Rho-GTPase Activating Protein Myosin MYO9A ระบุว่าเป็นยีนผู้สมัครนวนิยายสำหรับโรคเนื้องอกต่อมน้ำเหลือง Monogenic Focal Segmental

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1 , Ashima Gulati2,6 , Mathieu Lemaire3,7 , Timothy Nottoli4 , Allen Bale3 และ Alda Tufro1,5

1 Department of Pediatrics, Nephrology Section, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; 2 Department of Internal Medicine, Nephrology Section, Yale School of Medicine, นิวเฮเวน, คอนเนตทิคัต, สหรัฐอเมริกา; 3 ภาควิชาพันธุศาสตร์, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; 4 Yale Gene Editing Center, Yale School of Medicine, นิวเฮเวน, คอนเนตทิคัต, สหรัฐอเมริกา; และ 5 Department of Cell and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA

คำสำคัญ: FSGS; ปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin; รุ่น MYO9A; กิจกรรม RhoA

glomerulosclerosis ปล้องโฟกัส(FSGS) เป็นโรค podocytopathy ที่นำไปสู่ภาวะไตวาย ซึ่งสาเหตุระดับโมเลกุลมักยังไม่ได้รับการแก้ไข ในที่นี้ เราอธิบายการกลายพันธุ์ของ heterozygous ไร้สาระจากการทำงานที่หายาก (p.Arg701*) ที่หายากจากการทำงานซึ่งเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของการเกิดโรคในคู่พี่น้องที่มีครอบครัวFSGS/โปรตีนในปัสสาวะ. ตัวแปรของ MYO9A ที่มีนัยสำคัญที่ไม่แน่นอนถูกระบุโดยการจัดลำดับแบบทั้งหมดในกลุ่มผู้ป่วยที่ได้รับ FSGS ที่ได้รับการพิสูจน์ด้วยการตรวจชิ้นเนื้อ 94 ราย MYO9A เป็นไมโอซินที่ไม่ธรรมดาที่มีโดเมน Rho-GAP ที่ควบคุมการประกอบจุดเชื่อมต่อเซลล์เยื่อบุผิว การเชื่อมขวาง และการรวมกลุ่มของแอคติน และปิดการทำงานของโปรตีน GTPase ขนาดเล็กที่เข้ารหัสโดยยีน RHOA กิจกรรม RhoA เกี่ยวข้องกับการควบคุมโครงร่างโครงร่างของการสร้างเส้นใยความเครียดของแอคตินและการหดตัวของแอคโตไมโอซิน ตรวจพบ Myo9A ในหนูเมาส์และพอดไซต์ของมนุษย์ ในหลอดทดลอง และในร่างกาย หนู Knockin ถือ p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) ที่สร้างขึ้นโดยการพัฒนาการตัดต่อยีน

โปรตีนในปัสสาวะ ผลพอโดไซต์ และFSGS. ไตและ podocytes จากหนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X/D เผยให้เห็น Myo9A haploinsufficiency, กิจกรรม RhoA ที่เพิ่มขึ้น, ปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin ที่ลดลง, การยึดติด podocyte ที่บกพร่องและการย้ายถิ่น ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่า Myo9A เป็นส่วนประกอบใหม่ของอุปกรณ์โครงร่างโครงกระดูกของ podocyte ที่ควบคุมการทำงานของ RhoA และการทำงานของ podocyte ดังนั้น Myo9AR701X/þ เมาส์แบบ knock-in ได้สรุปฟีโนไทป์ของ proband FSGS แสดงให้เห็นว่า p.R701X Myo9A เป็นการกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิด FSGS ในหนู และแนะนำว่าการกลายพันธุ์ของ MYO9A ที่สูญเสียจากการทำงานแบบเฮเทอโรไซกัสอาจทำให้เกิดรูปแบบใหม่ที่มีลักษณะเด่นของ autosomal ของมนุษย์ เอฟเอสจีเอ ดังนั้นการระบุ MYO9A ที่ทำให้เกิดโรค

ตัวแปรในบุคคลเพิ่มเติมที่มีครอบครัวหรือประปรายFSGSเป็นสิ่งจำเป็นในการตรวจสอบการมีส่วนร่วมของยีนต่อโรค

คำชี้แจงการแปล

งานนี้ระบุการกลายพันธุ์ของ myosin 9A (MYO9A) ที่สูญเสียการทำงานในครอบครัวที่มีโปรตีนในปัสสาวะและเส้นโลหิตตีบไตปล้องโฟกัส (FSGS) และตัวแปร MYO9Aที่มีนัยสำคัญที่ไม่แน่นอนในกลุ่ม FSGS Myo9A หนูน็อคอินซึ่งมีการกลายพันธุ์ p.Arg701* พัฒนาโปรตีนในปัสสาวะและFSGSทำซ้ำฟีโนไทป์ของโพรแบนด์ โมเดลสัตว์ใหม่นี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกแบบใหม่เกี่ยวกับฟังก์ชัน Myo9A ในพอดไซต์ และช่วยให้ทดสอบการทดลองบำบัดสำหรับ FSGS ได้ ข้อมูลแนะนำว่าการกลายพันธุ์ของ MYO9A ที่สูญเสียหน้าที่การทำงานต่างกันอาจมีส่วนทำให้FSGSการเกิดโรค เราขอเสนอให้รวม MYO9A ในแผงการทดสอบทางพันธุกรรมของ FSGS

