- กรดไลโปอิกช่วยเพิ่มการสังเคราะห์คอลลาเจนและการสะสมในไตหนูที่เป็นเบาหวานและเบาหวาน

Nevena Grdović และคณะ

- กรดไลโปอิก (ALA) ถูกใช้อย่างกว้างขวางในฐานะอาหารเสริมและยารักษาโรคในการจัดการโรคเบาหวาน สารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นที่ยอมรับและฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือดของ ALA ได้รับการพิจารณาว่ามีความสำคัญอย่างยิ่งในการต่อสู้กับภาวะแทรกซ้อนจากโรคเบาหวาน ได้แก่ไตบาดเจ็บ. การศึกษาปัจจุบันได้ประเมินศักยภาพของ ALA ในการตอบสนองต่อเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นจริงในไตที่สามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการทำงานของมันได้ ALA ถูกบริหารให้ทางช่องท้อง (10 มก./กก.) แก่หนู Wistar เพศผู้ที่ไม่เป็นเบาหวานและที่เหนี่ยวนำโดยสเตรปโตโซโตซินเป็นเวลา 4 และ 8 สัปดาห์ ประสิทธิภาพของ ALA ได้รับการประเมินโดยเริ่มจากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง/ลักษณะทางสัณฐานวิทยาผ่านการเปลี่ยนแปลงที่กำหนดลักษณะเฉพาะของกระบวนการโปรไฟโบรติก ไปจนถึงการควบคุมการแสดงออกของยีนคอลลาเจนในไต. ที่นี่ เราแสดงให้เห็นว่า ALA ปรับปรุงระดับกลูโคสและยูเรียในระบบ ลดการก่อตัวของไตAdvanced glycation end products (AGEs) และรักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างไตในหนูที่เป็นเบาหวาน อย่างไรก็ตาม เหตุการณ์ profibrotic ที่กระตุ้นในผู้ป่วยเบาหวานไม่ได้รับการบรรเทาโดย ALA เนื่องจากการสังเคราะห์/การสะสมของคอลลาเจนและการแสดงออกของปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง- 1 (TGF- 1) และ -smooth muscle actin ( -SMA) ยังคงสูงขึ้นใน ALA- หนูเบาหวานที่รักษาโดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากเริ่มเป็นเบาหวาน 8 สัปดาห์ นอกจากนี้ 8 สัปดาห์ของการรักษาหนูที่ไม่เป็นเบาหวานด้วย ALA นำไปสู่การพัฒนาคุณสมบัติ profibrotic ที่ตอบสนองในการสังเคราะห์/การสะสมคอลลาเจนที่เพิ่มขึ้น นอกจากการส่งสัญญาณปลายน้ำ TGF- 1 แล้ว กลไกเพิ่มเติมที่อยู่ภายใต้การควบคุมของคอลลาเจน IV ในหนูที่ไม่ได้เป็นเบาหวานที่รักษาด้วย ALA นั้นเกี่ยวข้องกับการลดเมทิลเลชันของดีเอ็นเอของโปรโมเตอร์ที่อาจเกิดขึ้นจากการแสดงออกของ Tet1 ที่เพิ่มขึ้น การค้นพบนี้เน้นย้ำถึงความระมัดระวังในการรักษาในการใช้ ALA โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยที่มีไตเบาหวานภาวะแทรกซ้อน

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: ali.ma@wecistanche.com

Click to Cistanche extract powder สำหรับโรคไต

1. บทนำ

เบาหวานไตโรค (DKD) หรือโรคไตจากเบาหวานเป็นหนึ่งในภาวะแทรกซ้อนของ microvascular ที่มีอุบัติการณ์ 20-40 เปอร์เซ็นต์ในผู้ป่วยโรคเบาหวานซึ่งมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ก้าวหน้าและการสูญเสียการทำงานของไต [1] กลไกทางพยาธิสรีรวิทยาที่รองรับ DKD นั้นซับซ้อนและเริ่มต้นด้วยภาวะน้ำตาลในเลือดสูงเรื้อรังซึ่งจะกระตุ้นความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ขั้นปลายของไกลเคชั่นขั้นสูง (AGEs) การกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK/PKC และการแสดงออกในภายหลังของผู้ไกล่เกลี่ย proinflammatory และ profibrotic [2, 3]. ครอสทอล์คระหว่างเหตุการณ์เหล่านี้ส่งผลให้เกิดการสะสมของโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) ใน mesangium และ tubulointerstitium ด้วยรูปแบบทางจุลพยาธิวิทยาแบบคลาสสิกของไตพังผืด. มันเริ่มต้นด้วยการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง เช่น ความหนาของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินและการขยายตัวของเยื่อหุ้มเซลล์ ค่อยๆ พัฒนาไปสู่โรคลิ่มเลือดอุดตันและเนื้อเยื่อคั่นระหว่างหน้าในที่สุดไตความล้มเหลว[4, 5].

การเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต- 1 (TGF- 1) การส่งสัญญาณปลายน้ำเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการสมานแผลที่เมื่อเกิดการอักเสบอย่างต่อเนื่อง ระดับน้ำตาลในเลือดสูงหรือความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่บ่งบอกถึงลักษณะเฉพาะของโรคเบาหวาน จะแปลงเป็นพังผืดทางพยาธิสรีรวิทยา [6] . TGF- 1 เป็นตัวกลางไกล่เกลี่ยของการเกิดโรค DKD ซึ่งเป็นตัวควบคุมหลักของการแสดงออกของโปรตีน ECM ในผู้ป่วยเบาหวาน อาจเป็นผลมาจากสภาวะน้ำตาลในเลือดสูงและถูกรบกวน [7–10] TGF- 1 กระตุ้นการสะสม ECM โดยการกระตุ้นคอลลาเจนชนิดที่ 1 และ IV, - แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบ ( -SMA), การสังเคราะห์ลามินิน และไฟโบรเนกติน รวมถึงการยับยั้งเอนไซม์ที่ย่อยสลาย ECM [11]

คอลลาเจนชนิดที่ 4 เป็นองค์ประกอบที่มีมากที่สุดของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดิน [12] แสดงออกในเยื่อหุ้มเซลล์ไตและท่อใต้ดินภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา [13] อย่างไรก็ตาม โรคไตจากเบาหวานจะมาพร้อมกับการแสดงออกของคอลลาเจนชนิดที่ 4 ที่ผิดปกติ ซึ่งรวมถึงการผลิตที่มากเกินไปและการกระจายอย่างผิดปกติผ่านคั่นระหว่างหน้าและมีแซนเซียม [14-16] ในบรรดาไอโซฟอร์มหกชนิดของคอลลาเจนชนิด IV ( 1- 6), 1(IV) และ 2(IV) มีอยู่ทั่วไปในเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินทั้งหมด สายคอลลาเจน 1(IV) และ 2(IV) ถูกเข้ารหัสโดยยีน Col4a1 และ Col4a2 ซึ่งการควบคุมการถอดรหัสถ่ายทอดปฏิกิริยาระหว่างซิส-ทรานส์ที่อธิบายไว้อย่างดี [17] แต่การค้นพบเมื่อเร็วๆ นี้เน้นให้เห็นถึงบทบาทที่สำคัญของกลไกอีพีเจเนติก ซึ่งรวมถึงเมทิลเลชันของดีเอ็นเอใน ระเบียบการแสดงออก [18–20]

