การระบุและการวิเคราะห์หน้าที่ของ Bifavone เป็นตัวยับยั้งนวนิยายของตัวรับชั่วคราวที่มีศักยภาพ Vanilloid 4 ขึ้นกับกระบวนการ Atherogenic

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comเพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, เคย์ Lei &Shaik O. Rahaman

หลอดเลือดแดงซึ่งเป็นโรคที่เกิดจากการอักเสบแบบลุกลามของหลอดเลือดแดงใหญ่ ถือเป็นสาเหตุสำคัญอันดับต้นๆ ของภาระที่เพิ่มขึ้นของการตายและการเจ็บป่วยที่เกี่ยวข้องกับโรคหลอดเลือดหัวใจทั่วโลก1 เหตุการณ์เริ่มต้นที่สำคัญซึ่งนำไปสู่หลอดเลือดแดงเกี่ยวข้องกับการรักษาอนุภาคไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำที่ถูกดัดแปลง (oxLDL) ไว้ในช่องว่างภายในของหลอดเลือดแดงใต้เยื่อบุผนังหลอดเลือดโดยเฉพาะอย่างยิ่งในจุดสาขาหลอดเลือดแดง2 ในช่วงเริ่มต้นของการเกิดภาวะหลอดเลือด ภายหลังการทำงานของบุผนังหลอดเลือดผิดปกติ เซลล์โมโนไซต์ที่ไหลเวียนอยู่ในเลือดจะย้ายไปยังบริเวณ intima และแยกความแตกต่างออกเป็นเนื้อเยื่อมาโครฟาจ3 ในช่องว่างภายในของหลอดเลือด การจับและการดูดซึมของ oxLDL โดยมาโครฟาจที่ได้รับความช่วยเหลือจากตัวรับขยะ เช่น SRA และ CD36 จะสร้างวงจรการอักเสบของหลอดเลือดที่เคลื่อนไปข้างหน้าซึ่งส่งผลให้เกิดการพัฒนาเซลล์โฟมที่มีไขมันซึ่งเป็นกระบวนการที่สำคัญในหลอดเลือด 2–8 การเรียงซ้อนของเหตุการณ์การอักเสบที่กระตุ้นโดยเซลล์โฟมนำไปสู่การก่อตัวของเส้นไขมันในระยะแรกและในที่สุดการปรากฏตัวของรอยโรคหลอดเลือดแดงแข็งขั้นสูงที่มีลักษณะเฉพาะโดยการปรากฏตัวของเส้นใยหมวก เนื้อเยื่อที่กลายเป็นหินปูน เซลล์ภูมิคุ้มกัน โปรตีนเมทริกซ์ และไขมัน2–10 Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) ของอนุวงศ์ TRPV ซึ่งเป็นช่องไอออนบวกแบบหลายโมดอลที่ไม่ผ่านการคัดเลือกที่สามารถซึมผ่านไปยัง Ca2 plus ได้แสดงออกอย่างแพร่หลายในเซลล์ประเภทต่างๆ รวมทั้งมาโครฟาจ 11–24 ก่อนหน้านี้รู้จักกันในชื่อออสโมเซ็นเซอร์ ปัจจุบัน TRPV4 ตอบสนองต่อสิ่งเร้าทางชีวเคมีและชีวกลศาสตร์ที่หลากหลาย รวมถึงความร้อน ความฝืดของเมทริกซ์ ออสโมลาริตี ปัจจัยการเจริญเติบโต pH และ 4 ฟอร์โบลเอสเทอร์ 11–24 มีรายงานว่า TRPV4 เป็นสื่อกลางในการทำงานทางสรีรวิทยาหลายอย่าง เช่น ความรู้สึกเจ็บปวดในการอักเสบและเส้นประสาทส่วนปลาย 18,22,23 การเปลี่ยนแปลงและการย้ายถิ่นของ myofibroblast 17,25,26 และการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ในกระดูก27 การกลายพันธุ์ของ TRPV4 เกี่ยวข้องกับแชนเนลโอพาธีหลายอย่าง28–31 การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้โดยกลุ่มของเราและคนอื่นๆ มีส่วนเกี่ยวข้องกับบทบาทที่เป็นไปได้ของช่องทางนี้ในสภาวะทางพยาธิวิทยามากมาย เช่น การบาดเจ็บที่ปอด 22,32 การก่อตัวของเซลล์โฟม 14,16 พังผืดของเนื้อเยื่อ 17,33 การตอบสนองของร่างกายจากสิ่งแปลกปลอม 13 และมะเร็ง 34,35 ก่อนหน้านี้ มีการแสดงบทบาทของ Atheroprotective ของ TRPV4 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าฟังก์ชัน TRPV4 ที่เหนี่ยวนำให้เกิดสารเคมีในเซลล์บุผนังหลอดเลือดมีความเกี่ยวข้องกับการกระตุ้น eNOS และการยับยั้งการยึดเกาะของโมโนไซต์กับเซลล์บุผนังหลอดเลือด36 ในทางตรงกันข้าม ความบกพร่องในการทำงานของ TRPV4 นั้นเชื่อมโยงกับการตอบสนองของต่อมไขมันในร่างกายจำนวนมาก รวมถึงความผิดปกติของเยื่อบุผนังหลอดเลือด การสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจที่ลดลง และโรคเกี่ยวกับหลอดเลือด 14,16,37–39 ห้องปฏิบัติการของเราได้ระบุบทบาท proatherogenic ของ TRPV4 เมื่อเร็วๆ นี้ โดยควบคุมการสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจที่เกิดจาก oxLDL ในทางกลไก เราแสดงให้เห็นว่า TRPV4 ส่งผลต่อการดูดซึมแต่ไม่ผูกมัดของ oxLDL ในมาโครฟาจในลักษณะอิสระของ CD36-14 ในการศึกษาอื่น เรารายงานการกำเริบขึ้นโดยขึ้นกับ TRPV4-การเกิดเซลล์โฟมที่เกิดจาก oxLDL เมื่อมีไลโปโพลีแซ็กคาไรด์และความแข็งของเมทริกซ์ที่เพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงให้การเชื่อมโยงระหว่างการตรวจจับกลไกและความเสี่ยงของหลอดเลือด เมื่อพิจารณาร่วมกันแล้ว การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า TRPV4 เป็นเป้าหมายที่น่าสนใจในโรคหลอดเลือดแข็งและโรคอื่นๆ ดังนั้นจึงเป็นแรงจูงใจให้ค้นพบสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กของ TRPV4 ที่สามารถแปลเป็นวิธีการรักษาที่มีประสิทธิผลทางคลินิกได้ การใช้สารประกอบธรรมชาติในการบำบัดได้รับความโดดเด่น โดยส่วนใหญ่ได้รับแรงหนุนจากความต้องการสารประกอบที่คุ้มค่าและเข้ากันได้ทางชีวภาพ เมื่อเทียบกับยาสังเคราะห์ที่มีอยู่ในปัจจุบัน สารประกอบธรรมชาติเช่นฟลาโวนอยด์, ลคาลอยด์,โพลีฟีนอลและเคอร์คูมินอยด์ ส่งผลต่อโรคหลอดเลือดหัวใจด้วยกลไกต่างๆ เช่น การยับยั้งการอักเสบส่งสัญญาณ การแพ้อินซูลิน และการปรับปรุงโปรไฟล์ไขมันในเลือดโดยกำหนดเป้าหมายเส้นทาง AMPK, COX1/2, eNOS และ Nrf2 40–45 การศึกษาล่าสุดโดยหลายกลุ่มพบว่ามีสารฟลาโวนอยด์ 2 ชนิด ได้แก่ เบอร์เบอรีน และ apigenin เป็นตัวปรับศักยภาพของกิจกรรม TRPV446,47 เราได้พัฒนาและใช้วิธีการคัดกรองปริมาณงานสูงแบบกึ่งเพื่อระบุตัวต้านที่เป็นไปได้ของ TRPV4 จากคลังสารประกอบธรรมชาติโดยใช้ Ca2 plus influx assay ที่ใช้ Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) ในที่นี้ เรารายงานการระบุและการวิเคราะห์เชิงหน้าที่ของ Linkedin ซึ่งเป็นฟลาโวน เป็นตัวยับยั้งใหม่ของ TRPV4-กระบวนการสร้างหลอดเลือดที่ขึ้นกับ TRPV ในแมคโครฟาจ จึงเป็นการวางรากฐานสำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับสารประกอบธรรมชาตินี้ในฐานะสารต้านหลอดเลือดขนาดเล็กตามธรรมชาติ สารประกอบโมเลกุล มีรายงานว่า Linkedin แสดงสารป้องกันประสาทต่อต้านสารก่อมะเร็ง, และต้านการอักเสบบทบาท48,49. เรารายงานกลไกการออกฤทธิ์ของ Linkedin ต่อ TRPV4 ในการตั้งค่าของการเกิดเซลล์โฟมมาโครฟาจโดยใช้การทดสอบทางชีวเคมีและเซลล์จำนวนมาก

