การยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ไตของแมว Crandell-Rees โดย Senescence ที่เกิดจาก X-ray

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

มานาบุ โคอิเกะ^1,2)*, ยาสุโตโมะ ยุโทคุ¹⁾และ อากิ โคอิเกะ¹⁾

บทคัดย่อ.มีรายงานการดื้อต่อรังสีและความเป็นพิษต่อกัมมันตภาพรังสีหลังการรักษามะเร็งในแมว การปรับปริมาณรังสีให้เหมาะสมเพื่อกระตุ้นผลกระทบต่อเซลล์มะเร็งเท่านั้นและไม่ใช่เซลล์ปกติเป็นสิ่งสำคัญในการบรรลุการฉายรังสีที่มีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม กลไกของการต้านทานรังสี ความเป็นพิษของรังสี และการตอบสนองต่อความเสียหายของดีเอ็นเอ (DDR) ในเซลล์แมวยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน การแตกของ DNA สองสาย (DSB) เป็นชนิดที่เป็นพิษมากที่สุดของดีเอ็นเอความเสียหายที่เกิดจากรังสีเอกซ์และลำแสงไอออนหนักที่ใช้ในการรักษามะเร็ง Crandell-Rees Felineไต(CRFK) เซลล์เป็นหนึ่งในเซลล์แมวที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในการวิจัยด้านชีววิทยาศาสตร์ ที่นี่เรารายงานว่าDSB-กระตุ้นการชราภาพที่เกิดจากรังสีเอกซ์มีความสำคัญในการยับยั้งการแพร่กระจายของCRFKเซลล์. เราแสดงให้เห็นโดยการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ว่ารังสีเอกซ์ที่ขนาด 2 Gy และ 10 Gy เป็นพิษต่อCRFKเซลล์ที่ฉายรังสีเซลล์ CRFK ยับยั้งการเพิ่มจำนวน ในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสีด้วย X การเพิ่มขึ้นตามขนาดยาในความชราภาพที่กระตุ้นด้วย DSB ถูกตรวจพบตามการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและโดยใช้การทดสอบการย้อมสีกาแลคโตซิเดสที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ นอกจากนี้ ข้อมูลของเราระบุว่าในCRFKเซลล์ ซึ่งเป็นเส้นทางหลัก DDR ซึ่งเกี่ยวข้องกับฟอสโฟรีเลชันของH2AXที่ Ser139 ถูกเปิดใช้งานโดย ATM kinases ตามปกติ การค้นพบของเรามีประโยชน์ในการทำความเข้าใจเกี่ยวกับการเสื่อมสภาพของเซลล์ที่เกิดจากรังสีเอกซ์ และในการอธิบายผลกระทบทางชีวภาพของรังสี เช่น ความเป็นพิษ ในเซลล์แมว นอกจากนี้ การค้นพบของเรายังชี้ให้เห็นว่าสายเซลล์ CRFK เป็นเมทริกซ์ที่ยอดเยี่ยมสำหรับการอธิบายการต้านทานรังสีและความเป็นพิษของรังสีในเซลล์แมว

คีย์เวิร์ด:แมว, สัตว์เลี้ยง, การทำลายดีเอ็นเอสองเกลียว, การแผ่รังสี, ความชราภาพ

สารสกัดจาก Cistanche Deserticola: ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

สัตว์คู่หูมีบทบาทสำคัญมากขึ้นในสังคมมนุษย์ เนื่องจากการยืดอายุของสัตว์เลี้ยง จำนวนสุนัขและแมวสูงอายุจึงเพิ่มขึ้น และสุนัขและแมวจำนวนมากได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นมะเร็งใหม่ทุกปี [26, 27] การฉายรังสี ซึ่งเป็นหนึ่งในสามการรักษาโรคมะเร็ง มีการใช้กันมากขึ้นในโรงพยาบาลสัตวแพทย์ เพื่อเป็นทางเลือกในการรักษามะเร็งในสุนัขและแมว [24, 26] เพื่อให้ได้การฉายรังสีที่มีประสิทธิภาพสูงสุด สิ่งสำคัญคือต้องปรับสมดุลความเป็นพิษระหว่างเซลล์ปกติและเซลล์มะเร็ง ในขณะเดียวกัน แม้ว่าจะพบการต้านทานรังสีในแมวและเนื้องอกในแมวหลังการรักษาด้วยรังสีมะเร็ง แต่กลไกของการดื้อยาดังกล่าวยังไม่ได้รับการชี้แจง [24]

