การแจกแจงแบบปัวซอง 14 ความถี่ของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนถูกแจกแจง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความถี่มัธยฐานของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์เพิ่มขึ้นในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่เมื่อเปรียบเทียบกับอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี (SmD1: P ¼ 1; RNP70: P ¼ 0.{{ 35}}4; ฮิสโตน: P ¼ 0.35; Ro: P ¼ 0.02; La: P ¼ 0.04 ) และผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน (SmD1: P ¼ 0.79; RNP70: P ¼ 0.04; histone: P ¼ 0.23; Ro: P ¼ 0.04; La: P ¼ 0.006) (รูปที่ 1b) จำนวนรวมของเซลล์ CD4þ T ที่เกี่ยวกับปฏิกิริยาอัตโนมัติที่เกี่ยวข้องกับ SLE แตกต่างกันไปในแต่ละบุคคลในช่วง 0 ถึง 185.5 เซลล์ต่อ 1 ล้านเซลล์ โดยมีความถี่สูงสุดในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่ (รูปที่ 1c) เซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์สามารถตรวจพบได้ในผู้ป่วยทุกรายที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่ เซลล์เหล่านี้ยังสามารถตรวจพบได้ใน 5 รายจากผู้ป่วย 6 รายที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน ในขณะที่กลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีเพียง 3 จาก 6 รายเท่านั้นที่นำเสนอทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติแบบหมุนเวียน สิ่งที่น่าสนใจคือ ผู้ป่วยที่มี SLE ที่ออกฤทธิ์ยังแสดงการตอบสนองของ T-cell แบบ autoreactive ที่หลากหลายมากขึ้น โดยผู้ป่วยแต่ละรายมี T-cell ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์อย่างน้อย 3 ตัว ในการเปรียบเทียบ กลุ่มผลิตภัณฑ์เป้าหมายมีความแปรปรวนน้อยกว่าในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งานและกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี เมื่อนำมารวมกัน การหมุนเวียนของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์ไม่ได้มีไว้สำหรับ SLE เท่านั้น แต่ SLE ที่ไม่ใช้งาน จำนวนของพวกมันมากกว่าและโครงสร้างเป้าหมายของพวกมันแปรผันมากกว่า

เนื่องจาก autoreactive T cells มีบทบาทในการเผยแพร่การตอบสนองของ autoimmune เราจึงเปรียบเทียบจำนวน autoreactive T cells กับความรุนแรงของโรค ซึ่งประเมินโดยคะแนนดัชนีกิจกรรมโรค SLE (SLEDAI) เฉพาะความถี่ของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับ RNP70, Ro และ La มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ SLEDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ { {11}}.4865; Ro: P ¼ 0.005, r ¼ 0.6299; La: P ¼ 0.01, r ¼ 0.5651) (รูปที่ 1d) ในทางตรงกันข้าม ความถี่ของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับทรานส์ไทเรตินถูกพบในระดับที่ค่อนข้างใกล้เคียงกันในทั้ง 3 กลุ่ม (รูปที่ 1e) ดังนั้นจึงละเลยอคติในการทดลองที่เป็นไปได้เนื่องจาก SLE ที่ไม่ใช้งานของ T-cell hyperreactivity ที่ไม่เฉพาะเจาะจงทั่วไป

