Cistanche Polysaccharide ช่วยลดการสร้างเม็ดสีและลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้อย่างไร?

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola Polysaccharide กระตุ้นการสร้างเม็ดสีใน Melanocytes และลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

1Department of Dermatology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, China

2ภาควิชาระบบทางเดินปัสสาวะ, โรงพยาบาล Third Xiangya, Central South University, ฉางชา, จีน

3ศูนย์ทดลองยา, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, China

Cistancheทะเลทรายมีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม: ในฐานะที่เป็นส่วนหลักของความผิดปกติของเม็ดสี โรคผิวหนังที่เกิดจากรอยด่างดำ เช่น vitiligo และ achromic naevus เป็นเรื่องปกติมากและได้รับความสนใจมากขึ้นในขณะนี้ พยาธิกำเนิดของการเกิดสีตกรวมถึงการทำงานผิดปกติของเมลาโนไซต์และการสูญเสีย ซึ่งอาจเกิดจากกรรมพันธุ์ ภูมิต้านทานผิดปกติ และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ในหมู่พวกเขาความเครียดออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญ อย่างไรก็ตาม การรักษาทางคลินิกเพียงเล็กน้อยสามารถจัดการกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้ ตามที่รายงานCistancheทะเลทราย พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพ จากข้อมูลนั้น เราได้ประเมินบทบาทในเมลาโนไซต์และเปิดเผยกลไกเพิ่มเติม ในการศึกษานี้ เราพบว่า CDP สามารถส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (HEM) และเซลล์เมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ และยังทำให้เกิดการสร้างเม็ดสีในปลาม้าลายอีกด้วย นอกจากนี้ CDP สามารถกระตุ้นเส้นทางสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK) จากนั้นควบคุมการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) และยีนดาวน์สตรีม TYR, TRP1, TRP2 และ RAB27A ไม่เช่นนั้น เราพบว่า CDP สามารถลดทอน H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเมลาโนไซต์ได้ หลักฐานเพิ่มเติมเปิดเผยว่า CDP สามารถเพิ่มวิถีการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 และกำจัด ROS ภายในเซลล์ โดยสรุป CDP สามารถส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจนและป้องกันเมลาโนไซต์จากการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน โดยแนะนำว่า CDP จะช่วยรักษาสถานะปกติของเมลาโนไซต์ ดังนั้น CDP อาจเป็นยาใหม่สำหรับการรักษาโรครอยคล้ำ

คีย์เวิร์ด:

Cistanche deserticola พอลิแซ็กคาไรด์, โรครอยคล้ำ, เมลาโนไซต์, การสร้างเม็ดสี, NRF2,ความเครียดออกซิเดชัน

1. บทนำ

โรคที่เกิดจากการทำลายผิว เช่น vitiligo และ achromic naevus มีลักษณะเป็นหย่อมๆ หรือรอยคล้ำของผิวหนังเป็นวงกว้าง1 แม้ว่ารอยโรคที่ผิวหนังจะไม่ค่อยทำให้เกิดการบาดเจ็บทางร่างกายอย่างรุนแรง แต่ก็ส่งผลกระทบต่อรูปลักษณ์ของผู้ป่วยและสร้างภาระทางจิตใจอย่างรุนแรง แม้กระทั่งความผิดปกติทางสุขภาพจิต2 การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่สำคัญในการเกิด depigmentation รวมถึงความผิดปกติและการสูญเสียของ melanocyte ซึ่งส่งผลกระทบอย่างมากต่อการสังเคราะห์และการขนส่งเมลานิน ส่งผลให้การสะสมของเมลานินในผิวหนังไม่เพียงพอ

กลไกที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด แต่การศึกษาได้ระบุปัจจัยที่เกี่ยวข้องบางประการ ในอีกด้านหนึ่ง การทำงานของเมลาโนไซต์ส่วนหนึ่งขึ้นอยู่กับปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในการส่งเสริมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเมลาโนเจเนซิส ได้แก่ ไทโรซิเนส (TYR) โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 1 (TRP1) ที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส โปรตีน 2 (TRP2), Rab ที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน Rab-27a (RAB27A) และโปรตีนการรวมกลุ่มของโปรตีน fascin 1 (FSCN1)4 ในบรรดายีนเหล่านี้ TYR มีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์เมลานินผ่านการออกซิไดซ์ l-dopa เข้าไปใน dopaquinone.5 ในทางกลับกัน การศึกษาแนะนำการรวมกันของปัจจัยหลายอย่างที่อาจเป็นสาเหตุของการสูญเสียเมลาโนไซต์ ซึ่งรวมถึงกรรมพันธุ์ สิ่งแวดล้อม ภูมิต้านทานผิดปกติ และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน6-9 ในบรรดาปัจจัยเหล่านี้ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันถือเป็นสิ่งที่สำคัญที่สุด .

กลไกของความเครียดออกซิเดชันทำให้เกิดรอยคล้ำได้รับการเปิดเผยบางส่วน; ปริมาณออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เกินพิกัดเป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญ10 การโอเวอร์โหลดของ ROS ในการเกิด depigmentation เกี่ยวข้องกับความไม่สมดุลระหว่างระบบโปรและสารต้านอนุมูลอิสระ11 หนึ่งในองค์ประกอบที่มีส่วนร่วมในความไม่สมดุลนี้คือปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ที่เกี่ยวข้อง แฟคเตอร์ 2/องค์ประกอบตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ (NRF2/ARE) วิถีทางต่อต้านอนุมูลอิสระบกพร่อง12 วิถีทางประกอบด้วย NRF2 และเอ็นไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น heme oxygenase-1 (HMOX-1, H2O-1) , catalase (CAT), กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส 1 (GPX1), และ NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO1).13 เมื่อเมลาโนไซต์สัมผัสกับ ROS มากเกินไป NRF2 สามารถย้ายเข้าไปในนิวเคลียสและจับกับ ARE ที่อนุรักษ์ไว้ จากนั้นจึงส่งเสริม การแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ อย่างไรก็ตาม ในโรคที่เกิดจากรอยด่างดำบางโรค เช่น โรคด่างขาว เส้นทางของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/ARE ที่บกพร่องไม่สามารถกำจัด ROS.14 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การรักษาทางคลินิกที่ใช้กันทั่วไปในการกำจัดเม็ดสี ได้แก่ คอร์ติโคสเตียรอยด์เฉพาะที่หรือทั้งระบบ สารยับยั้ง calcineurin รังสีอัลตราไวโอเลตแบบวงแคบ B (NBUVB; 311 นาโนเมตร) , 308-แสง excimer นาโนเมตร, การปลูกถ่ายผิวหนังชั้นนอกของตนเอง และการบำบัดด้วยการแพทย์แผนจีน (TCM) Corticosteroids และ calcineurin inhibitors สามารถลดการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ผิดปกติได้ 15 ในขณะที่การบำบัดด้วยแสงใช้เป็นการรักษาทางเลือกแรก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง NBUVB กระตุ้นการงอกขยายของเมลาโนไซต์และการทำลายทีเซลล์ 16 ในขณะที่แสง excimer 308-นาโนเมตรทำให้เกิดการตายของเซลล์ T นอกจากนี้ ผลของการบำบัดด้วย TCM ยังเกี่ยวข้องกับการส่งเสริมการสร้างเม็ดสี18 วิธีการเหล่านี้ในระดับหนึ่ง มีประโยชน์สำหรับการปรับปรุงการเสื่อมสภาพ แต่การควบคุมการลุกลามของโรคยังคงมีความท้าทาย จำเป็นต้องพัฒนาวิธีบำบัดใหม่ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันซึ่งก่อนหน้านี้ละเลยไป

