ผลกระทบของการบริโภคโปรตีนต่ำขณะตั้งครรภ์ต่อการแสดงออกของ MicroRNA ของไตตัวอ่อนและในเซลล์ต้นกำเนิดของ Nephron ของทารกในครรภ์เพศชาย

edmund.chen@wecistanche.com

บทนำ

การขาดสารอาหารอาจส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงสัญญาณในเส้นทางสำคัญในช่วงต่างๆ ของการพัฒนาของทารกในครรภ์ ซึ่งอาจทำให้เกิดความผิดปกติของอวัยวะและระบบในวัยผู้ใหญ่ที่ไม่สามารถกลับคืนสภาพเดิมได้ [1] โปรแกรมของทารกในครรภ์หมายถึงการดูถูกใดๆ ในระหว่างการพัฒนา ซึ่งก่อให้เกิดผลกระทบระยะยาวต่อโครงสร้างหรือหน้าที่ของสิ่งมีชีวิต [2] การหยุดชะงักในการเขียนโปรแกรมของทารกในครรภ์ส่งผลให้น้ำหนักแรกเกิดต่ำ มีไตน้อยลง และเพิ่มความเสี่ยงต่อโรคหัวใจและหลอดเลือดและไตความผิดปกติในวัยผู้ใหญ่ [3–6]. การศึกษาโดยผู้เขียนคนอื่นๆ และเราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าน้ำหนักแรกเกิดลดลง ไตลดลง 28 เปอร์เซ็นต์ ลดลงไตการขับถ่ายเกลือเรื้อรังภาวะไตวายและความดันโลหิตสูงในหลอดเลือดแดงในการบริโภคโปรตีนต่ำ (LP) ของการตั้งครรภ์เมื่อเทียบกับลูกหลานที่ได้รับโปรตีนมาตรฐาน (NP) ในวัยผู้ใหญ่ [3–7] Nephrogenesis เกี่ยวข้องกับการควบคุมการแสดงออกของยีน การสังเคราะห์โปรตีน และการสร้างเนื้อเยื่อใหม่อย่างเข้มงวด จากการศึกษาพบว่าจำนวน nephron ถูกกำหนดโดยปฏิกิริยาระหว่าง ureter bud (UB) กับ metanephros mesenchyme (MM) progenitor cells [8–10] สัญญาณจาก MM กระตุ้น UB กระตุ้นการเจริญเติบโตและการแตกแขนงของระบบท่อ ในทางกลับกัน การเพิ่มจำนวนและการแยกความแตกต่างของ MM ซึ่งประกอบเป็นหมวกเยื่อหุ้มมีเซนไคม์ (CM) ถูกสื่อกลางโดยปลาย UB [11]

CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต

มีความสนใจอย่างมากในบทบาทของการเปลี่ยนแปลงอีพีเจเนติก เกี่ยวกับผลกระทบระยะยาวของความเครียดก่อนคลอด ต่อพัฒนาการของทารกในครรภ์ [12] MicroRNAs (miRNAs) เป็นจีโนมที่เข้ารหัส RNA ขนาดเล็กที่ไม่มีการเข้ารหัสซึ่งมีความยาวประมาณ 22 นิวคลีโอไทด์ และมีบทบาทสำคัญในการควบคุมหลังการถอดเสียงของการแสดงออกของยีนเป้าหมาย [13-16] miRNAs ควบคุมการแสดงออกของยีนหลังการถอดเสียงโดยควบคุมการแปล mRNA หรือความเสถียรในไซโตพลาสซึม [17, 18] การศึกษาเชิงหน้าที่ระบุว่า miRNAs เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่สำคัญในระหว่างการพัฒนาและในสรีรวิทยาของเซลล์ [13, 16] พบการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกในหลายโรค [16, 19] ดังนั้น การกำหนดลักษณะเฉพาะของ miRNAs จึงช่วยให้เข้าใจการควบคุมยีนและการเพิ่มจำนวนเซลล์ การแยกความแตกต่าง และการตายของเซลล์ และอธิบายความผิดปกติทางพยาธิสรีรวิทยา ซึ่งรวมถึงไตความผิดปกติ [20-22] มีการศึกษารายงานว่าในช่วงไตOntogeny miRNAs จำเป็นสำหรับการพัฒนาของ nephron [23–26] ยิ่งไปกว่านั้น การแสดงออกของ miR NA บางตัวในเซลล์ต้นกำเนิด MM น้อยเกินไปจะลดการเพิ่มจำนวนเซลล์ ส่งผลให้เกิดความแตกต่างในช่วงต้น และทำให้จำนวน nephrons ลดลง [27, 28] ปรากฏการณ์นี้มีลักษณะเฉพาะด้วยการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสที่เพิ่มขึ้นและการแสดงออกของ Bim สูงในเซลล์ต้นกำเนิด [27] ดังนั้น miRNAs จะปรับความสมดุลระหว่างอะพอพโทซิสและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ปฐมภูมิ metanephric เหล่านี้ [29]

เราตั้งสมมติฐานว่าการเปลี่ยนแปลงของ epigenetic ที่ไม่รู้จักและการทำโปรไฟล์การแสดงออก miRNA นั้นสัมพันธ์กับไตพัฒนาการผิดปกติในลูกที่จำกัดโปรตีนของมารดา ดังนั้นเราจึงมุ่งที่จะประเมินรูปแบบของ miRNA และทำนายการแสดงออกของยีนในทารกในครรภ์ไตเมื่ออายุครรภ์ 17 วัน (17-DG) ลูกเพศผู้จำกัดโปรตีนเพื่อระบุวิถีทางโมเลกุลและความผิดปกติที่เกี่ยวข้องไตการเพิ่มจำนวนเซลล์และการสร้างความแตกต่างระหว่างไตการพัฒนา.