มีการศึกษาจำนวนมากเกี่ยวกับผลกระทบของรังสีต่อเซลล์ที่ได้จากมนุษย์และหนู [6, 10, 23, 28] จีโนมดีเอ็นเอเป็นเป้าหมายทางชีววิทยาหลักของการรักษาที่ใช้รังสี เช่น รังสีเอกซ์และบีมไอออนหนัก Double-strand break (DSB) เป็นประเภทที่สำคัญที่สุดของความเสียหายของ DNA ที่เกิดจากรังสี เส้นทางการตอบสนองความเสียหายของ DNA (DDR) ที่หลากหลาย รวมถึงการตรวจจับความเสียหายของ DNA การส่งสัญญาณ DDR และการซ่อมแซม DNA จะเปิดใช้งานเมื่อ DSB เกิดขึ้น เป็นผลให้เซลล์ฟื้นตัวจากการบาดเจ็บจากรังสีและ DNA ที่ได้รับผลกระทบได้รับการซ่อมแซมอย่างถูกต้องและมีประสิทธิภาพ [8, 25] ในเซลล์ของสุนัขและแมว DSB อาจซ่อมแซมได้เป็นส่วนใหญ่โดยกลไกการซ่อมแซม non-homologous end-joining (NHEJ) ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการยึดเกาะของปลาย DSB ของ Ku heterodimer ซึ่งประกอบด้วย Ku70 และ Ku80 [14–17] อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงเรื่องนี้ นอกจากนี้ ในระยะเริ่มต้นของการซ่อมแซม ไคเนส เช่น DNA-PK และ ATM kinases ถูกกระตุ้น และ phosphorylate Ser139 เหล่านี้ของฮิสโตน H2AX ใกล้ไซต์ DSB [5, 6] มีแนวโน้มว่า DSB จะกระตุ้นกลไกการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ ซึ่งรวมถึงการตายของเซลล์และการชราภาพ เมื่อเซลล์ไม่สามารถซ่อมแซมได้ [9, 32] กลไกระดับโมเลกุลของ DDR ต่างๆ เช่น การซ่อมแซม DNA ในเซลล์แมว ได้รับการศึกษาไม่ดีนัก

Crandell-Rees Feline ผู้เป็นอมตะไต(CRFK) สายเซลล์เป็นหนึ่งในสายเซลล์แมวที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุด กลุ่มเซลล์ CRFK ก่อตั้งขึ้นครั้งแรกในปี 2507 จากไตเยื่อหุ้มสมองของลูกแมวเพศเมียอายุ 12-สัปดาห์ [3] แครนเดลและคณะ [3] อธิบายว่ากลุ่มเซลล์ CRFK มีประโยชน์ในการวิจัยไวรัสในแมวและยาวินิจฉัย และกลายเป็นที่สนใจเป็นพิเศษในการวิจัยโรคมะเร็ง ในปัจจุบัน สายเซลล์ CRFK เป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้ในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต รวมถึงการวิจัยมะเร็งและไวรัส ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจความไวของรังสีของเซลล์ CRFK ซึ่งมีการวิเคราะห์เส้นทางของโมเลกุลต่างๆ เพื่อให้ได้ข้อมูลการวิจัยเบื้องต้นเพื่ออธิบายกลไกระดับโมเลกุลของผลกระทบทางชีวภาพของรังสีในแมว อย่างไรก็ตาม ขณะนี้ยังไม่มีรายงานเกี่ยวกับผลกระทบและกลไกของการแผ่รังสีต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ CRFK

ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบผลกระทบทางชีวภาพของรังสีเอกซ์ต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ CRFK การค้นพบของเราระบุว่ารังสีเอกซ์ยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ CRFK อย่างเห็นได้ชัด นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเรายังชี้ให้เห็นว่าการปราบปรามการเพิ่มจำนวนนั้นเกิดจากการเสื่อมสภาพของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นซึ่งกระตุ้นโดย DSB นอกจากนี้ เรายืนยันในเซลล์ CRFK ว่าเส้นทาง DDR หลักเปิดใช้งานตามปกติโดย ATM kinase

สารสกัด cistanche tubolosa: รักษาโรคไต

วัสดุและวิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์ สารเคมี และการเอ็กซ์เรย์

เซลล์ CRFK (HSRRB, โอซาก้า, ญี่ปุ่น) ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [17] เซลล์ที่อยู่ติดกันถูกฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์ที่ 1, 2 หรือ 10 Gy และที่อัตราขนาดยา 0.71–077 Gy/นาที (200 kV/20) mA ด้วย 0.5-mm Al และ 0.5-mm Cu filters) โดยใช้ Pantak HF320S (Shimadzu, Kyoto, Japan) ที่อุณหภูมิห้องตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [17] ซื้อ KU-55933 ซึ่งเป็นตัวยับยั้งไคเนสของ ATM จาก Wako Pure Chemical (โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น) KU-55933 ถูกเจือจางใน DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) และเจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อทันทีก่อนใช้งาน

การกำหนดจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต

การทดสอบการแยกสีน้ำเงิน Trypan ใช้เพื่อกำหนดจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต เซลล์ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 2.2 × 104 เซลล์ต่อจานในจานขนาด 60-มม. วันรุ่งขึ้น เซลล์ถูกฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์และฟักเป็นเวลา 5 วันหลังการฉายรังสี ต่อจากนั้น เซลล์ถูกล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) แขวนลอยในสารละลายทริปซิน-EDTA (T3924, Sigma-Aldrich) รวบรวม ปั่นเหวี่ยง ย้อมด้วยสารละลายทริปแพนบลู 4 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร ( Wako Pure Chemical) หรือ 0.4 เปอร์เซ็นต์ Trypan Blue (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) และนับโดยใช้ TC10™ Automated Cell Counter (Bio-Rad) การฉายรังสีทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

การสกัดโปรตีนทั้งหมดและการวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [11, 17] โดยมีการดัดแปลงต่อไปนี้ โปรตีนทั้งหมดถูกอิเล็กโตรโฟเรสใน Extra PAGE One Precast Gel 5–20 เปอร์เซ็นต์ (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) หรือ Super Sep ACE Gel 5–20 เปอร์เซ็นต์ (Wako Pure Chemical) ผลิตภัณฑ์ที่แยกส่วนถูกถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าไปยังเยื่อ Hybond-P (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) จากนั้นเยื่อหุ้มถูกบล็อกใน Blocking One (Nacalai Tesque) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องและบ่มด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน H2AX ของเมาส์ (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc., Charlottesville, VA, USA) หรือ mouse -actin monoclonal antibody ( ซิกมา-อัลดริช) หลังจากล้าง เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วย IgG HRP-Linked Whole Ab ที่เชื่อมโยงกับหนู (จากแกะ) (NA931) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง Immunoblotting ดำเนินการโดยใช้ Select Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) แถบโปรตีนถูกแสดงภาพโดยใช้ระบบ ChemiDoc XRS (Bio-Rad)

อิมมูโนไซโตเคมี

การสร้างภูมิคุ้มกันได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12, 17] โดยมีการปรับเปลี่ยนดังต่อไปนี้ โดยสังเขป เซลล์ที่เพาะเลี้ยงได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาที ซึมผ่านด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 ใน PBS เป็นเวลา 5 นาที บล็อกโดยใช้สารละลายการบล็อก และบ่ม ด้วยเมาส์ anti- H2AX โมโนโคลนัลแอนติบอดี (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc.) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างเซลล์ด้วย PBS การตรวจจับได้ดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีทุติยภูมิแบบคอนจูเกตของ Alexa Fluor 568- (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) หรือแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตที่เชื่อมด้วยฟลูออเรสซินไอโซไทโอไซยาเนต (Cappel Laboratories, Durham, NC, USA) ). จากนั้น นิวเคลียสถูกย้อมด้วย 0.025 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ 4,6-ไดอะมิโน-2-สีย้อมเรืองแสงฟีนิลลินโดล (DAPI) 4,6-ไดอะมิโน-2-สีย้อมเรืองแสง (DAPI) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) ได้ภาพเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงโอลิมปัส BX51 (โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล (Olympus DP50, Olympus)

กาแลคโตซิเดสที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SA- -gal) การทดสอบการย้อมสี

สำหรับการทดสอบนี้ เซลล์ (5 × 103) ถูกชุบในเพลต 35-มม. และย้อมโดยใช้ชุดการย้อมสี Senescence -Galactosidase (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) 5 วันหลังจาก การฉายรังสีตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยมีการปรับเปลี่ยนดังต่อไปนี้ นิวเคลียสถูกย้อมด้วยสีย้อมเรืองแสง DAPI 0.025 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ภาพเซลล์ที่เปื้อนหลังจาก 18 ชม. ได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์โอลิมปัส CKX41 ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล (Olympus DP12, Olympus) หรือใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ของโอลิมปัส BX51 ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล (Olympus DP50) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่ย้อมในเชิงบวกถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์สามฟิลด์สุ่มอย่างน้อย 100 เซลล์แต่ละเซลล์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Image J ขนาดของนิวเคลียสของเซลล์ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์สนามสุ่มสามสนาม เซลล์ละ 10 เซลล์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Image J การฉายรังสีทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า

