ATG16L-Dependent Autophagy ที่บกพร่องส่งเสริมการเกิดไฟโบรซิสของไตในความผิดปกติของไตเรื้อรังโดยการกระตุ้น EndMT โดยเส้นทางสัญญาณ NF-kB

Zeping Gui^1,2†, Chuanjian Suo^1†, Zijie Wang ^1†, หมิง เจิ้ง¹, ซวงเฟย¹, ห่าวเฉิน¹, หลี่ ซุน¹, Zhijian Han¹, จุน เทา¹, Xiaobin Ju¹, Haiwei Yang¹, มินกู^2*และลั่วหยุนถาน^1*

เรื้อรังไตความผิดปกติของการรับสินบน (CAD) เกิดจากหลายปัจจัย ได้แก่ glomerular sclerosis, inflamation, interstitial fibrosis และ tubular atrophy (IF/TA) อย่างไรก็ตาม องค์ประกอบที่โดดเด่นที่สุดของCADคือ IF/TA การศึกษาของเราได้ยืนยันว่าการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผนังหลอดเลือด (EndMT) เป็นแหล่งสำคัญของการปลูกถ่าย IF/TA ลักษณะของ EndMT คือการสูญเสียเครื่องหมายบุผนังหลอดเลือดและการได้มาซึ่งฟีโนไทป์ของเยื่อหุ้มสมองหรือไฟโบรบลาสติก Autophagy เป็นวิถีการย่อยสลายภายในเซลล์ซึ่งควบคุมโดยโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy และมีบทบาทสำคัญในสภาวะที่เกิดพังผืดหลายอย่าง อย่างไรก็ตาม ไม่ว่า autophagy จะทำให้เกิดพังผืดของ .หรือไม่ไตallograft และกลไกดังกล่าวเกิดขึ้นได้อย่างไรยังคงไม่ชัดเจน ยีนที่คล้ายกัน 16 แบบที่เกี่ยวข้องกับ autophagy (ATG16L) เป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ที่สำคัญ (ARG) ที่จำเป็นสำหรับการก่อรูปออโตฟาโกโซม ในที่นี้ อันดับแรก เราวิเคราะห์เนื้อเยื่อของผู้ป่วยที่ปลูกถ่ายไตจากชุดข้อมูล Gene Expression Omnibus (GEO) และผู้ป่วยที่ปลูกถ่ายไต 60 รายจากศูนย์ของเรา ผู้รับที่มีการทำงานของไตคงที่ถูกกำหนดให้เป็นCADกลุ่มและผู้ป่วยทั้งหมดในCADกลุ่มที่ได้รับการวินิจฉัยทางจุลพยาธิวิทยากับCAD. ผลการศึกษาพบว่า ATG16L ในฐานะ ARG ดิฟเฟอเรนเชียลที่มีนัยสำคัญอย่างหนึ่ง แสดงออกน้อยกว่าในCADกลุ่มเทียบกับกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD นอกจากนี้ เราพบว่ามีออโตฟาโกโซมและออโตไลโซโซมน้อยลงในไตที่ปลูกถ่ายของCADผู้ป่วยและการลดลงของ autophagy เป็นปัจจัยการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี ในหลอดทดลอง เราพบว่าการล้มลงของ ATG16L ได้ปรับปรุงกระบวนการของ EndMT ในมนุษย์ไตเซลล์บุผนังหลอดเลือดไต (HRGECs) ในร่างกาย การเปลี่ยนแปลงของ EndMT และ autophagic flux ถูกตรวจพบในหนูไตแบบจำลองการปลูกถ่ายของCAD. เราแสดงให้เห็นถึงการเกิดขึ้นของ EndMT และระบุว่า ATG16L จำนวนมากมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลง autophagic flux แบบไดนามิกตามระยะต่างๆ ของการปลูกถ่ายไต ในทางกลไก การล้มลงของ ATG16L โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์บุผนังหลอดเลือด ลดการสลายตัวของ NF-kB และขับไซโตไคน์ในเซลล์ที่ขับออกมา (IL-1b, IL-6 และ TNF-a) ซึ่งสามารถอำนวยความสะดวกให้ EndMT โดยสรุป ฟลักซ์ autophagic ที่ขึ้นกับ ATG16L ที่เกิดจากการปลูกถ่ายพบว่ามีการสูญเสียเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป

ไซโตไคน์ที่อักเสบจากกระบวนการนี้ส่งเสริม EndMT ซึ่งนำไปสู่ความก้าวหน้าของCAD. ATG16L ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบของ EndMT และการพัฒนาของไตกราฟต์ไฟโบรซิสและ autophagy สามารถสำรวจได้ว่าเป็นเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับความผิดปกติของการรับสินบนไตเรื้อรัง

คำสำคัญ:ความผิดปกติของการปลูกถ่ายไตเรื้อรัง, ไตพังผืดคั่นระหว่างหน้า, ATG16L, autophagy, EndMT, ไซโตไคน์อักเสบ

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

การแนะนำ

ไตการปลูกถ่ายเป็นหนึ่งในการรักษาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับผู้ป่วยที่มีภาวะปัสสาวะเล็ดเพราะช่วยปรับปรุงคุณภาพชีวิตของพวกเขาอย่างมีนัยสำคัญ (1) อย่างไรก็ตาม มีความผิดปกติของ allograft ของไตค่อนข้างสูงหลังการปลูกถ่ายเนื่องจากการเสื่อมถอยของการทำงานของไตเรื้อรังซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญที่ส่งผลต่อการอยู่รอดในระยะยาวของไตที่ปลูกถ่าย (2) ความผิดปกติของการปลูกถ่ายไตเรื้อรัง (CAD) เดิมเรียกว่าโรคไตเรื้อรัง allograft เป็นภาวะที่มีหลายปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืดคั่นระหว่างไตที่ก้าวหน้า ปัจจัยต่างๆ เป็นที่ทราบกันดีว่ามีส่วนทำให้สูญเสียการทำงานของ allograft ของไต ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง การปฏิเสธแบบเฉียบพลันและเรื้อรัง ภาวะขาดเลือดขาดเลือดและกระบวนการสร้างใหม่ของเนื้อเยื่อและ reperfusion และความเป็นพิษต่อไตที่เกี่ยวข้องกับยา (3)

CADมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยการอักเสบ, พังผืดคั่นระหว่างหน้าแบบก้าวหน้าและการฝ่อของท่อ (IF/TA) และเส้นโลหิตตีบ (4) ในหมู่พวกเขา IF/TA เป็นปัจจัยสำคัญที่กำหนดฟังก์ชัน allograft ของไต แต่ยังไม่ทราบกลไกที่เกิดขึ้น มีการระบุปัจจัยหลายประการที่ส่งผลต่อสัดส่วนที่สูงของการสูญเสีย allograft ของไต ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เรายังยืนยันด้วยว่ากระบวนการทางพยาธิวิทยาหลักของ CAD คือ IF/TA allograft ของไต ซึ่งมีลักษณะเฉพาะจากการสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์มากเกินไปในเนื้อเยื่อไตที่ปลูกถ่ายและคั่นระหว่างหน้า (5) จากการศึกษาพบว่าคอลลาเจนส่วนใหญ่หลั่งออกมาจากไมโอไฟโบรบลาสต์ และการหลั่งคอลลาเจนทำให้เกิดการตกตะกอนของเมทริกซ์นอกเซลล์ และต่อมาปลูกถ่าย IF/TA ของไต มีสี่เซลล์หลักที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของไมโอไฟโบรบลาสต์: เซลล์เยื่อบุผิว เซลล์บุผนังหลอดเลือด ไฟโบรบลาสต์ที่ได้จากไขกระดูก และเยื่อหุ้มหลอดเลือดขนาดเล็ก (6, 7) พวกเขามีบทบาทสำคัญในการซ่อมแซมและปกป้องความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อไต ในหมู่พวกเขา สิ่งเร้าภายนอกทำให้เกิดความแตกต่างของเซลล์ไตภายในเช่นเซลล์เยื่อบุผิวไปยัง myofibroblasts ซึ่งสามารถผลิตเมทริกซ์นอกเซลล์ กระบวนการนี้เรียกว่าการเปลี่ยนเยื่อบุผิวเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ (EMT) EMT มักเกี่ยวข้องกับสามประเภท: (I) การสร้างตัวอ่อน (II) การซ่อมแซมเนื้อเยื่อและการพังผืด (III) การแพร่กระจาย (8) มีการศึกษาหลายชิ้นเพื่ออธิบายกลไกระดับโมเลกุลและเซลล์ของ EMT ประเภท II ในพังผืดของอวัยวะ (9, 10) อย่างไรก็ตาม บทบาทของ EMT ในกระบวนการสร้างไฟโบรบลาสต์หลักที่แตกต่างกันระหว่างความก้าวหน้าของ CAD ยังคงไม่สามารถสรุปได้