คำสำคัญ:ภาวะไตวาย; ท่อไต; ความผิดปกติของไต การพัฒนาไต ไต

วัสดุและวิธีการ

สัตว์และอาหารการทดลองได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดก่อนหน้านี้ [5, 6] กับหนูเพศเมียและเพศผู้ที่เข้าคู่กันอายุของหนู Wistar HanUnib ที่ผสมพันธุ์กับพี่น้อง (250–300 ก.) ที่มาจากแหล่งเพาะพันธุ์ที่จัดหาโดย CEMIB/ UNICAMP , Campinas, SP, บราซิล สภาพแวดล้อมและที่อยู่อาศัยนำเสนอเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับการจัดการสุขภาพและความเป็นอยู่ที่ดีในระหว่างขั้นตอนการทดลอง ทันทีหลังจากหย่านมเมื่ออายุได้สามสัปดาห์ สัตว์จะได้รับการดูแลภายใต้อุณหภูมิที่ควบคุมได้ (25˚C) และสภาพแสง (07:00–19:00 น.) พร้อมการเข้าถึงน้ำประปาและเชาสำหรับสัตว์ฟันแทะในห้องปฏิบัติการมาตรฐานฟรี (Purina Nuvital , กูรีตีบา, ประชาสัมพันธ์, บราซิล: Na plus content: 135 ± 3μEq/g; K plus content: 293 ± 5μEq/g) เป็นเวลา 12 สัปดาห์ก่อนการผสมพันธุ์ คณะกรรมการจริยธรรมของสถาบันว่าด้วยการใช้สัตว์ที่มหาวิทยาลัยแห่งรัฐเซาเปาโล (#446-CEUA/UNESP) อนุมัติระเบียบวิธีการทดลอง และหลักเกณฑ์ทั่วไปที่กำหนดโดยวิทยาลัยทดลองสัตว์แห่งบราซิลได้รับการปฏิบัติตามตลอดการสอบสวน กำหนดให้วันที่ 1 ของการตั้งครรภ์เป็นวันที่ตรวจพบอสุจิทางช่องคลอด จากนั้น เขื่อนได้รับการบำรุงรักษาโดยอิสระตลอดการตั้งครรภ์ในห้องปฏิบัติการหนูที่มีไอโซคาลอริกที่มีปริมาณโปรตีนมาตรฐาน [NP, n=36] (โปรตีน 17 เปอร์เซ็นต์) หรือปริมาณโปรตีนต่ำ [LP, n=51 ] (โปรตีน 6 เปอร์เซ็นต์) การบริโภคอาหารของมารดา NP และ LP ถูกกำหนดทุกวัน (ต่อมาทำให้น้ำหนักตัวเป็นปกติ) และบันทึกน้ำหนักตัวของเขื่อนทุกสัปดาห์ในทั้งสองกลุ่ม ในวันที่ 17 ของการตั้งครรภ์ (17-DG) เขื่อนได้รับการดมยาสลบด้วยคีตามีน (75 มก./กก.) และไซลาซีน (10 มก./กก.) และมดลูกก็เปิดออก ทารกในครรภ์ถูกนำออกและทำการุณยฆาตทันทีโดยการตัดหัว ชั่งน้ำหนักตัวอ่อนและเก็บหางและแขนขาเพื่อมีเพศสัมพันธ์ metanephros ถูกรวบรวมสำหรับ Next Generation Sequencing (NGS), RT-qPCR และการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี

CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต

ความมุ่งมั่นทางเพศการศึกษานี้ดำเนินการในลูกหลาน 17-DG เพศชายเท่านั้น และการกำหนดเพศถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ลำดับ PCR แบบธรรมดาของ Sry (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส) สกัด DNA โดยการสลายด้วยเอนไซม์ด้วยโปรตีเอสเคและฟีนอล-คลอโรฟอร์ม สำหรับปฏิกิริยา ใช้ Master Mix Colorless—Promega กับสภาวะการปั่นจักรยานของผู้ผลิต Integrated DNA Technologies (IDT) สังเคราะห์ไพรเมอร์ตามลำดับต่อไปนี้: Forward: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Reverse: 5'-GCACTTTAACCTTCGATTAG-3'

การสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมดRNA ถูกสกัดจาก NP (n=4) และ LP (n=4) ทั้งหมดไตโดยใช้รีเอเจนต์ Trizol (Invitrogen) ตามคำแนะนำที่ระบุโดยผู้ผลิต ปริมาณ RNA ทั้งหมดถูกกำหนดโดยการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ nanoVue (GE Healthcare, USA) RNA Integrity ได้รับการประกันโดยได้รับ RNA Integrity Number—RIN > 8 กับ Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Germany) [30]

miRNA-Seq และการวิเคราะห์ข้อมูลการจัดลำดับดำเนินการบนแพลตฟอร์ม MiSeq (Illumina) โปรโตคอลปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตที่มีอยู่ในโดยย่อ การจัดลำดับรวมถึงการสร้างไลบรารี และสิ่งนี้ถูกใช้ RNA ทั้งหมด 1ug ในขั้นตอนนี้ อะแดปเตอร์เชื่อมต่อ 3 'และ 5' หลังจากการผูกมัดของอะแด็ปเตอร์ ปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับถูกดำเนินการเพื่อสร้าง cDNA จากนั้น มันถูกขยายโดยปฏิกิริยา PCR มาตรฐาน ซึ่งใช้ไพรเมอร์ที่มีดัชนีลำดับสำหรับการระบุตัวอย่าง—ไลบรารี cDNA นี้ ซึ่งอยู่ภายใต้ agarose gel electrophoresis สำหรับการแยก miRNA หลังจากการหาปริมาณ ความเข้มข้นของไลบรารีถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึง 2 นาโนโมลาร์โดยใช้ 10 นาโนโมลาร์ Tris-HCl, pH 8.5 และการหาลำดับทรานสคริปโทมถูกดำเนินการโดย MiSeq Reagent Kit v2 (50 รอบ)

การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการร่วมกับ Tao Chen, Ph.D. จาก Division of Genetic and Molecular Toxicological, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, USA. ข้อมูลจาก Next Generation Sequencing (NGS) ของ miRNAs ถูกสร้างขึ้นในรูปแบบ FASTA และนำเข้าสู่ BaseSpace.com (Illumina, USA) ประเมินคุณภาพข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ CASAVA ที่เรียกฐานซึ่งพัฒนาโดยผู้ผลิต (Illumina) การวิเคราะห์ทำโดย BaseSpace miRNA Analysis (จาก University of Torino ประเทศแคนาดา) และการทำแผนที่ลำดับของ miRNA ต่างๆ โดย Small RNA (Illumina, USA) สำหรับจีโนมของหนู การศึกษา miRNA ที่แสดงความแตกต่างได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, USA)