Cistanche deserticolaเป็นที่รู้จักกันในนาม 'โสมทะเลทราย' 19 ส่วนประกอบของมันมีประโยชน์ในการบาดเจ็บของตับที่เกิดจากเอทานอลและการอักเสบในลำไส้มากเกินไป นอกจากนี้ยังสามารถใช้เป็นสารต่อต้านความเหนื่อยล้า ต้านการอักเสบ และต่อต้านเนื้องอกได้อีกด้วย20-22 เมื่อเร็ว ๆ นี้ Guo et al รายงานว่าCistanche deserticola พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักอย่างหนึ่ง มีสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ป้องกันตับ20; อีกสองการศึกษาระบุถึงบทบาทในการปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บในภาวะขาดออกซิเจน/การกลับเป็นซ้ำ และภาวะโรคกระดูกพรุน23,24 อย่างไรก็ตาม บทบาทของ CDP ในโรคที่เกิดจากรอยด่างดำยังไม่เป็นที่แน่ชัด ในที่นี้ เรามุ่งที่จะยืนยันว่า CDP cความเครียดออกซิเดชันจะส่งผลต่อการสร้างเม็ดสีและปกป้องเซลล์ผิวจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

2.|วัสดุและวิธีการ

2.1|สารเคมีและแอนติบอดี

Cistanche deserticolaพอลิแซ็กคาไรด์(CDP) และ l-dopa ซื้อมาจาก Yuanye Biotec (ความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2), ไดเมทิลซัลโฟออกไซด์ (DMSO), NaOH, ไทรทัน X-100, 4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล-2,5-ไดฟีนิลเตตทราโซเลียม โบรไมด์ ( MTT) และ Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit จาก Sigma-Aldrich ซื้อพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นกลาง 4% จาก Biosharp (เหอเฟย์, จีน); และชุดย้อมสีภูมิคุ้มกัน (Alexa Fluor 488) และ 2,7-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) จาก Beyotime Biotec (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) Fontana-Masson Stain Kit และ Nucleoplasmic Protein Extraction Kit ถูกซื้อจาก Sloarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) อาหารเสริมเพื่อการเจริญเติบโตของเมลาโนไซต์ของมนุษย์ (HMGS), สื่ออินทรีดัดแปลง (DMEM) ของ Dulbecco และสื่อ 254 ถูกซื้อจาก Gibco ซื้อซีรั่มวัวในครรภ์ (FBS) จาก BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel) แอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับ -แอกติน, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 และ HO-1 ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology โดยซื้อแอนติบอดีหลักสำหรับ MITF จาก St John's Laboratory ซึ่งเป็นแอนติบอดีหลักสำหรับ p-MITF ที่ซื้อจาก Affinity Biosciences ซึ่งเป็นแอนติบอดีปฐมภูมิ สำหรับ GAPDH นั้นซื้อจาก Bioworld และซื้อแอนติบอดีหลักสำหรับ TRP1 จาก EMD Millipore

2.2| การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

เซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ขนาดกลางที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์และยาปฏิชีวนะผสมเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เมลาโนไซต์ของผิวหนังมนุษย์ (HEMs) ถูกแยกออกจากหนังหุ้มปลายลึงค์ของมนุษย์ (อ้างอิงจากการศึกษาก่อนหน้านี้ 25) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ 254 ที่เสริมด้วย HMGS, FBS 5 เปอร์เซ็นต์ และยาปฏิชีวนะผสมเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ทั้งหมดถูกเพาะเลี้ยงในตู้ฟักแบบเปียกที่ 37 องศาพร้อมคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ CDP ถูกละลายใน DMSO และเจือจาง

ด้วยตัวกลางก่อนใช้งาน ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ต่ำกว่า 0.1 เปอร์เซ็นต์ H2O2 ถูกเจือจางด้วยตัวกลางก่อนใช้

2.3|การเพาะเลี้ยงปลาม้าลายและการรักษา

ตัวอ่อนและสื่อของปลาม้าลายซื้อมาจาก EzeRinka Biotech โปรโตคอลการทดลองได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์ ปลาม้าลายถูกเพาะเลี้ยงในเพลต12-หลุมที่ 37 องศาจากแสงและบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP ใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวเพื่อสังเกตและบันทึกเมลานินที่หัวและหางของปลาม้าลายทุกวัน หลังจากการสังเกต เราเปลี่ยนสื่อและเพิ่ม CDP อีกครั้ง วัดความหนาแน่นของเมลานินที่ส่วนหางของปลาม้าลายด้วย Image J และแสดงค่าเป็นความหนาแน่นทางแสงแบบบูรณาการ (IOD)

2.4| ความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกวัดโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของ CDP, HEMs และเซลล์ B16F10 ถูกปลูกฝังในเพลต96-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 1{{30}}3 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงจนกระทั่ง เซลล์ถูกยึดติดกับจาน จากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 และ 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CDP เป็นเวลา 24, 48 หรือ 72 ชั่วโมง ก่อนการวัด MTT 20 ไมโครลิตรถูกเติมในแต่ละหลุมและเพลตถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากนั้น เราทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอนและเติม DMSO 160 ไมโครลิตรในแต่ละหลุมเพื่อละลายผลึกฟอร์มาซาน ค่าการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรวัดโดยเครื่องอ่านเพลตมัลติโหมด (PerkinElmer) เพื่อตรวจสอบผลของ CDP ในสภาวะความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย H2O2-, HEM และเซลล์ B16F10 ถูกชุบในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 4 × 103 เซลล์/หลุม เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย CDP ที่มีความเข้มข้นต่างกัน (0, 20, 40 หรือ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงเพิ่ม H2O2 (ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 ไมโครเมตรสำหรับ HEM และ 1.0 มม. สำหรับเซลล์ B16F10) ลงในแต่ละหลุม และฟักตัวเซลล์ต่อไปอีก 24 ชั่วโมง เราตั้งค่ากลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วย CDP และกลุ่มควบคุมเชิงลบ (NC) ขั้นตอนการตรวจจับเหมือนกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