ด้วยการปลูกถ่ายไต มีโอกาสมากขึ้นที่จะสร้างความเสียหายให้กับแมโคร allograft และ microvasculature เนื่องจากตำแหน่งทางกายภาพของ endothelium allograft ที่ทำให้เป็นเป้าหมายเริ่มต้นสำหรับการบาดเจ็บ allograft (11) Allografts ทำหน้าที่เป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยอาศัยไซโตไคน์ในซีรัมในซีรัมค่อนข้างมาก จากการศึกษาพบว่า cytokines ที่ทำลายเซลล์หลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับCADกระบวนการ (12) และเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่บริเวณที่มีการปลูกถ่ายอัลโลกราฟของไตไม่เพียงแต่มีส่วนร่วมในการทำลายล้างเท่านั้น แต่ยังเป็นตัวควบคุมการทำลายล้าง (11) งานวิจัยก่อนหน้านี้ของเราเปิดเผยว่า TNF‐a แสดงออกได้ชัดเจนกว่าในCADกลุ่มมากกว่ากลุ่มที่ไม่ใช่ CAD TNF-a ยังช่วยอำนวยความสะดวกในกระบวนการ EMT ในเซลล์ท่อใกล้เคียงของมนุษย์ (HK2) (13) ด้วยการสัมผัสกันอย่างใกล้ชิดระหว่างเซลล์บุผนังหลอดเลือดและเลือด การหมุนเวียนเซลล์ inflammatory และ cytokines จะโจมตี endothelium allograft ก่อน การกระตุ้นเรื้อรังจากการอักเสบของไซโตไคน์นำไปสู่เซลล์บุผนังหลอดเลือดซึ่งมีความผิดปกติของโครงสร้างเซลล์และสภาพแวดล้อมภายใน ซึ่งส่งผลให้เกิดการบาดเจ็บที่บุผนังหลอดเลือด การศึกษาที่เกิดขึ้นใหม่ชี้ให้เห็นว่าการบาดเจ็บที่บุผนังหลอดเลือดมีส่วนทำให้เกิดการสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์และมีบทบาทสำคัญในโรคพังผืดของอวัยวะ เมื่อเร็ว ๆ นี้ Endothelial-to-mesenchymal Transition (EndMT) ถือเป็นสาเหตุหลักของการบาดเจ็บที่บุผนังหลอดเลือดและส่งเสริมความก้าวหน้าของ IF/TA ระหว่างโรคพังผืดของไต (5, 9) EndMT เป็นประเภท EMT ที่โดดเด่น มีลักษณะเฉพาะโดยเซลล์ที่ค่อยๆ สูญเสียเครื่องหมายของเยื่อบุผนังหลอดเลือด เช่น CD31 และ CD34 และได้รับฟีโนไทป์ของเยื่อหุ้มเซลล์หรือไมโอไฟโบรบลาสติก เช่น แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบ (a-SMA) คอลลาเจน I และไฟโบรเนกติน (FN) กลไกการกำกับดูแลสำหรับ EndMT ยังคงเป็นปัญหาที่ซับซ้อน การเกิดขึ้นของ EndMT อาจได้รับผลกระทบจากปัจจัยหลายอย่าง เช่น ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การขาดออกซิเจน และการบาดเจ็บต่างๆ (14, 15) แต่ในที่สุดปัจจัยด้านกฎระเบียบเหล่านี้เกือบทั้งหมดมารวมกันในการดำเนินการโดยตรงเพียงครั้งเดียว ซึ่งก็คือไซโตไคน์ที่ทำลายล้าง ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เราแสดงให้เห็นว่า EndMT เป็นปัจจัยสำคัญในการทำให้เกิดโรคของ IF/TA และ CAD ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ TGF-b/Smad (5) นอกจากนี้ นักวิชาการคนอื่นๆ ยังแนะนำว่าการแสดงออกของ TGF-b ได้รับการควบคุมโดย TNF‐a (16) ดังนั้น ไซโตไคน์ในช่องปากเช่น TNF-a อาจเป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดโรคที่สำคัญในการบาดเจ็บที่บุผนังหลอดเลือดที่บุผนังหลอดเลือดซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของการลุกลามของ CAD แม้ว่าปัจจัยเริ่มต้นของ EndMT จะแตกต่างกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคต่างๆ แต่ผลลัพธ์สุดท้ายก็เหมือนกัน ดังนั้นจึงเพียงพอแล้วที่จะตั้งสมมติฐานว่าจะต้องมีกลไกควบคุมส่วนกลางในการผลิตไซโตไคน์ที่แทรกซึมและความก้าวหน้าของ EndMT

Autophagy เป็นวิถีของเซลล์ที่รับผิดชอบในการย่อยสลายโปรตีนและออร์แกเนลล์ (17) กระบวนการ autophagy เรียกอีกอย่างว่า autophagic flux และความแข็งแรงของกระบวนการนี้มักแสดงถึงระดับของการกระตุ้น autophagy Autophagy เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางพยาธิสรีรวิทยาของไตที่แตกต่างกันรวมถึง glomerulosclerosis, โรคไตจากเบาหวานและโรคไตเรื้อรัง (18) การศึกษาบางชิ้นรายงานว่า autophagy เป็นกระบวนการป้องกันเซลล์ การป้องกันแบบคลาสสิกสำหรับสมมติฐานนี้เป็นไปตามที่เห็นในหนูที่มีการลบ ATG5 ท่อใกล้เคียงซึ่งการลบนี้ส่งเสริมการเกิดพังผืดของไตที่รุนแรงมากขึ้นเนื่องจาก autophagy บกพร่อง (19) การศึกษาอื่น ๆ ยังพบว่าเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงแบบมีเงื่อนไข ATG5 ทำให้อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันรุนแรงขึ้นในระยะแรก แต่ชะลอการลุกลามของพังผืดในไตในกระบวนการฟื้นฟูหรือซ่อมแซม (20) อย่างไรก็ตาม ปฏิสัมพันธ์เฉพาะระหว่าง autophagy และ EMT หรือ EndMT กับโรค fibrosis ยังคงเป็นที่ถกเถียงกันอยู่ การศึกษาหลายชิ้นชี้ให้เห็นว่าการยับยั้ง autophagy สามารถกระตุ้น EMT และการเกิดพังผืดโดยส่งผลต่อ crosstalk ของเยื่อบุผิวที่ผิดปรกติในการเกิดพังผืดในปอดที่ไม่ทราบสาเหตุ (21) คนอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่า Rapamycin ส่งเสริม EndMT ผ่านการกระตุ้น autophagy ในช่วงชราภาพก่อนวัยอันควร (22) ยีน ATG16L ส่วนใหญ่ประกอบด้วย ATG16L1 และ ATG16L2 ATG16L2 homo- และ hetero-oligomerizes ด้วย ATG16L1 แต่ ATG16L2 มีความเกี่ยวข้องกับ autophagy น้อยกว่า (23) ATG16L1 ถูกกำหนดให้เป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ที่สำคัญ ส่งเสริมการสร้าง autophagosome ที่พลาสมาเมมเบรน และมีบทบาทสำคัญในรูปแบบ lipidated ของ LC3 (23) ในที่นี้ ATG16L1 เรียกรวมกันว่า ATG16L ในฐานะที่เป็นปัจจัยสำคัญใน autophagy ครั้งหนึ่ง ATG16L เคยมีรายงานว่าเกี่ยวข้องกับการก่อโรคของโรคติดเชื้อต่างๆ ตัวอย่างเช่น การกลายพันธุ์ของ ATG16L ทำให้เกิดความโน้มเอียงอย่างมากต่อการพัฒนาโรคของโครห์น (24) อย่างไรก็ตาม กลไกการทำงานของ ATG16L และ autophagy ยังไม่ได้รับการศึกษาอย่างดีในแนวทางที่เป็นเป้าหมาย เช่น ในการจัดการและการพยากรณ์การปลูกถ่ายไต ดังนั้นบทบาทแบบไดนามิกของ autophagic flux และ autophagy ที่ขึ้นกับ ATG16L จึงต้องเป็นจุดสนใจของการวิจัยสำหรับการรักษาที่มีศักยภาพในการลุกลามของ CAD

ในการศึกษานี้ เราสำรวจบทบาทที่เป็นไปได้ของ autophagy ที่ขึ้นกับ ATG16L ในการลุกลามของ CAD เราเปิดเผยว่าการสูญเสีย ATG16L และ autophagy เกี่ยวข้องกับการเกิด EndMT ในผู้ป่วย CAD ทางคลินิกและหนูที่ได้รับการปลูกถ่ายไต จากนั้นเราพบว่าระดับของ EndMT และการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าของไตได้รับการปรับปรุงหลังจากเปลี่ยนแปลงกิจกรรม autophagy โดยการทำให้ยีน ATG16L ล้มลง นอกจากนี้ กลไกพื้นฐานที่เป็นไปได้ยังถูกสำรวจโดยการจัดลำดับ RNA เราพบว่าการด้อยค่าของ ATG16L มีส่วนทำให้เกิดการกระตุ้นวิถีของนิวเคลียส-kB (NF-kB) และการหลั่งไซโตไคน์ในเซลล์ประสาท จากนั้นจึงส่งเสริมความก้าวหน้าของ EndMT

วัสดุและวิธีการ

คำชี้แจงจริยธรรม

ระเบียบการของการศึกษาสอดคล้องกับปฏิญญาเฮลซิงกิและอิสตันบูล การศึกษาของมนุษย์ได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่นของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง (ID: IACUC-2010020) ได้รับความยินยอมจากผู้รับการปลูกถ่ายทั้งหมดรวมทั้งผู้ป่วยที่ตัดไตที่รวมอยู่ในการวิจัยนี้

การศึกษาเกี่ยวกับหนูได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่นของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง (ID: IACUC-2010020) เจ้าของจะได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรสำหรับการมีส่วนร่วมของสัตว์ในการวิจัยนี้

การเก็บตัวอย่าง

Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5 ซม.) ในผู้ป่วยที่ได้รับการผ่าตัดไตวายเรื้อรัง เก็บตัวอย่างเลือดหลังจากที่ผู้ป่วยได้รับความยินยอม ขั้นตอนเฉพาะสามารถอ้างถึงในการศึกษาก่อนหน้าของเรา (5) ลักษณะพื้นฐานของผู้ป่วยในกลุ่ม CAD และกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD แสดงไว้ในตารางที่ 1