การตรวจสอบการแสดงออกของ miRNAแต่ละกลุ่มใช้ลูกตัวผู้สี่ตัวจากครอกที่แตกต่างกันสำหรับ miRNA (miR{0}}p, -144-3p, -298-5p, ให้-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p และ -199a-5p) การวิเคราะห์นิพจน์ โดยสังเขป 450 ng RNA ถูกคัดลอกย้อนกลับโดยไม่มีการขยายสัญญาณล่วงหน้า โดยใช้ TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kit ตามแนวทางของผู้ผลิต DNA เสริม (cDNA) ถูกขยายโดยใช้ TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) กับ TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) บน StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้การแสดงออกของยีนสัมพัทธ์ที่ประเมินโดยใช้วิธีการหาปริมาณเปรียบเทียบ (Pfaffl, 2001) จากการวิเคราะห์ความเสถียร U6 snRNA และ U87 scaRNA ถูกใช้เป็นยีนอ้างอิง การหาปริมาณสัมพัทธ์ทั้งหมดได้รับการประเมินโดยใช้ซอฟต์แวร์ DataAssist v 3.0 โดยใช้วิธี ΔΔCT ข้อมูล miRNA ถูกสร้างขึ้นตามแนวทาง MIQE [31]

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

RT-qPCR ของยีนเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้สำหรับการสังเคราะห์ cDNA นั้นใช้ชุดการถอดรหัสย้อนกลับ cDNA ความจุสูง (Life Technologies, USA) ปฏิกิริยา RT-qPCR สำหรับ Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 และ IGF1 ยีนดำเนินการโดย SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ) ให้บริการโดย IDT1 Integrated DNA Technologies (ตารางที่ 1) ปฏิกิริยาถูกกระทำในปริมาตรรวม 20 ไมโครลิตรโดยใช้ 2 ไมโครลิตรของ cDNA (เจือจาง 1:30), 10μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) และ 4 ไมโครลิตรของไพรเมอร์จำเพาะแต่ละตัว (5 นาโนโมลาร์) การขยายเสียงและการตรวจจับดำเนินการโดยใช้ระบบ PCR แบบเรียลไทม์ StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM) ค่า Ct ถูกแปลงเป็นค่านิพจน์สัมพัทธ์โดยใช้วิธี ΔΔCt โดยมีข้อมูลเมตาเนฟรอสของลูกหลานทำให้เป็นมาตรฐานด้วย GAPDH เป็นยีนอ้างอิง [32]

อิมมูโนฮิสโตเคมีทารกในครรภ์ (n {{0}} ต่อกลุ่ม) ถูกกำจัดออกและตรึงทันทีในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์, pH 7.4) วัสดุถูกทำให้แห้ง ไดอะฟาไนซ์ และรวมอยู่ในพาราพลาสต์ และบล็อกถูกตัดเป็นส่วนที่มีความหนา 5-ไมโครเมตร ส่วนทางจุลพยาธิวิทยาถูกกำจัดพาราฟินและแปรรูปเพื่ออิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และอิมมูโนเปอร์ออกซิเดส ส่วนต่างๆ ได้แก่

ฟักไข่ด้วยสารละลายบล็อค (8 เปอร์เซ็นต์ของทารกในครรภ์โคซีรั่ม, 2.5 เปอร์เซ็นต์จากวัวอัลบูมินและ 2 เปอร์เซ็นต์ของนมผงพร่องมันเนยใน PBS) ต่อจากนั้น ตั้งค่าด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (anti-Six-2) ที่เจือจางใน PBS ที่มีนมพร่องมันเนย 1 เปอร์เซ็นต์ค้างคืนภายใต้ตู้เย็น หลังจากล้างด้วย PBS ส่วนต่างๆ จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีรองจำเพาะ คอนจูเกตกับ Alexa 488 fluorophore ซึ่งเจือจางในบัฟเฟอร์เดียวกัน ซึ่งมีนม 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS อย่างต่อเนื่อง สไลด์ก็ถูกติดตั้งด้วยแผ่นปิดโดยใช้สื่อการประกอบเรืองแสง Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) การเรืองแสงในชิ้นงานทดสอบถูกตรวจพบโดยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล ได้ภาพโดยใช้ระบบ Focus Imagecorder Plus สำหรับ c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 แยก, โปรตีน cyclin A และ WT1, อิมมูโนฮิสโตเคมีถูกดำเนินการ สไลด์ถูกไฮเดรท และหลังจากถูกล้างใน PBS pH 7.2 เป็นเวลา 5 นาที การกู้คืนแอนติเจนถูกสร้างขึ้นด้วยบัฟเฟอร์ซิเตรต pH 60 เป็นเวลา 25 นาทีในหม้อความดัน สไลด์ถูกล้างใน PBS ต่อจากนั้น ทำการปิดกั้นเปอร์ออกซิเดสภายในร่างกายด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และเมทานอลเป็นเวลา 10 นาทีในความมืด ส่วนต่างๆ ถูกล้างซ้ำใน PBS จากนั้นจึงติดตามการบล็อกของการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจง และสไลด์ถูกบ่มด้วยสารละลายการบล็อก (นมผงพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ ใน PBS) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (ตารางที่ 2) เจือจางใน 1 เปอร์เซ็นต์ BSA ในตู้เย็นข้ามคืน หลังจากการล้างด้วย PBS ส่วนต่างๆ ถูกสัมผัสกับแอนติบอดีทุติยภูมิที่จำเพาะเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง สไลด์ถูกล้างด้วย PBS ชิ้นถูกเปิดเผยด้วย DAB (3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma—Aldrich CO1, USA) หลังจากล้างน้ำไหลอย่างต่อเนื่อง สไลด์ก็ถูกย้อมทับด้วยฮีมาทอกซิลิน อบแห้ง และติดตั้งด้วยแผ่นปิดโดยใช้ Entellan1 ได้ภาพโดยใช้โฟโตไมโครสโคป (Olympus BX51) หรือเลนส์คอนโฟคอล Zeiss LSM 780-NLO บนกล้องจุลทรรศน์ Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG ประเทศเยอรมนี) จากสถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติเกี่ยวกับโฟโตนิกส์ที่ใช้กับเซลล์ ชีววิทยา (INFABIC) ที่ State University of Campinas