2.5|การทดสอบ NaOH ของปริมาณเมลานิน

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ {{0}} มม. และบำบัดด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมใน 1 5-หลอดมล. เราล้างเซลล์สองครั้งด้วยน้ำกลั่นสองครั้ง แขวนเซลล์ใหม่อีกครั้งในเอทานอล 1 มล. และหมุนเวียนเซลล์เพื่อปลดปล่อยเมลานิน จากนั้นเราปั่นแยกส่วนผสม (200 กรัม, 5 นาที) และทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอน เติม DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ 1 มล. (เจือจางด้วยสารละลาย NaOH 1 มม.) 1 มล. ลงในหลอดแต่ละหลอด และแขวนตะกอนไว้ เราฟักตัวในอ่างน้ำที่ 80 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้เมลานินละลาย สุดท้าย เราถ่ายโอนของเหลว 200 ไมโครลิตรไปยังเพลท 96-หลุม และใช้เครื่องอ่านเพลทแบบมัลติโหมดเพื่อวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 470 นาโนเมตร

2.6|การวัดกิจกรรมของไทโรซิเนส

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อขนาด {{0} มม. และบำบัดด้วย CDP ก่อนการวัด ย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอดขนาด 1.5- มล. และล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS ). เราย้ายเซลล์ 106 เซลล์จากตัวอย่างแต่ละตัวอย่างไปยังหลอดใหม่ และทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอนหลังจากการปั่นแยก จากนั้นเติมไทรทัน X-100 1 มล. 0.5 เปอร์เซ็นต์ลงในเม็ดเซลล์และเก็บ ผสมที่อุณหภูมิ 0 องศาเป็นเวลา 15 นาที หลังจากนั้น เราเพิ่ม l-dopa 1 มล. (1 มม. เจือจางด้วยบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์ 0.1 M ฟอสเฟต) เป็นสารตั้งต้นและผสมสารละลาย ย้ายส่วนผสม 200 ไมโครลิตรไปยังจานหลุม 96-หลุม ทันทีและวัดค่าการดูดกลืนแสง (A0) ที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านเพลตมัลติโหมด ทำซ้ำการวัดที่ 10 นาที (A10) กิจกรรมของไทโรซิเนสคำนวณโดย (A10-A0)/105 และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ ( เปอร์เซ็นต์ ) เทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ

2.7| Fontana-Masson การย้อมสีเมลานิน

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 12-หลุมจนได้ความหนาแน่น 50 เปอร์เซ็นต์ หลังการรักษา เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นกลาง 4% เป็นเวลา 30 นาที และล้างด้วยน้ำกลั่น จากนั้นเราเติมสารละลายแอมโมเนีย-เงินฟอนทานา 500 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และเก็บจานไว้ในที่มืดเป็นเวลา 16 ชั่วโมงเพื่อย้อมเมลานิน ต่อไป เราล้างเซลล์ด้วยน้ำกลั่นห้าครั้ง (ในแต่ละครั้ง 1 นาที) และแช่เซลล์ในไฮโปซัลไฟต์ 500 ไมโครลิตรเป็นเวลา 5 นาที ในที่สุด เราก็เอาไฮโปซัลไฟต์ออกและล้างเซลล์อีกครั้งด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 1 นาที จากนั้นเราใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวเพื่อสังเกตและบันทึกเมลานิน

2.8|การสกัด RNA และปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ - โพลีเมอเรส

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 6-หลุม หลังการบำบัด เซลล์ถูกย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มล. เราล้างเซลล์ด้วย PBS สองครั้ง จากนั้นเติมบัฟเฟอร์ lysis 1 มล. ปั่นส่วนผสม และวางหลอดบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อทำให้เซลล์แตกสลายอย่างสมบูรณ์ RNA ถูกสกัดโดยใช้ Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) และ reverse-transcribed (RT) โดยใช้ ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ-โพลีเมอเรส (PCR) ถูกดำเนินการโดยใช้ KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO) ปริมาตรปฏิกิริยาของของผสม RT คือ 20 ไมโครลิตร ในขณะที่ปริมาตรปฏิกิริยาของของผสม PCR คือ 20 ไมโครลิตร (cDNA 1-8 ไมโครลิตร, MIX 10 ไมโครลิตร, ไพรเมอร์ F 1 ไมโครลิตร, ไพรเมอร์ R 1 ไมโครลิตร, เพิ่ม DEPC H2O ถึง 20 ไมโครลิตร ). การทดลองได้ดำเนินการตามโปรโตคอล ลำดับของไพรเมอร์แสดงอยู่ในตาราง S1

2.9|การสกัดโปรตีนและ Western blotting/ immunofluorescence

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ 100- มม. หลังการบำบัด เซลล์ถูกย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มล. เราล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS จากนั้นเติมใน 500 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ RIPA lysis (Thermo Fisher) เสริมด้วยฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ 1 มม. (Thermo Fisher) และค็อกเทลสารยับยั้งฟอสฟาเตสเจือจาง 1:100 (โรช) โปรตีนนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึมถูกสกัดโดยใช้ชุดสกัดโปรตีนนิวคลีโอพลาสซึมตามระเบียบวิธีของผู้ผลิต เราวางหลอดไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาทีและหมุนวนทุกๆ 5 นาทีเพื่อทำให้เซลล์แตกสลายอย่างสมบูรณ์ เราปั่นแยกเซลล์ (200 กรัม 4 องศา 15 นาที) ย้ายส่วนลอยเหนือตะกอนไปยังหลอดใหม่ และวัดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (KeyGEN Biotec) เราต้มโปรตีนด้วยบัฟเฟอร์โหลด 5 เท่า (Beyotime Biotec, China) ที่ 100 องศาเป็นเวลา 10 นาที แล้วเก็บไว้ที่ −80 องศา วิธีโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (PAGE) ถูกใช้ใน Western blotting และแยกโปรตีน 20 ไมโครกรัมของแต่ละกลุ่มและถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ หลังจากการบล็อกแอนติเจน เราฟักตัวเมมเบรนในแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง 1:1000 เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 4 องศา จากนั้นล้างเมมเบรนด้วย PBST และบ่มใน 1:{22}} แอนติบอดีรองฟลูออเรสเซนต์เจือจางเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา . ตรวจพบความเข้มของการเรืองแสงโดยใช้ระบบการถ่ายภาพ Odyssey CLx (LI-COR) อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ดำเนินการโดยใช้ชุดย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (Alexa Fluor