glomerulosclerosis ปล้องโฟกัส(FSGS) เป็นรอยโรคทางเนื้อเยื่อที่สามารถนำไปสู่โรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้ายได้1 การศึกษาทางพันธุกรรมแสดงให้เห็นว่า FSGS ส่วนใหญ่เป็นสาเหตุของโรคพอโดไซโทพาที เนื่องจาก podocytes แสดงยีนกลายพันธุ์ที่เป็นสาเหตุส่วนใหญ่2,3 อย่างไรก็ตาม ไม่ทราบสาเหตุระดับโมเลกุลของ FSGS ในกว่าครึ่งกรณี3 ดังนั้น การระบุยีนที่ก่อให้เกิด FSGS เพิ่มเติมและการเกิดโรคระดับโมเลกุลจึงมีความเกี่ยวข้องทางคลินิก ที่นี่เราระบุ myosin 9A (MYO9A) เป็นยีนใหม่สำหรับ FSGS ของมนุษย์โดยการจัดลำดับทั้งหมด (WES) เป้าหมายโดยรวมของการศึกษานี้คือการพิจารณาว่าตัวแปร MYO9A ที่หายากซึ่งระบุในผู้ป่วยเปลี่ยนแปลงการทำงานของ podocyte และทำให้เกิด FSGS ในร่างกายหรือไม่ MYO9A เข้ารหัส myosin ที่ไม่ใช่กล้ามเนื้อที่ไม่ธรรมดาซึ่งไม่เคยเกี่ยวข้องกับโรคไตของมนุษย์มาก่อน4 มีรายงานการกลายพันธุ์ของ MYO9A ในผู้ป่วยโรคไขข้อและ myasthenic แต่กำเนิด5,6 Myosins เป็นตระกูลของมอเตอร์โมเลกุลที่ผูกแอกตินเพื่อสร้างแรงและการเคลื่อนไหวและให้บริการหลายเซลล์ หน้าที่ รวมทั้งการเคลื่อนไหวและการควบคุมรูปร่าง การค้าออร์แกเนลล์ และการส่งสัญญาณ มีรายงานว่าการกลายพันธุ์ของ Myosin IIA (MYH9) และการกลายพันธุ์ของ myosin 1E (MYO1E) ที่ 7–9 ทำให้เกิดโรคไตและ FSGS.10–12 คลาสที่ด้อย autosomal-9 myosins ประกอบด้วย MYO9A และ MYO9B ที่แสดงออกโดยเซลล์เยื่อบุผิวและเซลล์ภูมิคุ้มกัน ตามลำดับ9,13 ลักษณะเด่นของพวกมันคือกระบวนการหัวเดียวที่เคลื่อนที่บน F-actin และโดเมนหาง Rho-guanosine triphosphatase activating protein (Rho-GAP) ที่ทำให้ไม่ทำงาน โรอา. Myo9A mRNA แสดงออกในเยื่อบุผิวependymal epithelium ของสมองและในอัณฑะ ปอด และเยื่อบุผิวของไต4 Myo9A น็อคเอาท์หนูพัฒนา hydrocephalus ก้าวหน้า hydronephrosis เล็กน้อยและ tubulopathy.14,15 ในหลอดทดลอง Myo9A ควบคุมการรวมตัวของเซลล์เยื่อบุผิวและการย้ายเซลล์ส่วนรวม 9 ที่สำคัญ Myo9A นั้นเพียงพอที่จะเชื่อมขวางและมัดเส้นใยแอคตินที่เหนี่ยวนำให้เกิดเครือข่ายแอคติน16

RhoA ปรับพลวัตของแอคติน podocyte และรักษาความสามารถในการซึมผ่านของไต 17 การรบกวนของกิจกรรม Rho-guanosine triphosphatase (Rho-GTPase) ใน podocytes ทำให้เกิดโรคไต (ทบทวนใน Mouawad et al.18) การกลายพันธุ์ของ downstream effectors (INF2)19 และสารควบคุมของ Rho guanosine diphosphate dissociation–inhibitor alpha (ARHGDIA)3 และ Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 ทำให้เกิดโปรตีนในปัสสาวะและ FSGS ดังนั้น การปรับจูนแบบละเอียดของกิจกรรม Rho-GTPaseมีความสำคัญต่อการรักษาฟีโนไทป์ของ podocyte ในร่างกายให้เป็นปกติ 18