ในมุมมองของกลไกทางพยาธิสรีรวิทยาที่อยู่เบื้องหลัง DKD กลยุทธ์การรักษานั้นตรงไปตรงมาและกำหนดเป้าหมายภาวะน้ำตาลในเลือดสูงและความเครียดออกซิเดชัน ศักยภาพในการลดน้ำตาลในเลือดและสารต้านอนุมูลอิสระของ ALA ซึ่งเป็นหนึ่งในสารต้านอนุมูลอิสระที่ใช้กันอย่างแพร่หลายนั้นพบว่าช่วยบรรเทาได้ไตการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่เกี่ยวข้องกับโรคไตจากเบาหวาน [21-23] อย่างไรก็ตาม ที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพของผิว มีรายงานผลที่เป็นประโยชน์ของ ALA ผ่านการสังเคราะห์คอลลาเจนประเภทที่ 1 ที่เพิ่มขึ้นในไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ [24] เมื่อพิจารณาจากพยาธิสรีรวิทยาของ DKD ผลที่คล้ายกันของ ALA อาจส่งผลเสียต่อผู้ป่วยโรคเบาหวานด้วยไตภาวะแทรกซ้อน ด้วยภูมิหลังนี้ การศึกษาในปัจจุบันจึงมุ่งเน้นไปที่การประเมินประสิทธิภาพของ ALA ต่อลักษณะโครงสร้าง/ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของไต และกระบวนการโปรไฟโบรติก โดยเน้นที่การแสดงออกของยีนคอลลาเจนชนิดที่ 4 ในหนูที่เป็นเบาหวานและไม่เป็นเบาหวาน

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.สัตว์ การรักษา และการทดลองการทดลองทั้งหมดดำเนินการกับหนูขาว Wistar เผือกเพศผู้อายุ 2.5-เดือนที่มีน้ำหนักระหว่าง 220 ถึง 250 กรัม ขั้นตอนของสัตว์ทั้งหมดที่ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมสำหรับการใช้สัตว์ทดลองของสถาบันวิจัยชีวภาพ "Siniša Stan-ković" มหาวิทยาลัยเบลเกรดเป็นไปตาม Directive 2010/63/EU ว่าด้วยการคุ้มครองสัตว์ที่ใช้สำหรับการทดลองและ วัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์อื่น ๆ สัตว์ในการศึกษานี้ถูกสังเวยโดยวิธีทางกายภาพของนาเซียเซียโดยใช้กิโยติน ตามคำแนะนำทั้งหมดของแนวทางการุณยฆาตของสัตว์ ความตายเกิดขึ้นทันทีและสัตว์ก็ไม่รอด ทำการุณยฆาตในห้องผ่าตัด แยกออกจากห้องเคหะ สัตว์ตัวหนึ่งต่อตัว (สัตว์ที่เหลือในการทดลองถูกเลี้ยงไว้ในห้องทดลองซึ่งแยกออกจากห้องผ่าตัดที่ทำการุณยฆาตเพื่อหลีกเลี่ยงความเครียดจากอีกตัวหนึ่ง สัตว์). การุณยฆาตดำเนินการโดย stuFF ที่ได้รับการฝึกอบรมมาเป็นอย่างดีและมีประสบการณ์ อุปกรณ์ที่ใช้ในการตัดหัวใช้งานได้ดี (มีบริการเพื่อความคมของใบมีดเป็นประจำ)

โรคเบาหวานเกิดจากการฉีดสเตรปโตโซติซิน (STZ) (MP Biomedicals) ในขนาดต่ำ (40 มก./กก.) หลายครั้งเป็นเวลาห้าวันติดต่อกัน หนูควบคุมถูกฉีดด้วยกระสายยาเพียงอย่างเดียว (0.1 โมลาร์โซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์, pH 4.5) วัดระดับน้ำตาลในเลือด 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีด STZ ครั้งสุดท้ายด้วยเครื่องวัดน้ำตาลในเลือด Accu-Chek Active และสัตว์เหล่านี้ถือเป็นเบาหวานเมื่อระดับน้ำตาลในเลือดขณะอดอาหารเกิน 20 มิลลิโมล/ลิตร หนูถูกสุ่มแบ่งเป็นกลุ่มทดลองสี่กลุ่ม: กลุ่มควบคุม (กลุ่มควบคุม, n=8), กลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วย ALA (ALA, n=8), เบาหวาน (STZ, n=10) และ กลุ่มผู้ป่วยเบาหวานที่รักษาด้วย ALA (STZ/ALA, n=10) ALA (Ivančić i synovial, Belgrade, Serbia) ถูกฉีดเข้าช่องท้อง (10 มก./กก.) ทุกวันเป็นเวลา 4 และ 8 สัปดาห์ โดยเริ่มจากการฉีด STZ ครั้งล่าสุด หลังจากการบูชายัญและการเก็บเลือด ได้มีการผ่าท้องและทั้งสองอย่างไตถูกถอดออก หนึ่งไตถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว เก็บไว้ที่ -80 องศา และใช้สำหรับการแยกโปรตีน ดีเอ็นเอ และอาร์เอ็นเอ ในขณะที่อีกส่วนหนึ่งถูกตรึงในฟอร์มาลินที่บัฟเฟอร์ 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับการตรวจเนื้อเยื่อ

2.2.การวิเคราะห์ทางชีวเคมี.หนูได้อดอาหารข้ามคืนก่อนที่จะสังเวย เก็บซีรัมในเลือดหลังจากการแข็งตัวของเลือดและการหมุนเหวี่ยงที่ 2,000 กรัม เป็นเวลา 10 นาที ซีรั่มใช้สำหรับกำหนดความเข้มข้นของกลูโคสด้วยชุดเครื่องมือทางการค้า (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer) ระดับไตรกลีเซอไรด์ในซีรัมโดยวิธี GPO-PAP โดยใช้ชุดทดสอบเอนไซม์ (Randox Laboratories, UK) ระดับยูเรียโดย Urea Assay ชุดคิท (Abcam, USA) และความเข้มข้นของครีเอตินินโดยใช้การทดสอบ Creatinine ของเคย์แมนตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.3.การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาและการสร้างภูมิคุ้มกันฟอร์มาลินคงที่ไตเนื้อเยื่อถูกทำให้ขาดน้ำในชุดไซลอลและแอลกอฮอล์ที่ลดลงสำหรับการรวมส่วนหลังในบล็อกพาราffi บล็อกเนื้อเยื่อถูกแบ่งส่วนที่ 5 ไมโครเมตรบนไมโครโทมแบบหมุน (RM 2125RT; Leica Microsystem) เพื่อที่จะสังเกตการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของไต ส่วนของเนื้อเยื่อถูกย้อมโดยใช้วิธี Periodic Acid–Schiff (PAS) นอกจากนี้ ส่วนที่เปื้อนถูกวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ของโอลิมปัส (BX-51) ที่ติดตั้งไมโครแอคทูเอเตอร์ สเตจแบบใช้มอเตอร์ และกล้อง ซึ่งควบคุมโดยชุดซอฟต์แวร์สเตอริโอ CAST ใหม่ Visiopharm Integrator System พื้นที่ลูเมนของท่อได้มาจากการขยายวัตถุ 40x และแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ ( เปอร์เซ็นต์ ) ต่อพื้นที่ที่ทำการตรวจสอบ เศษส่วนของเมทริกซ์ Mesangial ถูกประเมินว่าเป็นพื้นที่ของการย้อมสี PAS ที่เป็นบวก โดยแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ต่อพื้นที่ไตทั้งหมด (การขยายเชิงวัตถุ 100x)

สำหรับการตรวจจับเส้นใยคอลลาเจน ส่วนของเนื้อเยื่อถูกย้อมด้วยคราบ Masson trichrome หลังจากการย้อมสี มีการสังเกตส่วนต่างๆ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany, พร้อมกับกล้อง Leica DFC 320 CCD; กำลังขยายตามวัตถุ 40x) การวิเคราะห์รูปภาพทำได้โดยซอฟต์แวร์ ImageJ (เวอร์ชัน 1.52p, National Institutes of Health) รูปภาพถูกแปลงเป็นกอง RGB และใช้เกณฑ์กำหนดแบบแมนนวลเพื่อประเมินสัดส่วนของพื้นที่คอลลาเจนต่อพื้นที่เนื้อเยื่อ

การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน [25] โดยใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่ต่อต้าน N(?)-(คาร์บอกซีเมทิล)ไลซีน (CML) (เจือจาง 1: 50) (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) และเปอร์ออกซิเดสจากพืชชนิดหนึ่งที่มีแอนติบอดีทุติยภูมิ (1: 100) (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ). ส่วนของเนื้อเยื่อถูกย้อมด้วย 3,3′-ไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB) ย้อมทับด้วยฮีมาทอกซิลิน และติดตั้งและสังเกตดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (กล้องจุลทรรศน์ภาพถ่าย Leica DM RB; กำลังขยายวัตถุประสงค์ 40x) การวิเคราะห์รูปภาพทำได้โดยซอฟต์แวร์ ImageJ (เวอร์ชัน 1.52p, National Institutes of Health) รูปภาพถูกประมวลผลโดยการแปลงสีด้วยตัวเลือกเวกเตอร์ H DAB การส่งสัญญาณ CML คำนวณโดยความเข้มสีเทาเฉลี่ยของการย้อมสี DAB ที่ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามจำนวนนิวเคลียส (ได้โดยใช้ตัวเลือกวิเคราะห์อนุภาค)

2.4.การวิเคราะห์ Western Blot25 ไมโครกรัมของไตโฮโมจีเนตถูกแยกโดย SDS–PAGE, ถ่ายโอนไปยังเยื่อพอลิไวนิลลิดีนไดfluoride และสอบสวนด้วยโพลีโคลนัลแอนติบอดีที่ต้าน GAPDH (FL-335) และโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ต้านหนู TGF- 1 (3C11) และ SMA (CGA7) ทั้งหมดจาก เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซและทั้งหมดเจือจางในอัตราส่วน 1: 1,000 การตรวจจับดำเนินการโดยระบบตรวจจับเคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (Santa Cruz Biotechnology) การหาปริมาณของแถบอิมมูโนรีแอคทีฟดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์อิเล็กโตรโฟรีซิส TotalLab (Phoretix) (เวอร์ชัน 1.10) และทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับ GAPDH ที่ใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด

2.5.Real-Time PCR เชิงปริมาณ (RT-qPCR)รวม RNA แยกจากไตใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen) สำหรับการสังเคราะห์ cDNA นั้น 1 ug ของ RNA ทั้งหมดได้รับการรักษาด้วย DNase I และคัดลอกกลับด้วย RevertAid First- Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, เบอร์ลิงตัน, แคนาดา) โดยใช้ไพรเมอร์สุ่มเฮกซาเมอร์และโอลิโก (dT) ผสมกัน ระดับของ mRNA ถูกหาปริมาณโดยใช้ 2x Maxima SYBR Green/- ROX qPCR Master Mix (Fermentas) บนระบบ QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/) ถูกใช้เพื่อออกแบบไพรเมอร์ (แสดงอยู่ในตารางเสริม S1) สำหรับการประเมิน Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b และ การแสดงออกของยีน Tet1 รอบการระบายความร้อนประกอบด้วยการเปลี่ยนสภาพเริ่มต้นที่ 95 องศา /10 นาที และ 40 รอบของ PCR สองขั้นตอนที่ 95 องศา /15 วินาที และ 60 องศา /60 วินาที ระดับการแสดงออก mRNA ของยีนที่สนใจถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงระดับการแสดงออก mRNA ของ Actb เป็นยีนอ้างอิงโดยวิธี 2-dCT

2.6.การแยก DNA ของจีโนมและการแปลงไบซัลไฟต์ของ DNAจีโนมดีเอ็นเอถูกแยกออกโดยใช้วิธี Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26] ตามโปรโตคอลสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (ดูออนไลน์ได้ที่ https://bomb.bio/protocols/) จีโนมดีเอ็นเออยู่ภายใต้โปรโตคอลการแปลงไบซัลไฟต์ BOMB (ออนไลน์ได้ที่ https://bomb.bio/protocols/) [26]

2.7.การวัดระดับของ DNA Methylation ทั่วโลกระดับเมทิลเลชันของ DNA ทั่วโลกถูกวัดโดยใช้ 5-mC DNA ELISA kit (Zymo Research, California, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จีโนม DNA ที่บริสุทธิ์ (100 ng) ที่แยกได้จากไตจากกลุ่มทดลองทั้งหมดถูกใช้ และแต่ละตัวอย่างถูกวิเคราะห์ซ้ำกัน นัยสำคัญทางสถิติถูกประเมินโดยใช้ ANOVA ทางเดียวที่มีการปิดกั้น โดยถือว่าแต่ละเพลต ELISA เป็นบล็อก

2.8.PCR เฉพาะเมทิลเลชัน (MSP)คู่ไพรเมอร์สำหรับการวิเคราะห์ MSP ซึ่งออกแบบบนพื้นที่โปรโมเตอร์ของ Col4a1 ซึ่งครอบคลุมไซต์เริ่มต้นการถอดรหัส (TSS) ได้รับการออกแบบโดยใช้ MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (ตารางเสริม S2 ). ตำแหน่งของไพรเมอร์ (เทียบกับ TSS สำหรับ Col4a1 ทำเครื่องหมายเป็นบวก 1) ที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ MSP มีดังนี้: M fw (-35, -14), M รอบ (บวก 44, บวก 64), U fw (-35, -14) และ U rev (บวก 45 บวก 69) เนื่องจากไพรเมอร์แต่ละตัวครอบคลุม 2 CpGs จึงมีการทดสอบทั้งหมด 4 CpG สำหรับสถานะเมทิลเลชั่นต่อคู่ไพรเมอร์ ของผสมปฏิกิริยาสำหรับ MSP ประกอบด้วย Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng ของ DNA ที่แปลงเป็นไบซัลไฟต์ และ 0.5 ไมโครโมลาร์ของไพรเมอร์จำเพาะแต่ละชนิดสำหรับ DNA ที่ถูกเมทิลเลต (M) และที่ไม่เป็นเมทิล (U) ที่ปริมาตรสุดท้าย 10 ไมโครลิตร MSP ดำเนินการบนระบบ QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems) เงื่อนไขการปั่นจักรยาน PCR มีดังนี้: ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเริ่มต้นที่ 95 องศา /10 นาที และตามด้วย 40 รอบของการเปลี่ยนสภาพที่ 95 องศา /15 วินาที และการหลอมและการยืดตัวที่ 58 องศา /60 วินาที ระดับสัมพัทธ์ของ DNA ที่มีเมทิลเลตถูกแสดงออกโดยใช้ดัชนีเมทิลเลชั่นที่กำหนดเป็น 2 (รอบดีเมทิล Ct) − (รอบเมทิลเลต Ct) [27]

2.9.การวิเคราะห์ทางสถิติ.ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) สำหรับพารามิเตอร์ทั้งหมดที่ศึกษา การทดสอบ t ของนักเรียนใช้เพื่อเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยของตัวแปรแบบกระจายปกติระหว่างสองกลุ่ม วิเคราะห์ความแตกต่างทางสถิติระหว่างกลุ่มโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณของ Tukey โดยใช้ GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