ไลบรารี T-cell มีข้อดีหลายประการ รวมถึงความไวสูงในการตรวจจับเซลล์ที่หายากมากภายในเซลล์อินพุตจำนวนน้อย อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้อาศัยการขยายตัวของเซลล์ ซึ่งอาจเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของเซลล์และให้ความเป็นไปได้ที่จำกัดในการอธิบายลักษณะเฉพาะของเซลล์ปฏิกิริยาฟีโนไทป์ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการสังเกตของเราด้วยวิธี ARTE โปรโตคอล ARTE ต้องการเซลล์อินพุตจำนวนมาก ซึ่งท้าทายโดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยโรคเอสแอลอีที่มักมีภาวะต่อมน้ำเหลืองและโรคโลหิตจาง เนื่องจากข้อจำกัดนี้และเพื่อเพิ่มการอ่านค่าที่คาดหวังของเซลล์ปฏิกิริยา เราจึงรวมแอนติเจนของนิวเคลียสของนิวเคลียสทั้ง 5 ตัว และใช้แหล่งรวมนี้เพื่อกระตุ้นเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือด (PBMC) ก่อนการเสริมคุณค่าของ CD154-ซึ่งแสดงออกถึงเซลล์ (n ¼ 15 ผู้ป่วยโรคเอสแอลอี n ¼ 6 กลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี) โดยใช้การรวมกันของมาร์คเกอร์ที่พื้นผิว CD154 และ CD69, ทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์ที่เกี่ยวข้องกับ SLE สามารถระบุได้ภายในประชากรพื้นหลัง (รูปที่ 1f) แม้ว่าการแสดงออกเบื้องหลังของ CD154 และ CD69 จะสังเกตพบอย่างมากมายในแต่ละคน ผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่มีความถี่ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ CD154þCD69þ T เมื่อถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนของนิวเคลียร์เมื่อเทียบกับการกระตุ้นพื้นหลัง (P ¼ 00{ {18}}8) ในขณะที่บุคคลที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งานมีความถี่ใกล้เคียงกันระหว่างเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแอนติเจนและเซลล์ที่ไม่กระตุ้น (บุคคลที่มีสุขภาพดี: P ¼ 0.44 ผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน: P ¼ {{23} }.56) (รูปที่ 1g) นอกจากนี้ โดยการลบความถี่พื้นหลัง ความถี่ของ T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับนิวเคลียสแอนติเจนมีค่าสูงกว่าในผู้ป่วยโรคที่ลุกลามมากกว่าในคนที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยโรคที่ไม่เคลื่อนไหว (P ¼ 0.02 และ P ¼ 0.11 ตามลำดับ) (รูปที่ 1 ชม.) ความถี่ของ T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ที่ถูกลบพื้นหลังด้วยเหตุนี้จึงมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับกิจกรรมของโรค (P ¼ 0.004, r ¼ 0.5978) ซึ่งชี้ให้เห็นถึงบทบาทที่เป็นไปได้ในการเกิดโรค SLE (รูปที่ 1i) นอกจากนี้ เซลล์ CD4þ T ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนที่เรียกคืน Candida albicans MP65 แสดงให้เห็นความถี่ที่คล้ายคลึงกันทั่วทั้งผู้ให้ (รูปที่ 1j) โดยไม่รวมความเป็นไปได้ของอคติทั่วไปที่มีต่อความถี่ที่สูงขึ้นของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ออกฤทธิ์

โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราที่สร้างขึ้นโดยใช้คลัง T-cell และวิธี ARTE แสดงการขยายตัวของเซลล์ CD4þ ที่จำเพาะต่อออโตแอนติเจนในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่ เทคนิคทั้งสองเปรียบเทียบกันได้ตามที่บ่งชี้โดยค่าดัชนีการกระตุ้นค่ามัธยฐานที่คล้ายคลึงกันระหว่างการตอบสนองของทีเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแอนติเจนและไม่กระตุ้น (ดัชนีการกระตุ้นค่ามัธยฐาน—คลัง T-cell: 1.857; ARTE: 1.614; P ¼ 0.33) แม้ว่า เทคนิค ARTE เปิดเผยความถี่ที่สูงกว่าของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์มากกว่าเทคนิคห้องสมุด T-cell (รูปที่ 1k)

นิวเคลียสแอนติเจน–รีแอกทีฟทีเซลล์ในบุคคลที่มีสุขภาพดีคือ โบนาไฟฟ์ autoreactive CD4D T เซลล์

ทั้งคลัง T-cell และเทคนิค ARTE แสดงให้เห็นถึงการตรวจหา T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติในบุคคลที่มีสุขภาพดี ซึ่งแสดงถึงต้นกำเนิดที่เป็นไปได้สำหรับการพัฒนาภูมิคุ้มกันทำลายตนเองของมนุษย์²⁵อย่างไรก็ตาม จำนวนของพวกมันไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากความถี่พื้นหลัง ทำให้ไม่แน่ใจว่าอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีจำเป็นต้องหมุนเวียนเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์หรือไม่ เพื่อคลี่คลายความจำเพาะของแอนติเจนของ autoreactive T เซลล์ในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี เราได้สร้าง T-cell โคลนจากสารตั้งต้นเซลล์ CD154þCD69þ CD4þ T ที่แยกได้จากบุคคลที่มีสุขภาพดีหลังจากการกระตุ้น PBMC ด้วยแอนติเจนนิวเคลียร์แต่ละตัวและแอนติเจนควบคุมที่ได้มาจาก Aspergillus fumigatus lysate สำเนาพันธุ์ทีเซลล์จำเพาะต่อออโตแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ SLE จำนวนมากตอบสนองต่อแอนติเจนที่สอดคล้องกันของพวกมันหลังจากการกระตุ้นแอนติเจนตามที่เน้นโดยการแสดงออกร่วมกันของ IFN-g กับ CD154 (จำนวนของโคลนจำเพาะ—Aspergillus fumigatus: 5 จาก 5; SmD1: 4 ของ 8; RNP70: 3 จาก 11; ฮิสโตน: 5 จาก 5; Ro: 4 จาก 9; La: 5 จาก 7) (รูปที่เสริม S2A และ B) นอกจากนี้ การตอบสนองของแอนติเจน (แสดงแทนสำหรับ SmD1) ขึ้นอยู่กับขนาดยา โดยเน้นว่า T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์ในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรงคือ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยาได้เองตามธรรมชาติ (รูปที่ S2C เพิ่มเติม) ดังนั้นเราจึงยืนยันการมีอยู่ของ T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีภายในสัญญาณพื้นหลังของวิธีการตรวจจับที่ใช้