488) ด้วยการเจือจาง 1:100 ของแอนติบอดีปฐมภูมิ

2.10|การวัดการตายของเซลล์

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ {{0}} มม. และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CDP เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และ H2O2 ถูกเติม ( ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 ไมโครเมตรสำหรับ HEM, 1.0 มม. สำหรับเซลล์ B16F10) ในแต่ละหลุมและฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง นอกจากนี้เรายังตั้งกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDP และกลุ่ม NC หลังการรักษา เราย่อยเซลล์ด้วยทริปซินที่ปราศจาก EDTA และรวบรวมพวกมันในหลอด จากนั้นล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS และแขวนลอยใหม่ใน 100 ไมโครลิตรของ PBS เซลล์ถูกย้อมด้วย Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit ตามโปรโตคอลและตรวจพบโดย flow cytometry (FCM) ซอฟต์แวร์ FlowJo ใช้ในการวิเคราะห์อัตราการตายของเซลล์

2.11| การวัด ROS ภายในเซลล์

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต {{0}}หลุม และทำการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CDP เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งเราเติม H2O2 (ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 µm สำหรับ HEM

1.0 มม. สำหรับ B16F10 เซลล์) ต่อแต่ละหลุม บ่มเซลล์สำหรับอีกหลุมหนึ่ง

24 ชั่วโมงและตั้งค่ากลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDP และ NC หลังการรักษา เราล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS เพื่อเอาสื่อและ FBS ออกทั้งหมด จากนั้นเจือจางโพรบ DCFH-DA เป็น 1:1000 ด้วยสื่อและเพิ่มในแต่ละหลุม เราฟักเซลล์ที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที และล้างเซลล์เหล่านั้นสามครั้งด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัม เราใช้ an

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงกลับด้านเพื่อสังเกตและบันทึกการเรืองแสง จากนั้นใช้ ImageJ เพื่อวัดความเข้มของการเรืองแสง

2.12|สถิติและการวิเคราะห์

ข้อมูลในงานนี้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) และการวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 7.0) หรือ SPSS (เวอร์ชัน 220) และ Student's t-test หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายกลุ่ม ค่าสีเทาของแถบโปรตีน WB ถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย GAPDH หรือ -แอกติน ค่าของ P < .05="" ถือว่ามีนัยสำคัญ="">

3|ผลลัพธ์

3.1|CDP กระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ HEM และ B16F10

ก่อนที่เราจะเริ่มต้น เราใช้การทดสอบ MTT เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่อาจเกิดขึ้นของ CDP บน HEM และเซลล์เมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ เซลล์ถูกบำบัดด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกันเป็นเวลา 24, 48 หรือ 72 ชั่วโมง การทดสอบความมีชีวิตของ HEM แสดงให้เห็นว่าเมื่อความเข้มข้นต่ำกว่า 320 ug/mL, CDP ไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ อย่างไรก็ตาม ความอยู่รอดได้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อความเข้มข้นถึง 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรที่ 24, 48 และ 72 ชั่วโมง (P < .05;="" รูปที่="" 1a)="" ความมีชีวิตของเซลล์="" b16f10="" ยังลดลงที่="" 48="" และ="" 72="" ชั่วโมงเมื่อ="" cdp="" ถึง="" 320="" ไมโครกรัม/มิลลิลิตร="" (p="">< .01)="" แต่ไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงที่ความเข้มข้นต่ำกว่า="" (รูปที่="" 1b)="" จากนั้นเราได้สำรวจบทบาทของ="" cdp="" ในการเกิดเมลาโนเจเนซิสและเปรียบเทียบผลกระทบของฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์="" (="" -msh;="" ความเข้มข้น:="" 20,="" 100="" และ="" 400="" นาโนเมตร)="" และ="" dmso="" (0.1="" เปอร์เซ็นต์)="" ใน="" hem="" ผลการย้อมสีเมลานิน="" กิจกรรมของไทโรซิเนส="" และการทดสอบปริมาณเมลานินชี้ให้เห็นว่า="" cdp="" เทียบได้กับ="" -msh="" ในการส่งเสริมการสร้างเม็ดสี="" ในขณะที่การรักษาด้วย="" dmso="" 0.1="" เปอร์เซ็นต์ไม่มีความแตกต่าง="" (รูปที่="">

เราปรับปรุงการสำรวจของเราเพิ่มเติมตามลำดับ HEM ถูกบำบัดด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง; การย้อมสีเมลานิน ปริมาณเมลานิน และการทดสอบฤทธิ์ของไทโรซิเนสได้ดำเนินการ และทั้งหมดแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วย CDP ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นซึ่งสูงสุดในกลุ่ม 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (P < .05,="" รูปที่="" 2a-c)="" .="" จากนั้นเราวัดระดับ="" mrna="" และโปรตีนของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" และ="" fscn1)="" cdp="" เพิ่มระดับ="" mrna="" ของยีนเหล่านั้นใน="" hem="" อย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< .05;="" รูปที่="" s2a)="" นอกจากนี้="" ระดับของโปรตีน="" mitf,="" tyr,="" trp1="" และ="" rab27a="" เพิ่มขึ้น="" เช่นเดียวกับอัตราส่วนของ="" mitf="" ที่มีฟอสโฟรีเลตต่อ="" mitf="" ทั้งหมด="" (p="">< .05)="" ในขณะที่="" trp2="" และ="" fscn1="" ไม่มีความแตกต่าง="" (รูปที่="" 2d,="" e)="" ผลการวิจัยพบว่า="" cdp="">

นอกจากนี้เรายังตรวจสอบผลกระทบของ CDP อีกครั้งด้วยเซลล์ B16F10 และพบว่าปริมาณเมลานินของเซลล์ B16F10 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < .01;="" รูปที่="" s2b)="" นอกจากนี้="" cdp="">