3. ผลลัพธ์

3.1.ผลของ ALA ต่อดัชนีชีวเคมีในหนูเบาหวาน.กลูโคส ไตรกลีเซอไรด์ ยูเรีย และครีเอตินีนถูกกำหนดหาในซีรัมของหนูกลุ่มควบคุมที่เป็นเบาหวานและหนูที่ไม่เป็นเบาหวานและเบาหวานที่บำบัดด้วย ALA (รูปที่ 1) ติดตามสภาพเบาหวาน 4 สัปดาห์และ 8 สัปดาห์ เพื่อที่จะรวมระยะเวลาที่จำเป็นสำหรับกระบวนการที่เป็นอันตรายที่จะแสดงออกมา หนูเบาหวานทั้งสองกลุ่มมีลักษณะเฉพาะโดยภาวะน้ำตาลในเลือดสูง แนวโน้มที่เพิ่มขึ้นของระดับไตรกลีเซอไรด์และครีเอตินีน แต่ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ และโดยระดับยูเรียที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ในหนูที่เป็นเบาหวาน การรักษาด้วย ALA เป็นเวลา 4 สัปดาห์ส่งผลให้ระดับน้ำตาลในเลือดลดลงจนถึงระดับควบคุม ในขณะที่ระดับน้ำตาลในเลือดลดลงหลังจากผ่านไป 8 สัปดาห์ แต่ยังคงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ในกลุ่มผู้ป่วยเบาหวานทั้งสองกลุ่มที่รักษาด้วย ALA ไตรกลีเซอไรด์และครีเอตินีนไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ การรักษาด้วย ALA ช่วยลดระดับยูเรียในหนูเบาหวานได้อย่างมีนัยสำคัญหลังจากผ่านไป 4 สัปดาห์ ในขณะที่หลังจาก 8 สัปดาห์ระดับยูเรียในซีรัมของหนูเบาหวานลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเบาหวาน แต่ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ การบริหาร ALA เพื่อควบคุมหนูไม่มีผลต่อพารามิเตอร์ทางชีวเคมีที่ตรวจสอบอย่างมีนัยสำคัญ

3.2.การประเมินทางสัณฐานวิทยาของโครงสร้างไตและการสร้าง CML หลังการรักษา ALAการย้อมสี PAS เน้นย้ำถึงลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาของไตที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวาน (รูปที่ 2(a)) ความหนาของเยื่อหุ้มไตชั้นใต้ดินปรากฏขึ้นหลังจากเริ่มเป็นโรคเบาหวาน 4 สัปดาห์ในขณะที่พบการขยายตัวของเมทริกซ์ mesangial และท่อที่มีลูเมนกว้างขึ้นหลังจากเริ่มเป็นเบาหวาน 8 สัปดาห์ การวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาเปิดเผยว่าพื้นที่ของ tubular lumen, glomerular และ mesangial matrix เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่เป็นเบาหวาน 8 สัปดาห์เมื่อเทียบกับหนูกลุ่มควบคุมและหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย ALA อย่างไรก็ตาม หลังการบำบัดด้วย ALA การขยายท่อและการขยายตัวของเมทริกซ์ mesangial ลดลงอย่างมีนัยสำคัญแต่ยังคงสูงกว่าค่าควบคุม ในขณะที่บริเวณไตกลับถูกเปลี่ยนกลับเป็นระดับควบคุมโดยสมบูรณ์ ในหนูควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย ALA พบว่าเศษส่วนของเมทริกซ์มีเซนเชียลเพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าการใช้ ALA ในระยะยาวอาจส่งผลกระทบต่อลักษณะโครงสร้างบางอย่างในไต(รูปที่ 2(ก)).

วัยเป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดโรคซึ่งส่งผลต่อความเสียหายของไตในผู้ป่วยเบาหวาน เพื่อตรวจสอบว่า ALA มีผลกับการสะสมของผลิตภัณฑ์ AGE หรือไม่ไตของหนูที่เป็นเบาหวาน เนื้อหาของไต CML ได้รับการประเมินโดยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีในการควบคุม หนูที่เป็นเบาหวาน (4 และ 8 สัปดาห์) และ ALA ที่ได้รับการรักษากลุ่มควบคุมและหนูที่เป็นเบาหวาน (4 และ 8 สัปดาห์) (รูปที่ 2(b)) การย้อมสีสำหรับ CML เป็นผลบวกในหนูเบาหวานทั้งสองกลุ่มโดยเปิดเผยว่า CML สะสมส่วนใหญ่ใน tubulointerstitium และใน glomeruli ในระดับที่น้อยกว่า ตามการหาปริมาณของเนื้อหา CML การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้มีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่เกี่ยวข้อง (รูปที่ 2(b)) หลังจากการรักษาด้วย ALA ในหนูที่เป็นเบาหวาน (4 และ 8 สัปดาห์) ภูมิคุ้มกันของ CML ทั้งในท่อและไตลดลงอย่างเห็นได้ชัดในขณะที่ในหนูควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย ALA พบว่าผลบวกของ CML ยังคงตรวจไม่พบเช่นเดียวกับในกลุ่มควบคุม

3.3.ผลของ ALA ต่อการสะสมคอลลาเจนและการแสดงออกของยีน Col4a1การย้อมสี Masson Trichrome เผยให้เห็นการสะสมของคอลลาเจนในบริเวณเนื้อเยื่อท่อและภายในโกลเมอรูไล โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของทั้งสองส่วนในกลุ่มหนูที่เป็นเบาหวาน (4 และ 8 สัปดาห์) (รูปที่ 3(a)) การรักษาด้วย ALA (4 และ 8 สัปดาห์) ของหนูที่ไม่เป็นเบาหวานยังสัมพันธ์กับการสะสมคอลลาเจนที่เพิ่มขึ้นซึ่งมีลักษณะเฉพาะโดยบริเวณไตและเนื้อเยื่อท่อไตที่ถูกครอบครองโดยเมทริกซ์ที่ย้อมสีคอลลาเจน แต่ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ ในหนูที่เป็นเบาหวานที่ได้รับการรักษาด้วย ALA (4 และ 8 สัปดาห์) การสะสมของคอลลาเจนยังคงอยู่อย่างต่อเนื่องเนื่องจากตรวจไม่พบการลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับหนูที่เป็นเบาหวาน เพื่อตรวจสอบการเพิ่มขึ้นของการสังเคราะห์คอลลาเจน ระดับของการแสดงออกของยีน Col4a1 ถูกประเมินโดย RT-PCR (รูปที่ 3(b)) การแสดงออกของยีน Col4a1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไตของหนูเบาหวานในทั้งสองช่วงเวลา เช่นเดียวกับในไตของหนูที่เป็นเบาหวานและไม่เป็นเบาหวานที่ได้รับการรักษาด้วย ALA จากกลุ่มทดลองทั้งสอง (4 และ 8 สัปดาห์) เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่เกี่ยวข้อง .