Annexin V/propidium iodide (PI) apoptosis assay

เซลล์ (2.2 × 104) ถูกชุบในเพลต 60- มม. และฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์ในวันถัดไป ห้าวันหลังจากการฉายรังสี เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและย้อมด้วย Annexin V Alexa Fluor 488-PI-solution (Tali™ Apoptosis Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ใช้การเจือจาง 200-เท่าของสารละลายย้อมสี PI สำหรับการย้อมสี นอกจากนี้ เซลล์ที่ติดฉลาก-apoptotic ของ Annexin V ยังถูกตรวจพบโดยใช้ Cytometer (Invitrogen) ที่ใช้ Tali Image การฉายรังสีทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์ทางสถิติแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n{0}}) การวิเคราะห์ทางสถิติไม่รวมขนาดนิวเคลียร์ดำเนินการโดยใช้การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ ANOVA และ Ryan (ANOVA4 บนเว็บ https://www.hju.ac.jp/~kiriki/anova4/) ขนาดนิวเคลียร์ประเมินโดยการทดสอบ t ของนักเรียน ค่า P ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

cistanche ชีวิตในทะเลทราย

ผลลัพธ์

การยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ CRFK โดยรังสีเอกซ์

เพื่อตรวจสอบผลกระทบของรังสีเอกซ์ต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ CRFK ทำการฉายรังสีที่ 2 และ 10 Gy ดังแสดงในรูปที่ 1 การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (P<0.05). these="" findings="" indicate="" that="" the="" proliferation="" was="" inhibited="" by="" x-rays="" at="" both="">

การเหนี่ยวนำ DSB ในเซลล์ CRFK โดย X-rays

ฟอสโฟรีเลชั่นของ H2AX ที่ Ser139 เป็นหนึ่งใน DDRs แบบเซลลูลาร์หลักและต้นทางไปยัง DSB [8, 20, 28] H2AX เป็นไบโอมาร์คเกอร์มาตรฐานทองคำสำหรับ DSB [8, 20, 28] ก่อนหน้านี้ โดยใช้ Western blotting เราได้กำหนดการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ H2AX ในเซลล์ CRFK ระหว่าง 1 ชั่วโมงถึง 24 ชั่วโมงหลังการฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์ที่ปริมาณ 10 Gy [17] ครั้งเดียว เป็นผลให้ระดับการแสดงออกของ H2AX สูงที่สุดหลังจาก 1 ชั่วโมง [17] เพื่อตรวจสอบว่ามีการเหนี่ยวนำให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน H2AX ในสารสกัดทั้งหมดจากเซลล์ CRFK 1 ชั่วโมงหลังการฉายรังสีที่ขึ้นกับขนาดยาหรือไม่ การวิเคราะห์แบบ western blot ได้ดำเนินการด้วยแอนติบอดีต้าน H2AX ดังแสดงในรูปที่ 2A การวิเคราะห์ western blot ระบุว่าการแสดงออกของ H2AX เพิ่มขึ้นขึ้นอยู่กับปริมาณรังสีเอกซ์ ต่อไป เราตรวจสอบว่ามีการตรวจพบโฟกัส H2AX ในเซลล์ที่ฉายรังสีหรือไม่โดยการทดสอบการสร้างภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีต้าน H2AX ผลลัพธ์ของเราระบุว่าจุดโฟกัส H2AX ก่อตัวขึ้นในนิวเคลียสของเซลล์ CRFK ที่ 1 ชั่วโมงหลังการฉายรังสี (รูปที่ 2B)

ฟอสโฟรีเลชันที่ขึ้นกับ ATMkinase ของ H2AXat Ser139 ในเซลล์ CRFK โดยรังสี

บทบาทที่สำคัญอย่างหนึ่งของ ATGM kinase หรือ DNA-PK ใน DDR ที่ถูกกระตุ้นโดยรังสีเอกซ์คือการสร้างฟอสโฟรีเลต H2AX รอบไซต์ DSB ในเซลล์มนุษย์และสัตว์ฟันแทะต่างๆ [18, 29]; อย่างไรก็ตาม บทบาทดังกล่าวยังไม่ได้รับการตรวจสอบในเซลล์แมว รวมทั้งเซลล์ CRFK เพื่อยืนยันว่า ATM kinase มีหน้าที่ในการทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน H2AX ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสีเอกซ์ที่ Ser139 ในเซลล์ CRFK หรือไม่ เซลล์ถูกบ่มในตัวกลางที่มีตัวยับยั้งไคเนส ATM KU-55933 (10 µM) หรือตัวทำละลาย (DMSO) สำหรับ 1 ชั่วโมงก่อนการฉายรังสี (10 Gy) ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3 การก่อตัวของจุดโฟกัส H2AX ถูกยับยั้งในเซลล์ที่ฉายรังสีต่อหน้า KU- 55933 ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ATM เป็นไคเนสหลักสำหรับฟอสโฟรีเลชันของ H2AX ที่ Ser139 ที่เหนี่ยวนำโดยการฉายรังสีในเซลล์ CRFK