การหาปริมาณทางสัณฐานวิทยาพาราฟิน 5 ไมโครเมตรไตวิเคราะห์ส่วนต่างๆ โดยใช้ซอฟต์แวร์ CellSens Dimension จากโฟโตไมโครสโคป (Olympus BX51) ดิไตมีการเข้าถึงชิ้นเพื่อกำหนดพื้นที่ที่เกิดโรคไต, โปรตีน CM และ UB และจำนวนเซลล์, hematoxylin-eosin ที่ย้อมใน 17-DG LP fetus(n=5) เทียบกับลูกหลาน NP ที่จับคู่ตามอายุ (n {{4 }}) จากแม่ที่แตกต่างกัน เราหาปริมาณ CM และ UB ทั้งหมดของแต่ละ metanephros ที่วิเคราะห์ (4NP และ 4LP จากมารดาที่แตกต่างกัน) และการวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดย t-test และค่าต่างๆ แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD p�0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ GraphPad Prism v01 Software, Inc. สหรัฐอเมริกา ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติและการสร้างตัวเลข

การวิเคราะห์ทางสถิติใช้การทดสอบ t และค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) P�0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ ซอฟต์แวร์ GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติและการสร้างตัวเลข

ผลลัพธ์

การแสดงออกของ miRNAs โดย miRNA-Seqเพื่อให้เข้าใจการเปลี่ยนแปลงของ microRNA ที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนต่ำของมารดาไตการเขียนโปรแกรม เราทำนิพจน์ของการวิเคราะห์โปรไฟล์ miRNA ทั่วโลก มันถูกระบุ 44 miRNA ที่ควบคุมไม่ได้ (p � 0.05) โดยที่ 19 และ 25 miRNAs ตามลำดับมีการควบคุมขึ้นหรือลง (ตารางที่ 3) miRNAs ที่แสดงด้านบนและหน้าที่ เส้นทาง และเครือข่ายถูกระบุโดยใช้ซอฟต์แวร์ Ingenuity (ตารางที่ 4)

การตรวจสอบความถูกต้องของการแสดงออก miRNAในสัตว์ของกลุ่ม LP ให้-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p เพิ่มขึ้น ในขณะที่ miR-127-3p, miR-144-3p และ miR-199a-5p ลดลงเมื่อเทียบกับสัตว์ NP ผลลัพธ์ไม่แสดงความแตกต่างในนิพจน์ miR-298 เมื่อเปรียบเทียบทั้งสองกลุ่ม (รูปที่ 1) ตารางที่ 5 แสดงค่าที่ได้จากการจัดลำดับ miRNA ด้วยข้อมูลการตรวจสอบความถูกต้องของ RT-qPCR แม้ว่าความแตกต่างในการแสดงออกของ miRNA อย่างมีนัยสำคัญจะสังเกตพบใน LP ที่สัมพันธ์กับลูกหลานของ NP แต่การเปลี่ยนแปลงการพับ (FC) ของ miRNA ที่ตรวจสอบความถูกต้องแล้วนั้นคล้ายคลึงกับทั้งสองเทคนิค

เป้าหมายของยีน miRNA

ยีนนิพจน์ของเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้ของ miRNA ต่างๆ เช่น Six-2, Bcl-2, PRDM1, cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3 และ Bim ใน LP ไม่แตกต่างจาก NP อย่างมีนัยสำคัญ ทารกในครรภ์ อย่างไรก็ตาม Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 และ IGF1 การแสดงออกของยีนได้รับการควบคุมใน {{15 }}กลุ่ม DG LP เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมที่ตรงกับอายุ ในทางกลับกัน c-Myc และ NOTHC1 ถูกปรับลดในลูกที่จำกัดโปรตีนของมารดา (รูปที่ 2)

มวลกายของทารกในครรภ์และ metanephros morphometryน้ำหนักตัวของ 17-DG LP ไม่แตกต่างจากลูกหลานของ NP ที่จับคู่อายุ อย่างไรก็ตาม metanephros mesenchyme ของ LP พบว่าพื้นที่ลดลง 7.6% และความหนาของเยื่อหุ้มสมองลดลง 29 เปอร์เซ็นต์เมื่อเทียบกับกลุ่ม NP (รูปที่ 3)อิมมูโนฮิสโตเคมีในการศึกษานี้ LP ทารกในครรภ์แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (ประมาณ 69 เปอร์เซ็นต์) ของการเรืองแสงของหมวกหก-2มากกว่าลูกหลาน NP (รูปที่ 4)

การวิเคราะห์ Six-2 immunoperoxidase แสดงให้เห็นจำนวนเซลล์ที่ลดลง (14 เปอร์เซ็นต์ ) ใน LP CM จากที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ที่ลดลง Six-2 บวก 28 เปอร์เซ็นต์ที่สัมพันธ์กับพื้นที่แคปที่เปรียบเทียบกับลูกหลานของ NP (รูปที่ 4) การศึกษาในปัจจุบันยังแสดงให้เห็นเปอร์เซ็นต์ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ภูมิคุ้มกัน c-Myc CM และ UB (น้อยกว่า 14 เปอร์เซ็นต์) ใน LP เมื่อเทียบกับลูกหลานของ NP (รูปที่ 4) นอกจากนี้ เปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ติดฉลาก Ki-67 ใน CM น้อยกว่า 48 เปอร์เซ็นต์ใน LP เมื่อเทียบกับ NP fetus ในขณะที่ Bcl-2 และ caspase ที่แยกออก-3 immunoreactivityไม่แตกต่างจากทั้งสองกลุ่ม (รูปที่ 5 และ 6) การศึกษาในปัจจุบันยังแสดงให้เห็นเปอร์เซ็นต์ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ภูมิคุ้มกัน c-Myc CM และ UB (น้อยกว่า 14 เปอร์เซ็นต์) ใน LP เมื่อเทียบกับลูกหลานของ NP (รูปที่ 4) นอกจากนี้ เปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ติดฉลาก Ki-67 ใน CM น้อยกว่า 48 เปอร์เซ็นต์ใน LP เมื่อเทียบกับ NP fetus ในขณะที่ Bcl-2 และ caspase แยก-3 immunoreactivityไม่แตกต่างจากทั้งสองกลุ่ม (รูปที่ 5 และ 6) ในทางกลับกัน ใน LP พื้นที่ติดฉลาก CM และ UB -catenin เพิ่มขึ้น 154 และ 85 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ เมื่อเทียบกับพื้นที่ที่มีในลูกหลานของ NP (รูปที่ 7) ในเวลาเดียวกัน การกระจายภูมิคุ้มกันของ mTOR ยังครอบครองพื้นที่ที่กว้างขวางมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน LP CM (139 เปอร์เซ็นต์) และ UB (104 เปอร์เซ็นต์) มากกว่าใน NP fetus (รูปที่ 7) ในลูกหลานของ LP TGF -1 ในการย้อมสีเซลล์ UBS เพิ่มขึ้น (ประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์) ในขณะที่ใน CM เซลล์ที่มีภูมิคุ้มกันไม่แตกต่างกันกับกลุ่ม NP (รูปที่ 8) ZEB1 metanephros-stained ซึ่งอยู่ในเซลล์นิวเคลียสของ CM เพิ่มขึ้น 30 เปอร์เซ็นต์ใน LP เมื่อเทียบกับทารกในครรภ์ NP (รูปที่ 8) ในขณะเดียวกัน ZEB2 immunofluorescence แม้ว่าจะมีอยู่ในโครงสร้าง metanephros ทั้งหมด แต่ก็มีความคล้ายคลึงกันในทั้งสองกลุ่มทดลอง (รูปที่ 8) การศึกษาในปัจจุบันโดยคำนึงถึงการแสดงออกของ miRNA และ mRNA และโปรตีน