โมเดลหนูและสัตว์

หนูที่โตเต็มวัย F344 และหนูลูอิส (น้ำหนัก 250 ± 10.3 กรัม) ได้มาจากห้องปฏิบัติการ Charles River (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และปฏิบัติตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันที่มหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง สัตว์เหล่านี้ได้รับการจัดการตามบรรทัดฐานของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิงและแนวทางที่เผยแพร่โดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา

สัตว์เหล่านี้ทั้งหมดได้รับการปลูกถ่ายไตทางออร์โธปิกซ้าย หนูลูอิสถูกใช้เป็นผู้รับและผู้บริจาคซินเจนีก (กลุ่มซิน) หนู F344 เป็นผู้บริจาคอัลโลเจเนอิก (กลุ่มอัลโล) ไตขวาถูกตัดออกพร้อมกัน เวลาเฉลี่ยของการขาดเลือดขาดเลือดเย็นน้อยกว่า 20 นาทีและขาดเลือดขาดเลือดที่อบอุ่นน้อยกว่า 35 นาที Cyclosporine A (5 มก./กก., QD, IP; Neoral, Novartis, Switzerland) ใช้เป็นเวลา 14 วันเพื่อหลีกเลี่ยงการปฏิเสธเฉียบพลัน

การบำบัดทางเภสัชกรรมและการเก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อ

ไตที่ปลูกถ่ายจากหนูถูกเก็บเกี่ยวในสัปดาห์ที่ 4, 8, 12 และ 16 หลังการผ่าตัด ตัวอย่างเนื้อเยื่อไตที่ปลูกถ่ายด้วยฟอร์มาลินที่ฝังด้วยพาราฟิน (10 เปอร์เซ็นต์เป็นกลางฟอร์มาลิน) ได้มาสำหรับการย้อมเนื้อเยื่อและ IHC/IF ไตที่เหลือถูกเก็บไว้ในตู้เย็น − 80 องศาเพื่อตรวจหา RNA และโปรตีน

HE และ Masson Trichrome Staining Assay

โปรโตคอลของการทดสอบการย้อมสี HE และ Masson trichrome สามารถอ้างถึงในการศึกษาก่อนหน้าของเรา (5) เพื่อระบุความรุนแรงของ CAD และขอบเขตของพื้นที่ไฟโบรติก พื้นที่การเกิดพังผืดของไตจะถูกหาปริมาณด้วยการย้อมสี Masson trichrome สำหรับแต่ละสไลซ์ จะมีการเลือกช่องการมองเห็นแบบสุ่มห้าช่องภายใต้กล้องจุลทรรศน์× 400 ตัว พื้นที่ที่เป็นบวกสำหรับ Masson trichrome วัดโดยนักพยาธิวิทยาสองคนที่มองไม่เห็นการออกแบบทดลองโดยใช้ Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD)

การทดสอบการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี

เนื้อเยื่อไตที่ยึดฟอร์มาลินถูกตัดเป็นพาราฟินหนา 3 มม. กระบวนการ deparaffinized ให้ความชุ่มชื้น และดึงแอนติเจนนั้นสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้าของเรา (5) แอนติบอดี [anti‐ATG16L (1:100; Abcam, USA), anti‐a‐ SMA (1:200; Abcam, USA), anti‐Fibronectin (1:100; Abcam, USA) และ แอนติ‐CD31 (1:100; CST, สหรัฐอเมริกา)] ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาหลังจากส่วนที่ถูกบล็อกด้วยซีรัมลาปกติ 10 เปอร์เซ็นต์ ขั้นตอนถัดไปยังดำเนินการตามที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้ด้วย IgG ต่อต้านเมาส์/กระต่ายของแพะ biotinylated (0.5 มก./มล.;

Abcam) และซับสเตรต 3-อะมิโน-9-เอทิล คาร์บาโซลหรือ 3,3′

ไดอะมิโนเบนซิดีน (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ภาพนิ่งที่เปื้อนถูกถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse 80i ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล (DS-Ri1, Nikon, เซี่ยงไฮ้, จีน)

การทดสอบการย้อมสีภูมิคุ้มกันทางอ้อม

หลังจากแก้ไขด้วยสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ ส่วน allograft ของไตและชิ้นการปีนเซลล์ถูกเจาะด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นบล็อกด้วยเซรั่มแพะ 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น ชิ้นส่วนและชิ้นไต่เซลล์ถูกบ่มด้วยสารต้าน NF-kB p65 (1:200; Abcam สหรัฐอเมริกา) ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน สภาวะการฟักตัวของแอนติบอดีทุติยภูมิ Dapi สามารถอ้างอิงถึงการศึกษาก่อนหน้าของเรา (5) ดูภาพสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, เซี่ยงไฮ้, จีน)

การตรวจจับฟลักซ์อัตโนมัติ

AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Shanghai, China) ถูกฉีดเข้าไปในไตด้านซ้ายของหนู Lewis (3 มล.) 14 วันก่อนการปลูกถ่าย ไตถูกเอาออกเมื่อ 4, 8, 12, 16 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย และแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ดูภาพสไลด์ (30 มม.) ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบเรืองแสงของ Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, เซี่ยงไฮ้, จีน) จุดสีเหลืองหมายถึงออโตฟาโกโซมและจุดสีแดงแสดงถึงออโตไลโซโซม เมื่อสัญญาณสีแดงแรงกว่าสัญญาณสีเหลืองแสดงว่า autophagic flux ถูกเปิดใช้งาน เมื่อสัญญาณสีเหลืองมากกว่าสัญญาณสีแดงแสดงว่า autophagic flux บกพร่อง

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ตัวอย่างถูกตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์ที่เย็นจัด (3 เปอร์เซ็นต์ใน 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.4) และดำเนินการต่อไปโดย Core Facility (บริการ, หวู่ฮั่น, จีน) ทำการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEOL JEM-2100

การตรวจจับการทำงานของไต

เราใช้ QuantiChrom Creatinine Assay Kit ของหนูและ QuantiChrom Urea Assay Kit (เจี้ยนเฉิง ปักกิ่ง ประเทศจีน) เพื่อตรวจหาความเข้มข้นของครีเอตินินในเลือดของหนูและยูเรียไนโตรเจนตามคำแนะนำของผู้ผลิต

การตรวจจับโปรตีน Uria

ตัวอย่างปัสสาวะ 24 ชั่วโมงถูกเก็บโดยใช้กรงเมตาบอลิซึม และการทดสอบการขับโปรตีนในปัสสาวะด้วยชุดเครื่องมือทางการค้า (Mlbio, Shanghai, China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

การประเมิน PCR แบบเรียลไทม์

Briefly RNA ทั้งหมดถูกทำให้บริสุทธิ์จาก HRGEC โดยใช้ชุดแยก RNA (TIANGEN, Beijing, China) cDNA (cDNA) ถูกสังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (5) การแสดงออกของยีนถูกวัดโดยการทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์ (Vazyme) และระบบ DNA Engine Opticon 2 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) ลำดับไพรเมอร์ถูกอธิบายไว้ดังนี้:

IL-1 b: 5′- TTCCTGTTGTCTACACCAATGC-3′ (F) 5′-CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA-3′ (R);

IL-6: 5′-TCTCTCCGCAAGAGACTTCCA-3′ (F)

5′- ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG-3′ (R);

TNF-a: 5′- CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′ (F) 5′- GAGGACCTGGGAGTAGATGAG -3′ (R);

แอคติน: 5′- TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′ (F) 5′- CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′ (R);

Western Blot และ Elisa Assay

Briefly โปรตีนจากเซลล์และเนื้อเยื่อถูกสกัดในบัฟเฟอร์ RIPA (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, USA) ที่มีสารฟอสฟาเตสและสารยับยั้งโปรตีเอส (Sigma, St Louis, MO, USA) โปรตีน (20 มก.) ถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, USA) ตาม SDS-PAGE สไลด์ถูกบ่มในสารละลายบล็อค (นมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์) เป็นเวลา 60 นาที จากนั้นเมมเบรน PVDF ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิโดยไม่ต้องล้างในห้องเย็นข้ามคืน หลังจากนั้น กระบวนการล้างเมมเบรน PVDF โดยบัฟเฟอร์ทริสบัฟเฟอร์ saline-tween (TBST) ที่บ่มโดยแอนติบอดีทุติยภูมิ การจัดตาราง ECL และการสัมผัสนั้นสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา (5) แอนติบอดีปฐมภูมิมีการระบุไว้ดังนี้: แอนติ-GAPDH (1:1000; CST, USA), แอนติ-CD31 (1:1000; CST, สหรัฐอเมริกา), แอนติ-a-SMA (1:1000;

Abcam, USA), สารต้านไฟโบรเนกติน (1:1000; BD Biosciences, USA),

ต้าน LC3 (1:1000; CST, USA), ต้าน ATG16L (1:1000; CST, USA),

anti-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA), anti‐ Phospho-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA) การหาปริมาณทำได้โดยการวัดความเข้มของสัญญาณโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ NIH ตรวจพบ MAP1LC3 โดยใช้ชุดอุปกรณ์ ELISA (ml000829, Mlbio, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