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

วัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงสัตว์และเซลล์

เราซื้อเมาส์ C57BL/6 wild type (WT) ที่มีมาแต่กำเนิดจาก Charles River Laboratories (วิลมิงตัน รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) มีการปฏิบัติตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยแมริแลนด์สำหรับการทดลองในสัตว์ทั้งหมด และผู้เขียนปฏิบัติตามแนวทาง ARRIVE สำหรับการแยกของมาโครฟาจที่มีถิ่นที่อยู่ของหนูที่เหนี่ยวนำโดยไธโอไกลโคเลต (MRM) การล้างช่องท้องถูกรวบรวมหลังจาก 4 วันของการฉีดไธโอไกลโคเลตในช่องท้อง และเซลล์ถูกคงรักษาไว้ใน 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมวัวในครรภ์ (FBS) ที่มี DMEM7,14,16 สายเซลล์มาโครฟาจของหนู (RAW264.7) และไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ (HDF) ถูกซื้อจาก ATCC (Manassas, VA) และถูกเพาะเลี้ยงตามลำดับด้วย DMEM หรือ MEM (Gibco, Waltham, MA) มาโครฟาจที่ได้มาจากไขกระดูก (BMDM) ของหนูถูกเก็บเกี่ยวจากหนูอายุ 6- ถึง 7- สัปดาห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 14,50,51 โดยย่อ กระดูกโคนขาจากหนูเมาส์ WT และ TRPV4 KO ถูกรวบรวม และไขกระดูกของกระดูกโคนขาถูกชะล้างด้วยสื่อ DMEM ที่สมบูรณ์ด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ไขกระดูกที่ถูกแขวนลอยถูกกรองผ่านเครื่องกรอง 70 ไมโครเมตร (BD bioscience) หมุนเหวี่ยงและคงสภาพไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ที่เสริมด้วย M-CSF (25 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 7-8 วันที่ 37 องศาเพื่อยอมให้มีการดิฟเฟอเรนติเอตไปเป็นมาโครฟาจ

รีเอเจนต์

Linkedin และ GSK1016790A (GSK101) ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) และได้รับชุดทดสอบ FLIPR Calcium 6 จาก Molecular Device (Sunnyvale, CA) ซื้อ LDL ดั้งเดิมของมนุษย์ (VLDL) จาก Stemcell Technologies (แวนคูเวอร์, แคนาดา) เราฟัก LDL ด้วย 5 µM CuSO4 เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ 37 องศาเพื่อเตรียม LDL ที่ออกซิไดซ์ด้วยทองแดง (oxLDL)7,14,16 DiI-oxLDL ที่ติดฉลากสีเรืองแสงถูกซื้อจาก Invitrogen (Carlsbad, CA) และ MCSF จาก R&D (Minneapolis, MN) แอนติบอดีสำหรับการวิเคราะห์ FACS ได้แก่ TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 และ TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO) แอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย PE มาจาก R&D (มินนิอาโปลิส, MN) และกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ที่คอนจูเกตด้วย PE มาจาก BD (Franklin Lake, NJ) สำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณ (qRT-PCR) เราใช้ RNeasy kit จาก QIAGEN (Redwood City, CA) ไพรเมอร์ทั้งหมดซื้อจาก Bio-Rad (Hercules, CA) สื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยงเซลล์ และสารทำปฏิกิริยาแบบ Western blot ได้มาจาก Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA)