การผลิตไซโตไคน์ของเซลล์ CD4D T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์

ต่อไปเราจะตรวจสอบการผลิตไซโตไคน์ของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ CD154-ซึ่งแสดงออกเซลล์ถูกย้อมภายในเซลล์สำหรับเอฟเฟกเตอร์ไซโตไคน์ เช่น IFN-g, อินเตอร์ลิวคิน (IL)-17, IL-4 และ IL-10 หลังการกระตุ้นด้วยกลุ่มของ แอนติเจนนิวเคลียร์ที่เกี่ยวข้องกับ SLE (รูปที่ 2a) ความถี่ของ IFN-g–, IL-17– และ IL{{10}}–ที่ผลิตเซลล์ CD154þCD4þ T เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ออกฤทธิ์ (ไซโตไคน์ทั้งหมด: P ¼ {{16} }.004) ในขณะที่ความถี่ของ IL-4–การผลิตทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติยังคงไม่แตกต่างจากความถี่พื้นหลัง (P ¼ 0.125) (รูปที่ 2b ). นอกจากนี้ จำนวนสัมบูรณ์ของ IFN-g– และ IL{{20}}-ที่ผลิต autoreactive T เซลล์นั้นสูงกว่าในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ออกฤทธิ์มากกว่าในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรงและผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน (รูปที่ 2b) โดยการลบความถี่พื้นหลัง ผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่มีความถี่ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญของ IFN-g– และ IL-10 – ซึ่งสร้าง T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติมากกว่าคนที่มีสุขภาพดี (IFN-g: P ¼ {{40 }}.003; IL-10: P ¼ 0.004) เช่นเดียวกับ IFN-g– , IL-17– และ IL-10–สร้างทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติมากกว่าผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน (IFN-g: P ¼ 0.002; IL{{ 36}}: P ¼ 0.002; IL-10: P ¼ 0.005) (รูปที่ 2c) นอกจากนี้ ความถี่ของ IFN-g– และ IL-10– แต่ไม่ใช่ของ IL-17– และ IL-4–การผลิตนิวเคลียสแอนติเจน– ปฏิกิริยาทีเซลล์มีความสัมพันธ์กับการออกฤทธิ์ของโรค อย่างไรก็ตาม เฉพาะความถี่ของ IL-4 – เซลล์ที่ผลิตได้มีความสัมพันธ์กับกิจกรรมของโรคน้อยลง (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0.7574;="" il-17:="" p="" ¼="" 0.005,="" r="" ¼="" 0.5889;="" il="" -4:="" p="" ¼="" 0.14,="" r="" ¼="" 0.3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0.0004,="" r="" ¼="" 0.6977)="" (รูปที่="" 2d)="" ตัดสินโดยความถี่ของผู้ผลิต="" ifn-g="" เซลล์="" cd4þ="" t="" ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนส่วนใหญ่เป็นสายเลือด="" th1="" ในทางตรงกันข้าม="" il-17="" และผู้ผลิต="" il-10="" ถูกตรวจพบที่ความถี่ต่ำเท่านั้น26="" เมื่อเทียบกับระดับ="" autoantibody="" ความถี่ของเซลล์="" cd4þ="" t="" ที่ผลิตไซโตไคน์ไม่มีความสัมพันธ์กับความเข้มข้นของ="" dna="" ที่ต่อต้านสายคู่และด้วยระดับซีรัมของแอนติบอดีต้านนิวเคลียร์="" (รูปที่="" s3a="" และ="" b="" เพิ่มเติม)="" ไม่พบความสัมพันธ์อื่นระหว่างเซลล์="" cd4þ="" t="" ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์และออโตแอนติบอดี="" ยกเว้นเซลล์="" cd4þ="" t="" ที่เกิดปฏิกิริยากับ="" la="" ออโตแอนติบอดี="" (รูปที่="" s3c="">

Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 ถูกรวมไว้สำหรับการแจงนับเซลล์ CD4þ T ในปัสสาวะที่จำเพาะต่อแอนติเจนของนิวเคลียสแต่ละตัว ขนานกับ CD4þ T เซลล์ในปัสสาวะ ความถี่ของเซลล์ CD4þ ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียสในเลือดส่วนปลายถูกกำหนด ซึ่งช่วยให้สามารถเปรียบเทียบโดยตรงของความถี่ตามลำดับภายในบุคคลเดียวกัน (รูปที่ 3b) เราพบว่า LN ที่ไม่ใช้งาน ซึ่งเป็นความถี่ของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ในปัสสาวะสูงกว่าเลือดที่อยู่รอบข้าง เพื่อยืนยันการสังเกตนี้ เราติดฉลากเซลล์ปัสสาวะที่แยกได้จากผู้ให้ LN 4 รายที่มี carboxyfluorescein succinimidyl ester และผสมเซลล์ที่ติดฉลากกับ PBMC ที่จับคู่ผู้บริจาคเพื่อให้สามารถเปรียบเทียบเซลล์ที่มีปฏิกิริยาแอนติเจนโดยตรงในการทดสอบ 1 ครั้งโดยใช้เทคนิค ARTE ความถี่ของเซลล์ CD154þCD69þ T ในตัวอย่างที่ถูกกระตุ้นและไม่กระตุ้นของเซลล์เม็ดเลือดปัสสาวะและอุปกรณ์ต่อพ่วงที่จับคู่ผู้บริจาคถูกใช้เพื่อประเมินว่า T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียสนั้นอุดมไปด้วยปัสสาวะเป็นตัวแทนสำหรับไตโดยคำนวณดัชนีการกระตุ้น (รูปที่ 3c) แม้ว่าคลัง T-cell ของปัสสาวะและวิธีการ ARTE จะต่างกันในดัชนีการกระตุ้นค่ามัธยฐานกับแอนติเจนของนิวเคลียร์ (ดัชนีการกระตุ้น—คลัง T-cell ในปัสสาวะ: 17; ARTE: 2.79; P ¼ 0.4) (รูปที่ 3d) การวิเคราะห์ปฏิกิริยาอัตโนมัติในเซลล์ CD4þ T ที่ส่วนปลายและทางเดินปัสสาวะจากทั้งสองวิธี (รวม n ¼ 7) แสดงให้เห็นดัชนีการกระตุ้นจำเพาะของนิวเคลียสที่จำเพาะต่อแอนติเจนในปัสสาวะเพิ่มขึ้น (P ¼ 0.0156) (รูปที่ 3e) การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์บุกและสะสมในเซลล์ที่อักเสบไต. ดังนั้น การอักเสบของเนื้อเยื่อเฉพาะที่ใน SLE อาจเป็นปรากฏการณ์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนและถูกมอดูเลตโดยตรงโดยทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติที่แทรกซึม

อภิปรายผล

การทำลายความทนทานต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์ถือเป็นจุดเด่นของ SLE และนอกจากเซลล์ B แล้ว ทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติยังคิดว่ามีบทบาทสำคัญในการก่อโรค อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการตรวจหา (อัตโนมัติ) แอนติเจนจำเพาะ เซลล์ CD4þ T ยังคงเป็นความท้าทายที่สำคัญในการวิจัยภูมิคุ้มกันในตัวเอง จนถึงปัจจุบัน ไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ใน SLE

เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการพัฒนาวิธีการใหม่สำหรับการตรวจหาและการแจงนับเซลล์ CD4þ T ที่จำเพาะต่อแอนติเจน วิธีการไลบรารี T-cell ใช้ประโยชน์จากการขยายตัวของพอลิโคลนอลก่อนหน้าของทีเซลล์เพื่อให้สามารถตรวจหา T-cell โคลนที่จำเพาะต่อแอนติเจนที่หายากได้14 กลยุทธ์นี้ให้ความไวสูงและอนุญาตให้ทำงานกับเซลล์ในปริมาณที่จำกัด เมื่อใช้เทคนิคนี้ เราสามารถแสดงทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์แบบบัญญัติ 5 ตัวในผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่ ข้อเสียของการตรวจจับตามไลบรารีนั้น นอกจากจะใช้แรงงานมากแล้ว ยังไม่สามารถแยกผลพลอยได้หรือการสูญเสียของโคลนบางตัวในระหว่างระยะการขยายออกได้ และตัวเลือกที่จำกัดสำหรับการวิเคราะห์ฟีโนไทป์ของเซลล์