การชักนำให้เกิดการชราภาพในเซลล์ CRFK โดยรังสีเอกซ์

เพื่อตรวจสอบว่าการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ CRFK ในการตอบสนองต่อการฉายรังสีนั้นเกี่ยวข้องกับการชราภาพและการตายของเซลล์หรือไม่ เซลล์ถูกฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์ที่ 2 และ 10 Gy อย่างแรก 5 วันหลังจากการฉายรังสี เซลล์ถูกวิเคราะห์โดยใช้ SA- -การย้อมด้วยสี Gal ซึ่งเป็นการสอบวิเคราะห์มาตรฐานระดับทองสำหรับการชราภาพ เราสังเกตสัณฐานที่จำเพาะต่อความชราภาพ เช่น รูปร่างของเซลล์ขนาดใหญ่และแบน (รูปที่ 4A) และนิวเคลียสที่ผิดปกติ ซึ่งรวมถึงนิวเคลียสที่ขยายใหญ่ขึ้นหรือมีหลายนิวเคลียส (รูปที่ 4B) ในเซลล์ที่ฉายรังสี นอกจากนี้ ในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสี SA- -เซลล์ gal-positive เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4A–C) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์เชิงปริมาณการขยายขนาดของนิวเคลียสของเซลล์ ซึ่งเป็นเครื่องหมายอีกตัวหนึ่งสำหรับเซลล์ชราภาพ ดังแสดงในรูปที่ 4D ขนาดของนิวเคลียสของเซลล์มีขนาดใหญ่กว่าอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสี (P<0.05). altogether,="" these="" findings="" indicate="" that="" x-rays="" highly="" induce="" senescence="" in="" crfk="" cells.="" next,="" to="" examine="" whether="" x-rays="" induced="" apoptosis="" in="" the="" irradiated="" crfk="" cells,="" apoptosis="" was="" quantified="" using="" tali™="" image-based="" cytometer.="" dual="" staining="" with="" fluorescent="" annexin="" v="" and="" pi="" was="" performed="" to="" detect="" apoptotic="" cells.="" cells="" stained="" positive="" for="" annexin="" v="" are="" considered="" apoptotic="" cells.="" as="" shown="" in="" fig.="" 5,="" the="" proportion="" of="" apoptotic="" cells="" was="" significantly="" higher="" in="" the="" 10-gy="" group="" than="" in="" the="" non-irradiated="" group="" and="" the="" 2-gy="" group="" but="" was="" lower="" (approximately="" 6%)="" in="" the="" 10-gy="" group.="" in="" addition,="" no="" significant="" increase="" in="" apoptosis="" was="" observed="" in="" the="" 2-gy="" group="" compared="" with="" the="" non-irradiated="">

ประโยชน์ต่อสุขภาพของ cistanche: ต้านมะเร็ง

อภิปรายผล

การทำความเข้าใจผลกระทบทางชีวภาพของรังสีต่อเซลล์แมวมีความสำคัญในการอธิบายความเป็นพิษของรังสีและการพัฒนาแนวทางการรักษาแบบใหม่สำหรับการรักษามะเร็ง ในการศึกษาครั้งนี้เราพบว่าการแพร่กระจายของแมวไตเซลล์ CRFK ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดยรังสีเอกซ์ที่ขนาด 2 และ 10 Gy การค้นพบนี้เปิดเผยว่ารังสีเอกซ์เป็นพิษต่อการเติบโตของเซลล์ CRFK ภายใต้สภาวะที่ใช้ในการศึกษานี้ นอกจากนี้ เซลล์ชราภาพเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสี ในขณะเดียวกัน การค้นพบของเราเปิดเผยในเซลล์ CRFK ไคเนสของ ATM กระตุ้นฟอสโฟรีเลชันของ H2AX ที่ Ser139 ซึ่งเป็นหนึ่งใน DDR หลักไปยัง DSB ที่ผลิตโดยรังสีเอกซ์ มีรายงานว่า DSBs ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสีสามารถกระตุ้นการชราภาพและการตายของเซลล์ในเซลล์ของมนุษย์และสัตว์ฟันแทะ [4, 22] การค้นพบของเราแนะนำว่ากลไกการชราภาพที่ถูกกระตุ้นโดย DSB มีส่วนในการยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ CRFK ด้วยรังสีเอกซ์