Cistanche สำหรับต่อต้านความเมื่อยล้า

การตรวจคัดกรองปริมาณงานสูง

เราทำการตรวจคัดกรองปริมาณงานสูงแบบกึ่งสำหรับคู่อริของ Trpv4 จากคลังสารประกอบธรรมชาติ 2,000 ชนิด (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) โดยใช้การทดสอบแคลเซียมที่ไหลเข้าด้วยเครื่องอ่านแผ่นฟลูออโรเมตริก (FLIPR) 14,17 เราระบุ ginkgetin (GGT) ว่าเป็นศัตรูตัวสำคัญกับ TRPV4 การตรวจคัดกรองหลักและรองดำเนินการด้วย RAW264.7, HDF และ BMDM เพื่อประเมินความสามารถของ Linkedin และตัวเลือกอื่นๆ ในการยับยั้ง TRPV4-ที่กระตุ้น Ca2 plus infux14,17 ในการควบคุม เราใช้ A23187 แคลเซียมไอโอโนฟอร์ TRPV4 null BMDM และ GSK219 ซึ่งเป็นสารต้าน TRPV4 ที่เลือก 17 หลังจากการคัดกรองทุติยภูมิ เราระบุสารประกอบหกชนิดที่แสดงการยับยั้งมากกว่าสามเท่าของ TRPV4-สื่อกลาง Ca2 บวกการไหลเข้าที่เปรียบเทียบกับการควบคุมด้วยกระสายยา Linkedin ถูกระบุว่าเป็นตัวยับยั้งการออกฤทธิ์ของ TRPV4 ที่มีศักยภาพมากที่สุด BMDM (5× 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะลงในแผ่นเคลือบคอลลาเจน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 96-หลุมที่ใสสะอาดและบ่มที่ 37 องศา ร้อยละ 5 CO2 ในวันที่ทำการทดลอง เซลล์ถูกบรรจุด้วยสีย้อมแคลเซียม 6 ใน HBSS, 20 mM HEPES, 2.5 mM probenecid และฟักเป็นเวลา 45 นาทีที่ 37 องศา หลังจากการบ่ม สารประกอบของคลังถูกเติมลงในแต่ละหลุมจนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 2 ไมโครโมลาร์ เพลตถูกบ่มอีก 45 นาทีที่ 37 องศา Ca2 บวกกับการไหลเข้าถูกเหนี่ยวนำโดยการเติม 10 นาโนโมลาร์ของตัวเอก TRPV4 GSK1016790A ในเซลล์ที่ถูกบำบัดด้วยพาหะหรือสารประกอบและบันทึกโดยการวัด ΔF/F (สูงสุด-ต่ำสุด) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้17 ข้อมูลแสดงเป็นหน่วยการเรืองแสงสัมพัทธ์ (RFU)

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

มาโครฟาจในช่องท้องที่กระตุ้นโดยไธโอไกลโคเลตถูกเพาะใน FBS 10 เปอร์เซ็นต์ที่มี DMEM และบ่มข้ามคืน ล้างเซลล์ที่ไม่ยึดติด และ 1 เปอร์เซ็นต์ของโบวีนซีรัมอัลบูมิน (BSA) ที่มี DMEM ถูกเติมลงในจานและบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมงก่อนการรักษาด้วย Linkedin เพื่อกำหนดหาการแสดงออกของโปรตีน CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 และ GAPDH ไลเซตทั้งเซลล์ถูกเตรียมจากเซลล์ที่บำบัดข้ามคืนด้วย Linkedin (1 และ 5 ไมโครโมลาร์) หรือกระสายยาในการมีอยู่หรือไม่มี oxLDL (25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ). เพื่อกำหนดหาระดับการแสดงออกของ p-JNK และ JNK ที่กระตุ้นด้วย LPS เซลล์ถูกบำบัดก่อนด้วย Linkedin (5 และ 10 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 3 ชั่วโมง และจากนั้นกระตุ้นด้วย E. coli LPS เป็นเวลา 30 นาที ไลเซตทั้งเซลล์ถูกเตรียมจากเซลล์ที่ล้างสองครั้ง (PBS ที่เย็นด้วยน้ำแข็ง) โดยใช้บัฟเฟอร์ RIPA กับค็อกเทลที่เติมสารยับยั้งโปรตีเอส (Thermo Scientific, MA) ตรวจสอบรอยเปื้อนด้วยสารต้าน TRPV4 ของกระต่าย (Alomon Lab, เยรูซาเลม, อิสราเอล), สารต่อต้านเมาส์ CD36 (R&D, มินนิอาโปลิส, มินนิอาโปลิส), สารต้าน TLR4 ของกระต่าย, สารต้าน TLR6 ของกระต่าย, สารต้านกระต่าย JNK และสารต้านกระต่าย-p- แอนติบอดีปฐมภูมิของ JNK (การส่งสัญญาณของเซลล์, เดนเวอร์, แมสซาชูเซตส์) ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกต HRP ที่คอนจูเกตต้านกระต่ายและเมาส์ (R&D, Minneapolis, MN) บล็อตถูกถอดออกและโพรบใหม่ด้วยแอนติ-GAPDH IgG (1:2000; ซานตาครูซ, ดัลลาส, เท็กซัส) สำหรับการควบคุมการโหลด