ในที่นี้ เรารายงานว่า MYO9A เป็นโปรตีน podocyte แบบใหม่ ซึ่งเมื่อกลายพันธุ์ในหนูทดลองจะทำให้เกิดโปรตีนในปัสสาวะ การเคลื่อนตัวของกระบวนการที่เท้า (FPE) และ FSGS ซึ่งจำลองลักษณะฟีโนไทป์ของมนุษย์ที่เกี่ยวข้องกับตัวแปร p.Arg701* MYO9A การค้นพบของเราเผยให้เห็นความเกี่ยวข้องของ Myo9A ใน podocytes แสดงให้เห็นว่า Myo9A ควบคุม podocyte RhoA และให้หลักฐานแรกที่แสดงว่า p.Arg701* Myo9A ทำให้เกิดความผิดปกติของ podocyte โดยไม่สามารถควบคุม RhoA ในทางลบและลดปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin

cistancheสามารถรักษาโรคไตทำให้ดีขึ้นการทำงานของไต

วิธีการ

WES

WES ของตัวอย่าง DNA จากพี่น้องที่ได้รับผลกระทบ 2 คนและกลุ่มตัวอย่าง 94 คนจาก Focal Segmental Glomerulosclerosis Clinical Trial (FSGS-CT; NCT00135811) ดำเนินการที่ Yale Center for Genome Analysis และ Yale DNA Clinical lab บนแพลตฟอร์ม Illumina 21–26 The FSGS- ชุดข้อมูล CT cohort WES ถูกสอบปากคำเพื่อระบุตัวแปร MYO9Aด้วยค่าตัดความถี่อัลลีลเล็กน้อย #{{0}}.01 เปอร์เซ็นต์สำหรับแวเรียนต์เฮเทอโรไซกัสและ #0.1 เปอร์เซ็นต์สำหรับแวเรียนต์แบบโฮโมไซกัสและเฮเทอโรไซกัสแบบผสม ประเมินโดยใช้คะแนนชีวสารสนเทศ MetaSVM,27 SIFT,28 และ CADD29 ตัวแปร MYO9A ได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับ Sanger แผงยีน 64 ยีนที่ก่อให้เกิด FSGS โดยอิงจาก OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, ฐานข้อมูล (omim.org) และวรรณกรรมที่เกี่ยวข้องกับ "FSGS" "glomerular proteinuria" หรือ "nephrotic syndrome" (หรือการรวมกันของ ข้อกำหนดเหล่านี้) ใช้เพื่อระบุตัวแปรที่เกี่ยวข้อง

การสร้างหนูน็อคอิน Myo9AR701X

เราสร้างเมาส์แบบน็อคอิน Myo9AR701X โดย CRISPR/Cas9-การแก้ไขยีนที่เป็นสื่อกลาง.30 วิธีการที่สมบูรณ์รวมอยู่ในวิธีการเสริม Myo9AR701X น็อคอินและเพื่อนครอกชนิดป่า ทั้งตัวผู้และตัวเมีย ถูกใช้ตามโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการดูแลสัตว์และการใช้สัตว์ของศูนย์วิจัยสัตว์เยล

จุล/IF

การตรวจชิ้นเนื้อไตของมนุษย์และไตของหนูเมาส์ได้รับการประมวลผลสำหรับเนื้อเยื่อวิทยา อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (IF) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ตามที่อธิบายไว้ 31,32 IF ถูกดำเนินการในส่วนที่ไตแช่แข็งของหนูเมาส์และพอโดไซต์ที่เพาะเลี้ยง แอนติบอดีปฐมภูมิคือแอนติ-MYO9A ของหนูเมาส์ (โคลน 4C11; Abnova, ไทเป, ไต้หวัน), แอนติ-โพโดซินของกระต่าย (P0372; Sigma, St. Louis, MO), แอนติ-ลามินินของกระต่าย (L9393; Sigma), แอนติ-อควาโพริน2 (PAS) ของกระต่าย -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA) และ anti-megalin ของกระต่าย 33 แอนติบอดีทุติยภูมิคือ Alexa Fluor-488 และ 594-คอนจูเกต (Invitrogen) ภาพได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Japan) หรือ Leica SP{18}}Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Germany)

Immunoblot / ภูมิคุ้มกัน

โปรตีนได้รับการแก้ไขโดยโซเดียม dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis และ immunoblotted ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 31,32 พร้อม anti-MYO9A (โคลน 4C11), แอคติน (A2066; Sigma), สงบ (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), glyceraldehyde{{ 9}}ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) แอนติบอดีปฐมภูมิ Coimmunoprecipitation ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ 34,35 ด้วยแอนติบอดีโพลีโคลนอลสำหรับกระต่าย anti-MYO9A (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) ตามด้วย immunoblotting

cistanche สำหรับ glomerulosclerosis ปล้องโฟกัส

PCR เชิงปริมาณ

RNA ทั้งหมดถูกคัดลอกย้อนกลับโดยใช้ชุดเครื่องมือสังเคราะห์ iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ขยายด้วย iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) และไพรเมอร์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส Myo9A (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 และ 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 โดยใช้ CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad) Myo9a mRNA ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH mRNA ด้วยวิธีการ 2-DDCt ตามที่อธิบายไว้ 36

กล้องจุลทรรศน์ TEM/อิมมูโนอิเล็กตรอน

ดำเนินการ TEM ตามที่อธิบายไว้ 32 สำหรับ immunogold EM ไตของหนูเมาส์ชนิด wild-type ได้รับการแก้ไขแล้ว cryosection แบบบางเฉียบถูกดับ บล็อก และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิของหนูเมาส์ anti-MYO9A (โคลน 4C11) แอนติบอดีทุติยภูมิคือ IgG ต้านเมาส์ของกระต่าย, คอนจูเกตสีทองคือทองคำ 10 นาโนเมตรที่ต้านกระต่ายกับแพะ ส่วนต่างๆ ถูกโพสต์ฟิกซ์ ย้อมสี และตรวจสอบบน FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM

การแยกโพโดไซต์ปฐมภูมิและการทดสอบการทำงาน

Podocytes แยกได้จากไตพันธุ์ป่าและ Myo9AR701X/þ ตามที่อธิบายไว้ 34 โดยมีการดัดแปลงเพียงเล็กน้อย 37,38 ทดสอบการยึดติดตามที่อธิบายและหาปริมาณโดยใช้การย้อมสีคริสตัลไวโอเล็ต37

Myo9A น็อคดาวน์

การทำให้ล้มลงของ Myo9A (Myo9AKD) ถูกชักนำในพอดไซต์ของหนูเมาส์ที่เป็นอมตะประเภทไวด์โดยใช้ RNA ที่รบกวนขนาดเล็กของ Myo9A (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โพโดไซต์และพอโดไซต์ที่ไม่ถูกทรานส์เฟกที่ทรานส์เฟกด้วย siRNA ที่ไม่กำหนดเป้าหมาย (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-control, Dharmacon) ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>การกลายพันธุ์ T ที่แบ่งใช้โดยลำดับโพรแบนด์ ซิสเตอร์ และมารดา (บนสุด ระบุโดย *) และลำดับแบบไวด์ไทป์ (WT) จากบิดา (ด้านล่าง) โดยอิงตามลำดับอ้างอิง MYO9A ของมนุษย์ NM_006901.4 (b) การตรวจชิ้นเนื้อไตจากโพรแบนด์แสดง FSGS และการแทรกซึมของคั่นระหว่างหน้าที่ไม่รุนแรง (กรดเป็นระยะ – คราบ Schiff, กำลังขยายดั้งเดิม X 400) (c) วงศ์ตระกูลแสดงการแยกยีน-ฟีโนไทป์: บุคคลที่มีโปรตีนในปัสสาวะ/FSGS และตัวแปร MYO9A p.R701X (สัญลักษณ์ที่เป็นของแข็ง), ชนิดพันธุ์ป่า (สัญลักษณ์ว่าง) หรือยีน MYO9A ที่ไม่รู้จัก (ระบุด้วย #) (d) MYO9A ชนิดป่า (NP_008832.2) โดเมนโปรตีน: โดเมนมอเตอร์ (สีเทา) รวมถึงลูป 2 (สีเหลือง) และไซต์ที่จับกับคาโมดูลิน (สีแดง), โดเมนคอ (สีน้ำเงิน), โดเมนหาง (สีชมพู ) รวมถึงโดเมนกระตุ้นโปรตีน Rho–guanosine triphosphatase (Rho-GAP) (สีเขียว); ขอบเขตของโดเมนถูกระบุโดยเลขเรซิดิวกรดอะมิโน p.R701X MYO9A ที่คาดการณ์ไว้จะสิ้นสุดลงภายในไซต์ที่มีผลผูกพันกับคาโมดูลินในลูป 2 โดยไม่มีโดเมนส่วนคอและส่วนท้าย เครื่องหมายดอกจันระบุตำแหน่งของความผิดพลาดตัวแปร MYO9Aที่ไม่ทราบนัยสำคัญที่ระบุ (จ) การอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการของเรซิดิวกรดอะมิโนที่เปลี่ยนแปลงโดย MYO9A missense (ต่อ)

รูปที่ 1|(ต่อ) การกลายพันธุ์ที่ระบุในผู้ป่วยที่มี FSGS: MYO9A ดัดแปลงสิ่งตกค้าง p.D156G (p.Asp156) และ p.E765D (p.Glu765) (ลูกศรสีแดง) ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงผ่านสายวิวัฒนาการ หมายเลขภาคยานุวัติ: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) และ X. tropicalis (XP_002934596.2) ถูกใช้สำหรับการจัดตำแหน่งหลายลำดับของ MYO9A กับ Clustal Omega, EMBL-EBI (European Molecular Biology ห้องปฏิบัติการ – European Bioinformatics Institute, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/) หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

กิจกรรม RhoA

RhoA ที่ใช้งานอยู่ถูกวัดด้วยการทดสอบ Rho-activation pulldown assay (Millipore) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต39 Active RhoA ถูกตรวจพบโดย immunoblotting.40

การวิเคราะห์ทางสถิติ

วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 8 (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย) กับการทดสอบ t ของนักเรียนแบบ unpaired ด้วยการแก้ไขของ Welch หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนของ Welch ตามความเหมาะสม P < 0.05="">

ผลลัพธ์

การระบุตัวแปร MYO9A ในผู้ป่วยที่มีโปรตีนในปัสสาวะและ FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* ตัวแปร MYO9A ซึ่งบ่งชี้การถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่โดดเด่นของ autosomal ของการกลายพันธุ์ (รูปที่ 1c) จีโนไทป์จากลุงของแม่ที่เป็นโรคไตเรื้อรังไม่มี MYO9A p.Arg701* (p.R701X) คาดว่าจะส่งผลให้เกิดการสูญเสียการทำงานเนื่องจากการสลายตัวของ mRNA ที่ไร้เหตุผลหรือการตัดทอนในลูป 2 ของโดเมนส่วนหัว MYO9A (รูปที่ 1d) ที่จำเป็นสำหรับ Myo9A เพื่อเชื่อมขวางแอกติน .16 ตารางเสริม S1 แสดงตัวแปรทั้งหมดที่ใช้ร่วมกันโดยพี่น้อง ไม่มีการกลายพันธุ์ใน FSGS หรือกลุ่มอาการไตวาย - ยีนที่รายงานจนถึงปัจจุบันถูกตรวจพบในพี่น้องทั้งสอง (ตารางเสริม S2) ตามความรู้ของเรา นี่เป็นรายงานฉบับแรกที่เชื่อมโยงการกลายพันธุ์ของ MYO9A ที่สูญเสียการทำงานกับโรคไตในมนุษย์