เพื่อน cytometry มาตรฐานถูกจำกัดด้วยจำนวนของเหตุการณ์ที่ตรวจพบได้ ซึ่งมักจะจำกัดการวิเคราะห์ตัวอย่างเฉพาะกับประชากรที่มีความถี่สูงกว่า {{0}}.01 เปอร์เซ็นต์ การสังเกตของเราโดยใช้คลัง T-cell เปิดเผยว่าความถี่ของการหมุนเวียนเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติสำหรับ autoantigen เฉพาะในคนไข้ที่เป็นโรคลุกเป็นไฟคือเซลล์ w20 ในล้านเซลล์ คิดเป็นความถี่ 0.002 เปอร์เซ็นต์; ดังนั้น การตรวจหาเซลล์ CD4þ T ที่จำเพาะต่อ autoantigen โดยใช้ cytometry มาตรฐานที่ไม่ได้รับการควบคุมจึงแทบจะเป็นไปไม่ได้ Bacher และคณะ แนะนำการเพิ่มคุณค่าล่วงหน้าของเซลล์ CD4þ T ที่มีปฏิกิริยาต่อแอนติเจนเฉพาะก่อนที่จะได้มาซึ่งไซโตเมตรีเพื่อนหรือที่เรียกว่าวิธี ARTE15 การปรับวิธีการนี้สำหรับการตรวจหาเซลล์ CD4þ T ที่จำเพาะต่อแอนติเจนของนิวเคลียร์ เราสามารถยืนยันการค้นพบของเราและ แสดงให้เห็นถึงการขยายตัวของแอนติเจนนิวเคลียร์– รีแอคทีฟเซลล์ CD4þ T ใน SLE ที่ใช้งานอยู่ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความถี่ของทีเซลล์ทำปฏิกิริยากับทรานส์ไทเรตินและซี อัลบิแคนส์ ไม่แยแสระหว่างกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยโรคเอสแอลอีที่มีกิจกรรมโรคต่างกัน ดังนั้น การขยายตัวที่สังเกตได้ของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติจึงไม่น่าจะเป็นผลมาจาก SLE ที่ไม่ใช้งานไฮเปอร์แอกทีฟทั่วไป แต่เป็นการขยายตัวของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจน

รายงานก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่ามีการมีอยู่ของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติใน SLE โดยหลักแล้วจะใช้การเพิ่มจำนวน การผลิตไซโตไคน์ หรือการเพิ่มการควบคุมของตัวทำเครื่องหมายการกระตุ้นแม้ว่าจะไม่สามารถหาจำนวนประชากรที่ชัดเจนของเซลล์เหล่านี้ได้4–6,8 หลักฐานที่ดีที่สุดเกี่ยวกับ ความถี่ของ T เซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนนิวเคลียร์มีอยู่สำหรับการเกิดปฏิกิริยากับไรโบนิวคลีโอโปรตีนขนาดเล็ก U1 ซึ่งเป็นเป้าหมายของ autoantigen ที่มีลักษณะเฉพาะในโรคเนื้อเยื่อเกี่ยวพันแบบผสม และพบได้ในผู้ป่วย SLE เพียงเล็กน้อยเท่านั้น ไรโบนิวคลีโอโปรตีนนิวเคลียร์ขนาดเล็ก U1– เซลล์ CD4þ ที่ทำปฏิกิริยาได้ถูกกำหนดโดยใช้การจำกัดการเจือจางและการทดสอบจุดตรวจอิมมูโนที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISPOT) และรายงานว่าเกิดขึ้นที่ความถี่ (40 ถึง 250) - 106 ทีเซลล์และ (20 ถึง 60) ) 106 PBMC ตามลำดับ 7.9 ซึ่งมีขนาดใกล้เคียงกันกับความถี่ของเซลล์ปฏิกิริยาอัตโนมัติในการศึกษาของเรา ในงานของเรา เราได้ตรวจสอบการเกิดปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์ที่เกี่ยวข้องกับ SLE ที่มีลักษณะเฉพาะหลายอย่าง ที่น่าสนใจ แม้ว่าผู้ป่วยทุกรายที่มี LN ที่ใช้งานอยู่จะแสดงความถี่ที่เพิ่มขึ้นของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนต่อต้านนิวเคลียร์ แต่ผู้ป่วยก็ต่างกันในกลุ่มเป้าหมายของพวกเขา และความสามารถในการทำปฏิกิริยามุ่งเป้าไปที่กลุ่มของแอนติเจนที่กว้างกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน ความสำคัญทางชีวภาพของสิ่งนี้ไม่เป็นที่รู้จักในปัจจุบัน ปฏิกิริยาของ CD4þ T เซลล์ที่แตกต่างกันอาจสัมพันธ์กับอาการทางคลินิกบางอย่างของปฏิกิริยาที่แตกต่างกันซึ่งอาจซ้ำซ้อนสำหรับการเกิดโรค