3.2|CDP ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีในปลาม้าลาย

เพื่อตรวจสอบว่า CDP สามารถส่งเสริมได้หรือไม่การสร้างเม็ดสีในร่างกาย เราใช้ตัวอ่อนของปลาม้าลาย เอ็มบริโอของ zebrafish ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่มและบำบัดอย่างต่อเนื่องด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเพียงอย่างเดียว (NC) หรือ CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ug/mL); บันทึกความหนาแน่นและการกระจายของเม็ดเมลานินทุกวัน เมื่อเอ็มบริโอของ zebrafish โตขึ้น เราพบว่าความหนาแน่นของเมลานินค่อยๆ เพิ่มขึ้นที่หัวและหาง ในวันที่ 3 ความแตกต่างระหว่างกลุ่มสามารถแยกแยะได้ และความแตกต่างยังคงเพิ่มขึ้นจนกว่าเราจะสิ้นสุดการทดสอบในวันที่ 6 (รูปที่ 3A) เราใช้ Image J เพื่อวัดความหนาแน่นของเมลานินในหางของปลาม้าลาย ความหนาแน่นของเมลานินในกลุ่มที่บำบัดด้วย CDP สูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < .05;="" รูปที่="">

3.3|เส้นทางสัญญาณ MAPK ที่เปิดใช้งาน CDP ในเซลล์ HEM และ B16F10

เพื่อเปิดเผยกลไกที่ กปปส. ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีเรารักษา HEM ด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ

80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงตรวจสอบระดับฟอสโฟรีเลตและระดับทั้งหมดของโปรตีน ERK, JNK และ p38 ในวิถีการส่งสัญญาณ MAPK ตามที่วัดโดย Western blotting ระดับ p-ERK, p-JNK และ p-p38 เพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย CDP (P < .05)="" ในขณะที่ระดับทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลง="" (รูปที่="" 4a,="" b)="" การทดลองซ้ำกับเซลล์="" b16f10="" และระดับฟอสโฟรีเลตของโปรตีน="" erk,="" jnk="" และ="" p38="" เพิ่มขึ้น="" (p="">< .05)="" แต่ระดับ="" mapk="" ทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลง="" (รูปที่="" 4c,="" d)="" สอดคล้องกับผลลัพธ์ใน="" hem="">

3.4|CDP ที่ลดทอน H2O2-ที่เหนี่ยวนำ

ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเซลล์ HEMs และ B16F10

เราใช้ H2O2 เพื่อจำลองความเครียดออกซิเดชันสิ่งแวดล้อมและสำรวจบทบาทของ CDP ใน melanocytes ภายใต้ความเครียดออกซิเดชัน. ความเข้มข้นสุดท้ายของ H2O2 ที่ใช้ใน HEM คือ 500 ไมโครเมตร ในขณะที่ในเซลล์ B16F10 คือ 1.0 มม. เพื่อตรวจสอบผลของ CDP ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก H2O2- เราได้เตรียมเซลล์ HEM และ B16F10 ด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ug/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงเติม H2O2 และทำการบำบัดต่อไป เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนดำเนินการสังเกตและทดสอบ MTT

H2O2 ทำให้เกิดการหลั่งของเมมเบรนและการหดตัวของเซลล์ใน HEMs ในกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วย CDP สถานการณ์ก็บรรเทาลง การบำบัดด้วย CDP เพียงอย่างเดียวไม่มีผล (รูปที่ 5A) การทดสอบ MTT แสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันในการที่การรักษาด้วย H2O2 ลดความมีชีวิตของ HEM ในขณะที่ CDP ช่วยบรรเทาผลกระทบที่เป็นอันตรายนี้ได้อย่างมีนัยสำคัญ

3.5|CDP scavenged H2O2-กระตุ้น ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ HEM และ B16F10

ในการตรวจสอบกลไกของ CDP ในการลดความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ H2O2-และการตายของเซลล์ เราได้ตรวจพบ ROS ภายในเซลล์เพิ่มเติมในเซลล์ HEM และ B16F10 โดยใช้การเรืองแสง DCFH-DA

4|การอภิปรายและข้อสรุป

ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบบทบาทของ CDP ในเซลล์ HEM และ B16F10 เป็นครั้งแรกที่เราพบว่า CDP สามารถส่งเสริมได้การสร้างเม็ดสีใน melanocytes และส่งเสริมการสร้างเม็ดสีใน zebrafish การทดลองต่อมาแสดงให้เห็นว่าวิถีการส่งสัญญาณ MAPK ถูกกระตุ้นภายใต้การบำบัดด้วย CDP เราได้ตรวจสอบบทบาทของมันเพิ่มเติมในความเครียดออกซิเดชันและพบว่า CDP สามารถลดทอน H2O2- ที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเมลาโนไซต์ ในขณะเดียวกัน CDP สามารถกระตุ้นเส้นทางของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 และกำจัด ROS ภายในเซลล์ภายใต้ความเครียดออกซิเดชันเงื่อนไข.

ไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนเป็นวิถีทางที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมของ MITF ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญที่ส่งเสริมการแสดงออกของการสร้างเม็ดสี-ยีนที่เกี่ยวข้องและส่งผลต่อการสังเคราะห์และการขนส่งเมลานินในเวลาต่อมา26,27 ในการศึกษาของเรา การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของ ERK, JNK และ p38 ในเมลาโนไซต์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษา CDP; ในขณะเดียวกัน การแสดงออกของ MITF/p-MITF และ TYR ที่ขับเคลื่อนด้วย MITF, TRP1, TRP2 และ RAB27A

ถูกควบคุมขึ้นตามนั้น ดังนั้น เราขอแนะนำว่า CDP สามารถ

ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีผ่านการเปิดใช้งานเส้นทาง MAPK แต่วิธีที่ CDP เปิดใช้งาน MAPK ยังไม่ทราบ จากการศึกษาล่าสุดพบว่า toll-like receptor 4 (TLR4) แสดงออกอย่างมากใน melanocytes และเกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี 28,29 TLR4 เป็นโปรตีนเมมเบรนที่สำคัญที่สามารถจับ lipopolysaccharide (LPS) 30; การศึกษารายงานว่า LPS สามารถกระตุ้นการสร้างเม็ดสีได้29 ที่น่าสนใจคือพอลิแซ็กคาไรด์สกัดจากพืชหรือเห็ดที่มีรายงานว่าเปิดใช้งาน TLR และเส้นทางส่งสัญญาณปลายน้ำเช่น MAPK และปัจจัยนิวเคลียร์แคปปาเบต้า (NF-κB) 31,32 ดังนั้นเราจึงสงสัยว่า CDP สามารถรับรู้และผูกมัดโดย TLR จากนั้นเปิดใช้งานสัญญาณ MAPK ปลายทาง - เส้นทางหลิงและส่งเสริมการสร้างเม็ดสี. นอกจากนี้ นิวคลีโอไทด์ที่มีผลผูกพัน oligomerization domain-like receptors (NLRs) ยังรู้จักลิแกนด์ภายในเซลล์และกระตุ้นการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK และ NF-κB 33,34 ตามรายงาน โพลีแซคคาไรด์ที่สกัดจากเห็ดหลินจือและแอสตรากาลัสสามารถเข้าสู่เซลล์ได้ และส่งผลกระทบต่อ NLRs.35,36 ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ CDP สามารถเข้าสู่เมลาโนไซต์และควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ผ่าน NLR อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันสมมติฐานนี้

