การถ่ายภาพไต: จากแสงสู่กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูง

ติดต่อ: ali.ma@wecistanche.com

มาเรีย ลูเซีย อันเจล็อตติ^1,2, Giulia Antonelli^1,2 แคโรไลนา คอนเต้^1,2และเปาลา โรมานยานี^1,2

บทคัดย่อ

ความสำเร็จที่สำคัญในไตกลไกทางสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาส่วนใหญ่สามารถกำหนดให้ก้าวหน้าในเทคโนโลยีของกล้องจุลทรรศน์ สิ่งที่เรารู้มากมายเกี่ยวกับสถาปัตยกรรมของไตอิงตามคำอธิบายพื้นฐานของนักจุลกายวิภาคศาสตร์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง และต่อมาโดยการวิเคราะห์โครงสร้างพื้นฐานโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน เทคนิคทั้งสองนี้ใช้สำหรับระบบการจำแนกประเภทแรกของโรคไตและสำหรับการปรับปรุงอย่างต่อเนื่อง อีกไม่นาน ชุดของเทคนิคการสร้างภาพใหม่ได้เพิ่มการวิเคราะห์ในมิติเพิ่มเติมของเวลาและพื้นที่ กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลช่วยให้เราสามารถแสดงภาพส่วนออปติคัลตามแกน z ได้ตามลำดับ และความพร้อมของซอฟต์แวร์การวิเคราะห์เฉพาะที่ให้การแสดงผลสามมิติของตัวอย่างเนื้อเยื่อที่หนาขึ้น กล้องจุลทรรศน์ Multiphoton อนุญาตให้เราตรวจสอบพร้อมกันได้ไตฟังก์ชันและโครงสร้างแบบเรียลไทม์ กล้องจุลทรรศน์แสดงภาพตลอดอายุการเรืองแสงช่วยให้เราศึกษาการกระจายตัวเชิงพื้นที่ของสารเมตาโบไลต์ กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงเพิ่มความไวและความละเอียดได้ถึงระดับนาโน ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด นักวิจัยสามารถเห็นภาพชีวโมเลกุลแต่ละตัวในระดับอะตอมได้โดยตรงในเนื้อเยื่อ และทำความเข้าใจปฏิสัมพันธ์ของพวกมันในระดับเซลล์ย่อย สุดท้ายนี้ แมสสเปกโตรเมตรีด้วยแมสสเปกโตรเมตรีที่ใช้เมทริกซ์ช่วยทำให้สามารถตรวจวัดโมเลกุลต่างๆ ได้หลายร้อยโมเลกุลพร้อมกันบนส่วนเนื้อเยื่อที่ความละเอียดสูง รีวิวนี้ให้ภาพรวมของที่มีอยู่ไตกลยุทธ์การถ่ายภาพ โดยมุ่งเน้นที่ผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากการปรับปรุงเทคโนโลยีล่าสุด

คำสำคัญ:อิมมูโนฮิสโตเคมี,ไตการตรวจชิ้นเนื้อใกล้เคียงท่อ, เซลล์ต้นกำเนิด

Cistanche herba สำหรับโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

การแนะนำ

ดิไตความซับซ้อนของโครงสร้างที่น่าสนใจนั้นจำเป็นต่อการทำหน้าที่ทางสรีรวิทยาที่หลากหลาย ในการเริ่มต้นศึกษาเรื่องไตถูกจำกัดอยู่แค่การสังเกตด้วยตาเปล่าและการมีส่วนร่วมในการวินิจฉัยโรคไตก็จำกัดอย่างปฏิเสธไม่ได้ มีการอธิบายอาการทางคลินิกแต่ไม่ทราบกลไกการก่อโรค ความสำเร็จในการทำความเข้าใจเกี่ยวกับสรีรวิทยาของไตและพยาธิสรีรวิทยาของไตนั้นส่วนใหญ่มาจากความก้าวหน้าอย่างต่อเนื่องในด้านกล้องจุลทรรศน์ ความพยายามที่ไตเริ่มสร้างภาพเมื่อนานมาแล้ว [1] ในปี ค.ศ. 1666 นักกายวิภาคศาสตร์มัลปิกิได้ตรวจสอบไตเนื้อเยื่อด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่มีพลังประมาณ 25-30 และอธิบายเป็นครั้งแรกว่าโกลเมอรูลัสเป็น 'ต่อมที่ปัสสาวะแยกออกจากเลือด'[2] การสนับสนุนนี้ถูกเพิกเฉยจนถึงปี 1842 เมื่อโครงสร้าง nephron ถูกคลี่คลายด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงที่ทรงพลังกว่า 10 เท่าโดย Sir William Bowman Bowman ค้นพบแคปซูล periglomerular (ภายหลังเรียกว่าแคปซูล Bowman) ที่เชื่อมต่อทางกายวิภาคกับส่วนแรกของท่อ [3] ในปี ค.ศ. 1862 จาค็อบ เฮนเลได้บรรยายถึงส่วนของท่อที่มีลักษณะคล้ายลูปซึ่งใช้ชื่อของเขาซึ่งเชื่อมระหว่างท่อเยื่อหุ้มสมองและตุ่มของไต

ต้องขอบคุณการแนะนำของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง การจำแนกทางสัณฐานวิทยาของไตโรคเป็นไปได้ [1] โอกาสที่จะสังเกตสิ่งที่เกิดขึ้นในไตที่เป็นโรคทำให้คนเข้าใจว่าการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาแตกต่างกันอย่างมากระหว่างผู้ป่วยที่มีอาการทางคลินิกที่คล้ายคลึงกัน อย่างไรก็ตาม การศึกษาครั้งแรกเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพในเนื้อเยื่อไตได้ดำเนินการกับตัวอย่างการชันสูตรพลิกศพ ซึ่งนำไปสู่คำอธิบายของโรคเรื้อรังเป็นส่วนใหญ่ การขาดข้อมูลเกี่ยวกับวิวัฒนาการของโรคไตและปัญหาทางเทคนิคของปรากฏการณ์ autolytic ซึ่งสัมพันธ์กับการใช้เนื้อเยื่อหลังการชันสูตรพลิกศพ จำกัด ความรู้เกี่ยวกับโรคของมนุษย์ ในปี พ.ศ. 2494 ได้มีการนำไตการตรวจชิ้นเนื้ออนุญาตให้สังเกตโดยตรงและศึกษาไม่เพียงแต่โรคเรื้อรังเท่านั้น แต่ยังรวมถึงโรคไตเฉียบพลันด้วย ในขณะเดียวกัน กล้องจุลทรรศน์ก็ค่อยๆ มีความซับซ้อนมากขึ้นด้วยความไวและความละเอียดที่เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ จนถึงระดับนาโน ในการทบทวนนี้ เราจะให้ภาพรวมของการค้นพบไตขั้นพื้นฐานที่เป็นไปได้โดยความก้าวหน้าในเทคโนโลยีกล้องจุลทรรศน์ โดยเน้นที่ความเป็นไปได้ที่พัฒนามาจากการพัฒนาทางเทคนิคล่าสุด

การแสดงภาพภูมิคุ้มกันของเด็ก

กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนลาเบลลิ่งและฟลูออเรสเซนซ์

ความเป็นไปได้ที่จะได้รับชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อที่มีชีวิตที่เป็นตัวแทนอนุญาตให้ใช้เทคนิคที่เกิดขึ้นใหม่ซึ่งจำเป็นต้องมีการเก็บรักษาเนื้อเยื่ออย่างสูงสุด เช่น วิธีการทางอิมมูโนฮิสโตเคมี (ฟลูออเรสเซนต์ก่อน แล้วจึงใช้เอนไซม์) ในความเป็นจริง ในปี 1950 Coons ได้พัฒนาวิธีการติดฉลากแอนติบอดีด้วยฟลูออเรสซิน ไอโซไซยาเนต นั่นคืออิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ โดยไม่ทำลายความสามารถในการทำปฏิกิริยาโดยเฉพาะกับแอนติเจนในเนื้อเยื่อของพวกมัน ตั้งแต่นั้นมาอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ก็ถูกรวมไว้ในขั้นตอนการวินิจฉัยเพื่อประเมินตัวอย่างชิ้นเนื้อไตแช่แข็ง เป็นครั้งแรกที่เทคนิคเหล่านี้อนุญาตให้สังเกตอิมมูโนโกลบูลินในไต (Igs) และการสะสมของสารเสริมในผู้ป่วยที่ได้รับผลกระทบจากโรคไตวายเรื้อรัง ทำให้เกิดการเลือกปฏิบัติของพยาธิสรีรวิทยาที่แตกต่างกันซึ่งเกิดจากรอยโรคของเนื้อเยื่อที่ไม่เฉพาะเจาะจง ตัวอย่างเช่น ในโรคไตวายเรื้อรัง (Crescentic glomerulonephritis) [4] นอกจากนี้ ความเป็นไปได้ที่จะสังเกตรูปแบบการย้อมสีที่เป็นลักษณะเฉพาะและการมีเพศสัมพันธ์ของฟลูออเรสซีนกับแอนติบอดีอื่นๆ ที่ไม่ใช่อิมมูโนโกลบูลิน G (IgG) นำไปสู่การรับรู้ถึงการสะสมของอิมมูโนโกลบูลิน A (IgA) ในโรคไตของ IgA เช่นเดียวกับการสะสมในไตหลังติดเชื้อ และโรคไตอักเสบจากเยื่อหุ้มเซลล์ [4]

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้รับการปรับปรุงทางเทคนิคอย่างมากด้วยการเปิดตัวกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลในช่วงปลายทศวรรษ 1980 องค์ประกอบหลักในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลคือการโฟกัสที่จุดไฟและสแกนบนชิ้นงานทดสอบ และรูรับแสงคอนโฟคอลแบบปรับได้ (รูเข็ม) ที่ด้านหน้าของเครื่องตรวจจับซึ่งช่วยให้รวบรวมแสงจากส่วนที่บางรอบระนาบโฟกัสเท่านั้น (เรียกว่าส่วนออปติคัล) กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลช่วยให้สามารถศึกษาไตในร่างกายครั้งแรกในแบบจำลองการทดลองและการสังเกตการดูดซึมและการขนส่งโมเลกุลเรืองแสงผ่านท่อในสภาพที่สมบูรณ์ไตหลังจากเจาะไมโคร อนุญาตให้ศึกษาการทำงานของท่อในสภาวะทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยา [5]

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 นาโนเมตร เนื่องจากการจำกัดการเลี้ยวเบนของแสงที่มองเห็น การฟอกขาว และความเป็นพิษต่อแสง