กลไกที่ทำให้เกิดความแตกต่างของความไวต่อคลื่นวิทยุในมนุษย์ สุนัข และแมว และกลไกการซ่อมแซมเซลล์แมวยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น ข้อมูลของเราระบุว่า DDR ที่ขึ้นกับไคเนสของ ATM นั้นเปิดใช้งานโดยเอ็กซ์เรย์ในเซลล์ CRFK นอกจากนี้ การศึกษานี้และการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า DSB ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสีเอกซ์ในเซลล์ CRFK สามารถตรวจพบได้โดยการวิเคราะห์ Western blot และอิมมูโนไซโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีต้าน H2AX ที่มีขายทั่วไป [17] การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าเซลล์ CRFK มีประโยชน์ในการชี้แจงกลไกระดับโมเลกุลของ DDR ในเซลล์แมว มัวร์ [24] อธิบายว่าการฉายรังสีสำหรับแมวนั้นแตกต่างจากการฉายรังสีสำหรับสุนัขในแง่ของการตอบสนองของเนื้องอกและความเป็นพิษต่อเนื้อเยื่อตามปกติ ฟูจิอิ และคณะ [7] แสดงให้เห็นว่าไฟโบรบลาสต์ในแมวมีความทนทานต่อกัมมันตภาพรังสีมากกว่าในมนุษย์ในการวิเคราะห์การก่อตัวเป็นอาณานิคม และจุดโฟกัส H2AX ที่เกิดจากรังสีอาจซ่อมแซมได้เร็วและมีประสิทธิภาพมากกว่าในไฟโบรบลาสต์ของแมว นอกจากนี้ พวกเขาเสนอแนะความเป็นไปได้ที่ DNA และความเสียหายของโครโมโซมที่เกิดจากรังสีเอกซ์จะซ่อมแซมในเซลล์ลิมโฟไซต์ของแมวได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าในเซลล์ลิมโฟไซต์ของมนุษย์หรือสุนัข การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าความแตกต่างของความต้านทานรังสีของมนุษย์ สุนัข และแมว อาจเกี่ยวข้องกับความแตกต่างในการซ่อมแซมดีเอ็นเอ เมื่อเร็ว ๆ นี้ เราสาธิตการใช้เซลล์ CRFK ที่ NHEJ ซ่อมแซมโปรตีนหลัก เช่น cat Ku70, Ku80 และ XLF สะสมที่ไซต์ DSB ที่เกิดจากไมโครเลเซอร์ 405-nm [17] เราได้เปิดเผยด้วยว่าการจัดหาแมว XLF, XLF ของมนุษย์หรือสุนัข XLF ขึ้นอยู่กับการปรากฏตัวของ Ku [13, 14, 17]; การค้นพบนี้สนับสนุนอย่างยิ่งว่าการควบคุมเชิงพื้นที่ของปัจจัย NHEJ หลัก รวมถึง Ku70, Ku80 และ XLF มีความสำคัญในกฎระเบียบของการซ่อมแซม NHEJ [10, 19] โดยรวมแล้ว เซลล์ CRFK อาจมีประโยชน์ในการค้นพบกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้ความแตกต่างของความต้านทานรังสีในเซลล์ของแมว สุนัข และมนุษย์เท่านั้น แต่ยังรวมถึง DDRs ซึ่งรวมถึงการซ่อมแซม NHEJ ที่ขึ้นกับ Ku ที่อนุรักษ์ไว้ด้วย

การเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT) เป็นกลไกสำคัญสำหรับการเปลี่ยนแปลงของมะเร็ง เช่น การเปลี่ยนความต้านทานของเซลล์มะเร็งต่อการฉายรังสีและยาต้านมะเร็ง เมื่อเร็ว ๆ นี้ เซลล์ CRFK ได้รับรายงานว่ามีลักษณะของไฟโบรบลาสต์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเกี่ยวกับลักษณะทางสัณฐานวิทยา ชีวเคมี และอณูชีววิทยา แม้ว่าเซลล์ CRFK จะได้รับการจัดตั้งขึ้นเป็นเซลล์เยื่อบุผิว [21] นอกจากนี้ Van Beusekom และคณะ [31] รายงานว่า TGF- 1 เปลี่ยนสัณฐานวิทยาของเซลล์ CRFK จากฟีโนไทป์ของเยื่อบุผิวไปเป็นฟีโนไทป์ของไฟโบรบลาสติก และมันกระตุ้นการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย EMT บางตัวในเซลล์ CRFK อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ CRFK สามารถรับ EMT ได้ ในการศึกษานี้ การชราภาพมีความสำคัญมากกว่าการตายของเซลล์จากการยับยั้งการเจริญเติบโตในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสี โดยรวมแล้ว สายเซลล์ CRFK อาจเป็นกิริยาช่วยที่ดีเยี่ยมสำหรับไม่เพียงแต่อธิบายความสัมพันธ์ระหว่างหรือระหว่างความชราภาพที่เกิดจากรังสีเอกซ์ ความต้านทานรังสี และ/หรือความเป็นพิษต่อรังสีในแมวไตเซลล์เยื่อบุผิว แต่ยังใช้สำหรับอธิบายผลกระทบของ EMT ต่อการฉายรังสีและเคมีบำบัด