งานวิจัยบางชิ้นรายงานการใช้สมุนไพรพอลิแซ็กคาไรด์ในการสร้างเมลาโนเจเนซิสเพื่อยับยั้งการผลิตเมลานิน37,38 อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ CDP ได้ส่งเสริมการสร้างเมลานินใน

เมลาโนไซต์ และผลกระทบนี้ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมหลังจากเปรียบเทียบกับ -MSH CDP ก็เป็นเหมือนพอลิแซ็กคาไรด์สกัดจากสมุนไพร เราสงสัยว่าผลตรงกันข้ามของ CDP อาจเกี่ยวข้องกับความแตกต่างของโครงสร้างระหว่าง CDP กับอื่นๆพอลิแซ็กคาไรด์. โพลีแซ็กคาไรด์เกิดขึ้นจากกระบวนการพอลิเมอไรเซชันของโมโนแซ็กคาไรด์ แต่แปรผันในประเภทโมโนแซ็กคาไรด์ องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์ พันธะไกลโคซิดิก โครงสร้างสายข้าง และน้ำหนักโมเลกุล39,40 คิดว่าปัจจัยเหล่านี้กำหนดหน้าที่ทางชีวภาพของพวกมัน 41 การศึกษาที่มีอยู่ได้เสนอโครงสร้างของ CDP และเสนอว่าโครงสร้าง CDP มีอิทธิพลต่อการทำงานของมันในเวลาต่อมา42 ดังนั้น จำเป็นต้องมีการพิสูจน์เพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจ CDP อย่างถ่องแท้และยืนยันสมมติฐานของเรา

การสร้างเม็ดสีเป็นกลไกการป้องกันที่สำคัญของการต่อต้าน

ความเสียหายจากรังสีอัลตราไวโอเลตและการรักษาสภาวะสมดุลของร่างกาย43; ในเวลาเดียวกัน

เวลา melanocytes สามารถสัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยได้ง่ายเช่น ROS overload.11 เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่า ROS มีส่วนร่วมในการส่งเสริมการสร้างเม็ดสีหนึ่งในกลไกที่กระตุ้น MAPKs44 แต่จากการศึกษายังพบว่าผลกระทบนี้มีอยู่ภายในระดับ ROS ที่แน่นอนเท่านั้น ในขณะที่ ROS โอเวอร์โหลดจะบั่นทอนการสร้างเม็ดสีอย่างมีนัยสำคัญ45 ความสัมพันธ์ระหว่าง ROS, MAPK และการสร้างเม็ดสีมีความแปรปรวนภายใต้สภาวะที่ต่างกัน ดังนั้น ความสมดุลระหว่างระบบโปรและสารต่อต้านอนุมูลอิสระมีความสำคัญอย่างเห็นได้ชัด ในโรคที่เกิดจากรอยด่างดำ เช่น โรคด่างขาว ระบบต้านอนุมูลอิสระที่ไม่สมดุลและ ROS เกินพิกัดที่ควบคุมไม่ได้จะทำลายเมลาโนไซต์และลดความมีชีวิตของเซลล์11,46 ในการศึกษานี้ เราใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ H2O2 เพื่อจำลองการโอเวอร์โหลด ROS ในเซลล์ และ HEM มีความทนทานน้อยกว่า H2O2 มากกว่าเซลล์ B16F10 เมื่อเมลาโนไซต์ได้รับการรักษาด้วย H2O2 ความมีชีวิตและอัตราการตายของเซลล์จะแย่ลง แต่

การปรับสภาพของ CDP อาจทำให้แนวโน้มกลับด้านได้บางส่วน ในเวลาเดียวกัน ROS ก็ถูกไล่ออก ตามที่รายงาน การกระตุ้นเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระ NRF2/ARE เป็นวิธีการหลักในการกำจัด ROS ในเซลล์ผิวหนัง14 ในการทดลองของเรา ระดับโปรตีนของ NRF2 และ H2O-1 ในเซลล์เมลาโนไซต์ถูกควบคุมขึ้นหลังการรักษาด้วย H2O2 โดยไม่มี CDP; นี่หมายความว่า H2O2-ถูกเหนี่ยวนำความเครียดออกซิเดชันสามารถเปิดใช้งานเส้นทาง NRF2/HO-1 แต่ไม่เพียงพอสำหรับการรักษาสมดุลรีดอกซ์และปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บ อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพด้วย CDP ได้ปรับปรุงเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 และช่วยคืนความสมดุล ดังนั้น เราขอแนะนำว่า CDP สามารถปกป้องเซลล์เมลาโนไซต์จากการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านการกระตุ้นเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 และการขจัด ROS

เราพบว่าการรักษาด้วย CDP เพียงอย่างเดียวไม่มีผลต่อ ROS หรือ NRF2/HO-1 ในเมลาโนไซต์ ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นว่า CDP สามารถส่งผลต่อสมดุลรีดอกซ์ภายใต้ความเครียดออกซิเดชัน แต่ไม่ใช่สภาวะปกติ นอกจากนี้ มีรายงานว่าเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K, NF-κB และ MAPK 47,48 ในการศึกษาของเรา CDP สามารถเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ได้ เป็นไปได้ที่ CDP สามารถเปิดใช้งานเส้นทาง NRF2/HO-1 ผ่าน MAPK ที่ควบคุมขึ้น ตามที่ Slominski รายงาน เมลาโนไซต์เป็นเซ็นเซอร์วัดความเครียดที่เกี่ยวข้องกับเครือข่ายการกำกับดูแล และหน้าที่ของพวกมันสามารถเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วตามสภาพแวดล้อม เราแนะนำว่าบทบาทของ CDP นั้นได้รับอิทธิพลจากสถานะของเมลาโนไซต์ มันสามารถส่งเสริมการสร้างเม็ดสีโดยไม่ส่งผลกระทบต่อสารต้านอนุมูลอิสระ ระบบภายใต้สภาวะปกติแต่คืนสมดุลรีดอกซ์ภายใต้ความเครียดออกซิเดชันเงื่อนไข. ดังนั้น CDP จึงสามารถรักษาหน้าที่ของเมลาโนไซต์และการอยู่รอดได้สองวิธี CDP ช่วยให้เมลาโนไซต์รักษาสภาวะสมดุล ซึ่งเป็นหน้าที่สำคัญของการสร้างเม็ดสีด้วย50,51