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 ตัวแปร missense อีก 3 แบบถือว่าไม่เป็นพิษเป็นภัยโดยอิงจากคะแนนการทำนายชีวสารสนเทศ 3 รายการ กรดอะมิโนที่ถูกแทนที่ในแวเรียนต์ p.Asp156Gly และ p.Glu765Asp มีแนวโน้มที่จะมีหน้าที่ที่เกี่ยวข้องเนื่องจากเรซิดิวเหล่านี้ได้รับการอนุรักษ์ผ่านการวิวัฒนาการ (รูปที่ 1e) นอกจากนี้เรายังระบุผู้ป่วย 1 รายที่มีตัวแปร MYO9A (p.Arg2283His) ที่ไม่ตรงตามเกณฑ์ความถี่อัลลีลเล็กน้อยของเราที่รายงานก่อนหน้านี้ในกลุ่มอาการ myasthenia ที่มีมา แต่กำเนิด6 ไม่มีการกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคหรือตัวแปรที่เป็นอันตรายในยีนที่ก่อให้เกิด FSGS/NS/โปรตีนในปัสสาวะ (ตารางเสริม S2 ) ถูกระบุในบุคคล 5 รายที่มีตัวแปร MYO9A

การแสดงออกของ MYO9A ใน podocytes และโรคไต

ตรวจพบการแสดงออกของโปรตีน Myo9A โดยการทำให้ภูมิคุ้มกันบกพร่องในไตของหนูเมาส์และหนูเมาส์และพอดไซต์ของมนุษย์ (รูปที่ 2a) อิมมูโนไซโตเคมียืนยันการแสดงออกของไซโทพลาสซึมของ MYO9A ในพอดไซต์ของมนุษย์ (รูปที่ 2b) Immunoreactive Myo9A ถูกตรวจพบโดย IF microscopy ใน glomeruli ของเมาส์ โดยจะรวมเข้ากับ podocin บางส่วน (รูปที่ 2c) กล้องจุลทรรศน์แบบใช้ฉลากคู่และแบบคอนโฟคอลแสดงการโลคัลไลซ์เซชัน Myo9A ตามลักษณะภายนอกของเยื่อหุ้มไตชั้นใต้ดิน (GBM) ที่ติดกันอย่างแน่นหนาหรือจัดเป็นคอลลาคัลไลซ์กับโพโดซิน (รูปที่ 2d) และลามินิน (รูปที่ 2e) Immunogold EM แสดงให้เห็นถึงการแปลที่แม่นยำของ Myo9A อนุภาคทองคำถูกกระจายในไซโตพลาสซึมของเท้าโปรเซสและตัวเซลล์พอโดไซต์ (รูปที่ 2f และ g, รูปที่ S1B และ D เพิ่มเติม) ไดอะแฟรมกรีดไม่มีฉลากเหมือนกัน เซลล์ mesangial และ endothelial ไม่มีการติดฉลากที่มีนัยสำคัญ อนุภาคทองคำยังถูกตรวจพบในเซลล์ทูบูลส่วนต้น (รูปที่ S1C เสริม)

เพื่อประเมินว่าการแสดงออกของ Myo9A ถูกรบกวนในโรคไตหรือไม่ เราได้ตรวจสอบแบบจำลองเมาส์ 2 แบบที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนในปัสสาวะที่มีช่วงไตวาย ในทำนองเดียวกัน Myo9A ของไตจะลดลงในหนูที่มี streptozotocin-mediated เบาหวาน glomerulosclerosis ขั้นสูงที่เกิดจาก Vegfa overexpression 32 เมื่อเทียบกับ Myo9A ที่ตรวจพบในหนูที่เป็นเบาหวานไม่แสดงออก Vegfa มากเกินไป (รูปที่ 3b) และหนูที่ไม่เป็นเบาหวาน (รูปที่ 2c) การโลคัลไลซ์เซชันของเท้า Myo9A podocyte และ Myo9A ไตที่ลดลงในแบบจำลองโรคโปรตีนยูริกทั้งสองแบบแนะนำว่า Myo9A อาจมีบทบาทในการทำงานของสิ่งกีดขวางการกรองไต

ตารางที่ 1|ตัวแปร Missense MYO9A ที่ระบุในกลุ่มผู้ป่วย FSGS-CT

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P1704S, p.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. ตัวแปรกรองที่ความถี่อัลลีลเล็กน้อย #0.01 เปอร์เซ็นต์ n ¼ 94 ตัวอย่างตามหมายเหตุประกอบ ANNOVAR