ทำความเข้าใจกับสิ่งกีดขวางการกรองแบบโกลเมอรูลาร์: กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ความพยายามครั้งแรกในการเอาชนะขีด จำกัด ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แสงและการเรืองแสงคือในปี 1931 เมื่อ Ernst Ruska และ Max Knoll คิดค้นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (EM) ซึ่งใช้ลำแสงอิเล็กตรอนเร่งแทนลำแสงเป็นแหล่งกระตุ้น และมีกำลังการแยกภาพสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (สูงสุด 0.2 นาโนเมตร) สำหรับนวัตกรรมนี้ ในปี 1986 Ernst Ruska ได้รับรางวัลโนเบลสาขาฟิสิกส์ ด้วยพลังความละเอียดที่เพิ่มขึ้น ในไม่ช้าก็เห็นได้ชัดว่าโกลเมอรูลัสไม่ได้เป็นเพียงตัวกรองเชิงกล แต่เป็นอวัยวะที่ซับซ้อนอย่างยิ่งซึ่งประกอบด้วยสามชั้น: เซลล์บุผนังหลอดเลือด เยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของโกลเมอรูลาร์ (GBM) และพอโดไซต์ [9] Transmission EM (TEM) อนุญาตให้มองเห็นภาพเซลล์ไตจากภายใน [10] และเปิดเผยว่าเซลล์บุผนังหลอดเลือดมีเซลล์ที่มีลักษณะ fenestrated บาง ในขณะที่ podocytes มีเนื้อเซลล์ขนาดใหญ่ และขยายกระบวนการ 'foot' หลักและรองที่ยึดกับ GBM และเชื่อมต่อกันผ่าน จุดต่อเชิงเส้น (ไดอะแฟรมเล็กน้อย) (รูปที่ 1B) นอกจากนี้ การสแกน EM (SEM) การจับอิเล็กตรอนที่กระจัดกระจายกลับช่วยให้มองเห็นเซลล์ไตจากพื้นผิวด้านนอก [10] และเผยให้เห็นว่ากระบวนการที่เท้าของพอดไซต์ที่อยู่ใกล้เคียงถูกอินเตอร์ดิจิไทด์และครอบคลุม GBM (รูปที่ 1C) EM ยังคงเป็นเครื่องมือที่ทรงพลังไม่เพียงแต่สำหรับความเข้าใจของ ultrastructure ของ glomerular ปกติเท่านั้นแต่สำหรับความเข้าใจด้วยไตสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยา [11]. การศึกษาจำนวนมากที่ดำเนินการกับตัวอย่างของมนุษย์หรือในแบบจำลองการทดลองได้เปิดเผยว่ากระบวนการของโรคต่างๆ มีความเกี่ยวข้องกับชุดของรูปแบบที่โดดเด่นของการปรับเปลี่ยนโครงสร้างอัลตราซาวด์ ซึ่งแสดงถึงการปรับปรุงเพิ่มเติมเกี่ยวกับระบบการจำแนกประเภทที่กำลังพัฒนาของไตโรคต่างๆ ความสามารถทางเทคนิคในการมองเห็นความซับซ้อนเพิ่มเติมของโครงสร้างพื้นฐานของไตได้รับรองความเชี่ยวชาญของนักพยาธิวิทยา 'nephro'

เทคนิค SEM ล่าสุดซึ่งใช้เครื่องตรวจจับที่มีความไวสูง ทำให้สามารถศึกษาส่วนที่ลึกที่สุดของไดอะแฟรมกรีด และพบว่ามีลักษณะเป็นรูพรุนที่มีขนาดต่างกัน [12] ในหนูแรท การเริ่มต้นของโปรตีนในปัสสาวะมีความสัมพันธ์กับรูพรุนขนาดใหญ่ ทำให้เกิดความเป็นไปได้ที่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างย่อยของไดอะแฟรมแบบผ่าอาจเป็นสาเหตุของการเปลี่ยนแปลงของการเปลี่ยนแปลงของค่า permelectivity ของไต [12] จากความก้าวหน้าทางเทคนิคเพิ่มเติม SEM แบบบล็อกหน้าอนุญาตให้ผ่านจากมุมมอง 2 มิติไปยังมุมมอง 3 มิติของอุปสรรคการกรองไตด้วยความละเอียดเพียงพอที่จะปฏิบัติตามโครงสร้างนาโนของกระบวนการเซลล์ที่บางที่สุดในหนูที่มีสุขภาพดี หนูที่เป็นโรค และในระหว่างไตพัฒนาการ [13, 14].

ในที่สุด การเชื่อมต่อของ EM กับระบบ X-ray microanalysis (X-ray microscopy) ทำให้สามารถวิเคราะห์องค์ประกอบของเซลล์หรือส่วนต่าง ๆ ของเซลล์ในระดับโครงสร้างพื้นฐานได้ กล้องจุลทรรศน์เอ็กซ์เรย์ใช้ TEM การสแกนด้วยลำแสงอิเล็กตรอนแคบเพื่อกระตุ้นตัวอย่าง ผลกระทบของอิเล็กตรอนพลังงานสูงจากลำแสงกับอะตอมในตัวอย่างทำให้เกิดพลังงานในรูปของโฟตอนเอ็กซ์เรย์ สัญญาณเอ็กซ์เรย์นี้ ซึ่งรวบรวมด้วยเครื่องตรวจจับเซมิคอนดักเตอร์แบบกระจายพลังงาน ใช้เพื่อระบุองค์ประกอบที่มีอยู่ในชิ้นงานทดสอบ ด้วยความละเอียดที่ดีที่สุด 30 นาโนเมตร ในไตภาคสนาม เบ็คและทูเราใช้การวิเคราะห์ไมโครเอ็กซ์เรย์อย่างประสบความสำเร็จในการศึกษาการขนส่งไอออนของท่อลำเลียง [15] และความเข้มข้นขององค์ประกอบภายในเซลล์ในเซลล์แบบท่อ [16]

การแสดงภาพทางสรีรวิทยาของไตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบมัลติโฟตอน

Multiphoton microscopy (MPM) ให้ความก้าวหน้าเพิ่มเติมในไตการวิจัย กล่าวคือ ความเป็นไปได้ในการตรวจสอบการทำงานของไตและความสัมพันธ์ของโครงสร้างในเวลาจริงพร้อมกัน [17] แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป การกระตุ้นด้วยโฟตอนสองโฟตอนขึ้นอยู่กับการดูดกลืนแสงสองโฟตอนพร้อมกันโดยมีความยาวคลื่นกระตุ้นสองเท่าซึ่งจำเป็นต่อการกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ด้วยการกระตุ้นด้วยโฟตอนเดียวแบบคลาสสิก (รูปที่ 1D) การใช้เลเซอร์กระตุ้นพลังงานต่ำแบบพัลซิ่งอินฟราเรดที่มีจำหน่ายในท้องตลาดช่วยเพิ่มการเจาะเนื้อเยื่อลึกและลดความเป็นพิษต่อแสง (ภาพที่ 1D) สิ่งนี้ทำให้นักวิจัยสามารถเห็นภาพกระบวนการของเซลล์แบบไดนามิกได้โดยตรงในสัตว์ที่มีชีวิต ซึ่งเป็นคุณลักษณะที่ไม่เคยทำได้มาก่อนด้วยเทคนิคอื่นใด MPM อนุญาตให้หาปริมาณของการทำงานของไตขั้นพื้นฐานและการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา เช่น การซึมผ่านของไต การไหลเวียนของเลือดในหลอดเลือด อัตราการกรองไตเดี่ยวของไต และการไหลของท่อ [17] (รูปที่ 1E และ F) นอกจากนี้ MPM ยังอนุญาตให้มีการศึกษากระบวนการภายในเซลล์เพื่อตอบสนองต่อการบาดเจ็บ รวมถึงการตายของเซลล์และการหลุดร่วง การกลิ้งของเม็ดโลหิตขาว และการสรรหาและการหยุดชะงักของ GBM [17] การปรับปรุงทางเทคนิคเพิ่มเติมช่วยให้การถ่ายภาพภายในหลอดอาหารเป็นเวลานานเป็นเวลาหลายสัปดาห์ [18] ซึ่งเมื่อใช้ร่วมกับหนูดัดแปรพันธุกรรมที่แสดงโปรตีนเรืองแสง ได้ถูกนำมาใช้เพื่อติดตามชะตากรรมของเซลล์เดี่ยวโดยตรงในร่างกายในไตที่มีสุขภาพดีและได้รับบาดเจ็บ [19] และเพื่อ เข้าใจกลไกการหมุนเวียนของเซลล์ไตและการสร้างใหม่ดีขึ้น

เทคนิคการถ่ายภาพแบบไม่มีฉลากยังเป็นไปได้ด้วย MPM โดยใช้ประโยชน์จากการเรืองแสงอัตโนมัติตามธรรมชาติของ nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NADH) เพื่อศึกษาสถานะรีดอกซ์ของเซลล์ท่อหลังได้รับบาดเจ็บ [20] นอกจากนี้ ยังใช้การสร้างฮาร์มอนิกที่สองจากคอลลาเจนไฟบริลลาร์เพื่อหาปริมาณการสะสมคอลลาเจน ซึ่งเป็นเครื่องหมายของการเกิดพังผืดในไต [21] การสร้างฮาร์โมนิกที่สองเป็นกระบวนการทางแสงที่ไม่เป็นเชิงเส้น ซึ่งโฟตอนกระตุ้นสองตัวที่มีความยาวคลื่นเท่ากันมีปฏิสัมพันธ์กับโครงสร้างที่ไม่สมมาตรศูนย์กลางในเนื้อเยื่อชีวภาพ เช่น คอลลาเจนหรือไมโครทูบูล และสร้างโฟตอนใหม่ที่มีความยาวคลื่นเพียงครึ่งเดียว

นวัตกรรมล่าสุดของกล้องจุลทรรศน์ในช่องปากคือการนำกล้องเอนโดสโคปแบบมัลติโฟตอนขนาดเล็กมาใช้ในการถ่ายภาพไตในหนูที่ได้รับยาสลบที่ยังมีชีวิตอยู่ได้สำเร็จ [22] MPM ที่มีการบุกรุกน้อยที่สุดนี้อาจปูทางสำหรับการวินิจฉัยภายในร่างกายแบบเรียลไทม์ โดยไม่ต้องเอาเนื้อเยื่อออก และในเวลาอันสั้น

KIDNEY ในรูปแบบ 3 มิติ: เทคนิคการล้างเนื้อเยื่อและการขยายกล้องจุลทรรศน์

แม้จะมีการปรับปรุงทางเทคโนโลยี แต่หนึ่งในข้อจำกัดหลักสำหรับการถ่ายภาพเชิงปริมาตรที่ลึกกว่านั้นก็คือความทึบของเนื้อเยื่อไต ซึ่งทำให้ไตหนึ่งในอวัยวะที่ท้าทายสายตามากที่สุด นี่เป็นเหตุผลว่าทำไมเทคนิคการล้างเนื้อเยื่อจึงได้รับความสนใจอย่างมาก [23] จุดมุ่งหมายของวิธีการเหล่านี้คือการเปลี่ยนเนื้อเยื่อทึบแสงให้กลายเป็นเนื้อเยื่อโปร่งใส รักษาโปรตีนและสุดท้ายเป็นเครื่องหมายเรืองแสง เพื่อสร้างภาพชิ้นเนื้อเยื่อหนา การรวมกันของการหักล้างด้วยแสงด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัยช่วยให้สามารถวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาได้ เช่น การหาปริมาณของปริมาตรและจำนวนของไต ในเนื้อเยื่อหนา หรือแม้แต่ในไตที่ไม่บุบสลาย [24] การใช้งานอื่นๆ ได้แก่ การวิเคราะห์ส่วนของ tubule ที่แตกต่างกัน [25], หน้าที่ของพวกมัน [26] และการหาปริมาณการสูญเสียของ podocyte [27]