3.4.การเปลี่ยนแปลงแบบโปรไฟโบรติกที่เกี่ยวข้องกับการรักษาโรคเบาหวานและ ALAการวิเคราะห์ Western blot เปิดเผยว่าระดับโปรตีน TGF- 1 ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 4 สัปดาห์โดยไม่คำนึงถึงการรักษา (รูปที่ 4(a)) อย่างไรก็ตาม มีการตรวจพบการเหนี่ยวนำของโปรตีน TGF- 1 ที่มีนัยสำคัญทางสถิติหลังจากเป็นโรคเบาหวาน 8 สัปดาห์ ซึ่งลดลงเล็กน้อยโดยการรักษาด้วย ALA แต่ยังคงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม นอกจากนี้ การเหนี่ยวนำที่คล้ายกันของ TGF- 1 ถูกสังเกตพบในสัตว์ที่ไม่เป็นเบาหวานที่บำบัดด้วย ALA (รูปที่ 4(a)) เพื่อตรวจสอบว่าการเหนี่ยวนำ TGF- 1 มาพร้อมกับการเกิด fibrotic markers หรือไม่ การวิเคราะห์การมีอยู่ของ SMA ถูกวิเคราะห์โดยใช้ Western blot (รูปที่ 4(b)) ภาวะเบาหวานทำให้เกิดการแสดงออกของ SMA ที่ตรวจพบตั้งแต่สัปดาห์ที่สี่หลังจากเริ่มเป็นโรคเบาหวานเป็นต้นไป การรักษาด้วย ALA ในหนูเบาหวานลด SMA ลงสู่ระดับควบคุมหลังจาก 4 สัปดาห์ แต่ไม่ได้ผลหลังจาก 8 สัปดาห์ การรักษาด้วย ALA ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อ SMA ในหนูที่ไม่เป็นเบาหวานหลังจากผ่านไป 4 สัปดาห์ ในขณะที่หลังจาก 8 สัปดาห์ มันนำไปสู่การแสดงออกของ SMA ที่เพิ่มขึ้นในส่วนที่เกี่ยวกับการควบคุม แต่การเพิ่มขึ้นนี้ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 4(b))

การรักษาหนูที่ไม่เป็นเบาหวานด้วย ALA ทำให้เกิดรอยประทับที่คล้ายคลึงกันเกี่ยวกับคุณสมบัติของโปรไฟโบรติกเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่เป็นเบาหวาน ซึ่งบ่งชี้ถึงความจำเป็นในการเปิดเผยกลไกที่รองรับการเปลี่ยนแปลงของไตที่สังเกตได้ของหนูที่ไม่เป็นเบาหวานที่รักษาด้วย ALA เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้ที่การปรับเปลี่ยน epigenetic เป็นตัวแทนของกลไกเพิ่มเติมที่เกี่ยวข้องกับภูมิทัศน์ profibrotic ที่เกิดจาก ALA ที่สังเกตพบในหนูที่ไม่เป็นเบาหวาน ในการแสดงออก Col4a1 ที่เพิ่มขึ้นโดยเฉพาะ ไตจากกลุ่มควบคุมและหนูที่ไม่เป็นเบาหวานที่บำบัดด้วย ALA จะต้องได้รับการวิเคราะห์สถานะ DNA methylation เพิ่มเติม .

3.5.ผลกระทบของ ALA ต่อสถานะ DNA Methylationระดับของ DNA methylation และการแสดงออกของยีนทั่วโลกของผู้เล่นหลักที่เกี่ยวข้องกับ DNA methylation (Dnmt1, Dnmt3a และ Dnmt3b) และ demethylation (Tet1) ได้รับการประเมินในไตของการควบคุมที่ไม่เป็นเบาหวานและหนูที่ได้รับการรักษาด้วย ALA เป็นเวลา 4 และ 8 สัปดาห์ (รูปที่ 5 ). มีเพียงระดับ Tet1 mRNA ที่แสดงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติหลังจากการรักษาด้วย ALA 8 สัปดาห์ ในขณะที่การแสดงออกของ Dnmts และระดับของ DNA methylation ทั่วโลกไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย ALA 4 หรือ 8 สัปดาห์เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม

การทดลองครั้งต่อไปมุ่งไปที่การตรวจสอบระดับ DNA methylation ของยีน Col4a1 ในท้องถิ่น รูปแบบที่สำคัญของคอลลาเจน IV ประกอบด้วยสายโซ่ 1(IV) สองสายและสายโซ่ 2(IV) หนึ่งสาย ซึ่งเข้ารหัสโดยยีน Col4a1 และ Col4a2 ซึ่งจัดเรียงในลักษณะหัวต่อหัวสร้างหน่วยการถอดรหัสที่ไม่ซ้ำกันและถ่ายทอดในทิศทางที่ต่างกันจากกันและกัน โปรโมเตอร์ [17]. Col4a1 คัดลอกมาจากภูมิภาค intergenic ยาว 130 bp ที่มีไซต์ Sp1 สองแห่ง กล่อง CAAT และ CTC [17] (รูปที่ 6 (a)) สถานะการเกิดเมทิลดีเอ็นเอของโปรโมเตอร์ Col4a1/Col4a2 ถูกประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ MSP และตำแหน่งของไพรเมอร์แสดงไว้ในรูปที่ 6(a) คู่ไพรเมอร์ทั้งคู่ เฉพาะสำหรับ methylated และ unmethylated DNA ครอบคลุม 2 CpGs ต่อไพรเมอร์ ผลลัพธ์ของ MSP เปิดเผยว่า ALA ไม่ส่งผลกระทบต่อสถานะเมทิลเลชันของโปรโมเตอร์ Col4a1/Col4a2 หลังการรักษาเป็นเวลานาน 4-สัปดาห์ (รูปที่ 6(b)) อย่างไรก็ตาม การลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในดัชนีเมทิลเลชันของ DNA สังเกตได้หลังจากการรักษาด้วย ALA 8 สัปดาห์ (รูปที่ 6 (b)) ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพของ ALA ในการปรับการแสดงออกของ Col4a1 ตลอดการเปลี่ยนแปลงรูปแบบ DNA methylation ของโปรโมเตอร์

4. การอภิปราย

เนื่องจากสัดส่วนการแพร่ระบาดของโรคเบาหวาน DKD จึงเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้ายทั่วโลก และเป็นปัจจัยบ่งชี้มากที่สุดสำหรับการตายก่อนวัยอันควรในผู้ป่วยเบาหวาน [28, 29] อุบัติการณ์ของ DKD ในผู้ป่วยเบาหวานไม่ได้ลดลงในทศวรรษที่ผ่านมาทั้งๆ ที่มีการรักษาอย่างเข้มข้นที่มุ่งไปที่การควบคุมระดับน้ำตาลในเลือด [28, 30] ในบรรดากลยุทธ์การรักษาที่เป็นไปได้ซึ่งแสดงให้เห็นประโยชน์ต่อ DKD คือการกำหนดเป้าหมายความเครียดออกซิเดชัน และในระยะนั้นได้มีการกำหนดว่า ALA สามารถปรับปรุงการทำงานของไตในผู้ป่วยเบาหวานได้ [29, 31, 32] ผลลัพธ์ที่ได้จากการศึกษานี้ยืนยันผลฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือดของ ALA แต่บ่งชี้ว่า ALA ไม่ได้ผลต่อระดับยูเรียที่ถูกรบกวนในผู้ป่วยเบาหวานในระยะยาว

การเพิ่มขึ้นของระดับน้ำตาลในเลือดเพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นหนึ่งในกลไกที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของ AGEs ซึ่งการสะสมในช่องไตและ tubulointerstitial มีความสัมพันธ์กับระดับของความเสียหายของไตในระบบแบบจำลองการทดลองของโรคไตจากโรคเบาหวาน [33, 34] . CML เป็นหนึ่งใน AGEs ที่สำคัญในร่างกาย [35] ซึ่งระดับการไหลเวียนและอวัยวะต่าง ๆ เพิ่มขึ้นรวมถึงไตของผู้ป่วยโรคเบาหวาน [36] ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของไตจากเบาหวาน [37] ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการสะสมของ CML ส่วนใหญ่สะสมอยู่ใน tubulointerstitial และในระดับที่น้อยกว่าในช่องไตของไตหนูที่เป็นเบาหวานซึ่งลดลงอย่างเห็นได้ชัดหลังการรักษาด้วย ALA ตามข้อมูลที่เผยแพร่ ท่อที่อุดมด้วย CML อาจเป็นช่องไตที่ได้รับบาดเจ็บสาหัสที่สุด [38–40] ด้วยความคลาดเคลื่อนกับผลลัพธ์ของเรา มีการอธิบายผลที่จำกัดของ ALA ต่อเนื้อหา CML ในหนูที่เป็นเบาหวาน ซึ่งตรวจพบทั้งโดยการสร้างภูมิคุ้มกันและการวิเคราะห์ทางเคมี [40] และความคลาดเคลื่อนนี้อาจเกิดขึ้นจากการออกแบบการทดลองของการศึกษา

การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาของโครงสร้างไตโดยการย้อมสี PAS ยืนยันประสิทธิภาพการป้องกันของ ALA ในผู้ป่วยเบาหวาน ผลของสารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นประโยชน์ของ ALA ต่อการบาดเจ็บจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากเบาหวานในไตนั้นเป็นที่ยอมรับ [22, 31, 32] พบว่าการรักษาด้วย ALA ช่วยป้องกันภาวะไตวายและบรรเทาการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพของโครงสร้างไตรวมทั้งการขยายตัวของเมทริกซ์ของไตและโรคหลอดเลือดตีบเนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระรวมกันและศักยภาพในการลดน้ำตาลในเลือด [21, 22] เมื่อพิจารณาว่าน้ำตาลกลูโคสสูง ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการก่อตัวของ AGEs เป็นที่ยอมรับว่าเป็นปัจจัยสำคัญในการกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงของโปรไฟโบรติกในไต [41] สารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นที่ยอมรับและประสิทธิภาพในการลดน้ำตาลในเลือด และความสามารถของ ALA ในการลดเนื้อหา CML นั้นสนับสนุนอย่างมากสำหรับ ศักยภาพของ ALA ในการบรรเทากระบวนการเกิดพังผืดในไตของผู้ป่วยเบาหวาน อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าในเนื้อเยื่อไตที่มีคราบของ Masson ระดับของการสะสมของเส้นใยคอลลาเจนไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย ALA ของหนูที่เป็นเบาหวาน นอกจากนี้ การรักษาด้วย ALA ยังแสดงให้เห็นแนวโน้มที่จะเพิ่มการสังเคราะห์/- ปริมาณคอลลาเจนในหนูที่ไม่เป็นเบาหวาน ตามการค้นพบของเรา มีการรายงานผลที่เป็นอันตรายของ ALA ต่อการควบคุม/ไตที่แข็งแรง [42] การศึกษากลไกการป้องกันการกลับของ ALA ในโรคไตจากเบาหวาน ผู้เขียนค้นพบโดยไม่คาดคิดว่าการรักษาด้วย ALA เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของ glomerulosclerosis, tubulointerstitial fibrosis และการลดลงของการทำงานของไตในไตที่ไม่เป็นเบาหวาน การศึกษาอิสระเปิดเผยว่าปริมาณ ALA ที่สูงขึ้นกระตุ้นความเสียหายของโปรตีนออกซิเดชันในหนูสูงอายุ [43] และแม้กระทั่งการทำงานของไตลดลงในโรคเบาหวาน [40] ในทำนองเดียวกัน ผลของสารต้านอนุมูลอิสระของ ALA ไม่เพียงแต่แสดงให้เห็นในการศึกษาในสัตว์ทดลองเท่านั้น แต่ยังพบในผู้ป่วยที่ป่วยด้วยโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้ายที่ได้รับธาตุเหล็กในหลอดเลือดดำ [44]

ในบริบทของผลที่สังเกตได้ของ ALA ต่อการสะสมคอลลาเจน ผลลัพธ์ของเรายังแสดงให้เห็นว่า ALA ไม่ได้ลดระดับของ fibrotic markers สองตัว นั่นคือ TGF- 1 และ -SMA ในหนูที่เป็นเบาหวานหลังจาก 8 สัปดาห์และแม้กระทั่งเหนี่ยวนำให้เกิด TGF - 1 การแสดงออกในหนูที่ไม่เป็นเบาหวานหลังการรักษา 8 สัปดาห์ ในทำนองเดียวกัน การแสดงออกของยีนของคอลลาเจนชนิดที่ 4 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยเบาหวาน เช่นเดียวกับในหนูที่เป็นเบาหวานและไม่เป็นเบาหวานที่ได้รับการรักษาด้วย ALA เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ก่อนหน้านี้ แสดงให้เห็นแล้วว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันก่อให้เกิด TGF- 1 และยีนเป้าหมายปลายทาง เช่น คอลลาเจนประเภท I, III และ IV รวมทั้งไฟโบรเนกติน [9, 45] และสารต่อต้านอนุมูลอิสระกดทับ TGF{{ 10}} นิพจน์ [46]. ตรงกันข้ามกับแนวคิดทั่วไปของบทบาทการป้องกันและต้านการสลายของสารต้านอนุมูลอิสระ ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า ALA อาจมีผลหลายประการเกี่ยวกับปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเกิดพังผืดในไตที่เป็นเบาหวาน ดูเหมือนว่า ALA จะกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับพังผืดโดยเฉพาะ เช่น TGFB1 และโดยเฉพาะอย่างยิ่ง Col4a1 ซึ่งตรวจพบการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นแล้วหลังจากการรักษาด้วย ALA ในไตที่เป็นเบาหวานและไตที่ไม่เป็นเบาหวานเป็นเวลา 4 สัปดาห์ การแสดงออกและการสะสมของคอลลาเจนประเภทที่ฉันสังเกตเห็นได้ดีขึ้นหลังจากการรักษาด้วย ALA ในไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ [24] ผลการศึกษาพบว่าการควบคุมของคอลลาเจนประเภทที่ 1 เป็นผลมาจากการส่งสัญญาณของตัวรับ TGF- I ที่ปลายน้ำ ดังนั้นจึงแนะนำประสิทธิภาพทางเภสัชวิทยาแบบใหม่ของ ALA ที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพของผิว เมื่อพิจารณาถึงผลลัพธ์ที่นำเสนอในที่นี้ การปรับเพิ่มของคอลลาเจนอาจเป็นการตอบสนองของเซลล์ทั่วไปต่อ ALA แทนที่จะเป็นลักษณะเฉพาะของกลไกเฉพาะสำหรับไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนัง

การสังเคราะห์คอลลาเจนชนิด IV ถูกควบคุมในระดับการถอดรหัส ภายหลังการถอดเสียง และหลังการแปลที่กำหนดไว้อย่างดี แต่มีข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทของ DNA methylation ในการแสดงออกของ Col4a1 เกิดขึ้น การศึกษาที่ดำเนินการเมื่อ 40 ปีที่แล้วเปิดเผยว่าการรักษาเซลล์มะเร็งเทอราโตคาร์ซิโนมา F9 ด้วย DNA demethylating agent 5-Azacytidine ส่งผลให้การแสดงออกของ Col4a1 เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าเป็นครั้งแรกที่ DNA methylation อาจมีบทบาทสำคัญในการแสดงออกของมัน [47] การศึกษาเมทิลโลมของมนุษย์และทรานสคริปโทมเปิดเผยความสัมพันธ์ของโปรโมเตอร์เมทิลเลชั่น Col4a1 กับการแสดงออกในเซลล์ที่มีสุขภาพดีและเซลล์ตับที่กระตุ้นเพื่อผลิตโปรตีน ECM [20, 48] พบสิ่งเดียวกันในเซลล์ mesangial ซึ่งตาม 5-การรักษาด้วย Azacytidine ระดับ Col4a1 mRNA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ [49] นอกจากนี้ ในผู้ป่วยโรคไตเรื้อรัง พบว่าระดับ DNA methylation ของยีน Col4a1 และ Col4a2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับหัวข้อย่อยที่มีสุขภาพดี และสัมพันธ์กับ mRNA และการแสดงออกของโปรตีนที่เพิ่มขึ้น [50] ผลลัพธ์ของเรายืนยันหลักฐานที่ชัดเจนของการควบคุมการแสดงออกของ Col4a1 ผ่าน DNA methylation ขณะที่เราพบว่าการแสดงออกของ Col4a1 มีความสัมพันธ์กับสถานะ methylation ของโปรโมเตอร์ในไต ควรสังเกตว่าการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้ในสถานะเมทิลเลชันของโปรโมเตอร์ Col4a1 ส่วนใหญ่อาจส่งผลต่อการแสดงออกของ Col4a2 ด้วย เนื่องจากยีนสองตัวถูกควบคุมผ่านภูมิภาคโปรโมเตอร์แบบสองทิศทางร่วมกัน ไพรเมอร์ MSP ที่ใช้ในการทดลองของเราได้รับการออกแบบให้ทับซ้อนบางส่วนกับไซต์การจับ Sp1 สองแห่งและการลดลงของเมทิลเลชันของ DNA ที่เราสังเกตเห็นหลังจากการบำบัดด้วย ALA สามารถตอบสนองต่อการจับ Sp1 ที่ปรับปรุงและการควบคุมการแสดงออกของ Col4a1 ที่เพิ่มขึ้น