โดยสรุป CDP สามารถส่งเสริมการสร้างเม็ดสีของเมลาโนไซต์

ผ่านการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK CDP สามารถปรับปรุงการอยู่รอดของเมลาโนไซต์ผ่านการกระตุ้นวิถีของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 และการกำจัด ROS ภายในเซลล์ภายใต้สภาวะความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การค้นพบของเรามีความหมายเพราะแสดงให้เห็นว่า CDP สามารถส่งเสริมได้ทั้งคู่การสร้างเม็ดสีและปกป้องเมลาโนไซต์จากความเครียดออกซิเดชันการบาดเจ็บซึ่งอาจเป็นสาเหตุของความผิดปกติและการสูญเสียของเมลาโนไซต์ ผลการศึกษานี้บ่งชี้ว่า CDP อาจเป็นยาใหม่ในการรักษาโรครอยคล้ำ

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย National Natural Science Foundation of China (No. 81703101), the New Xiangya Talent Projects of the Third Xiangya Hospital of Central South University (No. JY201623 and No. 20170301), the Natural Science Foundation of Hunan Province ( ฉบับที่ 2018JJ3788 และฉบับที่ 2018JJ3793) และโครงการคณะกรรมการสุขภาพหูหนาน (ฉบับที่ C2019173) ดร. Yibo Hu ได้ทำการศึกษาส่วนหลักของการศึกษาและเขียนต้นฉบับ ศาสตราจารย์ Jing Chen และ Qinghai Zeng ออกแบบการศึกษาและชี้นำการเขียนต้นฉบับ ศาสตราจารย์ Jinhua Huang, Lihua Huang และ Hong Xiang ให้การสนับสนุนด้านเทคนิคและวิเคราะห์ข้อมูล Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang และ Xiaojiao Zhao มีส่วนร่วมในการทดลอง

ขัดผลประโยชน์

ผู้เขียนยืนยันว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูลที่สนับสนุนการค้นพบของการศึกษานี้มีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องเมื่อมีการร้องขอที่สมเหตุสมผล

ข้อมูลอ้างอิง

1. Bleuel R, Eberlein B. การจัดการรักษาโรคด่างขาว เจ ดีช เดอร์มาทอล เกส 2018;16:1309-1313.

2. แต๊บ เอ, เมอร็องต์ เจเอ็ม. เราควรจัดลำดับความสำคัญของการแทรกแซงทางจิตวิทยาในการจัดการ vitiligo หรือไม่? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K และอื่น ๆ โรคด่างขาว Nat Rev Dis ไพรเมอร์ 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. เม็ดสีเมลานินในผิวหนังของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและการควบคุมฮอร์โมน Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tyrosine และ L-dihydroxyphenylalanine เป็นตัวควบคุมฮอร์โมนของการทำงานของเมลาโนไซต์ รงควัตถุเมลาโนมา Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมร่วมกันซึ่งอยู่ภายใต้โรคด่างขาวทั่วไปและโรคต่อมไทรอยด์แพ้ภูมิตัวเอง ไทรอยด์. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. โรคด่างขาวในวัยเด็กในประเทศจีน: ลักษณะทางคลินิกและการค้นพบทางภูมิคุ้มกันใน 620 ราย แอม เจ คลีน เดอร์มาทอล 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreactive T-Lymphocytes ในโรคผิวหนังอักเสบ อิมมูนอลด้านหน้า 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D และอื่น ๆ Vitiligo: การเกิดโรค ตัวแปรทางคลินิก และวิธีการรักษา ภูมิคุ้มกันอัตโนมัติ Rev. 2016;15:335-343

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, และคณะ ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาในการส่งสัญญาณเมตาบอลิซึมและการอักเสบ Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L และอื่น ๆ เมลาโนไซต์เป็นตัวกระตุ้นและตกเป็นเหยื่อของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน เจ อินเวสท์ เดอร์มาทอล 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและด่างขาว: Nrf2-ARE

การเชื่อมต่อสัญญาณ เจ อินเวสท์ เดอร์มาทอล 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. เครือข่ายการกำกับดูแล Nrf2 มีส่วนติดต่อระหว่างการเผาผลาญรีดอกซ์และตัวกลาง เทรนด์ Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. ความสำคัญของ Nrf2

ทางเดินใน (ภาพถ่าย) - การตอบสนองความเครียดออกซิเดชันใน melanocytes และ keratinocytes ของผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์ รงควัตถุเมลาโนมา Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speekaert R, Mollet I และอื่น ๆ แบบจำลองการเหนี่ยวนำและการรักษาใน vivo vitiligo: การทดลองทางคลินิกแบบสุ่มสองครั้ง รงควัตถุเมลาโนมา Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. การส่องไฟด้วยแสงอัลตราไวโอเลต B แบบวงแคบและเลเซอร์ excimer 308-nm ในการรักษาโรคด่างขาว: บทวิจารณ์ เจ แอม อแคด เดอร์มาทอล. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E และอื่น ๆ ซีนอนคลอไรด์อัลตราไวโอเลตบีเลเซอร์

มีประสิทธิภาพในการรักษาโรคสะเก็ดเงินและกระตุ้นการตายของเซลล์ T ได้ดีกว่ารังสีอัลตราไวโอเลตแบบวงแคบ B. J Photochem Photobiol B Biol 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C และอื่น ๆ ผลของสารสกัดที่เป็นน้ำของ Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator และ Rehmanniae radix preparator ต่อการสร้างเม็ดสีและการย้ายถิ่นของเมลาโนไซต์ของมนุษย์ เจ เอธโนฟาร์มาคอล. 2017;195:89-95.

19. วัง T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma "Desertginseng": บทวิจารณ์ แอม เจ ชิน เมด 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, และคณะ ลักษณะเบื้องต้น สารต้านอนุมูลอิสระ และกิจกรรมป้องกันตับของพอลิแซ็กคาไรด์จากCistanche deserticola. อินท์ เจ ไบโอล แมคโครมอล 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y และอื่น ๆ ฤทธิ์ต้านความล้าของสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนิลทานอยด์จากCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X และอื่น ๆ ฤทธิ์ต้านเนื้องอกและต้านการอักเสบของโอลิโกแซ็กคาไรด์จากCistanche deserticolaสารสกัดจากอาการบาดเจ็บไขสันหลัง อินท์ เจ ไบโอล แมคโครมอล 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M และอื่น ๆCistanche deserticola พอลิแซ็กคาไรด์ปกป้องเซลล์ PC12 จากการบาดเจ็บที่เกิดจาก OGD/RP เภสัชกร. 2018;99:671-680.