การเพาะเลี้ยงเซลล์ การรักษา และการเปลี่ยนถ่าย shRNA

เซลล์บุผนังหลอดเลือดในไตของมนุษย์ (HRGECs) ได้รับการเพาะเลี้ยงในตัวกลางของเซลล์บุผนังหลอดเลือด (ECM, ScienCell Research Laboratories Carlsbad, CA, USA) ที่มีซีรั่มวัวในครรภ์ 5 เปอร์เซ็นต์ การตั้งค่าอุปกรณ์ CO2 Incubator Culture HRGECs ในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศา เซลล์บุผนังหลอดเลือดถูกรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัมในชั่วข้ามคืน และจากนั้นบำบัดด้วย IL-1b, IL-6 และ TNF‐a เป็นเวลาหลายชั่วโมงหรือความเข้มข้นต่างกัน

HRGECs ที่เสถียร ATG16L-knockdown และ ATG16L- overexpression ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ lentivirus (Jikai, Shanghai, China) HRGEC ถูกทรานส์เฟกครั้งแรกด้วยไลโปเฟคตามีน 2000 จากนั้นทรานส์เฟกด้วยไวรัส ATG16L shRNA 1.5 มล. หรือ 2.0 มล. ATG16L ที่แสดงออกถึงไวรัสมากเกินไปตามโปรโตคอลของผู้ผลิต จากนั้นเซลล์บุผนังหลอดเลือดถูกเปลี่ยนเป็น ECM ที่มีพอลิเบรน 2.0 มล. และบ่มเป็นเวลาเพิ่มเติม 6 ชั่วโมง เราตรวจพบอัตราการติดไวรัสด้วยกล้องจุลทรรศน์ fluorescence ของ Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China) Puromycin (2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร; Gibco, Thermo Fisher Scientific) ถูกใช้เพื่อเลือกเซลล์ที่ติดไวรัสที่เสถียร หลังจากนั้น รวบรวม HRGEC สำหรับการทดลองเพิ่มเติม

การวิเคราะห์ทางสถิติ

GraphPad Prism 50 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (ค่าเฉลี่ย ± SD) จากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง เปรียบเทียบระหว่างและภายในหลายกลุ่มโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบ Student-Newman-Keuls ค่า P ของ<0.05 were="" considered="">

ผลลัพธ์

การเปลี่ยนแปลงของจุลสัณฐานวิทยาและพยาธิวิทยาในเนื้อเยื่อไตจากผู้ป่วยที่ไม่ใช่ CAD และ CAD

ในการศึกษานี้ การตรวจชิ้นเนื้อด้วย hematoxylin-eosin (HE) และการย้อมสีไตรโครมของ Masson พบว่า IF/TA allograft ไตที่มีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อของผู้ป่วย CAD (n=4) เมื่อเทียบกับผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไตที่มีการทำงานของไตที่เสถียรจากศูนย์ของเรา ( กลุ่มที่ไม่ใช่ CAD, n=4) (รูปที่ 1A, B) การรวบรวมตัวอย่างวัสดุและวิธีการ และตารางที่ 1 อธิบายข้อมูลการจัดกลุ่มโดยละเอียดสำหรับคุณสมบัติดั้งเดิม การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) ของตัวอย่างชิ้นเนื้อไตของมนุษย์แสดงให้เห็นการแสดงออกที่สูงกว่าของ a-SMA และไฟโบรเนกติน (FN) และการแสดงออกของ CD31 ในกลุ่ม CAD ที่น้อยลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 1C–H) CD31 เป็นโปรตีนมาร์กเกอร์ของเซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์บุผนังหลอดเลือดสูญเสียคุณสมบัติของ CD31 แต่ได้มาซึ่งคุณสมบัติมีเซนไคม์ เช่น a-SMA, FN เมื่อ EndMT เกิดขึ้น ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่านิพจน์ของเครื่องหมาย EndMT ในกลุ่ม CAD สูงกว่าอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD

ATG16L สูงขึ้นหลังการปลูกถ่ายไต แต่ ATG16L ลดลงในผู้ป่วย CAD เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยที่ไม่ใช่ CAD

ดาวน์โหลด RNA-seq และข้อมูลทางคลินิกจากตัวอย่าง CAD 25 ตัวอย่างและตัวอย่างเนื้อเยื่อไตของผู้ป่วยที่ไม่ใช่ CAD 21 ตัวอย่างดาวน์โหลดจาก GSE9493 ข้อมูลของผู้ป่วยในฐานข้อมูลได้รับการลงทะเบียนที่สถาบัน Novartis Institutes for BioMedical Research ประเทศสวิสเซอร์แลนด์ และได้รับการประมวลผลทางจุลพยาธิวิทยา การวินิจฉัยทางเนื้อเยื่อวิทยาและการจำแนกชิ้นเนื้อตามเกณฑ์ของ Banff '05 ข้อมูลทางประชากรศาสตร์และทางคลินิกมีอยู่ในฐานข้อมูล GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493) แผนผังไดอะแกรมของ flow ของการวิเคราะห์ดังแสดงในรูปที่ 2A มีการสกัดยีนที่แตกต่างกัน 1463 ยีนด้วยค่า P-value<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >7 ถูกเลือก มี 14 ARGs ที่รวมอยู่ใน ARG ของผู้ป่วย CAD และ non-CAD ในหมู่พวกเขา เราพบว่า ATG16L ซึ่งมียีนคะแนนความเกี่ยวข้องสูงสุดถูกปรับลดการควบคุมในตัวอย่าง CAD (รูปที่ 2C)

เพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบของแบทช์และความแตกต่างของประชากร เราได้ทำการทดลองหลายครั้งโดยใช้ตัวอย่างของมนุษย์จากศูนย์ของเราเพื่อยืนยันผลฐานข้อมูลสาธารณะ ในชุดแรก เราย้อมส่วนของตัวอย่างไตปกติที่ไม่ใช่ CAD และ CAD ด้วยแอนติบอดีต้าน ATG16L และแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ ATG16L ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วย CAD เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD (รูปที่ 2E) . ได้ข้อสรุปเดียวกันโดยการทดสอบ western blot (WB) การเพิ่มขึ้นของ FN แสดงถึงระดับการเกิดพังผืดที่รุนแรงขึ้นของการปลูกถ่ายไตและหนึ่งในตัวชี้วัดของ CAD แนวโน้ม WB ของ ATG16L สอดคล้องกับผลลัพธ์ของการตรวจสอบรอยเปื้อน IHC ของเราและสอดคล้องกับผลลัพธ์ใน GEO (รูปที่ 2D) สิ่งเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่านิพจน์ ATG16L ลดลงด้วยความก้าวหน้าของ CAD เมื่อทำการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน เราพบว่า ATG16L มีความสัมพันธ์เชิงลบอย่างมากในรูปแบบการแสดงออกของโปรตีน a‐SMA, FN และความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของ CD31 'r' แทนค่าสหสัมพันธ์แบบเพียร์สัน และค่า P แสดงถึงความสำคัญของสหสัมพันธ์ (รูปที่ 2F–I)

Autophagy ลดลงในผู้ป่วย CAD และการลดระดับของ MAP1LC3 ที่คาดการณ์การพยากรณ์โรคที่ไม่ดีในผู้ป่วย CAD

ในการทดลองก่อนหน้านี้ ARG จำนวนหนึ่งที่ควบคุม autophagy ถูกระบุจากฐานข้อมูล GEO ในหมู่พวกเขา ATG16L มีส่วนร่วมในขั้นตอนแรกของ autophagy เราคาดการณ์เกี่ยวกับความเป็นไปได้ที่ autophagy อาจเกี่ยวข้องกับ CAD เพื่อตรวจสอบระดับ autophagy ในเนื้อเยื่อ allograft ของไตของมนุษย์ เราพบ autophagic vacuoles น้อยลงในกลุ่ม CAD ผ่านกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD (รูปที่ 3A, B) นอกจาก TEM มาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจสอบ autophagy แล้ว ระดับ SQSTM1 ที่ลดลงและการแสดงออกของ LC3-II ที่เพิ่มขึ้นยังส่งผลต่อการเพิ่มขึ้นของ autophagy แนวโน้มที่คล้ายกันของระดับการแสดงออกของโปรตีนของ LC3-I (ที่ไม่ใช่ไขมันของ LC3), LC3-II (ลิพิเดชันของ LC3) และ SQSTM1 ในกลุ่ม CAD ถูกตรวจสอบโดยการสอบวิเคราะห์ WB ตามที่แสดงไว้ในรูป 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) เป็นรีเซพเตอร์ autophagy แบบเลือกเฟ้นและเสื่อมโทรมโดย autophagy ออโตฟาโกโซมเกี่ยวข้องกับลิพิเดชันของรูปแบบไซโตซอลลิกของ LC3 และการก่อรูปของ LC3-II ดังนั้น ผลลัพธ์ WB ยังชี้ให้เห็นว่า autophagy เกิดขึ้น