เมาส์ MYO9AR701X ที่ตัดต่อด้วยยีนเพื่อพัฒนา FSGS

เพื่อตรวจสอบว่า p.Arg701* (p.R701X) การกลายพันธุ์ไร้สาระของ MYO9A ทำให้เกิดโรคไตในหนูทดลองหรือไม่ เราได้สร้างหนูเมาส์ p.Arg701* (ในที่นี้เรียกว่า Myo9AR701X) โดย CRISPR/Cas9-การแก้ไขยีนที่เป็นสื่อกลาง 30 เฮเทอโรไซกัส หนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X/þ (รูปที่ 4a) ให้กำเนิดลูกสัตว์กลายพันธุ์ที่มีชีวิตในแบบ Mendelian แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์นั้นไม่ได้ทำให้ตัวอ่อนถึงตาย การกลายพันธุ์ที่เป็นเนื้อเดียวกันจะพัฒนา hydrocephalus แบบก้าวหน้า (รูปที่ S2), ataxia และอาการชัก และเกือบทั้งหมดตายก่อนอายุ 3 สัปดาห์ ซึ่งชวนให้นึกถึงหนู Myo9A-null 14 กลายพันธุ์ Myo9AR701X/þ ที่แตกต่างกันไม่มีฟีโนไทป์ที่ชัดเจนตั้งแต่แรกเกิด เจริญพันธุ์ และอยู่รอด สู่ความเป็นผู้ใหญ่

หนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X ทั้งหมดพัฒนา FPE และโปรตีนในปัสสาวะ แม้ว่าจะอายุต่างกัน การกลายพันธุ์ Myo9AR701X/R701X ที่เป็นเนื้อเดียวกันแสดงโกลเมอรูไลที่ผิดปกติ, การขยายท่อและการหล่อโปรตีนบนกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่อายุ 2 สัปดาห์ (รูปที่ 4b, รูปที่ S3A เพิ่มเติม) TEM ของไตที่กลายพันธุ์ Myo9AR701X/R701X ที่มีอายุ 2- สัปดาห์เผยให้เห็น FPE ที่กว้างขวาง, GBM ที่หนาและผิดปกติ และขาดไดอะแฟรมแบบร่อง แทนที่ด้วยทางแยกที่ยึดติดกัน (รูปที่ 4d) ในทางตรงกันข้าม 2-การกลายพันธุ์ Myo9AR701X/þ ต่างชนิดกันอายุหนึ่งสัปดาห์แสดงเนื้อเยื่อวิทยาของไตตามปกติและโครงสร้างพิเศษของสิ่งกีดขวางการกรองไต (รูปที่ 4c และ e) ซึ่งแยกไม่ออกจากครอกชนิดพันธุ์ป่า (รูปที่ 4f) ตามที่ได้รับการยืนยันโดยการวัดปริมาณของกระบวนการที่เท้า (FP/mm GBM) (รูปที่ 4g) ตรวจพบอัลบูมินูเรียในตัวอย่างปัสสาวะจากทั้งหนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X ที่เป็นเฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัสด้วยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (รูปที่ 4 ชม.) ที่อายุ 2 สัปดาห์

เมื่ออายุ 4 เดือน หนูที่แตกต่างกัน Myo9AR701X/þ แสดง FSGS ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (รูปที่ 5a และ g) และ TEM แสดง FPE (ลูกศรสีขาว) ไดอะแฟรมกรีดที่ผิดปกติ (ลูกศรสีดำสั้น) GBM ที่ไม่สม่ำเสมอ และการขยายตัวของ mesangial (รูปที่ 5b) . ปริมาณของกระบวนการที่เท้าแสดง FPE ที่มีนัยสำคัญใน Myo9AR701X/þ เทียบกับไตผู้ใหญ่แบบธรรมชาติ (รูปที่ 5c) ฟีโนไทป์ของไตนี้คล้ายกันอย่างน่าทึ่งกับที่พบในการตรวจชิ้นเนื้อไตของโพรแบนด์ (รูปที่ 1b) Myo9AR701X/þ ที่กลายพันธุ์ในหนูที่โตเต็มวัยมีอัตราส่วนอัลบูมิน – ครีเอตินีนในปัสสาวะสูงกว่าหนูป่าที่จับคู่ตามอายุอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5d) และไม่มีหลักฐานของภาวะปัสสาวะมากหรือน้ำหนักลด (รูปที่ 5e และ f) ในการตรวจสอบกรด-ชิฟฟ์เป็นระยะ ไต Myo9AR701X/þ สำหรับผู้ใหญ่แสดง FSGS ของความรุนแรงต่างๆ (ลูกศร รูปที่ 5g) และไม่มีการฝ่อของท่อและการขยายตัวหรือการแทรกซึมของคั่นระหว่างหน้า กล้องจุลทรรศน์แบบใช้ฉลากคู่และแบบคอนโฟคอลตรวจจับ Myo9A ในท่อใกล้เคียง ต่อพ่วงกับเมกาลิน (หัวลูกศร รูปที่ 5 ชม. และ k) ในขณะที่ตรวจไม่พบ Myo9A ในส่วนปลายของเนฟรอนที่แสดง aquaporin2 (รูปที่ 5 ชม. และผม) การติดฉลากของมาร์กเกอร์แบบท่อทั้งสองใน Myo9AR701X/þ สำหรับผู้ใหญ่นั้นแยกไม่ออกจากไตประเภท wild-type ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (ภาพที่ 5h และ k และ i และ l) ในทางตรงกันข้าม การย้อมสี Myo9A ในท่อใกล้เคียงและในโกลเมอรูไลลดลงใน Myo9AR701X/þ (รูปที่ 5 ชั่วโมงและ i) เมื่อเทียบกับไตประเภทธรรมชาติ (รูปที่ 5k และ l) การค้นพบเหล่านี้ร่วมกันแสดงให้เห็นว่า p.Arg701* เป็นการกลายพันธุ์ของ Myo9A ที่ก่อให้เกิด FSGS ในหนู ซึ่งสรุปลักษณะฟีโนไทป์และการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่โดดเด่นของออโตโซมของตัวแปร MYO9A p.Arg701* ที่แตกต่างกันซึ่งระบุในโพรแบนด์