เช่นเดียวกับโรคภูมิต้านตนเองอื่น ๆ เราสามารถแสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติในบุคคลที่มีสุขภาพดี 28,29 แม้ว่าจะมีความถี่ต่ำกว่ามากเมื่อเทียบกับผู้ป่วยที่มี SLE ที่ใช้งานอยู่ เซลล์เหล่านี้ตรวจไม่พบโดยการเปรียบเทียบจำนวนเซลล์ที่ถูกกระตุ้นที่มีหรือไม่มีการกระตุ้นแอนติเจน แม้แต่กับเทคนิคที่มีความไวสูงเช่นคลัง T-cell หรือวิธี ARTE อย่างไรก็ตาม โดยการโคลนเซลล์เดียว เราสามารถแสดงให้เห็นว่าสัญญาณ "พื้นหลัง" มีเซลล์ CD4þ T ที่จำเพาะต่อออโตแอนติเจนจริงๆ เหตุการณ์เฉพาะใดที่นำไปสู่การทำลายความอดทนและความถี่ที่เพิ่มขึ้นของทีเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติยังคงเป็นการเก็งกำไร อย่างไรก็ตาม ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการขยายตัวของโคลนที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติมีส่วนในการทำให้เกิดโรคของ SLE

เซลล์ CD4þ ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์แบบหมุนเวียนส่วนใหญ่ผลิต IFN-g และ IL-17 และ IL-10 ในระดับที่น้อยกว่า โปรไฟล์ไซโตไคน์นี้ร่วมกับความอ่อนแอ/ไม่มีความสัมพันธ์กับการผลิต autoantibody ชี้ให้เห็นว่าบทบาทของเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียสอาจไม่ใช่ผู้ให้บริการเฉพาะของความช่วยเหลือจากบีเซลล์ แสดงให้เห็นว่า IFN-g ขาดไม่ได้ในการเกิดโรคของ LN.30,31 เซลล์ Th1 แสดงให้เห็นว่าถูกคัดเลือกเข้าไปในเนื้อเยื่อไตที่อักเสบใน SLE, 20,32 ทำให้ T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนิวเคลียร์เป็นตัวเลือกที่สำคัญในการบุกรุกไตที่ซึ่งพวกเขาจะได้พบกับออโตแอนติเจนที่สืบเชื้อสายมาจากทุกหนทุกแห่ง ก่อนหน้านี้มีการอธิบายเซลล์ T ปัสสาวะเพื่อสะท้อนกิจกรรมของโรคและสะท้อนฟีโนไทป์ของเซลล์ในไตใน LN20,33; ดังนั้นเราจึงใช้เซลล์ T ปัสสาวะเป็นตัวแทนสำหรับเซลล์ T ของไต ทีเซลล์ในปัสสาวะเผยให้เห็นความแปรปรวนของ TCR ที่จำกัด ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตในไตการตรวจชิ้นเนื้อ 19,34 บ่งชี้ถึงการเสริมสมรรถนะของสำเนาพันธุ์ T-cell บางตัวในเนื้อเยื่อไตอักเสบ ในบรรดาทีเซลล์ในปัสสาวะ เราสามารถตรวจจับ T เซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียร์ได้ และความถี่ของพวกมันก็เพิ่มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ T ที่ไหลเวียน ดังนั้น ดูเหมือนว่าเซลล์ปฏิกิริยาแอนติเจน-นิวเคลียสจะมีส่วนร่วมโดยตรงในการแพร่กระจายของอวัยวะภายในที่เสียหาย

โดยสรุป เราแสดงให้เห็นในที่นี้ว่าเซลล์ CD4þ T ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนของนิวเคลียสถูกขยาย SLE ที่ไม่ใช้งาน พวกมันเป็นฟีโนไทป์โดยหลักคือ IFN-g ซึ่งสร้างเซลล์ Th1 T และบุกรุกอวัยวะเป้าหมายที่อักเสบ เช่น ไต

วิธีการ

วิธีการโดยละเอียดมีอยู่ในเอกสารประกอบ

วิชาและตัวอย่างเลือดและปัสสาวะ

เก็บตัวอย่างเลือดจากบุคคลที่มีสุขภาพดี 17 ราย ผู้ป่วย 12 รายที่มี SLE ที่ไม่ได้ใช้งาน (SLEDAI score<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). นอกจากนี้ ยังได้เก็บตัวอย่างปัสสาวะจากผู้ป่วย 12 รายที่มี SLE และ LN ที่ใช้งานอยู่ ทุกวิชาได้ให้ความยินยอมตามที่ได้รับแจ้งบนพื้นฐานของการอนุมัติทางจริยธรรมที่ได้รับจากคณะกรรมการพิจารณาของสถาบันและหน่วยงานด้านจริยธรรมที่Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 และ 1/036/16) PBMC และเซลล์ปัสสาวะถูกเตรียมขึ้นโดยใช้เกรเดียนท์ความหนาแน่น Ficoll-Hypaque