การศึกษาบางชิ้นแสดงให้เห็นว่ามีความแตกต่างของ ARGs ในซีรัมของผู้ป่วยที่ปลูกถ่ายไต ระดับ LC3 ในซีรัมอาจเป็นตัวบ่งชี้การพยากรณ์โรคที่สัมพันธ์กับความรุนแรงของโรค (25, 26) เพื่อสำรวจบทบาทของ autophagy ในขบวน CAD เพิ่มเติม เราได้ตรวจสอบความเข้มข้น LC3 ในซีรัมของผู้ป่วยที่ไม่ใช่ CAD 30 รายและผู้ป่วย CAD 30 รายโดยการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) ข้อมูลทางประชากรศาสตร์ที่นำเสนอคุณสมบัติพื้นฐานของผู้ป่วยอยู่ในตารางที่ 1 การกระจายของหมายเลขกรณี เพศของผู้ป่วย อายุของผู้ป่วย แอนติบอดีที่ตอบสนองต่อแผง (PRA) สูตรภูมิคุ้มกัน การทำงานของไตของกลุ่มที่ไม่ใช่ CAD และ CAD เป็นไปตามที่แสดง ในตารางที่ 1 เพศ อายุ และ PRA ไม่มีความแตกต่างที่สำคัญ ครีเอตินีนในเลือดและยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างทั้งสองกลุ่ม จากนั้น เราพยายามหาค่าพยากรณ์ของ autophagy ในผู้ป่วย CAD จากผลการทดสอบ ELISA ในซีรัม เราพบว่าการแสดงออกของ LC3 ต่ำกว่าในกลุ่ม CAD นอกจากนี้ยังมี CAD แบบก้าวหน้าและการลดลงพร้อมกันในระดับ LC3 (รูปที่ 3E) นอกจากนี้ เราแบ่ง LC3 ออกเป็นกลุ่มที่มีการแสดงออกสูงและต่ำโดยอิงตามค่ามัธยฐาน การวิเคราะห์การรอดชีวิต ผลลัพธ์ที่เปิดเผยว่ากลุ่มการแสดงออกที่ต่ำของ LC3 มีเวลาในการทำงานผิดปกติของ allograft ที่สั้นกว่า (รูปที่ 3F) โดยรวมแล้ว เราคาดการณ์ว่าความบกพร่องของ autophagy มีความเกี่ยวข้องอย่างมีนัยสำคัญกับความก้าวหน้าของ CAD

การปรับลด ATG16L ลด Autophagy และส่งเสริมความก้าวหน้าของ EndMT

เพื่อตรวจสอบว่า ATG16L เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของ autophagy หรือไม่ เราได้ทำการทรานส์เฟก HRGEC ด้วย RNA กิ๊บสั้น ATG16L (shRNA) TEM ถูกใช้เพื่อแสดงการก่อตัวของ autophagic vacuoles โดยตรง และเราพบว่ามี autophagic vacuoles น้อยกว่าในเซลล์ที่ทรานส์เฟก ATG16L shRNA เมื่อเทียบกับที่ทรานส์เฟกด้วย scramble shNC (รูปที่ 4A, B) ทั้งการแสดงออกของโปรตีน ATG16L และการออกฤทธิ์ของ autophagy ยังถูกปรับลดลงในการทำให้กลุ่ม ATG16L ล้มลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม shNC (รูปที่ 4C)

จากนั้นจึงตรวจสอบบทบาทของ autophagy ที่ขึ้นกับ ATG16L ในความก้าวหน้าของ EndMT HRGEC ถูกทรานส์เฟกด้วย ATG16L shRNA หรือ shNC รูปที่ 4D แสดงให้เห็นว่าการทรานส์เฟกชัน ATG16L shRNA สามารถอำนวยความสะดวกในการแสดงออกของ FN และ a-SMA ได้อย่างชัดเจน และลดการแสดงออกของ CD31 เมื่อเปรียบเทียบกับ HRGEC ที่ทรานส์เฟกด้วย shNC แบบแย่งชิง ในทางตรงกันข้าม เมื่อ ATG16L แสดงออกมากเกินไปใน HRGEC ความก้าวหน้าของ EndMT ไม่ได้ส่งเสริมอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4E) ผลการย้อมสี IHC ยังยืนยันแนวโน้ม WB สำหรับนิพจน์ CD31 และ a-SMA ใน HRGEC (รูปที่ 4F)

การเปลี่ยนแปลงของภาวะพังผืดคั่นระหว่างหน้าของไต โปรตีนในปัสสาวะ การทำงานของไต และการเพิ่มขึ้นของ EndMT ที่ขึ้นอยู่กับเวลาในแบบจำลองหนูที่ถูกปฏิเสธเรื้อรัง

ต่อไป เราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของไฟโบรซิสของไต โปรตีนในปัสสาวะ การทำงานของไต และ EndMT ในร่างกาย แบบจำลองการปลูกถ่ายไตของหนูที่มีการปฏิเสธเรื้อรังถูกสร้างขึ้นโดยการปลูกถ่ายไตจากหนู F344 ไปยังหนูลูอิส allografts ของไตถ่ายในสัปดาห์ที่ 8, 12 และ 16 หลังการปลูกถ่ายไต การทดสอบการย้อมสี HE และการย้อมสีของ Masson บ่งชี้ถึงระดับที่แตกต่างกันของการแทรกซึมของเซลล์ที่แทรกซึม, glomerulosclerosis, การฝ่อของท่อ และภาวะพังผืดคั่นระหว่างหน้าหลังการปลูกถ่ายไต ผลลัพธ์ของการย้อมสี Masson ยังแสดงให้เห็นเส้นใยคอลลาเจนที่มีคราบสีน้ำเงินจำนวนมากในเนื้องอกในไตและไตในสัปดาห์ที่ 8, 12, 16 หลังการปลูกถ่ายไต เมื่อเทียบกับกลุ่มซิน (รูปที่ 5A–C) เพื่อทดสอบการทำงานของไตของหนูด้วยการปลูกถ่าย allogeneic ไตข้างขวาโดยกำเนิดจะถูกกำจัดออกไปในระหว่างการปลูกถ่ายไต สี่สัปดาห์หลังการผ่าตัดไตด้านขวา โปรตีนในปัสสาวะตลอด 24 ชั่วโมงและการทำงานของไต รวมทั้ง creatinine ในซีรัมและ BUN ค่อยๆ เสื่อมลงในทุกกลุ่มจนกระทั่งเสียชีวิต (ภาพที่ 5D) ผลลัพธ์ของการสอบวิเคราะห์ IHC แสดงการแสดงออกที่สูงของ FN และ a-SMA ในขณะที่การแสดงออกของ CD31 ลดลงในทุกกลุ่มที่ 16 สัปดาห์ (รูปที่ 5E) การทดสอบ Western blot ยืนยันผลลัพธ์ของการทดสอบอิมมูโนฮิสโตเคมีและแสดงให้เห็นว่าความก้าวหน้าของ EndMT นั้นรุนแรงขึ้นด้วยการยืดเวลาหลังการปลูกถ่ายไต (รูปที่ 5F)

การปลูกถ่ายไตเปิดใช้งาน Autophagy แต่ฟลักซ์ Autophagic บกพร่องในระยะสุดท้ายของแบบจำลองหนูปฏิเสธเรื้อรัง

LC3 ซึ่งถือเป็นเครื่องหมายที่กำหนดไว้สำหรับ autophagy มีความสำคัญสำหรับการสร้าง autophagosome และการกระตุ้น autophagic flux Adeno-associated virus (AAV)-mRFP-GFP- LC3 ถูกฉีดเข้าไปใน allograft ไตของหนู ในร่างกาย stereotactically เราสร้างแบบจำลอง mRFP-GFP-LC3 เพื่อติดตามการทำงานของ autophagic ในการปลูกถ่ายไต มักใช้ AAV- mRFP-GFP-LC3 เพื่อตรวจสอบ autophagic flux ในร่างกาย สัญญาณ GFP มีความไวต่อสภาวะที่เป็นกรดของลูเมนไลโซโซมสูงกว่า mRFP ดังนั้นออโตฟาโกโซมจึงมีแสงเรืองแสงสีเหลืองเนื่องจากตำแหน่งร่วมของการเรืองแสงของ GFP และ mRFP บ่งชี้และออโตไลโซโซมแสดงการเรืองแสงสีแดง การเพิ่มขึ้นของแสงเรืองแสงสีแดงบ่งชี้ถึงการสะสมของออโตไลโซโซมและการกระตุ้น autophagy ในไต พื้นที่บวกของแสงเรืองแสงสีแดงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสัปดาห์ที่ 4, 8,12 และ 16 ในกลุ่ม allo เมื่อเทียบกับกลุ่ม syn อย่างไรก็ตาม รอยแดงจางลงอย่างรวดเร็วหลังจากถึงจุดสูงสุดที่ 8 และ 12 สัปดาห์ การเปลี่ยนแปลงในระดับของ autophagy ส่วนใหญ่สังเกตพบในหลอดเลือดขนาดเล็กที่เกี่ยวกับไตและส่วนปลาย มากกว่าในท่อส่วนปลายหรือท่อรวบรวม (รูปที่ 6A, B) ผลลัพธ์เหล่านี้เปิดเผยว่า autophagy ถูกกระตุ้นในระยะแรกของการปลูกถ่ายไต แต่ไม่ใช่ระยะสุดท้าย และการขจัด autophagosome จะลดลงหลังจากผ่านไปประมาณ 8 สัปดาห์ การสอบวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ ATG16L สูงขึ้นใน 8 สัปดาห์มากกว่า 16 สัปดาห์ (รูปที่ 6C) ผล Western blot ยังแสดงระดับ LC3-II และ ATG16L สูงสุดที่ 8 สัปดาห์ จากนั้นค่อยๆ ลดลงจนถึง 16 สัปดาห์ในไตที่ปลูกถ่ายในหนูหลังการปลูกถ่าย (รูปที่ 6D)

NF-kB Pathway ถูกเปิดใช้งานและเลื่อนขั้น EndMT หลังจากการล้มลงของ ATG16L Expression