24. เพลง D, Cao Z, Liu Z, และคณะCistanche deserticola พอลิแซ็กคาไรด์ลดทอน osteoclastogenesis และการสลายของกระดูกผ่านการยับยั้งการส่งสัญญาณ RANKL และการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา เจ เซลล์ ฟิสิออล 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J และอื่น ๆ การลดระดับของ TUG1 ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีและการสร้างเม็ดสีที่เกิดจาก UVB เอ็กซ์พี เดอร์มาทอล 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F และอื่น ๆ โปรแกรมการสืบเชื้อสายของ melanocyte ให้ความต้านทานต่อการยับยั้ง MAP kinase pathway ธรรมชาติ. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "สรีรวิทยาการถอดความ" ของการสร้างเม็ดสีใน melanocytes: บทบาทสำคัญของ MITF เอ็กซ์พี เดอร์มาทอล 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F และอื่น ๆ เซลล์เมลาโนไซต์ของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงจะกดตัวรับค่าโทรที่ทำหน้าที่เหมือน 2–4, 7 และ 9 J Dermatol Sci 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, คังฮยี เมลาโนไซต์ของมนุษย์แสดงรีเซพเตอร์ที่คล้ายค่าโทร 4. Exp Dermatol 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C และอื่น ๆ สัมพันธ์กันของกิจกรรมของผู้ช่วยครอบครัว GLA เซมิน อิมมูนอล 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC และอื่น ๆ นวนิยายพอลิแซ็กคาไรด์ที่ได้จาก Craterellus cornucopioides ช่วยเพิ่มการออกฤทธิ์ของภูมิคุ้มกันในแบบจำลองหนูที่มีภูมิคุ้มกันโดยผ่านการควบคุมของวิถี TLR4-NF-kappaB ฟังก์ชั่นอาหาร 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR และอื่น ๆ TLR-4 อาจเป็นสื่อกลางในการส่งสัญญาณเส้นทางของ Astragalusพอลิแซ็กคาไรด์RAP กระตุ้นการแสดงออกของไซโตไคน์ของเซลล์ RAW264.7 เจ เอธโนฟาร์มาคอล. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F และอื่น ๆ แบคทีเรีย T6SS effector EvpPprevents NLRP3 inflammasome Activation โดยการยับยั้งเส้นทาง MAPK-Jnk ที่ขึ้นกับ Ca (2 plus) เซลล์โฮสต์จุลินทรีย์ 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: เซ็นเซอร์ภูมิคุ้มกันในเนทหลายแง่มุม เทรนด์อิมมูนอล 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. ฤทธิ์ต้านการอักเสบและป้องกันตับของเห็ดหลินจือพอลิแซ็กคาไรด์ป้องกันการบาดเจ็บของตับที่เกิดจากคาร์บอนเตตระคลอไรด์ในหนูคุนหมิง เภสัชวิทยา. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B, และคณะ ตาตุ่มพอลิแซ็กคาไรด์ลดอาการลำไส้ใหญ่บวมของหนูผ่านการยับยั้ง NLRP3 inflammasome แพลนตา เมด. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J และอื่น ๆ เห็ดหลินจือพอลิแซ็กคาไรด์ลดการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยการยับยั้งผลกระทบของพาราไครน์ของเคราติโนไซต์และไฟโบรบลาสต์ผ่านวิถีทาง IL-6/STAT3/FGF2 เจ เซลล์ ฟิสิออล 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S และอื่น ๆ ผลกระทบของพอลิแซ็กคาไรด์FMP-1 จาก Morchella esculenta เกี่ยวกับการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ B16F10 และปลาม้าลาย ฟังก์ชั่นอาหาร 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY และอื่น ๆ ลักษณะทางโมเลกุลและฤทธิ์ทางชีวภาพของพอลิแซ็กคาไรด์จากหญ้าชนิต (Medicago sativa L.) สารอาหาร 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I และอื่น ๆ การปรากฏตัวขององค์ประกอบติดตามขยายการตอบสนองระดับโมเลกุลของเชื้อรา Aspergillus ไนเจอร์ต่อเหงือกกระทิงอย่างมีนัยสำคัญ นิวไบโอเทค. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q และอื่น ๆ ลักษณะของพืชพอลิแซ็กคาไรด์จาก Dendrobium officinale ด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟีหลายแบบและแมสสเปกโตรเมทริก J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. ลักษณะโครงสร้างและกิจกรรมทางภูมิคุ้มกันของสารสกัดน้ำเย็นสองตัวพอลิแซ็กคาไรด์จากCistanche deserticolaวายซี หม่า. คาร์โบไฮเดรต Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM และอื่น ๆ แสงยูวีสัมผัสสมองและระบบต่อมไร้ท่อผ่านผิวหนังอย่างไร และทำไม วิทยาต่อมไร้ท่อ 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. ข้อมูลใหม่เกี่ยวกับความผิดปกติของรอยดำ J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(ข้อ 5):18-21.

45. กลาสแมน เอสเจ โรคด่างขาว ชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา และทีเซลล์ คลินิกวิทย์. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. การไขความจริงเกี่ยวกับสารต้านอนุมูลอิสระ: mitohormesis อธิบายถึงประโยชน์ต่อสุขภาพที่เกิดจาก ROS นัท เมด. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P และอื่น ๆ เคอร์คูมินกระตุ้นยีน haem oxygenase-1 ผ่านการควบคุมของ Nrf2 และองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. ส่งสัญญาณไปที่

heme oxygenase-1 และศักยภาพในการรักษาต้านการอักเสบ

ไบโอเคมี ฟาร์มาคอล. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocytes เป็น "ประสาทสัมผัส" และเซลล์ควบคุมในผิวหนังชั้นนอก เจ เธียร์ ไบโอล 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT บทบาทของเม็ดสีเมลานินในมะเร็งผิวหนัง เอ็กซ์พี เดอร์มาทอล 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA และอื่น ๆ บทบาทของการสร้างเมลาโนเจเนซิสในการควบคุมพฤติกรรมของเมลาโนมา: การสร้างเมลาโนเจเนซิสนำไปสู่การกระตุ้นการแสดงออกของ HIF-1อัลฟาและวิถีผู้ดูแลที่ขึ้นกับ HIF Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.