การก่อตัวของเซลล์โฟมMRM ที่กระตุ้นด้วย Thioglycolate ถูกเพาะบนแผ่นปิดกระจกในจาน 12 หลุมที่มี DMEM, 10 เปอร์เซ็นต์ FBS และบ่มที่ 37 องศา , 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง GGT (1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) ถูกเติมไปยังเซลล์ และหลังจากการบ่ม 3 ชั่วโมง oxLDL (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเติมลงไป และการเพาะเลี้ยงถูกบ่มข้ามคืนที่ 37 องศา LDL ดั้งเดิม (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเติมลงในหลุมของกลุ่มควบคุมและบ่มข้ามคืน เซลล์ถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ตามด้วยการย้อม Oil Red O เพื่อหาปริมาณการสร้างเซลล์โฟม

การถ่ายโอนเวกเตอร์ Adenovirusเรารวบรวมโครงสร้าง Adenovirus เพื่อแสดง Ad(RGD)-mouse TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) และ adenovirus blank vector, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml) จาก Vector Biolabs, มัลเวิร์น, PA เราใช้ 1× 108 pfu/ml สำหรับการทดลองทั้งหมด สำหรับการศึกษาการสร้างเซลล์โฟม มาโครฟาจในช่องท้องของหนูเมาส์ถูกบ่มด้วย Ade-TRPV4 หรือ Ade-Vec ในตัวกลาง DMEM เป็นเวลา 72 ชั่วโมงก่อนการเติม oxLDL เพื่อสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจ

การจับและการดูดซึม ox-LDLเพื่อประเมินการจับ มาโครฟาจในช่องท้องถูกบำบัดด้วยขนาดยาสองขนาด (1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) ของ Linkedin หรือกระสายยาเป็นเวลา 3 ชั่วโมงและบ่มด้วย DiI-oxLDL ที่ 4 องศาเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง หลังจากการบำบัดล่วงหน้าด้วย Linkedin หรือกระสายยา เซลล์ถูกบ่มด้วย DiI-oxLDL ที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อประเมินการดูดซึม ภาพถูกจับโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (63x) และใช้ Image J เพื่อหาปริมาณผลลัพธ์

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีมาโครฟาจในช่องท้องที่กระตุ้นโดยไธโอไกลโคเลตถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM, 10 เปอร์เซ็นต์ FBS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ไม่ถูกยึดติดถูกชะล้างออก ตัวกลางที่ปราศจากซีรัมถูกเติม และเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงตามด้วยการเติม 5 ไมโครโมลาร์ GGT หรือกระสายยา และการบ่มยังคงดำเนินต่อไปเป็นเวลา 3 ชั่วโมง เซลล์ที่บำบัดถูกขูดออกจากเพลตและแขวนลอยใหม่ใน PBS, 2 เปอร์เซ็นต์ BSA เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิเป็นเวลา 45 นาทีตามด้วยการบ่ม 30 นาทีด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย PE โฟลว์ไซโตมิเตอร์ FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Canada) ถูกใช้เพื่อรับข้อมูล ข้อมูลทั้งหมดได้รับการประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo

qRT‑PCRมาโครฟาจที่เหนี่ยวนำโดยไธโอไกลโคเลตถูกบำบัดด้วยลิงค์จิดินหรือพาหะนำยา 5 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 3 ชั่วโมง; 25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ oxLDL ถูกเติมไปยังกระสายยาหรือเซลล์ที่บำบัดด้วย Linkedin และการฟักตัวถูกดำเนินต่อไปข้ามคืน RNeasy Micro Kit (# 74,004) จาก QIAGEN ใช้เพื่อแยก RNA ทั้งหมด และใช้ Universal SYBR Green One-Step Kit จาก Bio-Rad เพื่อย้อนกลับการถอดความ RNA ใช้ C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) เพื่อรับข้อมูล การแสดงออกของยีนถูกกำหนดเป็นปริมาณของ mRNA ที่จำเพาะต่อยีนที่สัมพันธ์กับ GAPDH mRNA โดยใช้วิธี CT เปรียบเทียบที่อธิบายไว้ในกระดานข่าวผู้ใช้ระบบ Bio-Rad qRT-PCR

การวิเคราะห์ทางสถิติ.ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่ากลาง±SEM ของค่าสามเท่าทางชีววิทยา ใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 70 และคำนวณโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนสำหรับสองกลุ่มหรือ ANOVA ทางเดียวสำหรับหลายกลุ่ม

การอนุมัติทางจริยธรรมการทดลองกับหนูทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบัน (IACUC) และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการทบทวนอุทยานมหาวิทยาลัยแมริแลนด์

ผลลัพธ์ in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>สามเท่า; พี<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

รูปที่ 1 การระบุแบบคัดกรองปริมาณงานสูงของ Linkedin เป็นตัวยับยั้ง TRPV4 แบบใหม่จากคลังของสารประกอบธรรมชาติ (A) ผังงานแสดงเวิร์กโฟลว์ที่ทำให้เกิดการระบุของ ginkgetin ว่าเป็นสารยับยั้ง TRPV4 ที่อาจเกิดขึ้นจากคลังสารประกอบธรรมชาติ 2000 ชนิด (B) การบันทึก FlexStation 3 ที่เป็นตัวแทนซึ่งแสดงผลการยับยั้งของสารประกอบธรรมชาติ 6 ชนิดต่อ Ca2 ที่เหนี่ยวนำด้วย TRPV4 (GSK1016790A) บวกกับการไหลเข้าใน BMDM ที่เติมด้วยสีย้อมแคลเซียม 6 ในระหว่างการคัดกรองทุติยภูมิ การปรับสภาพด้วยสารประกอบทั้งหมด 6 ชนิดแสดงผลการยับยั้งต่อ TRPV4-Ca2 บวกการไหลเข้าที่ขึ้นกับ TRPV เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดก่อนด้วยกระสายยา (กลุ่มควบคุมเชิงลบ; กระสายยาบวก GSK1016790A (10 นาโนโมลาร์)) หรือแคลเซียม ไอโอโนฟอร์ (A23187, 2 ไมโครโมลาร์) เราใช้ตัวเลือก TRPV4 antagonist, GSK2193874 (10 nM) เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ การทดลองทั้งหมดทำซ้ำสามครั้งในสี่เท่า RFU: หน่วยเรืองแสงสัมพัทธ์