พี เป็นอย่างไร Arg701* การกลายพันธุ์ของ Myo9A ทำให้เกิด FSGS หรือไม่

เราใช้ Myo9AR70หนูแบบน็อคอิน 1X เพื่อตรวจสอบการเกิดโรคระดับโมเลกุลของ FSGS ที่เกิดจากการกลายพันธุ์ p.Arg701* MYO9A การแสดงออกของ Myo9A ในไต Myo9AR701X ที่ถูกกระแทกลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเฮเทอโรไซโกต และตรวจไม่พบในโฮโมไซโกตโดย IF (รูปที่ 6a) และอิมมูโนบล็อตติง (รูปที่ 6b และ c) เราทำ PCR เชิงปริมาณเพื่อประเมินว่า haploinsufficiency ที่อาศัยการสลาย mRNA ไร้สาระ 42 เกิดขึ้นใน Myo9AR701X/þ กลายพันธุ์หรือไม่ การแสดงออกของ mRNA ของ Myo9A ในไต Myo9AR701X/þ ต่ำกว่าในไตประเภทปกติ 50 เปอร์เซ็นต์ (48.3 ± 5.6 เปอร์เซ็นต์ ; P < 0.0001)="" (รูปที่="" 6d)="">

Myo9A ที่ลดลงจะลดปฏิสัมพันธ์กับแอคตินและคาโมดูลิน

เราตรวจสอบว่า Myo9A haploinsufficiency เปลี่ยนแปลงปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin หรือไม่ การทดลองการตกตะกอนร่วมโดยเปรียบเทียบไตและ Myo9AR701X/þ และ podocytes ของไตและ Myo9AR701X/þ ยืนยันปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A กับแอคตินและกับคาโมดูลิน และแสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาของ Myo9A กับโปรตีนทั้งสองลดลง 50 เปอร์เซ็นต์ในไตและพอดไซต์ที่กลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/þ (รูปที่ 6e และ f) การลดลง คล้ายกับของ Myo9A แบบเต็มความยาว ในทางตรงกันข้าม ระดับการแสดงออกของแอคตินและคาโมดูลินยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (อินพุต รูปที่ 6e และ f) เพื่อวิเคราะห์การโต้ตอบของ Myo9A ในการตั้งค่าการแสดงออกที่ลดลง เราเหนี่ยวนำให้ Myo9AKD 50 เปอร์เซ็นต์ในพอดโดไซต์ของเมาส์แบบ wild-type ที่เป็นอมตะโดยใช้ siRNA ประเมินโดย PCR เชิงปริมาณและ immunoblotting (รูปที่ 7a และ b) จากนั้นทำการทดลอง coimmunoprecipitation Myo9AKD ลดการทำงานร่วมกันของ Myo9A-actin-calmodulin ตามสัดส่วนกับการแสดงออกของ Myo9A (รูปที่ 7c) ร่วมกัน พบว่าการกลายพันธุ์ของ p.Arg701* Myo9A และ Myo9AKD ช่วยลดความอุดมสมบูรณ์ของ Myo9A และด้วยเหตุนี้การมีปฏิสัมพันธ์กับแอคตินและคาโมดูลิน เนื่องจากการเชื่อมโยงข้ามของ Myo9A แอคตินที่อัตราส่วนโมลาร์ 1:1 ข้อมูลของเราจึงแนะนำว่าการลด Myo9A ใน Myo9AR701X/þ podocytes ที่ต่างกันอาจส่งผลเสียต่อการเชื่อมโยงข้ามและการรวมกลุ่มของแอคตินที่อาศัย Myo9A

รูปที่ 2|(ต่อ) ถึง podocin (สีเขียว) ที่ด้าน GBM (หัวลูกศร) ส่วนแทรกแสดงกำลังขยายที่สูงขึ้น แท่ง=25 มม. (จ) กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแสดงการย้อมสี Myo9A ที่ติดกันอย่างใกล้ชิดหรือจัดเป็นโคโลคัลไลซ์ด้วยลามินิน (สีเขียว) ตามแนวด้านนอกของ GBM (สิ่งที่ใส่เข้าไปและหัวลูกศร) แท่ง=25 มม. (f,g) Immunogold electron microscopy localization ของ Myo9A ใน glomeruli ของไตเมาส์ชนิด wild-type: พบอนุภาคทอง (ลูกศรสีดำ) ในร่างกายของเซลล์ podocyte (POD) และโปรเซสไซโตพลาสซึม (FP) ที่เท้าจะมองเห็นอนุภาคทองคำบางส่วน ที่ฐาน FP ถัดจากเมมเบรนชั้นใต้ดินของไตแต่ไม่อยู่ที่ไดอะแฟรมกรีด บาร์ ¼ 500 นาโนเมตร หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