เมื่อต้องการสร้างภาพเนื้อเยื่อปริมาณมาก และในขณะเดียวกัน ให้แก้ไขรายละเอียดโครงสร้างที่ละเอียด เราได้แนะนำแนวทางทางเทคนิคใหม่เมื่อเร็วๆ นี้ นั่นคือ กล้องจุลทรรศน์ขยาย (ExM) แนวคิดคือการขยายอวัยวะทั้งหมด 4- ถึง 5- เท่าโดยคงสภาพสถาปัตยกรรมโดยรวมและเนื้อหาโปรตีน 3 มิติไว้ การใช้พอลิเมอร์แบบขยายตัวซึ่งสังเคราะห์โดยตรงภายในชิ้นงานทดสอบ โมเลกุลที่อยู่ใกล้กว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบนของแสงจะถูกแยกจากกันแบบไอโซโทรปิกในอวกาศจนถึงระยะทางที่ไกลกว่า ดังนั้นจึงสามารถแก้ไขได้ทางสายตาแม้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ทั่วไป นอกจากนี้ ExM ยังให้ความโปร่งใสทางแสงที่มากขึ้นและลดการกระเจิงของแสง ทำให้มองเห็นเนื้อเยื่อในปริมาณที่มากขึ้น ด้วยวิธีการนี้ การแปลโปรตีนหลายชนิดในไดอะแฟรมกรีดและ GBM สามารถผ่าออกได้แม้จะใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลปกติ [28] ตัวอย่างเช่น มันสามารถเปิดเผยกระบวนการทางเท้าในหนูที่มีโปรตีนยูริก ทั้งใน 2D และ 3D ที่ความละเอียดนาโนเมตรที่ไม่เคยมีมาก่อน [29] เมื่อเร็ว ๆ นี้ ExM ถูกใช้สำหรับการประเมินทางคลินิกของฮิสโทพาโธเชิงตรรกะของสิ่งส่งตรวจที่ฝังด้วยพาราฟินที่ย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซินแล้ว [30] เทคนิคนี้สามารถ vi sualize effacement กระบวนการเท้าที่ระดับนาโนที่ก่อนหน้านี้ได้เฉพาะกับ EM เท่านั้น ความก้าวหน้าในการถ่ายภาพเชิงปริมาตรช่วยให้สามารถวิเคราะห์อวัยวะทั้งหมดในรูปแบบ 3 มิติที่มีความละเอียดสูงได้ ในลักษณะที่ข้อจำกัดหลักในการถ่ายภาพในเชิงลึกถูกถ่ายทอดโดยความสามารถของแอนติบอดีในการเจาะเนื้อเยื่อ

การศึกษาโปรไฟล์เมตาบอลิซึม: ไมโครสโคปสำหรับการถ่ายภาพความถี่-โดเมน-ฟลูออเรสเซนต์-ตลอดชีพ

ดิไตเป็นอวัยวะเมตาบอลิซึมที่มีไมโตคอนเดรียในปริมาณสูง รูปแบบที่ลดลงของ NADH และเมแทบอไลต์อื่นๆ เป็นฟลูออเรสเซนต์ตามธรรมชาติ และออโตฟลูออเรสเซนซ์นี้สามารถใช้เป็นดัชนีของสถานะรีดอกซ์ [20] อย่างไรก็ตาม สเปกตรัมการแผ่รังสีของฟลูออโรฟอร์ภายในร่างกายเหล่านี้ซ้อนทับกัน และไม่สามารถระบุแยกกันได้ แต่อายุการเรืองแสง (เช่น การสลายตัวตามเวลาของการเรืองแสง) พบว่ามีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์การถ่ายภาพตลอดอายุการเรืองแสง (FLIM) จึงช่วยให้สามารถศึกษาโปรไฟล์การเผาผลาญได้ [31] เมื่อเร็วๆ นี้ การใช้ MPM และ FLIM ร่วมกัน ทำให้สามารถระบุลักษณะเฉพาะของเมตาบอลิซึมเฉพาะเซลล์และติดตามการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมในร่างกายได้ในระหว่างไตโรคภัยไข้เจ็บ [32]. FLIM คาดว่าจะให้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับไตเมแทบอลิซึมในร่างกายในสุขภาพและโรค

ผลักดันความละเอียดเกินขีดจำกัด: ภาพที่มีความละเอียดสูงสุดของ KIDNEY

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาตรฐานต้องเผชิญกับข้อจำกัดของความละเอียดทางแสงที่เกิน 200 นาโนเมตร เทคโนโลยีใหม่ที่เรียกว่าการถ่ายภาพความละเอียดสูงช่วยให้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้ภาพที่เกินขีดจำกัดการเลี้ยวเบนซึ่งเป็นจุดเริ่มต้นของยุคนาโนสโคป [33] วิธีการเหล่านี้รวมความละเอียดระดับนาโนเข้ากับข้อดีของการติดฉลากเรืองแสงหลากสี ในการรับรู้ถึงผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากนวัตกรรมเหล่านี้ รางวัลโนเบลสาขาเคมีประจำปี 2014 จึงมอบให้แก่ Eric Betzig, Stefan Hell และ William Moerner 'สำหรับการพัฒนากล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่มีความละเอียดสูง สามารถใช้กลยุทธ์ต่างๆ ของการถ่ายภาพความละเอียดสูงเพื่อตอบคำถามทางชีววิทยาที่แตกต่างกัน วิธีการเหล่านี้สามารถจัดกลุ่มได้เป็นสองประเภทหลัก ขึ้นอยู่กับว่าจะใช้ความละเอียดสูงสุดที่ระดับโมเลกุลเดี่ยวหรือที่ตระการตา [33]

เทคนิคตามวงดนตรี

เทคนิคที่ใช้ทั้งมวลทำลายขีดจำกัดการเลี้ยวเบนโดยการปรับลำแสงกระตุ้นแบบชั่วคราวและเชิงพื้นที่ ในหมู่พวกเขา การถ่ายภาพพร่องการปล่อยมลพิษที่กระตุ้นด้วยความละเอียดสูง (STED) ใช้เลเซอร์สองตัว เลเซอร์กระตุ้นและเลเซอร์พร่องสีแดงสลับสีแดง (เลเซอร์ STED) ที่มีรูปร่างเหมือนโดนัท เพื่อยับยั้งการเปล่งแสงเรืองแสงจากฟลูออโรฟอร์ที่อยู่นอก ศูนย์กลางของการกระตุ้น การปราบปรามนี้ทำได้โดยการกระตุ้นการปล่อยและอนุญาตให้รวบรวมเฉพาะสัญญาณที่มาจากจุดโฟกัสที่มีมิติต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบน (รูปที่ 2A) การถ่ายภาพ STED ใช้เพื่อถ่ายภาพไดอะแฟรมกรีดในเลนส์ใสไตเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2B–c') และอนุญาตให้ระบุตำแหน่งการกระจายเชิงพื้นที่ของโพโดซินและเนฟรินที่ระดับนาโนเมตรจนถึงความลึกอย่างน้อย 30 ลูเมน [34] นอกจากนี้ ความเป็นไปได้ในการสังเกตและวัดปริมาณการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้าในแบบจำลองการทดลองสามารถทำให้การถ่ายภาพ STED มีประโยชน์สำหรับการศึกษาสิ่งกีดขวางการกรองไต [34]