การยับยั้ง TRPV4 โดย GGT ยกเลิกการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจที่เกิดจาก oxLDLการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า TRPV4-กระตุ้น Ca2 บวกการไหลเข้าเกี่ยวข้องกับการก่อรูปเซลล์โฟมที่อาศัย oxLDL 14,16 ดังนั้นเราจึงประเมินความเป็นไปได้ที่การสร้างเซลล์โฟมถูกยับยั้งโดยการเป็นปฏิปักษ์กับ GGT ที่เป็นสื่อกลางของกิจกรรม TRPV4 มาโครฟาจในช่องท้องของหนูชนิดพันธุ์ป่าถูกบ่มด้วย oxLDL เพื่อเหนี่ยวนำการก่อรูปเซลล์โฟมโดยมีหรือไม่มี GGT และวิเคราะห์โดยการย้อมสี O น้ำมันเรด ตามที่คาดไว้ เราพบว่าการสร้างเซลล์โฟมเพิ่มขึ้นห้าเท่าในมาโครฟาจที่บำบัดด้วย oxLDL เมื่อเปรียบเทียบกับ LDL ดั้งเดิม (รูปที่ 2A, B) อย่างไรก็ตาม การบำบัดมาโครฟาจด้วย GGT (1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) ก่อนการกระตุ้นด้วย oxLDL ทำให้เปอร์เซ็นต์ของเซลล์โฟมลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2A, B) โดยรวมแล้ว การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นถึงผลการยับยั้งของ GGT ต่อการสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจซึ่งอาจมุ่งเป้าไปที่ TRPV4-ที่กระตุ้น Ca2 บวกกับการไหลเข้า นอกจากนี้ เรายังแสดง TRPV4 มากเกินไปใน TRPV4 null macrophages โดยใช้ adenovirus construct แล้วจึงเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างเซลล์โฟมโดยใช้ oxLDL ต่อหน้า GGT เราพบว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ TRPV4 เพิ่มการสร้างเซลล์โฟมซึ่งถูกบล็อกเมื่อเราปรับสภาพเซลล์ด้วย GGT ก่อน ซึ่งแนะนำว่าการยับยั้งการก่อตัวของเซลล์โฟม proatherogenic โดย GGT นั้นขึ้นอยู่กับ TRPV4 (รูปที่ 2C, D)

GGT ไม่ได้ปิดกั้นระดับพื้นฐานของการแสดงออกของ TRPV4 และตัวรับการอักเสบตัวรับขยะ CD36 มีบทบาทสำคัญในการดูดซึมและการผูกมัดของ oxLDL และการสร้างเซลล์โฟม ซึ่งเป็นกระบวนการที่สำคัญในหลอดเลือด4–7,54,55 เมื่อเร็ว ๆ นี้ หลักฐานที่เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนร่วมของตัวรับที่คล้ายค่าโทรในหลอดเลือด2,4,56 ในการตรวจสอบว่า GGT ปิดกั้นการสร้างเซลล์โฟมโดยส่งผลต่อการแสดงออกของ CD36, TLR4, TLR6 และ TRPV4 หรือไม่ เราทำการวิเคราะห์อิมมูโนบลอตที่ความเข้มข้นสองระดับของ GGT (1 หรือ 5 µM) เราพบระดับการแสดงออกที่คล้ายกันของ CD36, TRPV4, TLR6 และ TLR4 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 3A–D) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกยังเผยให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกที่ผิวเซลล์ของโปรตีนที่มีหรือไม่มีการบำบัดด้วย GGT (รูปที่ 3E–H, I–L) เมื่อพิจารณาร่วมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GGT บล็อกการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจโดยไม่ยับยั้งระดับพื้นฐานของการแสดงออกของพื้นผิวของ TRPV4, CD36, TLR4 และ TLR6

รูปที่ 2 การยับยั้ง TRPV4 โดย Linkedin ยกเลิกการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจที่เกิดจาก oxLDL (A) มาโครฟาจในช่องท้องของหนูที่เหนี่ยวนำโดยไธโอไกลโคเลตถูกบำบัดข้ามคืนด้วย oxLDL 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ที่ตามด้วยการบ่มล่วงหน้า 3 ชั่วโมงด้วยกระสายยาหรือ 1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์ที่เชื่อมโยง เซลล์ถูกบำบัดด้วย LDL ดั้งเดิม 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (VLDL) เป็นกลุ่มควบคุม กำลังขยายดั้งเดิม: 40x (B) จำนวนผลลัพธ์แสดงใน (A) n=500 เซลล์/เงื่อนไข การทดสอบ t ของนักเรียน; ***ป<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

การดูดซึมของ oxLDLแต่การไม่ผูกมัดโดยมาโครฟาจถูกระงับโดย GGT เนื่องจากก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า TRPV4 มีบทบาทในการดูดซึมของ oxLDL และการสร้างเซลล์โฟม 14,16 เราจึงประเมินว่าการบำบัดด้วย GGT ทำให้เกิดการด้อยค่าในการจับของ oxLDL บนพื้นผิวมาโครฟาจหรือไม่ มาโครฟาจในช่องท้อง WT ถูกบำบัดด้วย GGT ก่อนการบ่มด้วย DiI-oxLDL ที่ 4 องศา และการจับถูกประเมิน ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าการจับของ oxLDL บนพื้นผิวมาโครฟาจไม่ถูกขัดขวางอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย GGT (1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) ที่เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมด้วยกระสายยา (รูปที่ 5A–C) หลังจากพิสูจน์แล้วว่า GGT ไม่ยับยั้งการจับของ oxLDL เราจึงตั้งเป้าที่จะตรวจสอบว่าการดูดซึม oxLDL ในมาโครฟาจบกพร่องโดยการบำบัดด้วย GGT หรือไม่ ที่น่าสนใจ ผลลัพธ์ของเราระบุว่ามีการยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญในการดูดซึมของ oxLDL ในมาโครฟาจในเซลล์ที่บำบัดด้วย GGT เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วยกระสายยา (รูปที่ 6A, B) เมื่อพิจารณาร่วมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GGT ขัดขวางการดูดซึมของ oxLDL แต่ไม่ผูกมัดในมาโครฟาจ