การค้นพบของเราว่าการแสดงออกของ Col4a1 และสถานะของเมทิลเลชันมีแนวโน้มที่จะเกิดการกระทำของ ALA ในสัตว์ที่ไม่เป็นเบาหวานหลังการรักษาด้วย ALA 8 สัปดาห์ ยังชี้ให้เห็นถึงศักยภาพของ ALA ในการทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมอีพีจีเนติกอีกด้วย จากผลลัพธ์ของเรา ALA ได้แก้ไขเอ็นไซม์ Tet1 หลังจากการรักษา 8 สัปดาห์ ไปสู่การแสดงออกที่เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงความเป็นไปได้ที่ยีนจำเพาะของยีนอาจเกิดขึ้นโดยไม่มีผลสุทธิที่ตรวจพบได้ใน DNA methylation ทั่วทั้งจีโนม แม้ว่าจะมีความสัมพันธ์กันระหว่างการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ Col4a1 กับการลด methylation ของโปรโมเตอร์หลังจากการรักษาด้วย ALA 8 สัปดาห์ ยังคงเป็นเรื่องยากที่จะพิจารณาอย่างแจ่มแจ้งว่า DNA demethylation เป็นเพียงสาเหตุเดียวที่เชื่อมโยงระหว่างการรักษาด้วย ALA และการแสดงออกของยีนคอลลาเจนที่เพิ่มขึ้นทำให้ ที่ 4 สัปดาห์ การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ Col4a1 ไม่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในสถานะ methylation ความสามารถของ ALA ในการควบคุมยีนบางตัวใน epigenetically ได้รับการเสนอสำหรับยีน IL-1 และ IL-6 ที่มี mRNA และระดับโปรตีนที่มีการควบคุมต่ำสัมพันธ์กับการเกิด hypermethylation ของบริเวณโปรโมเตอร์ [51, 52] แม้ว่า hypermethylation จะถูกเสนอให้เป็นหนึ่งในกลไกของการกระทำของ ALA แต่เส้นทางโดยละเอียดของการควบคุม epigenetic ที่ขับเคลื่อนโดย ALA ยังไม่ได้รับการชี้แจงและรอการยืนยันสำหรับยีนอื่นเช่นกัน ดังนั้น ความเชื่อมโยงระหว่างการสังเคราะห์/การสะสมของคอลลาเจนที่เพิ่มขึ้นซึ่งอาจส่งผลให้เกิดฟีโนไทป์ทางพยาธิวิทยาและการดีเมทิลเลชันของ DNA ที่อาศัย Tet ของโปรโมเตอร์ Col4a1 ที่กระตุ้นโดยการรักษาด้วย ALA จำเป็นต้องมีการพิสูจน์เพิ่มเติมและควรเป็นเวทีสำหรับการศึกษาในอนาคต

5. สรุปผลการวิจัย

บทบาทในการป้องกัน ALA ต่อการทำงานผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานของอวัยวะต่างๆ รวมทั้งไต ส่วนใหญ่มาจากสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือด อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ที่นำเสนอในการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่า ALA อาจจำกัดการป้องกันไตในผู้ป่วยเบาหวานเนื่องจากการสังเคราะห์/การสะสมของคอลลาเจนในไตเพิ่มขึ้น จากการวิเคราะห์ประสิทธิภาพของ ALA ต่อกระบวนการโปรไฟโบรติกในไตของหนูที่เป็นเบาหวาน เราพบว่า ALA ไม่ได้ลดการสังเคราะห์คอลลาเจนหรือเครื่องหมายโปรไฟโบรติก นอกจากนี้ การรักษาด้วย ALA มีส่วนทำให้เกิดการเกิด profibrotic และการสังเคราะห์คอลลาเจนแม้ในไตของหนูที่ไม่เป็นเบาหวานซึ่งบางส่วนเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในสถานะ DNA methylation ของยีน Col4a1 ดังนั้น ในผู้ป่วยที่มีภาวะไตวาย จำเป็นต้องมีความระมัดระวังเกี่ยวกับการใช้ ALA เพื่อหลีกเลี่ยงการทำให้อาการแทรกซ้อนของไตรุนแรงขึ้น นอกจากนี้ ต้องใช้ความระมัดระวังเมื่อใช้ ALA เพื่อเพิ่มศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระในบุคคลที่มีสุขภาพดีหรือในการจัดการภาวะแทรกซ้อนจากเบาหวานอื่นๆ เนื่องจากผลที่เป็นประโยชน์สำหรับภาวะแทรกซ้อนหนึ่งอาจเป็นอันตรายต่ออีกรายหนึ่ง

1Department of Molecular Biology, Institute for Biological Research "Siniša Stanković, " National Institute of Republic of Serbia, University of Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 เบลเกรด, เซอร์เบีย

2ภาควิชาเซลล์วิทยา สถาบันวิจัยชีวภาพ "Siniša Stanković " สถาบันแห่งชาติเซอร์เบีย

University of Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 เบลเกรด, เซอร์เบีย

ควรส่งจดหมายโต้ตอบถึง Aleksandra Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

ได้รับ 4 พฤศจิกายน 2020; แก้ไข 19 กุมภาพันธ์ 2564; ยอมรับ 27 กุมภาพันธ์ 2021; เผยแพร่เมื่อ 12 มีนาคม 2021

บรรณาธิการวิชาการ: Alin Ciobica

ลิขสิทธิ์ © 2021 Nevena Grdović et al. นี่เป็นบทความที่เข้าถึงได้ซึ่งเผยแพร่ภายใต้ Creative Commons Attribution License ซึ่งอนุญาตให้ใช้ แจกจ่าย และทำซ้ำได้ไม่จำกัดในสื่อใดๆ หากมีการอ้างถึงงานต้นฉบับอย่างเหมาะสม

ความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูลที่เกี่ยวข้องทั้งหมดที่ใช้เพื่อสนับสนุนการค้นพบของการศึกษานี้รวมอยู่ในบทความ

ผลประโยชน์ทับซ้อน

ผู้เขียนขอประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์เกี่ยวกับการตีพิมพ์บทความนี้

ผลงานของผู้เขียน

แนวคิดและการออกแบบการทดลอง: MM, NG, AU; การจัดการและการรักษาสัตว์: MĐ, JAJ, AU, SD; ทำการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา การสร้างภูมิคุ้มกัน และการหาปริมาณของผลลัพธ์: JAJ, MĐ, ST ดำเนินการวิเคราะห์ Western blot: AU, SD, NG; ทำการทดลอง RTqPCR: JR, MĐ; ทำการทดลอง DNA methylation: JR, AT, MV; การวิเคราะห์ทางสถิติ: NG; การตีความข้อมูลและการจัดเตรียมตัวเลข: NG, MM; เขียนบทความ: NG, AU; การแก้ไขต้นฉบับที่สำคัญ: MV, SD ผู้เขียนทั้งหมดอนุมัติเวอร์ชันสุดท้ายสำหรับการตีพิมพ์