การอภิปราย

ความรู้เกี่ยวกับกลไกระดับเซลล์และโมเลกุลของการสร้างไตเพิ่มขึ้น [33–37] อย่างไรก็ตาม ปัจจัยด้านกฎระเบียบและเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องมากมายในไตการสร้างเนื้องอกยังไม่ชัดเจน [38] miRNAs มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีนในช่วงไตพัฒนาการ [25, 39–41]. ตามความรู้ของเรา การวิเคราะห์การแสดงออกของ miRNA และ mRNA ในการบริโภค LP ของมารดา 17-เซลล์ mesenchyme เพศผู้ DG ยังไม่ได้รับการดำเนินการ เราขอเสนอกลไกระดับโมเลกุลใหม่ที่เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการสร้างไตในระยะเริ่มต้น ส่งผลให้จำนวน nephron ลดลง เราใช้ NGS เพื่อประเมินการแสดงออกของ miRNA และพบว่ามี 19 miRNAs เพิ่มขึ้นและ 25 ลดลงใน 17-DG LP เมื่อเปรียบเทียบกับ NP metanephros ในบรรดา miRNA ที่ไม่มีการควบคุม 10 อันดับแรก เราเลือก miRNA จำนวน 7 รายการโดยมีเป้าหมายทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวน การแยกความแตกต่าง และการตายของเซลล์ การวิเคราะห์ข้อมูลทั้ง miRNA-Seq และ TaqMan เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันและเฉพาะเจาะจงในการแสดงออกของ miRNA ในสัตว์ LP ที่สัมพันธ์กับสัตว์ควบคุมที่จับคู่อายุ NP

ครอบครัว miR-181 ประกอบด้วยสมาชิกที่ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงสี่คน ได้แก่ miR-181a, miR-181b, miR-181c และ miR-181d [ 42]. ในเซลล์เนื้องอก miR-181a ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งเนื้องอก ยับยั้งการแพร่กระจายและการย้ายถิ่นของเซลล์ และกระตุ้นการตายของเซลล์ [43] การศึกษานี้เผยให้เห็นการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ miR-181a-5p ใน 17-DG LP ที่สัมพันธ์กับลูกหลาน NP ที่จับคู่อายุ แม้ว่าการแสดงออกของ caspase mRNA จะไม่เปลี่ยนแปลง แต่อัตราส่วน mRNA ของ Bax/ Bcl-2 เพิ่มขึ้นสองเท่าใน LP เมื่อเทียบกับลูกหลานของ NP แสดงให้เห็นการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นใน CM ซึ่งบ่งชี้ว่าการตายของเซลล์นั้นถูกควบคุมภายหลังการถอดเสียง จากการศึกษาพบว่า BCL family ส่งเสริมการปลดปล่อย cytochrome จาก mitochondria และยับยั้งการกระตุ้นของ Casp3 ซึ่งจะยับยั้งการตายของเซลล์ [44] หลี่และคณะ ใช้แบบจำลองการบาดเจ็บที่ปอดเฉียบพลันเพื่อเปิดเผยว่า miR-181a ที่แสดงออกมากเกินไปเกี่ยวข้องกับระดับโปรตีน Bcl{18}} ที่ลดลง ในทางกลับกัน miR-181การยับยั้งเพิ่มระดับ Bcl-2 [45] การศึกษานี้ยืนยันผลลัพธ์ของ Lv et al. ซึ่งแสดงให้เห็นว่า miR-181c ควบคุมการแสดงออกของการแสดงออก Six-2 และการเพิ่มจำนวนเซลล์ในทางลบ ขนานกับการสูญเสียฟีโนไทป์ของเซลล์ mesenchymal ในระหว่างไตการพัฒนาใน LP 17-ลูกหลาน DG [25]

เซียงและคณะ แสดงให้เห็นว่าการแสดงออก miR-144 เพิ่มขึ้นยับยั้งไตการแพร่กระจายของมะเร็งทำให้ระยะ G2/M สั้นลง นอกจากนี้ Xiang และคณะ เปิดเผยว่าการแสดงออกของ miR มากเกินไป-144 ยับยั้งยีน mTOR และการแสดงออกของโปรตีน [46] Nijland และคณะ แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของสัญญาณ mTOR มีความสำคัญต่อการกำหนดจำนวน nephrons ในตัวอ่อนที่มารดาต้องอยู่ภายใต้การจำกัดสารอาหาร [47] เป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของราพามัยซินคอมเพล็กซ์ 1 (mTORC1) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาตัวอ่อน อย่างไรก็ตาม วิธีที่ซับซ้อนนี้ควบคุมความสมดุลระหว่างการเจริญเติบโตและการ autophagy ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยาและความเครียดจากสิ่งแวดล้อมยังไม่เป็นที่ทราบ [48] ดังนั้นการส่งสัญญาณ mTOR อาจเกี่ยวข้องกับการตอบสนองของเซลล์ในสัตว์ที่ได้รับ LP ในระหว่างตั้งครรภ์ ในการรับรู้ การเหนี่ยวนำ และการสิ้นสุดของ autophagy; และเพื่อตอบสนองต่อความพร้อมของสารอาหารภายในเซลล์ [46] ตามสมมุติฐาน ในระหว่างการจำกัดโปรตีนอย่างรุนแรง การแสดงออกที่ลดลงของ miR-144-3p อาจสัมพันธ์กับการแสดงออกของ mTOR ที่เพิ่มขึ้น ประมาณ 139 เปอร์เซ็นต์และ 104 เปอร์เซ็นต์ในเซลล์ CM และ UB ตามลำดับ เพื่อชดเชยการสูญเสียไตใน {{ 11}}DG LP ลูกหลาน Chen et al. กำหนด miR-127 เป็นตัวควบคุมใหม่ของความชราของเซลล์ผ่าน Bcl-6 [49] ปานและคณะ รายงานว่า miR{15}} underexpression มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มจำนวนเซลล์ในเซลล์ตับ [50] การศึกษานี้แสดงให้เห็นการลดลงของการเพิ่มจำนวนเซลล์และการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ที่ติดฉลากในเชิงบวกสำหรับ Ki-67 ใน CM ของสัตว์ที่จำกัดโปรตีน นอกจากนี้ยังพบการลดลงของพื้นที่ nephrogenic และการเพิ่มจำนวนในลูกหลานของ LP ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของ Menendez-Castro et al ในลูกหลานที่จำกัดโปรตีนร้อยละ 8.4 [51, 52] ดังนั้น การแสดงออกของ Ki-67 และ Bcl-6 mRNA ที่เพิ่มขึ้น พร้อมด้วยการแสดงออก miR{27}}p ที่ลดลงในฝาครอบ 17-DG LP อาจเกี่ยวข้องกับกลไกการต่อต้านการกำกับดูแลเพื่อรักษา การขยายพันธุ์