การบำบัดด้วยการชราภาพเป็นกลยุทธ์ใหม่ในการต่อต้านมะเร็งบนพื้นฐานของการกระตุ้นการเสื่อมของเซลล์มะเร็ง เพื่อนำกลยุทธ์นี้ไปใช้กับการรักษาแมว จำเป็นต้องอธิบายกลไกระดับโมเลกุลของการชักนำให้เกิดความชราภาพในเซลล์แมว ในทางกลับกัน Li et al. [22] ได้อธิบายว่าสาร senolytic ซึ่งเป็นกลุ่มของโมเลกุลขนาดเล็กที่สามารถเลือกฆ่าเซลล์ในวัยชราได้ มีศักยภาพที่ดีในการลดผลข้างเคียงที่เกิดจากการฉายรังสีในขณะที่ควบคุมการก่อมะเร็งได้อย่างสมเหตุสมผล เมื่อเร็ว ๆ นี้ แสดงให้เห็นว่าสาร senolytic agent ABT-737 กำจัดเซลล์ชราภาพที่เกิดจากรังสีไอออไนซ์ออกจากปอดของหนูที่ถูกฉายรังสี [35] ดังที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าเซลล์ชราภาพเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ CRFK ที่ฉายรังสี การค้นพบและการศึกษาเพิ่มเติมของเราโดยใช้เซลล์ CRFK อาจมีให้สำหรับการวิจัยขั้นพื้นฐานสำหรับการพัฒนา ไม่เพียงแต่การบำบัดเพื่อการชะลอวัยของแมว แต่ยังรวมถึงสาร senolytic เพื่อลดผลข้างเคียงที่เกิดจากการรักษาด้วยรังสี

CRFKเป็นสายพันธุ์ของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่สำคัญที่สุดชนิดหนึ่ง และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดลอง รวมทั้งการทดลองกับไวรัส เช่น ไวรัสโคโรนา (SARS-CoV) กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง หรือ SARS-CoV-2; การซ่อมแซมดีเอ็นเอและการวิจัยโรคมะเร็งในแมวเรื้อรังไต โรค; และการผลิตวัคซีน [1, 2, 17, 30, 33, 34] เซลล์ CRFK สามารถติดเชื้อไวรัสต่างๆ รวมทั้ง oncoviruses [1–3, 34] จากข้อมูลเหล่านี้ เราคาดการณ์ว่ากลุ่มเซลล์ CRFK อาจเหมาะสำหรับการวิจัยขั้นพื้นฐานเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงความไวต่อคลื่นวิทยุที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสและผลของการรักษาด้วยรังสีต่อเนื้องอกที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสCRFKเซลล์สามารถใช้เพื่ออธิบายกลไกที่อยู่ภายใต้การต้านทานรังสีและความเป็นพิษของรังสีในเซลล์เยื่อบุผิวไตของแมวและผลของการติดเชื้อไวรัสต่อความไวต่อคลื่นวิทยุ สรุปได้ว่า เซลล์ CRFK อาจเป็นสายเซลล์ที่ดีเยี่ยมสำหรับการวิจัยเกี่ยวกับความเป็นพิษของรังสีในแมว และการวิจัยขั้นพื้นฐานสำหรับการพัฒนาวิธีการรักษามะเร็งแบบใหม่

ซิสแทนเช่ ทูโบโลซ่า ประโยชน์ต่อสุขภาพ

ขัดผลประโยชน์.ผู้เขียนประกาศไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

รับทราบงานนี้ดำเนินการโดยได้รับการสนับสนุนจาก National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology และภาควิชาชีววิทยาการกำกับดูแล คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยไซตามะ

ข้อมูลอ้างอิง

1. Altamura, G. , Power, K. , Martano, M. , Degli Uberti, B. , Galiero, G. , De Luca, G. , Maiolino, P. และ Borzacchiello, G. 2018. Felis catus

ชนิดไวรัสแพพพิลโลมา-2 E6 จับกับ E6AP ส่งเสริมการรวม E6AP/p53 และเพิ่มประสิทธิภาพการย่อยสลายของ p53 proteasomal วิทย์. ตัวแทน 8: 17529.

2. Chu, H., Chan, JF, Yuen, TT, Shuai, H., Yuan, S., Wang, Y., Hu, B., Yip, CC, Tsang, JO, Huang, X., Chai, Y., Yang, D., Hou, Y., จิก, KK,

Zhang, X., Fung, AY, Tsoi, HW, Cai, JP, Chan, WM, Ip, JD, Chu, AW, Zhou, J., Lung, DC, Kok, KH, To, KK, Tsang, OT, Chan, KH และ Yuen, KY 2020. tropism เปรียบเทียบ จลนพลศาสตร์การจำลอง และโปรไฟล์ความเสียหายของเซลล์ของ SARS-CoV-2 และ SARS-CoV ที่มีผลกับอาการทางคลินิก การแพร่เชื้อ และการศึกษาในห้องปฏิบัติการของ COVID-19 : การศึกษาเชิงสังเกต มีดหมอจุลินทรีย์ 1: e14–e23

3. Crandell, RA, Fabricant, CG and Nelson-Rees, WA 1973. การพัฒนา ลักษณะเฉพาะ และความไวต่อไวรัสของสายเซลล์ไตของแมว (Felis catus) (CRFK) ในหลอดทดลอง 9: 176–185

4. d'Adda di Fagagna, F. 2008. การใช้ชีวิตในช่วงพัก: ความชราภาพของเซลล์เป็นการตอบสนองความเสียหายของ DNA แนท. รายได้มะเร็ง 8: 512–522

5. Durocher, D. และ Jackson, SP 2001. DNA-PK, ATM และ ATR เป็นเซ็นเซอร์ของความเสียหายของ DNA: การเปลี่ยนแปลงในธีม? สกุลเงิน ความคิดเห็น เซลล์ไบโอล. 13: 225–231.