กล้องจุลทรรศน์ STED ต้องใช้โปรโตคอลเฉพาะสำหรับการเตรียมตัวอย่าง ฟลูออโรฟอร์พิเศษ และการฝึกอบรมด้านเทคนิค ด้วยเหตุนี้ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาจึงได้รับความสนใจมากขึ้นสำหรับเทคนิคความละเอียดสูงพิเศษอื่น คือ กล้องจุลทรรศน์การส่องสว่างแบบมีโครงสร้าง (SIM) ซึ่งสามารถขยายขีดจำกัดการเลี้ยวเบนได้สองปัจจัยทั้งด้านข้างและตามแนวแกน SIM ใช้การตั้งค่าไมโครสโคปแบบมุมกว้างที่มีรูปแบบการส่องสว่างแบบละเอียด ทำให้สามารถบันทึกข้อมูลความถี่สูง (ซึ่งสัมพันธ์กับรายละเอียดปลีกย่อยในตัวอย่าง) ที่ความถี่เชิงพื้นที่ต่ำ เมื่อได้ภาพหลายภาพที่มีรูปแบบการส่องสว่างของเฟสและทิศทางต่างกัน สามารถสร้างภาพที่มีความละเอียดสูงขึ้นใหม่ได้ (ภาพที่ 3A) ซิมเข้ากันได้กับฟลูออโรฟอร์มาตรฐาน ไม่ต้องการการเตรียมตัวอย่างเฉพาะ และอนุญาตให้แสดงภาพ 3 มิติ จากข้อดีทั้งหมดเหล่านี้ จึงมีการศึกษาที่แตกต่างกันเพื่อประเมินความเป็นไปได้ของการใช้ SIM เป็นเครื่องมือวินิจฉัยอย่างรวดเร็ว [35] ตัวอย่างเช่น มีโอกาสตอบสนองที่สั้นกว่า EM เมื่อเร็ว ๆ นี้ 3D SIM และการประมวลผลภาพอัตโนมัติได้ถูกนำมาใช้เป็นเครื่องมือวินิจฉัยอย่างรวดเร็วของการลดขนาดเท้าโดยใช้ส่วนพาราฟินตามปกติจากการตัดชิ้นเนื้อของผู้ป่วยที่มีโรคที่เปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด [36] (รูปที่ 3B และ C) ความสามารถนี้ในการระบุการเปลี่ยนแปลงของโรคที่ทราบว่าแสดงพยาธิสภาพระดับนาโนได้สำเร็จ ยืนยันว่าซิมเป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มดีสำหรับการวินิจฉัยตามปกติ

วิธีการสร้างภาพตามตำแหน่งโมเลกุลเดี่ยว

เทคนิคเหล่านี้อาศัยความเป็นไปได้ในการเปิดและปิดโมเลกุลฟลูออเรสเซนต์แต่ละรอบแบบวนรอบ ซึ่งอยู่ใกล้เกินกว่าจะแก้ไขได้ ในแนวทางเหล่านี้ โมเลกุลภายในบริเวณจำกัดการเลี้ยวเบนสามารถกระตุ้นที่จุดเวลาที่ต่างกัน เพื่อให้สามารถถ่ายภาพแยกกันและแปลเป็นภาษาท้องถิ่นด้วยความแม่นยำระดับนาโนเมตรโดยการคำนวณหาจุดศูนย์กลาง (รูปที่ 3D) ในบรรดาวิธีการเหล่านี้ กล้องจุลทรรศน์การสร้างใหม่ด้วยแสงสุ่ม (STORM) ถูกนำมาใช้ครั้งแรกในไตการวิจัยในปี พ.ศ. 2556 ด้วยการศึกษาที่เผยให้เห็นการจัดโครงสร้างโมเลกุลที่ซับซ้อนของ GBM ที่มีความแม่นยำระดับนาโนเมตร รวมถึงการปฐมนิเทศของโมเลกุลภายใน [37] ในรูปแบบเมาส์ของโรคไตที่มีมา แต่กำเนิดที่หายาก STORM ได้เปิดเผยการรวมและการวางแนวที่ถูกต้องของลามินิน 521 ภายใน GBM หลังการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ ซึ่งเป็นการเปิดทางเลือกในการรักษาขั้นสูงสำหรับผู้ป่วย [38] การศึกษาอื่นอธิบายการจัดระเบียบของโครงร่างเซลล์ของแอคตินในพอดไซต์ที่ความละเอียดระดับโมเลกุล [39] (รูปที่ 3E–I) จากการค้นพบใหม่ podocytes มีการรวมกลุ่มของแอคตินที่หดตัวซึ่งเชื่อมต่อกับมัดแอคตินที่ไม่หดตัวในกระบวนการที่เท้า ในแบบจำลองการบาดเจ็บของ podocyte โครงสร้างแอคตินในกระบวนการของเท้าถูกถอดออก นำไปสู่การล่มสลายของโครงสร้างที่หดตัวในร่างกายหลัก [39]