ซันและคณะ แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ miR-199a-5p ช่วยลดการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เป็นซีสต์และทำให้เกิดการตายของเซลล์ นอกเหนือไปจากการควบคุมวัฏจักรของเซลล์ [53] ในการศึกษานี้ การแสดงออกของ miR-199a-5p ลดลงใน 17-DG LP มาพร้อมกับการถอดความ Ki-67 ที่เพิ่มขึ้น เครื่องหมายการเพิ่มจำนวนเซลล์ และ Map2k2 สัมพันธ์กับปฏิกิริยา Ki-67 ที่ลดลงใน LP 17-DG metanephros ดังนั้น ภาวะขาดสารอาหารระหว่างตั้งครรภ์จึงส่งเสริมการสร้างความแตกต่างผ่านกลไกหลังการถอดเสียง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็นบทบาทการปราบปรามของซิงค์-ฟิงเกอร์ E box binding homeobox 1 (ZEB1) ซึ่งเป็นตัวเหนี่ยวนำ EMT ซึ่งคงไว้ซึ่งความสมบูรณ์ของเซลล์ต้นกำเนิดในระหว่างการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน -catenin เป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นการถอดรหัส ZEB1 ของนิวเคลียร์ทำให้เกิดนิพจน์ ZEB1 [34] เส้นทางการส่งสัญญาณ TGF ซึ่งเป็นหนึ่งในเส้นทางการศึกษาที่ดีที่สุด สามารถกระตุ้น EMT ในระหว่างการพัฒนาของตัวอ่อน จำเป็นต้องมี TGF เช่นลิแกนด์จำนวนมากสำหรับการพัฒนาของตัวอ่อน อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ว่าผลกระทบที่เกิดจาก TGF ทั้งหมดบน EMT จะขึ้นอยู่กับ ZEB1/2 เซลล์ที่น่าพิศวงสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีน mesenchymal fibronectin และ N-cadherin อย่างไรก็ตาม E-cadherin ไม่ได้รับการควบคุมอีกต่อไป และเส้นใยแอคตินก็ก่อตัวขึ้นด้วย [54] คาร์เนอร์และคณะ รายงานว่าในช่วงไตการพัฒนา Wnt9b/ -catenin

เส้นทางการส่งสัญญาณที่แสดงทั้งใน UB และ CM จำเป็นสำหรับการต่ออายุและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิด nephron ซึ่งจำเป็นสำหรับการก่อตัวของ nephrons ในระหว่างการสร้างตัวอ่อน [55] เส้นทาง Wnt9b/ -catenin ที่ได้รับการอนุรักษ์โดยวิวัฒนาการมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาอวัยวะ เนื้อเยื่อ และการซ่อมแซมการบาดเจ็บในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ การศึกษาแสดงให้เห็นว่า c-Myc เป็นเป้าหมายการถอดรหัสของ -catenin ซึ่งควบคุมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของไตเยื่อบุผิวท่อ [56]. การแสดงออกของ -catenin ที่ระดับยีนและโปรตีนเพิ่มขึ้นในช่วงเวลาที่ศึกษาของไตพัฒนาการในครรภ์ 17-DG LP ปานและคณะ รายงานว่า Myc ร่วมมือกับ -catenin เพื่อส่งเสริมการต่ออายุเซลล์ต้นกำเนิด nephron [10] เมื่อเปรียบเทียบกับลูกหลานของ NP ที่จับคู่อายุ LP แสดงการแสดงออกของ c-Myc ที่ต่ำกว่า ดังนั้น สัตว์เหล่านี้อาจมีเซลล์สำรองที่ต่ำกว่าซึ่งจำเป็นสำหรับการเพิ่มจำนวนและการอยู่รอด และอาจสะท้อนถึงจำนวนที่น้อยกว่าของ nephron ในแบบจำลอง LP นอกจากนี้,

เส้นทางสัญญาณ Wnt/ -catenin และ Notch อาจประสานการควบคุมของการแสดงออก Six-2 และเกี่ยวข้องกับการปรับลดการแสดงออกของ Six-2 ในเซลล์ต้นกำเนิดของเนฟรอน การศึกษาได้แสดงให้เห็นว่าระดับต่ำของ -catenin อาจจำเป็นเพื่อรักษาการแสดงออกของ Six-2 และเซลล์ต้นกำเนิด CM ในสถานะที่ไม่แตกต่างกัน นอกจากนี้ ระดับสูงของ - catenin กำหนดชะตากรรมของเซลล์ต้นกำเนิด nephron [57, 58] ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าลดการส่งสัญญาณ cMyc และ Notch พร้อมกับการแสดงออกของ -catenin ที่เพิ่มขึ้น ลดการแสดงออกหก-2นิพจน์ลง 28 เปอร์เซ็นต์ในลูกหลาน 17-DG LP และสัมพันธ์กับการสร้างความแตกต่างของเซลล์ CM ในช่วงต้นและสเต็มเซลล์ที่ลดลงและ จำนวนเนฟรอนในวัยผู้ใหญ่ นอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังอาจคงไว้ซึ่งในเซลล์ MM ลูกหลานของ LP การแสดงออก Let-7a-5p และ -catenin ที่เพิ่มขึ้นและสัญญาณ Notch ที่ลดลงอาจปรับ c-Myc, Six-2, และการแสดงออกของ Ki-67 ส่งผลให้การต่ออายุตัวเองของเซลล์ต้นกำเนิดลดลง การพร่องของเซลล์ต้นกำเนิด CM ที่เหลือทำให้จำนวน nephron ลดลงและการพัฒนาของความดันโลหิตสูงในหลอดเลือดและไตความผิดปกติในวัยผู้ใหญ่ (รูปที่ 10) สอดคล้องกับของ Boivin et al. ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่า CM -catenin ที่เพิ่มขึ้นขัดขวางการเติบโตของ UB และการสร้างไต [59] จากการศึกษาพบว่า growth factor glial-derived neurotrophic factor (GDNF) ซึ่งเป็นตัวควบคุมที่สำคัญของการเติบโตของ UB ส่งสัญญาณผ่าน c-Ret tyrosine kinase receptor และ Gfra1 co-receptor [60, 61] ในลูกหลานของ 17-DG LP ที่สำคัญ