GGT บล็อกการแสดงออกของ TRPV4 ที่เกิดจาก oxLDL ในมาโครฟาจ

จากการศึกษาที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ของเราพบว่า TRPV4-กระตุ้น Ca2 plus มีบทบาทในการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจที่เป็นสื่อกลาง oxLDL14,16 เราจึงพยายามตรวจสอบว่า GGT ปิดกั้นการสร้างเซลล์โฟมผ่านการปราบปรามการแสดงออกของ CD36 ที่เกิดจาก oxLDL หรือไม่ TLR2, TLR4, TLR6 หรือ TRPV4 เราพบว่าการกระตุ้นมาโครฟาจในชั่วข้ามคืนด้วย oxLDL ส่งผลให้เกิดการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของการแสดงออกของโปรตีน TRPV4 เมื่อเทียบกับ LDL ในขณะที่การแสดงออกของตัวรับอื่นๆ (CD36, TLR2, TLR4 และ TLR6) ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 4A–F) การปรับสภาพเซลล์ด้วย GGT ก่อนการกระตุ้นด้วย oxLDL เลือกลดระดับการแสดงออกของโปรตีน TRPV4 เมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดด้วยกระสายยา (รูปที่ 4A–F) โดยรวมแล้ว การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นถึงผลการยับยั้งของ GGT ต่อการแสดงออกของโปรตีน TRPV4 ซึ่งอาจเป็นส่วนหนึ่งในการปราบปรามการสร้างเซลล์โฟมโดย GGT

รูปที่ 3 การบำบัดด้วย Linkedin ไม่เปลี่ยนแปลงโปรตีนทั้งหมดหรือการแสดงออกของพื้นผิวของ TRPV4, CD36 และ TLR ในมาโครฟาจ (A–D) อิมมูโนโบล็อตของมาโครฟาจทั้งเซลล์ไลเซตหลังจากการบำบัดข้ามคืนด้วย 1 หรือ 5 ไมโครโมลาร์ที่เชื่อมโยงหรือกระสายยา อิมมูโนบลอตที่เป็นตัวแทนแสดงการแสดงออกของโปรตีนทั้งหมดของ CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) และ TLR4 (D) ในเซลล์ที่บำบัดด้วย Linkedin และที่ไม่บำบัด ทำซ้ำทางชีวภาพอิสระสามครั้งและทำซ้ำการทดลอง 3 ครั้งสำหรับการทดลองแต่ละชุด (E–H) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของมาโครฟาจที่บำบัดข้ามคืนด้วย 5 ไมโครโมลาร์ที่เชื่อมโยงหรือไม่ถูกบำบัดซึ่งแสดงการแสดงออกที่พื้นผิวของ TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) และ TLR6 (G) ในเซลล์ที่ไม่ถูกบำบัดและถูกบำบัดด้วยลิงค์ดิดิน การจำลองแบบทางชีวภาพที่เป็นอิสระสามตัวและ 30,{18}} เซลล์ต่อสภาวะถูกวิเคราะห์ (I–L) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของผลลัพธ์จาก (E–H) วิเคราะห์โดย t-test แบบสองทางพร้อมช่วงความเชื่อมั่น 99 เปอร์เซ็นต์ นับเซลล์ต่อการทดลอง 30,000; การทดลองซ้ำสองครั้ง