ในแง่ของความสัมพันธ์ระหว่างการปรับลด ATG16L และ EndMT ในรูปแบบหนูที่ถูกปฏิเสธเรื้อรังและโรค CAD เราตั้งสมมติฐานว่าการสูญเสีย ATG16L อาจนำไปสู่ความก้าวหน้าของ EndMT โดยตรง เพื่อสำรวจกลไกที่เป็นไปได้เพิ่มเติมซึ่งความก้าวหน้านี้เกิดขึ้น อันดับแรก เราทำการจัดลำดับการถอดรหัสทั้งหมด (RNA-seq) ใน HRGEC ด้วย ShNC หรือ ShATG16L ได้รับยีนที่แตกต่างกันทั้งหมด 453 ยีน (DEG) ระหว่างทั้งสองกลุ่ม ในหมู่พวกเขา 358 DEG ได้รับการควบคุมและ 95 ได้รับการควบคุม (รูปที่ 7A) จากนั้น 20 เส้นทางได้รับการคัดเลือกอย่างมีนัยสำคัญโดยการเพิ่มประสิทธิภาพของ KEGG เราพบว่าวิถี NF-kB เป็นหนึ่งในเส้นทางที่ถูกกระตุ้นอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 7B) การปรับเพิ่มของยีนวิถี NF-kB ยังได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ชุดยีน (GSEA) (รูปที่ 7C)

NF-kB เป็นหนึ่งในปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญสำหรับเส้นทางการส่งสัญญาณการอักเสบ และ NF-kB จะย้ายจากไซโตพลาสซึมไปยังนิวเคลียสเมื่อเปิดใช้งาน เพื่อยืนยันการเปิดใช้งาน NF-kB และการย้ายนิวเคลียร์ เราทำการทดสอบการย้อมสีอิมมูโนออเรสเซนส์โดยใช้แอนติบอดีต้าน p65 และพบ p65 และสีย้อมนิวเคลียร์ถูกทำให้เป็นโคโลคัลไลซ์ซึ่งบ่งชี้การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ (รูปที่ 7D) นอกจากนี้ เราพบว่า QNZ ซึ่งเป็นตัวยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-kB ยับยั้งการแสดงออกของ NF-kB ในนิวเคลียสอย่างมีนัยสำคัญ และย้อนกลับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ EndMT ซึ่งเกิดจากการล้มลงของ ATG16L (รูปที่ 7E)

การทดสอบ WB ยังดำเนินการเพื่อตรวจสอบกลไกเฉพาะของการกระตุ้นเส้นทาง NF-kB เราตรวจพบการหาปริมาณของ p65 (รวม NF-kB) และ p-p65 (phosphorylated NF-kB) ใน HRGEC ผล WB แสดงให้เห็นว่าระดับ p65 เพิ่มขึ้นในกลุ่ม ShATG16L เมื่อเทียบกับกลุ่ม ShNC ในขณะที่ p-p65 มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นที่คล้ายกัน (รูปที่ 7F) การเพิ่มขึ้นของระดับ p-p65 ใน HRGEC หลังจาก ATG16L ล้มลงนั้นมาพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของโปรตีน p65 ทั้งหมด ซึ่งน่าจะสะท้อนผลกระทบเพิ่มเติมต่อการแสดงออกของ p65 ใน HRGEC เพื่อตรวจสอบว่าความเสถียรของ NF-kB เกิดจากการย่อยสลายที่ลดลงหรือการสังเคราะห์ที่เพิ่มขึ้น ไซโคลเฮกซิไมด์ (CHX) ตัวยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน (CHX) ถูกเติมลงในเซลล์เพื่อยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน และวิเคราะห์ระดับโปรตีน NF-kB ผล Western blot แสดงให้เห็นว่ามีการแสดงออกอย่างต่อเนื่องของโปรตีน p65 ต่อหน้า CHX (รูปที่ 7G) ในขณะเดียวกัน ระดับ mRNA ของ NF-kB ยังไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญโดย ShATG16L ข้อมูลเชิงปริมาณสำหรับระดับของ NF-kB mRNA ถูกบ่งชี้แบบกราฟิกในรูปที่ 7H สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ NF-kB เกิดจากการย่อยสลายที่ลดลง ไม่ใช่การสังเคราะห์ที่เพิ่มขึ้นหลังจากการล้มลงของ ATG16L ใน HRGEC เพื่อยืนยันการแสดงออกของ NF-kB ในเนื้อเยื่อของมนุษย์เพิ่มเติม เราทำการทดสอบการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์บนเนื้อเยื่อ allograft ของไตที่บรรลุผลสำเร็จ และพบว่าระดับการแสดงออกของ p65 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน allograft ไตของผู้ป่วย CAD (รูปที่ 7I, J)

การเปิดใช้งานเส้นทาง NF-kB กระตุ้นการหลั่ง Cytokines ในหมู่พวกเขา IL-1b, IL-6 และ TNF‐a สามารถกระตุ้นการลุกลามของ EndMT ใน HRGEC

การส่งสัญญาณ NF-kB เป็นตัวควบคุมหลักของการตอบสนองต่อการอักเสบ จากนั้นเราได้สำรวจปัจจัยที่ละลายน้ำได้ซึ่งรับผิดชอบต่อ EndMT ที่เกิดจาก shATG16L โดย RT-PCR ในบรรดาไซโตไคน์หลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับข้อบกพร่องของ autophagy และการตอบสนองของ inflammatory, IL-1b, IL-6 และ TNF-a ปัจจัยในกระแสน้ำทั่วไปที่เกิดจากวิถี NF-kB มีนัยสำคัญ สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับ HRGEC ที่ทรานส์เฟก shNC ระหว่างการด้อยค่าของกิจกรรม autophagy (รูปที่ 8A) สิ่งนี้สอดคล้องกับการค้นพบปัจจัยที่ทำให้เกิดการอักเสบก่อนหน้านี้ของเรา เช่น TNF-a การเพิ่มขึ้นของซีรัมในหนูที่มีการปฏิเสธเรื้อรัง (27)

ในการตรวจสอบการเกิดโรคของ EndMT ที่กระตุ้นโดย IL{{0}}b, IL-6 และ TNF-a เราบำบัด HRGEC ด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ IL-1b ({{ 7}}~20 ng/mL), IL-6 (0~200 ng/mL) และ

TNF-a ({{0}}~20 ng/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง IL-1b, IL-6 และ TNF-a ทั้งหมดสามารถเพิ่มระดับโปรตีนของ FN และ a‐SMA ได้ด้วยการลดลงตามขนาดยาของตัวบ่งชี้เซลล์บุผนังหลอดเลือด CD31 พร้อมกัน ผลกระทบเหล่านี้ถึงจุดสูงสุดเมื่อ HRGEC ถูกบำบัดด้วย 10 ng/mL IL-1b, 200 ng/mL IL-6 หรือ 10 ng/mL TNF‐a ตามลำดับ (รูปที่ 8B) การทดลองการพึ่งพาเวลายังดำเนินการเพื่อตรวจสอบความถูกต้องของนิพจน์ที่เกี่ยวข้องของ EndMT ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 8B, IL-1b, IL-6 หรือการบำบัด TNF-a สำหรับ 0~48 ชั่วโมงสามารถเหนี่ยวนำการแสดงออกของ FN และ a- SMA ได้อย่างน่าทึ่ง และนำไปสู่การสูญเสีย CD31 ใน HRGEC เป็น เวลากระตุ้นเพิ่มขึ้น เพื่อทดสอบผลของ IL-1b, IL-6 และ TNF-a ต่อ EndMT การบำบัดด้วย Anakinra, Tocilizumab และ Infliximab เริ่มต้นขึ้นเมื่อทำให้ ATG16L ล้มลง อนาคินราเป็นปฏิปักษ์ของอินเตอร์ลิวคิน-1 รีเซพเตอร์ (IL-1R) Tocilizumab คือแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง IL-6R ที่ขัดขวาง IL-6 จากการจับกับ IL-6R Infliximab เป็นโมโนโคลนอลแอนติบอดี IgG1 ที่จับกับ TNF-a โดยเฉพาะและเป็นตัวยับยั้ง TNF-a ที่ใช้อย่างประสบความสำเร็จในการจัดการโรคลำไส้อักเสบ ผล WB แสดงให้เห็นว่า Anakinra และ Infliximab สามารถลด EndMT ได้อย่างชัดเจนมากขึ้น (รูปที่ 8C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสีย ATG16L ไม่เพียงแต่ลดกิจกรรม autophagy แต่ยังส่งเสริมการหลั่งของ inflammatory cytokines IL-1b, IL-6 และ TNF-a โดยการยับยั้งการเสื่อมสภาพของ p65 เพื่อกระตุ้น NF- เส้นทาง kB (รูปที่ 8D)

อภิปรายผล

ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าการปลูกถ่ายไตทำให้ autophagic flux บกพร่อง ซึ่งสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของการตอบสนองของ inflammatory, EndMT และความรุนแรงของการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าของ allografts ของไต แม้ว่ากิจกรรม autophagic จะเพิ่มขึ้นชั่วคราวในระยะแรกของการปลูกถ่าย allograft แต่ก็ค่อยๆลดลงเนื่องจากการสูญเสีย ATG16L ออโตฟาจีที่ขึ้นกับ ATG16L ในฐานะกระบวนการปกป้องเซลล์ สามารถลดทอนภาวะพังผืดคั่นระหว่างหน้าของไตที่ปลูกถ่ายได้ผ่านทางการควบคุมของ EndMT ที่เหนี่ยวนำโดย IL-1b, IL-6 และ TNF-a เพื่อเป็นความรู้ที่ดีที่สุดของเรา นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่อธิบายบทบาทและการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกของ autophagic flux ในการปลูกถ่ายไต ในการศึกษานี้ เรายังได้ตรวจสอบรายละเอียดทางพยาธิสรีรวิทยาระดับโมเลกุลที่เป็นรากฐานของวิธีการที่ความบกพร่องของ autophagic flux ส่งผลให้เกิด EndMT และการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าของไต