การเพิ่มการเข้ารหัสตัวรับ c-Ret mRNA ในทางทฤษฎีจะนำไปสู่การเติบโตของ UB ในทางทฤษฎี อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ การแสดงออกของ GDNF นั้นไม่เปลี่ยนแปลง โดยบอกว่าแม้จะมี cRet mRNA เพิ่มขึ้น การแตกแขนงของ UB ก็ลดลง ก่อนหน้านี้ เราสังเกตเห็นการลดลง 28.3 เปอร์เซ็นต์ในกิ่งก้านของท่อไต หลังจากการจำกัดโปรตีนขณะตั้งครรภ์ 14.5 วัน [4] ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการลดลง 28 เปอร์เซ็นต์ในการติดฉลากเซลล์ MM จำนวนหก-2 แม้ว่าจะไม่มีการเปลี่ยนแปลงใน GDNF การถอดความ -catenin อาจโต้ตอบกับตัวรับ c-ret และถูกส่งไปยังนิวเคลียสของเซลล์ UB ส่งเสริมการแสดงออกของ TGF -1 ในเซลล์เยื่อบุผิว ยับยั้งการแตกแขนงของ UB และทำให้เกิดความแตกต่างก่อนวัยอันควรของเซลล์ต้นกำเนิด CM ดังที่เห็นใน {{11} }DG LP ลูกหลาน [62– 64] ดังนั้น GDNF อาจไม่จำเป็นในการไกล่เกลี่ยสัญญาณ mesenchymal ไปยังไตของไต อย่างไรก็ตาม กลไกยังคงต้องอธิบายให้ชัดเจน อันที่จริง เราได้แสดงให้เห็นว่า MM จากลูกหลานของ 17-DG LP แสดงการเพิ่มขึ้นเฉพาะในการแสดงออกของ Let-7 miRNA ส่งผลให้มีความบกพร่องอย่างมีนัยสำคัญไตการพัฒนาจึงยืนยันบทบาทการปรับของยีนเหล่านี้ในจังหวะเวลาของการพัฒนาของไต [65]

ในการศึกษาปัจจัยการเจริญเติบโตคล้ายอินซูลิน (IGF) เบื้องต้น บทบาทที่โดดเด่นของ IGF-1 และ -2 ในการเจริญเติบโตของทารกในครรภ์ได้รับการอธิบายโดยหลักฐานมากมาย แต่โดยอ้อมส่วนใหญ่ พบว่า IGFs ทำหน้าที่เป็นปัจจัยการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างในเซลล์ของทารกในครรภ์ที่เพาะเลี้ยงและตัวอ่อนก่อนการปลูกถ่าย นอกจากนี้ ยังพบว่า IGFs ถูกคัดหลั่งโดยเซลล์ของทารกในครรภ์ที่เพาะเลี้ยงและสารสกัดจากพืชในหลอดทดลอง [66] ปัจจัยการเจริญเติบโต รวมทั้ง IGF อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์บางส่วนหรือทั้งหมด การเปิดใช้งานเส้นทาง IGF ส่งผลให้เกิดการควบคุม EMT โดยการกระตุ้นนิพจน์ ZEB1 [67] แม้ว่าปัจจัยการเติบโตของผู้สมัครหลายรายจะเกี่ยวข้องกับไตการพัฒนาไม่ว่าจะเกี่ยวข้องกับการสร้างไตหรือไม่ อาจต้องใช้ปัจจัยการเติบโตที่แตกต่างกันในแต่ละช่วงเวลา ปัจจัยการเติบโตบางอย่างอาจซ้ำซ้อนในบริบทนี้ ในระหว่างการพัฒนาของตัวอ่อน จำเป็นต้องมี EMT และ MET ตามลำดับเพื่อแยกความแตกต่างของชนิดเซลล์เฉพาะและสร้างโครงสร้างสามมิติ ในการศึกษานี้ พบว่าความสามารถในการเปลี่ยนสภาพระหว่างเยื่อหุ้มเซลล์และเยื่อบุผิวเพื่อรักษาสภาพความเป็นพลาสติกของเซลล์ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีระบบที่เหนี่ยวนำได้สูงในสภาวะ LP สำหรับตัวอ่อน การแสดงออกของตระกูล Let-7 miRNA ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางในเนื้อเยื่อของทารกในครรภ์ต่างๆ การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ Let-7 miRNA เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนที่ลดลงและการเพิ่มขึ้นในช่วงต้นของการสร้างความแตกต่างของเซลล์ MM และทำให้จำนวน nephron ลดลง [27, 15, 68–71] การแสดงออกที่สูงขึ้นของ Let-7 ได้แสดงให้เห็นในสิ่งมีชีวิตที่สูงขึ้นในช่วงสุดท้ายของการสร้างตัวอ่อนในสมองในสัตว์ฟันแทะ [72, 73] นาคลักษมี et al. เปิดเผยว่า ให้-7 นิพจน์ miRNA เปลี่ยนชะตากรรมของเซลล์เยื่อบุผิว UB จากสารตั้งต้นเป็นสถานะที่แตกต่างกัน [71] ในทางตรงกันข้าม Yermalovich et al. แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ Lin28b ซึ่งเป็นโปรตีนที่จับกับ RNA นั้นสัมพันธ์กับ Let{15}} miRNAs ที่กดขี่ แม้ว่า lin28 และ Let-7 จะเป็นตัวควบคุมที่ทราบกันดีอยู่แล้วเกี่ยวกับจังหวะเวลาที่ก่อให้เกิดมะเร็งในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง แต่บทบาทของสิ่งเหล่านี้ในการพัฒนาอวัยวะของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมยังไม่เป็นที่เข้าใจ [65] ในการศึกษานี้ การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ Let-7a-5p miRNA ในทารกในครรภ์ LP อาจสัมพันธ์กับการเพิ่มจำนวนเซลล์ CM ที่ลดลง ซึ่งส่งผลต่อการเกิดไตเมื่อเทียบกับกลุ่ม NP ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าการปราบปรามการเพิ่มจำนวนเซลล์ CM และการหยุดชะงักของการเกิดไตในช่วงต้นที่เกิดจาก Let-7 miRNA ที่เพิ่มขึ้นอาจเกิดขึ้นโดยตรงหรือโดยอ้อมผ่านการแสดงออกที่ลดลงชั่วคราวของ Lin28b ใน 17-DG LP ผลกระทบนี้อาจส่งผลเสียอย่างมากไตการพัฒนาใน 17-DG LP ซึ่งยืนยันว่ายีนนี้ควบคุมจังหวะเวลาของการพัฒนาในระหว่างการสร้างไต ในการศึกษานี้ การแสดงออกของ Let-7a-5p miRNA ที่เพิ่มขึ้นเกิดขึ้นพร้อมกับการแสดงออกของ c-Myc ที่ลดลง Myc เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวน การเจริญเติบโต การตายแบบอะพอพโทซิส และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ในช่วงไตการสร้างอวัยวะ [74–76] ในลูกหลานของ LP 17-DG การแสดงออกของยีน MM c-Myc ลดลง และพื้นที่ของ CM c-Myc immunoreactivity มีขนาดเล็กลง 14 เปอร์เซ็นต์เมื่อเทียบกับในลูกหลานของ NP ในเวลาเดียวกัน จำนวนเซลล์ CM ลดลง 14 เปอร์เซ็นต์ พบว่าลด 48 เปอร์เซ็นต์ Ki-67 immunoreactivity ใน LP เทียบกับลูกหลานของ NP การศึกษาอย่างต่อเนื่องแสดงให้เห็นว่า c-Myc มีบทบาทสำคัญในระยะสุดท้ายของการแยกสาขา UB และในการกระตุ้นการเพิ่มจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดของ CM [74]