รับทราบ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยกระทรวงศึกษาธิการ วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีแห่งสาธารณรัฐเซอร์เบีย (Grant No. 451-03-9/2021-14/200007)

วัสดุเสริม

ตารางเสริม S1: ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ของ Col4a1 (สายโซ่คอลลาเจน IV alpha 1), Dnmt1 (DNA methyltransferase 1), Dnmt3a (DNA methyltransferase 3 alpha), Dnmt3b (DNA methyltransferase 3 beta), Tet1 (Tet methylcytosine dioxygenase 1) และการแสดงออกของยีน Actb (Actin, beta) ตารางเสริม S2: ลำดับของไพรเมอร์สำหรับการวิเคราะห์ MSP ของ DNA methylation ของภูมิภาคโปรโมเตอร์ของยีน Col4a1 รูปเสริม S1: ภาพตัวแทนของ immunoblotting ระดับโปรตีนของ TGF- 1 (A) และ SMA (B) โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืด 2 ชนิดในไตของ ALA ที่ได้รับการรักษาหรือไม่ได้รับการรักษา หนูควบคุมและหนูที่เป็นเบาหวาน 4 และ 8 สัปดาห์หลังจากการชักนำให้เกิดโรคเบาหวาน กำหนดโดย Western การวิเคราะห์รอยเปื้อน (วัสดุเสริม)

อ้างอิง

[1]RC Atkins "ระบาดวิทยาของโรคไตเรื้อรัง" Kidney International ภาคผนวก, ฉบับที่. 67, หน้า S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho และ B. Masala "กลยุทธ์ต้านอนุมูลอิสระในการจัดการโรคระบบประสาทเบาหวาน" BioMed Research International, vol. 2015, รหัสบทความ 515042, 15 หน้า, 2015.

[3]ม. Lv, Z. Chen, GY Hu และ QB Li "กลยุทธ์การรักษาของโรคไตจากเบาหวาน: ความคืบหน้าล่าสุดและมุมมองในอนาคต" Drug Discovery Today, vol. 20 ไม่ 3, หน้า 332–346, 2015.

[4]ก. Karihaloo, "การรักษาด้วยการต่อต้านพังผืดและโรคไตจากเบาหวาน" รายงานโรคเบาหวานในปัจจุบัน, ฉบับที่. 12 ไม่ 4, หน้า 414–422, 2012.

[5]ส. Yamagishi และ T. Matsui "ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายจากไกลเคชั่นขั้นสูง ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และโรคไตจากเบาหวาน" Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 3 ไม่ 2, หน้า 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal และ P. Boor "เมทริกซ์นอกเซลล์ในไต: แหล่งที่มาของ biomarkers ใหม่ที่ไม่รุกรานของภาวะไตวาย" Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7 ไม่ใช่ 1, น. 4, 2014.

[7]ส. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono,A. Casaretto และ FN Ziyadeh "บทบาทสำคัญของการเปลี่ยนแปลงระบบ growth factor-beta ในการเกิดโรคของโรคไตจากเบาหวาน" Renal Failure, vol. 23 หน้า 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu และ FN Ziyadeh "การกระตุ้นการถอดรหัสของปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง- 1ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ mesangial โดยความเข้มข้นของกลูโคสสูง" Kidney International, vol. 54 หมายเลข 4, หน้า 1107–1116, 1998.

[9]ม. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "ไคเนสที่เชื่อมโยงกับ Integrin ทำหน้าที่เป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโตที่ขึ้นกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์- 1 up-regulation" Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, หน้า 416–427, 2013.

[10]เค. Sharma และ TA McGowan, "TGF- ในโรคไตเบาหวาน: บทบาทของเส้นทางการส่งสัญญาณที่แปลกใหม่" Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11 ไม่ใช่ 1-2, หน้า 115–123, 2000.

[11]FJ Lopez-Hernandez และ JM Lopez-Novoa "บทบาทของ TGF- ในโรคไตเรื้อรัง: การบูรณาการของท่อ ไต และหลอดเลือด" การวิจัยเซลล์และเนื้อเยื่อ เล่ม 2 347 ไม่ใช่ 1, หน้า 141–154, 2555.

[12] PD Yurchenco และ JJ O'Rear "การประกอบแผ่นลามินาพื้นฐาน" ความคิดเห็นปัจจุบันในชีววิทยาเซลล์ vol. 6 ไม่ 5 หน้า 674–681, 1994

[13]ก. Nerlich และ E. Schleicher "การแปลอิมมูโนฮิสโตเคมีของส่วนประกอบเมทริกซ์นอกเซลล์ในรอยโรคไตเบาหวานของมนุษย์" The American Journal of Pathology, vol. 139 เลขที่ 4, หน้า 889–899, 1991.

[14]RM Mason และ NA Wahab, "เมทริกซ์เมทริกซ์ภายนอกเซลล์ในโรคไตจากเบาหวาน" Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, ไม่ 5, pp. 1358–1373, 2003.

[15]RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "การแสดงออกของการเปลี่ยนโกรทแฟคเตอร์-เบต้า 1 และคอลลาเจนชนิดที่ 4 ในไต tubulointerstitium ในผู้ป่วยเบาหวานทดลอง - ผลของการยับยั้ง ACE," Diabetes, vol. 47 หมายเลข 3, หน้า 414–422, 1998.

[16]MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, et al., "การสังเคราะห์คอลลาเจนชนิดที่ 3 และคอลลาเจนชนิดที่ IV โดยเซลล์เยื่อบุผิวท่อในโรคไตจากเบาหวาน" พยาธิวิทยา การวิจัยและการปฏิบัติ เล่ม 1 191 ไม่ใช่ 11 หน้า 1099–1104, 1995.

[17]JP Grande, DC Melder, DL Kluge และ ED Wieben "โครงสร้างของโปรโมเตอร์ IV คอลลาเจนของหนู" Biochimica et Bio- Physica Acta, vol. 1309 เลขที่ 1-2, หน้า 85–88, 1996.

[18]จ. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, et al., "การหยุดชะงักของไซต์ที่มีผลผูกพัน miR-29 ที่นำไปสู่การควบคุม COL4A1 ทำให้เกิด microangiopathy ที่โดดเด่นของ pontine autosomal ที่มี leukoencephalopathy" Annals of Neurology, vol. 80 ไม่ใช่ 5, หน้า 741– 753, 2016.

[19]ม. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk และ E. Dimitriadis, "miR-29c การแสดงออกที่มากเกินไปและการลด COL4A1 ในเยื่อบุโพรงมดลูกของมนุษย์ที่มีบุตรยากช่วยลดความสามารถในการยึดติดของเซลล์เยื่อบุเยื่อบุโพรงมดลูก _ในหลอดทดลอง_ โดยนัยถึงบทบาทในการเปิดรับ" รายงานทางวิทยาศาสตร์, ฉบับที่. 9 ไม่ใช่ 1, น. 8644, 2019.

[20]ก. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, et al., "การวิเคราะห์ทั้งจีโนมของ DNA methylation และรูปแบบการแสดงออกของยีนในเซลล์ตับของมนุษย์ที่บริสุทธิ์และไม่ได้รับการเพาะเลี้ยงและเซลล์ตับที่กระตุ้นการทำงาน" Oncotarget, vol. 6 ไม่ 29, หน้า 26729– 26745, 2015.