การแสดงภาพโครงสร้าง 3 มิติของชีวโมเลกุลพื้นฐานที่ระดับอะตอม: CRYO-ELECTRON MICROSCOPY

จนกระทั่งเมื่อไม่นานมานี้ ความเป็นไปได้ในการศึกษาโครงสร้างของโมเลกุลชีวภาพพื้นฐานจำกัดอยู่ที่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนด้วยความละเอียดไม่กี่นาโนเมตร อุปสรรคทางเทคนิค เช่น ความเสียหายของตัวอย่างจากลำแสงอิเล็กตรอนที่รุนแรง ความเปรียบต่างของภาพต่ำ และการเคลื่อนที่ของโมเลกุลหลังจากการมีปฏิสัมพันธ์กับอิเล็กตรอนหรือความยากลำบากในการเก็บน้ำไว้ในตัวอย่างทางชีววิทยาในสุญญากาศที่ใช้ภายในห้อง EM ทำให้ไม่สามารถแก้ไขโมเลกุลที่มีขนาดต่ำกว่านี้ . การระบายความร้อนของชิ้นงานทดสอบสามารถลดการระเหยของน้ำและความเสียหายที่เกิดจากอิเล็กตรอนได้ [40] จากแนวคิดนี้ cryo-EM ถูกนำมาใช้ในปี 1950 เมื่อไม่กี่ปีที่ผ่านมา การเปิดตัวเครื่องตรวจจับการนับอิเล็กตรอนแบบเดี่ยวได้ผลักดันความละเอียดที่เกินขีดจำกัดก่อนหน้านี้ในที่สุด ในปี 2560 รางวัลโนเบลสาขาเคมีได้รับรางวัลจาก Jacques Dubochet, Joachim Frank และ Richard Henderson สำหรับ 'การพัฒนากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเย็นเพื่อกำหนดโครงสร้างความละเอียดสูงของโมเลกุลชีวภาพในสารละลาย' ความก้าวหน้าเหล่านี้ทำให้สามารถกำหนดโครงสร้างของสารชีวโมเลกุลในสารละลายได้ [41]

ในไตการวิจัยโครงสร้างของโปรตีนพื้นฐานถูกกำหนดที่ระดับอะตอม [42, 43] ในหมู่พวกเขา โครงสร้างของ polycystin ของมนุษย์-2 ซึ่งการกลายพันธุ์มีส่วนทำให้เกิด polycystic ที่โดดเด่น autosomalไตโรค [44] และโครงสร้างของช่องไอออน 6 ไอออนที่เป็นที่ยอมรับของตัวรับชั่วคราวซึ่งการกลายพันธุ์ทำให้เกิด FSGS ในมนุษย์ [43] ถูกกำหนดด้วยความละเอียดไม่กี่อังสตรอม [44]

การทำความเข้าใจพื้นฐานระดับโมเลกุลของโรคไต: กล้องจุลทรรศน์แบบบูรณาการของไต

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีความสนใจเพิ่มขึ้นในแนวทางที่ปราศจากฉลากซึ่งสามารถทำแผนที่สเปกตรัมทั้งหมดของโมเลกุลในเนื้อเยื่อได้อย่างเฉพาะเจาะจงและพร้อมกัน [45] ในหมู่พวกเขา matrix-as-sisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) ช่วยให้สามารถวัดโมเลกุลต่างๆ ได้หลายร้อยโมเลกุลพร้อมกันโดยตรงบนส่วนเนื้อเยื่อที่ความละเอียดสูง ในการทดลอง MALDI-IMS ส่วนของเนื้อเยื่อบาง แช่แข็งหรือฝังด้วยพาราฟิน เคลือบด้วยเมทริกซ์ที่ดูดซับพลังงานเลเซอร์และส่งเสริมการแตกตัวเป็นไอออนของสารวิเคราะห์เนื้อเยื่อ การวิเคราะห์ในแมสสเปกโตรมิเตอร์จะสร้างสเปกตรัมสำหรับแต่ละพิกัด x/y หลังจากการวัด MALDI ส่วนของเนื้อเยื่อเดียวกันสามารถย้อมด้วยกระบวนการฮิสโตเคมีและอิมมูโนฮิสโตเคมีแบบดั้งเดิมเพื่อรวมรูปแบบโมเลกุลเข้ากับรายละเอียดทางเนื้อเยื่อวิทยา ในการวิจัยเกี่ยวกับไต MALDI-IMS ใช้เพื่อศึกษายา สารเมตาบอลิซึม ไขมัน เปปไทด์ และโปรตีนในเนื้อเยื่อปกติและเนื้อเยื่อที่เป็นโรค [45]

การใช้ MALDI-IMS บ่อยครั้งที่สุดคือการระบุเครื่องหมายโมเลกุลเพื่อจำแนกมะเร็งเซลล์ไต [46] และเพื่อสร้างระยะขอบที่แท้จริงระหว่างเนื้อเยื่อมะเร็งและเนื้อเยื่อปกติที่ระดับโมเลกุลและระดับเนื้อเยื่อ [47] นอกจากนี้ยังประสบความสำเร็จในการใช้ MALDI-IMS ในการศึกษาความเป็นพิษของยาในไตเพื่อตรวจหาสารพิษในระยะเริ่มต้นไตกลไกของความเสียหายที่เป็นตัวกลางโดยผู้สมัครทางเภสัชกรรม [48] นอกจากนี้ MALDI-IMS ยังใช้ในการศึกษาไขมันและบทบาทในโรคไต เช่น โรคไตจากเบาหวาน [49] อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน [50] และถุงน้ำหลายใบไตโรค [51] และเพื่อเปิดเผยโปรไฟล์การเผาผลาญภายในร่างกายเพื่อให้เข้าใจกลไกที่เกี่ยวข้องกับโรคอย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้น [52] การระบุโปรไฟล์ระดับโมเลกุลได้รับการสรุปสำหรับ biomarkers ที่เป็นไปได้ซึ่งอาจเป็น biomarkers ในการวินิจฉัยและพยากรณ์โรคที่เป็นไปได้ใหม่ [53, 54]