แอนติบอดีและเพื่อนไซโตเมทรี

โดยขึ้นอยู่กับการทดลอง โมเลกุลพื้นผิวหลายตัวถูกย้อมบนเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแอนติเจนในการรวมกันที่ต่างกันของมอนอโคลนอลแอนติบอดีต่อไปนี้: แอนติ-CD3, -CD4, -CD8, -CD14,-CD20, -CD69 และ -CD154; เพื่อแยกแยะเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว จึงใช้ชุด LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd., Paisley, UK) ในการย้อมส่วนเซลล์ภายในเซลล์ เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 2 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องและซึมผ่านได้ด้วย BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); แอนติเจนต่อไปนี้ถูกย้อมภายในเซลล์โดยใช้โปรโตคอลมาตรฐาน: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 และ IL-17 ตัวอย่างได้รับจากไซโตมิเตอร์รุ่นเดียวกันของ BD FACSCanto II และ BD LSRFortessa (BD Biosciences) ที่ Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin โดยใช้ซอฟต์แวร์ BDFACSDiva (BD Biosciences) ข้อมูลโฟลว์ไซโตเมทรีถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA)

การเตรียมแอนติเจนและแอนติเจนพูล

เราใช้แอนติเจนต่อไปนี้เพื่อกระตุ้น CD4þ T เซลล์ในการทดสอบคลัง T-cell: 0.5 มก./มล. ของโปรตีนลูกผสม SNRPD1 (SmD1) ของมนุษย์ (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 5{{9 }} ng/ml ของมนุษย์SNRP70 (RNP70) โปรตีนลูกผสม (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0.5 มก./มล. ของโปรตีนฮิสโตนของมนุษย์ตามธรรมชาติ (Abcam Plc. .), 0.5 มก./มล. ของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ SS-A/Ro ของมนุษย์ (กรุณาให้โดย Euroimmun AG, Lübeck, เยอรมนี), 0.5 มก./มล. ของโปรตีน SS-B/Larecombinant ของมนุษย์ (จัดหาให้โดย Orgentec DiagnostikaGmbH, ไมนซ์, เยอรมนี) , SEB 1 มก./มล. (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Germany), 1 มก./มล. ของ PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach ประเทศเยอรมนี) และ 0.5 มก./มล. ของโปรตีน recombinant transthyretin ของมนุษย์ (ATGen, ซองนัม ประเทศเกาหลีใต้)

ห้องสมุด T-cell อุปกรณ์ต่อพ่วงและทางเดินปัสสาวะ

The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >99 เปอร์เซ็นต์และ 70 เปอร์เซ็นต์ถึง 75 เปอร์เซ็นต์สำหรับตัวอย่างเลือดและปัสสาวะตามลำดับ ในแบบคู่ขนาน เซลล์ที่นำเสนอแอนติเจนถูกเตรียมโดยการรวบรวมเซลล์ CD3 จาก PBMC หลังจากการหมดสิ้นด้วยไมโครบีด CD3 ที่ต่อต้านมนุษย์ (Miltenyi Biotec GmbH) และเก็บรักษาด้วยการแช่แข็ง หลังจากการเพาะเลี้ยง 1 ถึง 2 สัปดาห์ เศษส่วนของเซลล์ CD4þ T ที่ถูกขยายถูกกระจายไปยังเพลต 96-หลุม ซึ่งขึ้นอยู่กับจำนวนของแอนติเจนที่จะวิเคราะห์ ก่อนการกระตุ้นด้วยแอนติเจน เซลล์จะถูกพักอย่างน้อย 4 วัน ในวันที่มีการกระตุ้น เซลล์ที่สร้างแอนติเจนถูกละลายและกระจายไปในการเพาะเลี้ยงทีเซลล์ในอัตราส่วนอย่างน้อย 1 เซลล์ที่สร้างแอนติเจนต่อ 100 CD4þ ทีเซลล์ คลัง CD4þ ทีเซลล์สำหรับกลุ่มควบคุมเชิงลบ (เซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้น) และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย SEB) ถูกรวมไว้ในการทดลองเสมอ CD4þ ทีเซลล์ถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนเป็นเวลา 4 วัน และการเพิ่มจำนวนถูกกำหนดหาโดยใช้โปรโตคอล [3 H]-ไทมิดีนมาตรฐาน

การระเบิดของ T-cell แบบขยายตอบสนองอย่างแตกต่างกับแอนติเจนที่แสดงโดย CPM ที่เรืองแสงวาบต่างกันอย่างมาก ดังนั้น การทำให้เป็นมาตรฐานของเกณฑ์การเพิ่มจำนวนที่กำหนดเป็นคะแนน z ที่จำเพาะต่อผู้ให้จึงมีความจำเป็น คะแนน z คำนวณจากความแตกต่าง 5 ประการของเปอร์เซ็นไทล์ที่ 75 และ 25 เหนือค่า CPM มัธยฐานของการเพาะเลี้ยงจุลภาคที่ไม่ถูกกระตุ้น เซลล์ในจุลภาคที่ถูกกระตุ้นด้วย SEB ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ข้อสังเกต จุลภาคที่มีดัชนีการกระตุ้น SEB ของ<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">