6. Firsanov, DV, Solovjeva, LV และ Svetlova, MP 2011 H2AX phosphorylation ที่ไซต์ของ DNA double-strand แบ่งในเซลล์และเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่เพาะเลี้ยง คลินิก อีพิเจเนติกส์ 2: 283–297

7. Fujii, Y., Yurkon, CR, Maeda, J., Genet, SC, Kubota, N., Fujimori, A., Mori, T., Maruo, K. และ Kato, TA 2013. การศึกษาเปรียบเทียบความต้านทานรังสีระหว่าง เซลล์แมวและเซลล์มนุษย์ รัศมี. ความละเอียด 180: 70–77.

8. Huang, RX และ Zhou, PK 2020. เส้นทางการส่งสัญญาณตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA และเป้าหมายสำหรับการแพ้ด้วยรังสีรักษาในมะเร็ง การส่งสัญญาณ เป้า. เธอ. 5: 60.

9. Jackson, SP 2002. การตรวจจับและซ่อมแซม DNA double-strand break. การก่อมะเร็ง 23: 687–696

10. Koike, M. 2002. Dimerization, translocation และ localization ของโปรตีน Ku70 และ Ku80 เจ. เรเดียต. ความละเอียด (โตเกียว) 43: 223–236.

11. Koike, M. และ Koike, A. 2008. การสะสมของโปรตีน Ku80 ที่ DNA สองเส้นแบ่งในเซลล์ที่มีชีวิต ประสบการณ์ ความละเอียดของเซลล์ 314: 1061–1070.

12. Koike, M. , Shiomi, T. และ Koike, A. 2001. Dimerization และการแปลนิวเคลียร์ของโปรตีน Ku เจ. ไบโอล. เคมี. 276: 11167–11173.

13. Koike, M. , Yutoku, Y. และ Koike, A. 2011. การสะสมของ Ku70 ที่ DNA double-strand แบ่งในเซลล์เยื่อบุผิวที่มีชีวิต ประสบการณ์ ความละเอียดของเซลล์ 317: 2429–2437.

14. Koike, M. , Yutoku, Y. และ Koike, A. 2017. การโคลน โลคัลไลเซชัน และการสร้างโฟกัสที่จุดทำลาย DNA ของสุนัข XLF เจ สัตวแพทย์ เมดิ. วิทย์. 79: 22–28.

15. Koike, M. , Yutoku, Y. และ Koike, A. 2017. การโคลน โลคัลไลเซชัน และการสร้างโฟกัสที่จุดทำลาย DNA ของสุนัข Ku70 เจ สัตวแพทย์ เมดิ. วิทย์. 79: 554–561.

16. Koike, M. , Yutoku, Y. และ Koike, A. 2017. การโคลนสุนัข Ku80 และการโลคัลไลเซชันและการสะสมที่ไซต์ความเสียหายของ DNA FEBS Open Bio 7: 1854–1863.

17. Koike, M. , Yutoku, Y. และ Koike, A. 2019. Feline XLF สะสมที่ไซต์ความเสียหายของ DNA ในลักษณะที่ขึ้นกับ Ku FEBS โอเพ่นไบโอ 9: 1052–1062

18. Koike, M. , Sugasawa, J. , Yasuda, M. และ Koike, A. 2008. ฟอสโฟรีเลชั่น H2AX ที่ขึ้นกับ DNA-PK เฉพาะเนื้อเยื่อและการกำจัดแกมมา-H2AX หลังจากการฉายรังสีเอ็กซ์ในร่างกาย ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด คอมมูนิตี้ 376: 52–55. [การแพทย์] [CrossRef]

19. Koike, M. , Awaji, T. , Kataoka, M. , Tsujimoto, G. , Kartasova, T. , Koike, A. และ Shiomi, T. 1999. การแปลความแตกต่างระหว่างเซลล์ย่อยของส่วนประกอบโปรตีนไคเนสที่ขึ้นกับ DNA Ku และ DNA-PKcs ระหว่างไมโทซิส เจเซลล์วิทย์. 112: 4031–4039. [เมดไลน์]

20. Kopp, B. , Khoury, L. และ Audebert, M. 2019 การตรวจสอบความถูกต้องของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ H2AX สำหรับการประเมินความเป็นพิษต่อพันธุกรรม: การทบทวน โค้ง. ท็อกซิคอล 93: 2103–2114. [การแพทย์] [CrossRef]