บทสรุปและมุมมองในอนาคต

การปรับปรุงเทคนิคการถ่ายภาพอย่างต่อเนื่องได้แก้ปัญหาอุปสรรคทางเทคนิคที่สำคัญหลายอย่างในไตการวิจัยและอนุญาตให้แสดงภาพแบบไดนามิกของโครงสร้างและการทำงานในไตปกติและไตที่เป็นโรค อันที่จริง การถือกำเนิดของเทคโนโลยีกล้องจุลทรรศน์แบบใหม่ได้ทำให้เกิดการค้นพบทางวิทยาศาสตร์ขั้นพื้นฐาน และต่อมาได้เปลี่ยนมุมมองของเราเกี่ยวกับสรีรวิทยาของไตและพยาธิสรีรวิทยาที่ขณะนี้สามารถแสดงเป็นภาพ 3 มิติและแม้แต่ถ่ายทำในวิดีโอ ซึ่งเวลาแสดงถึงมิติที่สี่ ด้วยนวัตกรรมทางเทคโนโลยีล่าสุดของกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงและความก้าวหน้าของเทคนิคการถ่ายภาพระดับโมเลกุล นักวิจัยสามารถเห็นภาพโมเลกุลชีวภาพแต่ละตัวได้โดยตรงในเนื้อเยื่อและกำหนดวิธีที่พวกมันโต้ตอบในระดับเซลล์และเซลล์ย่อย

ความเป็นไปได้ที่จะใช้เครื่องมือเหล่านี้กับพยาธิวิทยาไตตัวอย่างที่เน้นรายละเอียดระดับโมเลกุลและเซลล์ย่อยในการตรวจชิ้นเนื้อทางคลินิก ควรช่วยในการจำแนกประเภทโรคใหม่ ปัจจุบันนี้ยังไม่มีความชัดเจนหากและเมื่อใดจะส่งผลต่อการวินิจฉัยโรคไตหรือแม้แต่การจัดการผู้ป่วย

เงินทุน

เงินทุนจัดทำโดย European Research Council ภายใต้โครงการวิจัยและนวัตกรรม Horizon 2020 ของสหภาพยุโรป (อนุมัติข้อตกลง 648274)

ข้อมูลอ้างอิง

1. วีนนิ่ง เจเจ, เจนเน็ต เจซี. เหตุการณ์สำคัญทางประวัติศาสตร์ในพยาธิสภาพของไต Virchows ซุ้มประตู 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitio anatomica. โบโลญญา1666

3. Bowman W. เกี่ยวกับโครงสร้างและการใช้ร่าง Malpighian ของไตโดยมีการสังเกตการไหลเวียนผ่านต่อมนั้น Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. การเพิ่มขึ้นของพยาธิสภาพของไตในโรคไต: โครงสร้างส่องสว่างการทำงาน แอม เจไตพ.ศ. 2556; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอลในหลอดทดลองและการเจาะขนาดเล็กในหนูที่ยังไม่บุบสลาย Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 การปิดล้อมจะสร้าง podocytes ที่หายไปใน nephrons ของเยื่อหุ้มสมองโดยเฉพาะโดยกำหนดเป้าหมายกลไกป้อนกลับของ podocyte-progenitorไตอินท์ 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, จับคู่ A และคณะ การเจริญเติบโตมากเกินไปของเซลล์ท่อที่เกี่ยวข้องกับ Endocycle และการแพร่กระจายของต้นกำเนิดช่วยฟื้นฟูการทำงานของไตหลังจากเฉียบพลันไตบาดเจ็บ. แนท คอมมูนิตี้ 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับรูปแบบโครงสร้างที่พบใน glomerulosclerosis Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. ทิชเชอร์ ซีซี. กายวิภาคศาสตร์เชิงหน้าที่ของไต. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. Electron microscopy ในไตการวิจัย: การเห็นคือความเชื่อ Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Strong ML, Evers P. มิติที่สามในการวินิจฉัยไต การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของไตปกติและผิดปกติ S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A และคณะ การถ่ายภาพโครงสร้างพื้นฐานที่มีรูพรุนของรอยผ่ากรีดเยื่อบุผิวไต J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K และคณะ ต้องใช้ Vinculin เพื่อรักษาความสมบูรณ์ของสิ่งกีดขวางของไตไตอินท์ 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y และคณะ กระบวนการทางสัณฐานวิทยาของการพัฒนา podocyte เปิดเผยโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดหน้าบล็อก เจเซลล์วิทย์ 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX และคณะ การวิเคราะห์ไมโครเอ็กซ์เรย์โพรบอิเล็กตรอนของการขนส่งอิออน transepithelial Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J และคณะ ความเข้มข้นของธาตุภายในเซลล์ในเซลล์ท่อไต การวิเคราะห์อิเล็กตรอนไมโครโพรบ Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. นวนิยายในเทคนิควิฟเพื่อให้เห็นภาพไตกายวิภาคศาสตร์และหน้าที่ ไต Int 2015; 88: 44–51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E และอื่น ๆ การกระตุ้นด้วยมัลติโฟตอนความยาวคลื่นยาวเป็นประโยชน์สำหรับ intravitalไตภาพไตอินท์ 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K และคณะ การติดตามชะตากรรมของเซลล์เยื่อบุผิวไตในร่างกายโดยใช้การสร้างภาพมัลติโฟตอนแบบอนุกรมในเมาส์รุ่นใหม่ที่มีแท็กเชื้อสายเรืองแสง แนท เมด 2013; 19: 1661–1666

20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N และอื่น ๆ การถ่ายภาพด้วยมัลติโฟตอนเผยให้เห็นความแตกต่างในการทำงานของไมโตคอนเดรียระหว่างกลุ่มของเนฟรอน เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2009; 20: 1293–1302