แม้ว่าการวิจัยหลายประเภทได้รายงานว่า autophagy มีส่วนเกี่ยวข้องกับการก่อตัวและความก้าวหน้าของการเกิดพังผืดในไต แต่ ARG ยังไม่ได้รับการวิเคราะห์อย่างครอบคลุมเพื่อสำรวจคุณค่าทางคลินิกในการดำเนินของการปฏิเสธการรับสินบนไตเรื้อรัง โปรตีนหลายร้อยชนิดเกี่ยวข้องกับกระบวนการ autophagy เมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของ autophagy ในการปลูกถ่ายไต มีเหตุผลที่จะคาดเดาว่า ARGs มีสัญญาที่ดีในการพยากรณ์โรคและเป้าหมายการรักษา เพื่อที่จะสำรวจปัจจัยที่ทำให้เกิดโรคดั้งเดิมของ CAD เราจึงสร้างโปรไฟล์นิพจน์ mRNA ของ 149 ARG ในกลุ่ม GSE9493 และวิเคราะห์ ARG 14 อย่างเด่นชัด ซึ่งเกี่ยวข้องกับ autophagy มากที่สุดระหว่างผู้ป่วย CAD และผู้ป่วยที่ไม่ใช่ CAD ในบรรดา ARG ที่ถูกลดการควบคุมในกลุ่ม CAD ยีนควบคุมเชิงลบของ autophagy เช่น Raptor และ MAPK3 (28, 29) ถูกปรับลดลงในกลุ่ม CAD ในอีกทางหนึ่ง ATG16L ในฐานะ ARG ที่ควบคุมแบบอัพคือโครงสำหรับลิปิด LC3 โดยการจำกัดตำแหน่งแบบไดนามิกไปยังเยื่อหุ้มแหล่งกำเนิดสมมุติและส่งเสริมการก่อรูปแวคิวโอล autophagic (30) อย่างไรก็ตาม การศึกษาบางชิ้นแสดงให้เห็นว่าไม่จำเป็นต้องใช้ ATG16L สำหรับการยืดตัวของเมมเบรนแยก (23) ดังนั้นจึงได้ทำการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างบทบาทที่ไม่ขึ้นกับ autophagy หรือ autophagy-dependent ของ ATG16L และ EndMT

ในการตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง ATG16L, autophagy และ EndMT ในไตที่ปลูกถ่าย เราได้ล้ม ATG16L โดย shRNA ใน HRGECs ผลการวิจัยของเราเปิดเผยว่า shATG16L สามารถลดระดับ autophagy และกระตุ้นให้เกิด EndMT ในทำนองเดียวกัน การวิจัยในร่างกายและตัวอย่างทางคลินิกยังเปิดเผยว่าการกระตุ้น ATG16L และ autophagic flux ในระยะแรกของการปลูกถ่ายไต autophagic flux ลดลงในช่วงไดนามิกเมื่อการเปลี่ยนแปลงของเนื้องอกเพิ่มขึ้น อาจสรุปได้ว่าสาเหตุของการลุกลามของ EndMT อาจเป็นเพราะการลด autophagic flux และ autophagy ที่ขึ้นกับ ATG16L มีบทบาทสำคัญในการลุกลามของ EndMT และการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าของไต อย่างไรก็ตาม การค้นพบบางอย่างแสดงให้เห็นว่า autophagy ที่เกิดจาก rapamycin ทำให้เกิดการกระตุ้น EndMT ใน HCAECs ภายใต้สภาวะที่ไม่เป็นพิษ (22) สิ่งเหล่านี้ดูเหมือนจะแตกต่างจากผลลัพธ์ของเรา เราพิจารณาว่าบทบาทของ autophagy อาจแตกต่างกันในเซลล์ประเภทต่างๆ อาจเป็นบริบทของเซลล์และปัจจัยด้านกฎระเบียบต้นน้ำ เนื่องจาก autophagy ที่ขึ้นกับ ATG16L เป็นวิธีการป้องกันตนเองเมื่อ EndMT เกิดขึ้นใน CAD การพิจารณากลไกเฉพาะของ EndMT ที่เกิดจาก shATG16L จึงมีความหมาย

เราทำการจัดลำดับรุ่นต่อไปจากกลุ่มของการทำให้ล้มลง ATG16L และกลุ่มควบคุมใน HRGEC วิถีทาง KEGG และการวิเคราะห์ GSEA เปิดเผยว่าวิถีทาง NF-kB เป็นหนึ่งในวิถีทางที่สมบูรณ์ที่มีนัยสำคัญที่สุด โดยปกติ NF-kB จะจับกับ IkB ซึ่งทำให้ NF-kB เสถียรในไซโตพลาสซึม เมื่อวิถีทาง NF-kB ถูกกระตุ้น NF-kB heterodimer p65 จะย้ายไปยังนิวเคลียสและจับกับโปรโมเตอร์เฉพาะของมัน (31) หนึ่งในวิถีทางบัญญัติ (แบบคลาสสิก) สำหรับการโยกย้ายนิวเคลียร์ NF-kB คือ p65 phosphorylation อย่างไรก็ตาม มีรายงานการเพิ่มจำนวนของเส้นทางที่ไม่เป็นที่ยอมรับในโรคต่างๆ มีรายงานด้วยว่าการยับยั้ง p62/SQSTM1- autophagy แบบเลือกที่เป็นสื่อกลางสามารถลดการเสื่อมสภาพของ lysosomal ของเส้นทาง NF-kB (32) ได้) ข้อบกพร่องของ autophagy ยังนำไปสู่การเปิดใช้งาน NF-kB เนื่องจากการแสดงออกของ SQSTM1 ที่คงอยู่ ซึ่งจะส่งเสริม การเกิดเนื้องอกในแบบจำลองเมาส์ (33) ในการศึกษาของเรา เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของระดับโปรตีน p65 และ p-p65 ในขณะที่ระดับ mRNA นั้นไม่เปลี่ยนแปลง เมื่อมีตัวยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน CHX การสะสมของโปรตีน p65 ยังคงดำเนินต่อไปเมื่อเทียบกับการไม่มีตัวยับยั้ง ดังนั้นเราจึงคาดการณ์ว่าการกระตุ้น NF-kB ที่เหนี่ยวนำโดยการล้มลงของ ATG16L เป็นผลมาจากการย่อยสลายโปรตีนที่ลดลง และกระบวนการนี้อาจเป็นการปราบปรามการย่อยสลายที่ขึ้นกับ autophagic

Inflammations มีความเกี่ยวข้องอย่างเคร่งครัดกับผลที่ตามมาของการปลูกถ่ายไตในระดับคลินิกและการรักษา (34) NF-kB p65 เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญที่สุดในการควบคุมปัจจัยการแทรกซึมของเซลล์ ในการศึกษานี้ เรายังพบว่าการล้มลงของ ATG16L เพิ่มไซโตไคน์ IL-1b, IL-6 และ TNF-a ผ่านทางวิถี NF-kB การค้นพบนี้และผลอื่นๆ เห็นด้วยกับการศึกษาอื่นๆ มากมาย เช่น การศึกษาที่สรุปว่าการสูญเสีย ATG16L ได้เพิ่มการผลิต IL- 1b ที่เหนี่ยวนำโดยเอนโดทอกซิน (35) และ TNFAIP3/A20 จับ ATG16L1 เพื่อควบคุมการตอบสนองของ autophagic, NF-kB การเปิดใช้งาน (36) นอกจากนี้ยังมีรายงานบทบาทของไซโตไคน์ในการทำลายเชื้อใน EndMT ในการศึกษาก่อนหน้านี้บางส่วน อย่างไรก็ตาม มีความเป็นไปได้ที่ไซโตไคน์ที่ทำลายล้างเหล่านี้อาจมีบทบาทที่หลากหลายขึ้นอยู่กับพยาธิสภาพและระดับแวดล้อมของมัน ในรูปแบบเมาส์โรคอ้วนที่เหนี่ยวนำโดยอาหาร การขาด autophagy ของเยื่อบุผนังหลอดเลือดทำให้เกิด IL6-EndMT (37) ที่ขึ้นต่อกัน ในโรคแคลเซียมในหลอดเลือด IL-1b และ TNF-a เหนี่ยวนำ EndMT ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดเอออร์ตาปฐมภูมิของมนุษย์ (38) ผลลัพธ์ของเราได้คัดกรองและระบุ IL-1b, IL-6 และ TNF-a ในฐานะที่เป็นการส่งเสริมไซโตไคน์ในการติดเชื้อ EndMT ในสภาพแวดล้อมทางพยาธิวิทยาของ CAD พร้อมกันนี้ ได้ทำการวิจัยความสัมพันธ์ซึ่งกันและกันระหว่างการสูญเสีย ATG16L และไซโตไคน์ในช่องปากเพื่อเน้นย้ำเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้เพื่อควบคุมการสูญเสีย ATG16L ในการลุกลามของ CAD