GGT บล็อกการกระตุ้นและการอักเสบของ proatherogenic JNK2 ในแมคโครฟาจ รายงานที่ตีพิมพ์จากห้องปฏิบัติการของเราและอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น JNK2 มีบทบาทสำคัญในการสร้างเซลล์โฟมและหลอดเลือด7,57 เพื่อตรวจสอบว่า GGT สามารถยับยั้งการกระตุ้นของ JNK1/2 ได้หรือไม่ มาโครฟาจถูกบำบัดด้วย GGT ตามด้วยการกระตุ้นด้วย LPS หรือ oxLDL ผลลัพธ์จากการวิเคราะห์อิมมูโนบลอตแสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย GGT ยับยั้งฟอสโฟรีเลชันที่เหนี่ยวนำโดย oxLDL หรือ LPS ของ JNK1/2 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วย LDL ที่ไม่ได้รับการรักษาหรือโดยกำเนิด (รูปที่ 7A–D) มีการแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น JNK ในมาโครฟาจทำให้เกิดการถอดรหัสของผู้ไกล่เกลี่ยการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับหลอดเลือด 58–60 เพื่อตรวจสอบว่า GGT สามารถปิดกั้นการแสดงออกของสารควบคุมการอักเสบเหล่านี้ในมาโครฟาจหรือไม่ เซลล์ที่บำบัดด้วย GGT ถูกกระตุ้นด้วย oxLDL และระดับการแสดงออกของ mRNA ของ TNF , IL 6, IL12, IL1 และ MCP1 ถูกหาปริมาณโดยการวิเคราะห์ qRT-PCR เราตรวจพบการปรับลดอย่างมีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกที่เหนี่ยวนำโดย oxLDL ของ TNF , IL12, IL1 และ MCP1 mRNA ในเซลล์ที่บำบัดด้วย GGT เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วยกระสายยา (รูปที่ 7E–I) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GGT บล็อกการกระตุ้น JNK2 และการแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบเพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้น oxLDL ในแมคโครฟาจ สารประกอบธรรมชาติ เช่น ฟลาโวนอยด์และโพลีฟีนอลเป็นที่รู้จักกันในการปรับการตอบสนองของหัวใจและหลอดเลือดผ่านกลไกที่หลากหลาย เช่น การยับยั้งสัญญาณการอักเสบ การไวต่ออินซูลิน สถานะออกซิเดชัน และการปรับปรุงระดับไขมันในเลือด 40–45 ในที่นี้ เรารายงานการระบุโดยใช้การคัดกรองปริมาณงานสูงแบบกึ่งปริมาณสูงและการกำหนดลักษณะการทำงานของ Linkedin ซึ่งเป็นฟลาโวน เป็นตัวยับยั้งแบบใหม่ของกระบวนการทางพันธุกรรม/การอักเสบของ Prothero ที่ขึ้นกับ TRPV4-ในมาโครฟาจ เราแสดงให้เห็นโดยเฉพาะว่า i) ginkgetin บล็อก TRPV4-สื่อกลาง Ca2 บวกกับการไหลเข้าสู่มาโครฟาจ ii) การปิดล้อม ginkgetin ของฟังก์ชัน TRPV4 ลดการสร้างเซลล์โฟมที่เกิดจาก oxLDL ลงอย่างเห็นได้ชัดโดยการยับยั้งการดูดซึมของ oxLDL ในมาโครฟาจ และ iii) บล็อก ginkgetin ฟอสโฟรีเลชันที่เหนี่ยวนำโดย LPS และ oxLDL ของ JNK1/2 การแสดงออกของโปรตีน TRPV4 และการแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบ โดยรวมแล้ว ผลของการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า ginkgetin ยับยั้งการทำงานของมาโครฟาจ proatherogenic/inflammatory ในลักษณะที่ขึ้นกับ TRPV4- หลอดเลือดซึ่งเป็นโรคหลอดเลือดแดงใหญ่เกิดจากการอักเสบและการคัดตึงของแมคโครฟาจด้วย oxLDL ซึ่งทำให้เกิดการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจ เนื่องจากการสร้างเซลล์โฟมเป็นกระบวนการที่สำคัญในการเกิดภาวะหลอดเลือด การทำความเข้าใจและการจัดการการก่อตัวของเซลล์โฟมจึงสามารถมีศักยภาพในการรักษาได้ เป็นที่ทราบกันว่ามาโครฟาจแสดงอาร์เรย์ของช่องไอออนและปั๊มที่เจาะทะลุผ่านเมมเบรน ซึ่งรวมถึง TRPV4 ซึ่งเป็นโพลีโมดัล Ca2 ที่ไวต่อกลไกทางกลไก บวกกับช่องไอออนที่ซึมผ่านได้ ซึ่งกระตุ้นโดยสิ่งเร้าทั้งทางกายภาพและทางชีวเคมี 11–24 การศึกษาที่ตีพิมพ์โดยห้องปฏิบัติการของเราและอื่น ๆ ได้ระบุบทบาทของ TRPV4 ในการอักเสบของมาโครฟาจและการสร้างเซลล์โฟมที่เกิดจาก oxLDL14-16,26 ดังนั้น TRPV4 จึงสามารถใช้เป็นเป้าหมายในการลดทอนกระบวนการ proatherogenic