CISTANCHE จะปรับปรุงการติดเชื้อในไต/ไต

ระดับเซลล์ต้นกำเนิดลดลงโดยคงสภาพที่ไม่แตกต่าง อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ การแสดงออกที่รุนแรงของ Let-7a-5p miRNA ในการแสดงออกของ c-Myc ที่มีการควบคุม CM ลดลง ซึ่งจะช่วยลดการเพิ่มจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ในระยะแรกใน LP 17-DG ลูกหลาน (รูปที่ 10) การศึกษาเกี่ยวกับไตของหนูเมาส์แปลงพันธุ์ c-Myc เผยให้เห็นการลดลงพร้อมกันในเซลล์ CM ภูมิคุ้มกันของ c-Myc และ S-ix-2 ที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดที่ลดลง [74] การศึกษานี้แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (28 เปอร์เซ็นต์) ในเซลล์บวกหก-2 เซลล์ที่เป็นค่าจำเพาะไตเครื่องหมายระบุเซลล์ต้นกำเนิด เช่นเดียวกับการลดลงที่สังเกตพบในจำนวนเนฟรอน ใน CM ของลูกหลาน 17-DG LP เมื่อเปรียบเทียบกับจำนวนในลูกหลานของ NP ในปี 2552 Fogelgren และคณะ แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีน -2 ยีนลดลงในระหว่างการสร้างเนื้องอกในครรภ์เมื่อสัมพันธ์กับจำนวนไตที่ลดลง ความดันโลหิตสูง และเรื้อรังภาวะไตวาย[77]. ดังนั้น การแสดงออกของยีน -2 ที่ลดลงในเซลล์ต้นกำเนิด CM บ่งชี้ว่ามีการปราบปรามของความแตกต่างที่เกิดจากสัญญาณระหว่างไตการพัฒนาในลูกหลานของ 17-DG LP อย่างไรก็ตาม ควรใช้ความซ้ำซ้อนด้วยความระมัดระวัง—ข้อบกพร่องเล็กๆ น้อยๆ ในการเกิดไตอาจมองเห็นได้ชัดเจนด้วยการวิเคราะห์ที่ละเอียดมากขึ้นหรือภายใต้สภาวะที่ต่างกัน ระดับ mRNA ของ IGF1 สูงที่สุดในช่วงเริ่มต้นของการพัฒนาเมตาเนฟริก โดยมีการตรวจพบการถอดเสียงทั่วทั้ง MM ในขณะที่ระดับของพวกมันลดลงในระหว่างการพัฒนาต่อไป อย่างไรก็ตาม ในช่วงไตการกำเนิดของตัวอ่อน ซึ่งเป็นความสมดุลที่ละเอียดอ่อนระหว่างปัจจัยการเจริญเติบโตของไต (IGF1) และปัจจัยการเจริญเติบโตที่ยับยั้ง (TGF -1) ควบคุมการแตกแขนงของ UB

บทสรุป

แม้ว่าผู้เขียนหลายคนได้ศึกษาเกี่ยวกับการเกิดภาวะไตอักเสบ [34, 37, 78] แต่ก็ยังไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับกลไกที่กำหนดตัวเลขของเนฟรอน การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า miRNA ของเซลล์ต้นกำเนิด MM, mRNA และโปรตีนจำนวนมากมีการเปลี่ยนแปลงในลูกหลาน 17-DG LP ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มจำนวนที่ลดลงและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ในระยะแรก (รูปที่ 11) ความสมดุลที่ละเอียดอ่อนระหว่างการต่ออายุต้นกำเนิดของ nephron และการสร้างความแตกต่างเป็นสิ่งสำคัญสำหรับไตการพัฒนาเนื่องจากความล้มเหลวในการบรรลุจำนวน nephrons ที่เพียงพอเป็นปัจจัยเสี่ยงต่อโรคเรื้อรังไตความผิดปกติ