การวิจัยของเรามีข้อจำกัดหลายประการ การตรวจสอบความถูกต้องในปัจจุบันของผลกระทบของ ATG16L ต่อ EndMT และความก้าวหน้าของการเกิดพังผืดได้ดำเนินการในแบบจำลองเซลล์ที่ทำให้ล้มลงเท่านั้น ความซับซ้อนของการเปลี่ยนแปลง autophagy ในร่างกาย และในการพัฒนา CAD แทบจะไม่สามารถเลียนแบบได้ และเน้นย้ำถึงความจำเป็นในหนูน็อคเอาท์แบบมีเงื่อนไข ATG16L ที่บุผนังหลอดเลือด . เราจะสร้างแบบจำลองการปลูกถ่ายไตของเมาส์ ATG16L ที่น่าพิศวงสำหรับการศึกษากลไกเพิ่มเติม ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย ATG16L และ autophagy ที่ส่งเสริม EndMT, QNZ ยับยั้งการกระตุ้น NF-kB และ IL-1b, TNF-a monoclonal antibody ที่ต่อต้านรีเซพเตอร์จำเพาะจึงทำให้กระบวนการ allograft fibrotic ช้าลง แต่ก็ไม่สามารถทำได้อย่างสมบูรณ์ ย้อนกลับผลลัพธ์นี้ กลไกอื่นๆ มีบทบาทคล้ายคลึงกันหรือไม่นั้นยังไม่ทราบ นอกจากนี้ นอกเหนือไปจากเซลล์บุผนังหลอดเลือดแล้ว แหล่งที่มาของไมโอไฟโบรบลาสต์ยังประกอบด้วยเซลล์ที่หลากหลาย รวมถึงเยื่อบุผิว ไฟโบรบลาสต์ และเพอริไซต์ (39) ไม่ว่าการสูญเสีย ATG16L และการขาด autophagy จะส่งผลต่อเซลล์เหล่านี้หรือไม่นั้นยังคงไม่สามารถสรุปได้

โดยสรุป การศึกษาในปัจจุบันพิสูจน์แล้วว่าการล้มลงของ ATG16L มีความสำคัญต่อการด้อยค่าของ autophagic flux และการสร้าง EndMT ที่เกิดจาก IL-1b, IL-6 และ TNF‐a ในการลุกลามของเนื้องอกคั่นระหว่างหน้าที่ปลูกถ่าย . ฟังก์ชันนี้เป็นสื่อกลางโดย NF-kB ลดการเสื่อมสภาพและการเปิดใช้งานวิถี โดยสรุป ผลการศึกษาของเราให้ข้อมูลเชิงลึกที่แปลกใหม่เกี่ยวกับความสัมพันธ์แบบไดนามิกของ autophagic flux และ EndMT การป้องกันการสูญเสีย ATG16L และการยับยั้ง autophagy flux อาจเป็นทางเลือกใหม่สำหรับการรักษาและป้องกันความก้าวหน้าของภาวะพังผืดในไตและ CAD ในผู้รับการปลูกถ่ายไต

ก้าน Cistanche ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูลดิบที่สนับสนุนบทสรุปของบทความนี้จะเผยแพร่โดยผู้เขียนโดยไม่ต้องจองเกินควร

คำชี้แจงจริยธรรม

การศึกษาที่เกี่ยวข้องกับผู้เข้าร่วมที่เป็นมนุษย์ได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่นของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง ผู้ป่วย/ผู้เข้าร่วมให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรในการเข้าร่วมในการศึกษานี้ การศึกษาในสัตว์ทดลองได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่นของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากเจ้าของสำหรับการมีส่วนร่วมของสัตว์ในการศึกษานี้

ผลงานของผู้เขียน

RT และ MG ดูแลและให้กำเนิดโครงการ ZG, CS และ ZW ออกแบบและดำเนินการทดลองส่วนใหญ่ MZ และ SF เก็บตัวอย่างหนู LS, HC, ZH, JT, XJ และ HY วิเคราะห์ข้อมูล ZG และ ZW ได้สร้างผลงาน ZG และ RT ร่างและแก้ไขบทความ ผู้เขียนทุกคนมีส่วนร่วมในบทความและอนุมัติเวอร์ชันที่ส่ง

เงินทุน

งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน [หมายเลข 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532]

ข้อมูลอ้างอิง

1. คาร์นีย์ EF การปลูกถ่าย: ประโยชน์ในการเอาชีวิตรอดจากการรับไตผู้บริจาคที่เสียชีวิตจากเบาหวาน Nat Rev Nephrol (2017) 13(8):444. ดอย: 10.1038/nrneph.2017.88

2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M, et al. ผลลัพธ์ของการปลูกถ่ายไตในการปลูกถ่ายอวัยวะที่เป็นของแข็งขั้นต้น ซ้ำ และไตหลังไม่มีไต: การวิเคราะห์ 15-ปีของฐานข้อมูล UNOS ล่าสุด การปลูกถ่ายคลินิก (2017) 31(11) ดอย: 10.1111/ctr.13108

3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการปฏิเสธแอนติบอดี้เรื้อรังและความก้าวหน้าไปสู่การปลูกถ่าย glomerulopathy Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23(6):611–8. ดอย: 10.1097/MNH. 00000000000000000070

4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. ความผิดปกติของ Allograft เฉียบพลันและเรื้อรังในผู้รับการปลูกถ่ายไต Med Clin North Am (2016) 100(3):487–503. ดอย: 10.1016/j.mcna.2016.01.002

5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W, et al. บทบาทของการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผนังหลอดเลือดไปเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ที่เกิดจาก TGF-beta1 ในการเกิดพังผืดคั่นระหว่างไตที่ปลูกถ่าย J Cell Mol Med (2017) 21(10):2359–69. ดอย: 10.1111/ jump.13157

6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. กำหนดเป้าหมาย Fibroblasts ที่ได้รับจากไขกระดูกสำหรับภาวะไตวาย Adv Exp Med จิตเวช (2019) 1165:305–22. ดอย: 10.1007/978-981- 13-8871-2_14

7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) และ Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT): บทบาทและผลกระทบในภาวะไตวาย ผลลัพธ์ Probl Cell Differ (2017) 60:345–72 ดอย: 10.1007/978- 3-319-51436-9_13

8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M, et al. แนวทางและคำจำกัดความสำหรับการวิจัยเกี่ยวกับการเปลี่ยนผ่านของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ Nat Rev Mol เซลล์ Biol (2020) 21(6):341–52. ดอย: 10.1038/วินาที41580-020-0237-9

9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Fibroblasts ในภาวะไตวายเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผนังหลอดเลือดไปเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล (2008) 19(12):2282–7. ดอย: 10.1681/ASN.2008050513

10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E, และคณะ การเปลี่ยนจากเยื่อบุผิวไปเป็นเยื่อหุ้มเซลล์เป็นเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้ในความผิดปกติของเส้นใย Front Cell Dev Biol (2020) 8:607483. ดอย: 10.3389/ลดลง.2020.607483

11.Cardinal H, Dieude M, Hebert MJ. ความผิดปกติของเยื่อบุผนังหลอดเลือดในการปลูกถ่ายไต. อิมมูนอลด้านหน้า (2018) 9:1130. ดอย: 10.3389/fimmu.2018. 01130

12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z, และคณะ บทบาททางพยาธิวิทยาที่เป็นไปได้ของโปรอินflammatory cytokines (IL-6, TNF-alpha และ IL-17) ในการปลูกถ่ายซีโน การปลูกถ่ายซีโน (2019) 26(3):e12502. ดอย: 10.1111/Xen.12502

13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z, et al. บทบาทของ tumor necrosis factor-alpha ในการเปลี่ยนแปลงของ epithelial-to-mesenchymal ในเซลล์ไตที่ปลูกถ่ายในผู้รับที่มีความผิดปกติของ allograft เรื้อรัง ยีน (2018) 642:483–90. ดอย: 10.1016/j.gene.2017.11.059

14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. ภาวะขาดออกซิเจนทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเยื่อหุ้มเซลล์บุผนังหลอดเลือดในการเปลี่ยนแปลงรูปแบบหลอดเลือดในปอด Int J Mol Med (2018) 42(1):270–8. ดอย: 10.3892/ijmm.2018.3584

15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X, และคณะ อัลตราซาวนด์ Pulsed Pulsed ความเข้มต่ำช่วยป้องกันการเปลี่ยนผ่านของเยื่อบุผนังหลอดเลือด - Mesenchymal ที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชันในเซลล์บุผนังหลอดเลือดเอออร์ตาของมนุษย์ เซลล์ Physiol Biochem (2018) 45 (4): 1350–65 ดอย: 10.1159/000487561

16. Guan Q, Nguan CY, Du C. การแสดงออกของการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต-beta1 จำกัดการบาดเจ็บของไตขาดเลือดกลับ- การปลูกถ่าย (2010) 89(11):1320– 7. ดอย: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc

17. Levine B, Kroemer G. หน้าที่ทางชีวภาพของยีน Autophagy: มุมมองของโรค เซลล์ (2019) 176(1-2):11–42. ดอย: 10.1016/j.cell.2018.09.048

18.De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,

Levtchenko E, และคณะ Autophagy ในโรคไต Pediatr Nephrol (2016) 31 (5):737–52. ดอย: 10.1007/วินาที00467-015-3134-2

19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J, et al. Atg5-ความบกพร่องของ autophagy ที่เป็นสื่อกลางในหลอดอาหารใกล้เคียงส่งเสริมการจับกุม G2/M ของวงจรเซลล์และการเกิดพังผืดของไต Autophagy (2016) 12(9):1472–86. ดอย: 10.1080/ 15548627.2016.1190071

Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J และอื่น ๆ Autophagy ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลง Prosenescent ในส่วน Proximal Tubular S3 เจ แอม ซ็อก เนโฟรล (2016) 27(6):1609–16. ดอย: 10.1681/ASN.2014111059