รูปที่ 5 Linkedin ไม่ได้ระงับการผูก DiI-oxLDL กับมาโครฟาจ มาโครฟาจถูกบำบัดก่อนด้วยกระสายยาหรือเชื่อมโยง (1 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงตามด้วยการบ่มด้วย oxLDL ที่ติดฉลาก DiI (2.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 องศา (A) ภาพกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่เป็นตัวแทน (กำลังขยายดั้งเดิม 63×) ของการจับ DiI-oxLDL บนพื้นผิวเมมเบรนของมาโครฟาจ (n=20 เซลล์/สภาวะ) (B) ผลลัพธ์จากการทดลอง A แสดงเป็นโครงเรื่องโดยใช้ซอฟต์แวร์ NIH ImageJ (C) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของผลลัพธ์จาก A. n=20 เซลล์/สภาวะ ในการปรับปรุงหลอดเลือดโดยการลด MMP-2 และ MMP-9 และเพิ่มระดับของ NO และ NOS ในหลอดเลือดแดงใหญ่ทรวงอกของหนูแรท 52 ในการศึกษานี้ เราพบว่าแปะก๊วยขัดขวาง TRPV4-กระตุ้น Ca2 บวกกับการไหลเข้าในมาโครฟาจ ในทางกลไก เราพบว่าแปะก๊วยขัดขวางการดูดซึมของ oxLDL แต่ไม่มีผลผูกพันในมาโครฟาจ การศึกษาที่ทำ ในหลอดทดลอง และ ในหลอดทดลอง ชี้ให้เห็นถึงบทบาทที่สำคัญของ CD36 เป็นตัวรับ scavenger หลักในการดูดซึมของ oxLDL และการก่อตัวของเซลล์โฟมมาโครฟาจ2–7 แสดงให้เห็นว่าหนูทดลอง CD36 ที่ไม่มี ApoE หรือ LDLR มีแนวโน้มน้อยที่จะพัฒนารอยโรคหลอดเลือดแดง5,6 การศึกษาก่อนหน้านี้จากกลุ่มของเราระบุบทบาทที่สำคัญของ CD36-การส่งสัญญาณเรียงซ้อนของ JNK ในการสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจ7 รีเซพเตอร์ที่เหมือนโทรล TLR2, TLR4 และ TLR6 ทำหน้าที่เป็นตัวรับร่วมโดยการโต้ตอบกับ CD36 และแสดงให้เห็นว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการเกิดภาวะหลอดเลือด 2,56,63 เราตรวจสอบความเป็นไปได้ที่การขาดการก่อตัวของเซลล์โฟมที่เห็นในมาโครฟาจที่บำบัดด้วย Linkedin นั้นเกิดจากการแสดงออกที่ลดลงของโปรตีน CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 หรือ TLR6 ที่น่าสนใจ การบำบัดด้วย Linkedin ไม่ได้ลดการแสดงออกของโปรตีน CD36, TLR2, TLR4 หรือ TLR6 อย่างมีนัยสำคัญที่ระดับพื้นฐานหรือภายใต้สภาวะที่กระตุ้นด้วย oxLDL อย่างไรก็ตาม Linkedin บล็อกการควบคุมการแสดงออกของโปรตีน TRPV4 ที่เกิดจาก oxLDL โดยเฉพาะ ในขณะที่การแสดงออกของมันที่ระดับพื้นฐานยังคงไม่เปลี่ยนแปลง เมื่อพิจารณาร่วมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ginkgetin บล็อกการสร้างเซลล์โฟมที่เหนี่ยวนำโดย oxLDL ผ่านกลไกที่ไม่ขึ้นกับการแสดงออกของ CD36 และ TLR แต่ขึ้นอยู่กับ TRPV4 การศึกษาก่อนหน้านี้จากกลุ่มของเราและอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น JNK2 เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์โฟมและการพัฒนารอยโรคในหลอดเลือด7,57 มีรายงานด้วยว่า JNK เกี่ยวข้องกับการปรับ MMP-9 และ MMP-13 ซึ่งแสดงออกมากเกินไปในรอยโรคหลอดเลือด 64–68 จากการเชื่อมโยงที่รู้จักของ JNK ในกระบวนการสร้างเส้นเลือด เราต้องการตรวจสอบว่าแปะก๊วยสามารถยับยั้งการกระตุ้น JNK ได้หรือไม่ ตามรายงานก่อนหน้านี้ ผลลัพธ์ของเรายังแสดงให้เห็นว่า ginkgetin บล็อก phosphorylation ที่เกิดจากการกระตุ้นการอักเสบของ JNK2 ในแมคโครฟาจ ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นกลไกที่เป็นไปได้โดยที่ Linkedin บล็อกการสร้างเซลล์โฟม นอกจากนี้ เราพบการปรับลดที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกที่เหนี่ยวนำโดย oxLDL ของ TNF , IL12, IL1 และ MCP1 mRNA ในเซลล์ที่บำบัดด้วย ginkgetin เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมด้วยกระสายยา โดยเน้นถึงบทบาทการต้านการอักเสบที่เป็นไปได้ของกินเกตินในการตอบสนองต่อ oxLDL โดยสรุป ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า ginkgetin ยับยั้งการทำงานของมาโครฟาจ proatherogenic และการอักเสบในลักษณะที่ขึ้นกับ TRPV4- การค้นพบนี้จึงเสริมสร้างเหตุผลสำหรับการใช้สารประกอบธรรมชาติในการพัฒนาสารบำบัดที่มีศักยภาพและ/หรือสารทำปฏิกิริยาเคมี

อ้างอิง
1. Barquera, S. et al. ภาพรวมทั่วโลกของระบาดวิทยาของโรคหัวใจและหลอดเลือดหลอดเลือด โค้ง. เมดิ. ความละเอียด 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te ชีววิทยาเซลล์ของแมคโครฟาจในหลอดเลือด เซลล์ 145, 341–355 (2011)
3. Libby, P. การอักเสบในหลอดเลือด ธรรมชาติ 407, 233–241 (2002)
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokines, เมแทบอลิซึมของไขมันมาโครฟาจ และเซลล์โฟม: นัยสำหรับการรักษาโรคหัวใจและหลอดเลือด โปรแกรม ลิปิด Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. การหยุดชะงักของเป้าหมายของ CD36 ตัวรับกินของเน่าคลาส B ช่วยป้องกันการพัฒนารอยโรคหลอดเลือดในหนู เจ. คลิน. ลงทุน. 105, 1049–1056 (2000)
6. Kunjathoor, VV และคณะ ตัวรับกินของเน่าคลาส AI/II และ CD36 เป็นตัวรับหลักที่รับผิดชอบการดูดซึมของไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำดัดแปลงที่นำไปสู่การโหลดไขมันในมาโครฟาจ เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 49982–49988 (2545)
7. Rahaman SO และคณะ น้ำตกสัญญาณที่ขึ้นกับซีดี36-จำเป็นสำหรับการสร้างเซลล์โฟมมาโครฟาจ Metab ของเซลล์ 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Atherosclerosis - โรคอักเสบ N Engl เจ เมด. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te กลไกระดับโมเลกุลของภาวะแทรกซ้อนที่เกิดจากลิ่มเลือดอุดตันของหลอดเลือด เจ. อินเตอร์. เมดิ. 517–527, 2551.
10. Lusis, AJ หลอดเลือด. ธรรมชาติ 407, 233–241 (2000)
11. แมทธิวส์ BD และคณะ การกระตุ้นช่องไอออน TRPV4 อย่างรวดเร็วด้วยแรงเชิงกลที่ใช้กับอินทิกริน beta1 ของผิวเซลล์ จำนวนเต็ม. ไบโอล. (แคมบ์). 2(9), 435–442 (2010)
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-แกนส่งสัญญาณการถ่ายทอดทางกลไกของ TAZ ในความแข็งของเมทริกซ์- และ TGF 1-เหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ เซลล์โมล Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R. , Arya, RK, Biswas, D. , Zhu, X. & Rahaman, SO Transient receptor potential vanilloid 4 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการตอบสนองของร่างกายต่างประเทศและการสร้างเซลล์ขนาดยักษ์ เป็น. เจ. ปทุม. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. ช่องแคลเซียมที่ดูดซึมได้ TRPV4 เป็นตัวควบคุมแบบใหม่ของการเกิดเซลล์โฟมมาโครฟาจที่เกิดจากการออกซิไดซ์ LDL ฟรี Radic ไบโอล. เมดิ. 110, 142–150 (2017).