วิธี ARTE อุปกรณ์ต่อพ่วงและทางเดินปัสสาวะ

เราปฏิบัติตามโปรโตคอลที่ใช้ CD154 MicroBead Kit (Mil-tenyi Biotec GmbH)35 โดยสังเขป เซลล์ถูกกระตุ้นเป็นเวลา 7 ชั่วโมงด้วยแอนติเจน จากนั้นจึงติดฉลากด้วยซีดีแอนติบอดีต่อต้านมนุษย์154-ไบโอตินแอนติบอดีและไมโครบีดต้านไบโอตินตาม ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ที่ติดฉลากถูกโหลดเข้าสู่คอลัมน์ MS ที่ปรับเทียบแล้ว (Miltenyi Biotec GmbH) เพื่อเพิ่มคุณค่าของ CD154-ซึ่งแสดงออกถึงเซลล์ การติดฉลากเซลล์ด้วย carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (Sigma Aldrich Chemie GmbH) ดำเนินการตามโปรโตคอลมาตรฐาน

การสร้างโคลนเซลล์เดียว

สำเนาพันธุ์เซลล์เดียวถูกสร้างขึ้นจากเซลล์ที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจน ซึ่งถูกทำให้สมบูรณ์โดยการแสดงออกของ CD154 ตามโปรโตคอล ARTE CD154-การแสดงออกของเซลล์ถูกกรองด้วยตัวกรองการเตรียม 30-มม. (Miltenyi Biotec GmbH) และแขวนลอยใหม่ ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเย็น 20 เปอร์เซ็นต์ (v/v) 0.5 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มอัลบูมินจากวัว 0.5 เปอร์เซ็นต์ และกรดเอทิลีนไดเอมีนเตตระอะซิติก 2 มิลลิโมลาร์ เซลล์เป็นเซลล์เดี่ยวที่จัดแยกสำหรับฟีโนไทป์ CD154þCD69þ และเซลล์ที่คัดแยกเดี่ยวถูกเพาะเลี้ยงในหลุมเดียวของเพลต 96- หลุมในการมีอยู่ของเซลล์ตัวป้อน การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกคงไว้เป็นเวลา 3 ถึง 4 วันจนกระทั่งมองเห็นได้หลายโคลน หนึ่งวันก่อนการกระตุ้น เซลล์ที่นำเสนอแอนติเจนถูกละลายและกระจายไปในการเพาะเลี้ยงทีเซลล์ในอัตราส่วนของเซลล์ซึ่งนำเสนอแอนติเจนอย่างน้อย 1 เซลล์ต่อ 100 CD4þ ทีเซลล์ เซลล์ถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจน 1 มก./มล. และสำเนาพันธุ์ที่ไม่ถูกกระตุ้นทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ

การวิเคราะห์รายการเพลง TCR ที่อิงตามการจัดลำดับยุคหน้า

จีโนม DNA ถูกแยกออกจากเซลล์ CD4þ T ที่ต่อพ่วงและเซลล์ปัสสาวะโดยใช้ AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, The Netherlands) โลคัส TCR-b ที่รวมตัวใหม่ถูกขยายตามโปรโตคอลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 36 การอ่านถูกประมวลผลโดยใช้ IMSEQ,37 และโคลนไทป์ที่เท่ากันถูกทำคลัสเตอร์และวิเคราะห์เพิ่มเติม

สถิติ

ทำการทดสอบทางสถิติด้วยซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ใช้การปรับ Bonferroni สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ การทดสอบ Mann-Whitney U และการทดสอบอันดับที่ลงนามของ Wil-Coxon ถูกนำมาใช้ในการทดลองด้วยชุดข้อมูลที่เป็นอิสระและขึ้นอยู่กับตามลำดับ หลังจากการปรับปรุง Bonferroni สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ การคำนวณค่า P วิกฤตได้รับการแก้ไขแล้วเนื่องจากเป็นไปตามจำนวนของการเปรียบเทียบที่วางแผนไว้ ค่า P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">

กิตติกรรมประกาศ

เราขอขอบคุณ Toralf Kaiser และ Jenny Kirsch (Flow Cytometry and CellSorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) สำหรับความช่วยเหลือเกี่ยวกับ flflow cytometry และการคัดแยกเซลล์ การสนับสนุนสำหรับการศึกษาเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจาก DeutscheForschungsgemeinschaft ภายใน Sonderforschungsbereich 650 toGR และโดยทุนจาก Deutsche Gesellschaft für Nephrologie andClinical Scientist Program of Charité – Universitätsmedizin Berlin และBerlin Institute of Health to PE