การกลายพันธุ์ของ Myo9AR701X เพิ่มกิจกรรม Rho-A

เราวัดกิจกรรม RhoA โดยใช้การทดสอบแบบดึงลงในหนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X และหนูประเภทไวด์ โดยเน้นที่ Myo9AR701X/þ ที่แตกต่างกันเพื่อให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกเกี่ยวกับฟีโนไทป์ p.Arg701* MYO9A ของมนุษย์ RhoA ที่ออกฤทธิ์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไตทั้งหมด Myo9AR701X/þ (รูปที่ 8a), โกลเมอรูไลที่แยกได้ (รูปที่ 8b) และพอดไซต์ปฐมภูมิ (รูปที่ 8c) เมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างกลุ่มควบคุมชนิดพันธุ์ป่าที่สอดคล้องกัน ขนาดของ GTP-RhoA ที่เพิ่มขึ้นในตัวอย่าง Myo9AR701X/þ มีตั้งแต่ w60 เปอร์เซ็นต์ในโกลเมอรูไลที่แยกได้จนถึง2-เท่าในไตทั้งหมดและในพอดไซต์ (รูปที่ 8a–c) RhoA ที่ใช้งานอยู่จะสูงกว่าเล็กน้อยใน homozygous เมื่อเทียบกับไตกลายพันธุ์ heterozygous แต่ความแตกต่างไม่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 8a) การทดลองเหล่านี้ร่วมกันแสดงให้เห็นว่า Myo9AR701X ทำให้เกิดกิจกรรม RhoA เพิ่มขึ้น

การกลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/D และ Myo9AKD เปลี่ยนแปลงพฤติกรรมของ podocyte

เพื่อประเมินผลของการทำงานร่วมกันของ Myo9A-actin ที่บกพร่องและกิจกรรม RhoA ที่เพิ่มขึ้นที่ตรวจพบใน Myo9AR701X/þ มิวแทนท์ podocytes ที่กลายพันธุ์ต่อการทำงานของพวกมัน เราได้วัดการยึดเกาะและการเคลื่อนที่ของ podocyte โดยใช้การทดสอบการยึดติดและการย้ายถิ่น เปรียบเทียบชนิด wild-type กับ podocytes ปฐมภูมิที่กลายพันธุ์ในสภาวะการควบคุมและใน การยับยั้งการส่งสัญญาณ RhoA ด้วยตัวยับยั้งไคเนสที่เกี่ยวข้องกับ Rho Y27632 การทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่า Myo9AR701X/þ บั่นทอนความสามารถในการเคลื่อนที่ของ podocyte (รูปที่ 8d; รูปที่ S4) และการยึดติดของ podocyte (รูปที่ 8e) ในลักษณะที่ขึ้นกับ RhoA เพื่อประเมินผลของ Myo9A haploinsufficiency โดยตรงต่อการทำงานของ podocyte เราได้ทำการทดสอบสิ่งที่แนบมาและการย้ายถิ่นเปรียบเทียบ podocytes ของเมาส์แบบ wild-type กับ Myo9AKD podocytes ที่แสดง Myo9A mRNA และโปรตีน 50 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 7a และ b) โพโดไซต์ที่บำบัดด้วย siRNA ที่ไม่กำหนดเป้าหมายทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเพิ่มเติม Myo9AKD ลดการเกาะติดและการย้ายถิ่นของ podocyte ลงอย่างมาก ซึ่งเป็นข้อบกพร่องเดียวกันกับที่พบใน Myo9AR701X/þ podocytes (รูปที่ 8f และ g) ข้อมูลกลไกโดยรวมระบุว่าการกลายพันธุ์ของ heterozygote p.Arg701* Myo9A ส่งผลให้เกิดความไม่เพียงพอของ Myo9A haploins ส่งผลให้ปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin ลดลง และเพิ่ม RhoA ที่ใช้งานอยู่ในไต โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน podocytes เราตีความว่ากลไกเหล่านี้ขัดขวางการทำงานของ podocyte ซึ่งบ่งชี้จากการยึดติดและการเคลื่อนไหวในหลอดทดลองที่ลดลง และโดยการปรากฏตัวของโปรตีนในปัสสาวะในร่างกาย

อภิปรายผล

การศึกษานี้ระบุว่า Myo9A เป็นส่วนประกอบใหม่ของอุปกรณ์โครงร่างโครงกระดูกของ podocyte ที่มีอิทธิพลต่อการทำงานของ podocyte โดยควบคุมกิจกรรม RhoA ในเชิงลบ เราอธิบายการกลายพันธุ์ MYO9A ไร้สาระที่หายาก (p.Arg701*) ที่เกี่ยวข้องกับ

FSGS/proteinuria ในครอบครัว และแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์นี้ทำให้เกิดรอยโรคที่เหมือน FSGS ในหนู ซึ่งให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกการเกิดโรค

การค้นพบของเราสนับสนุนแนวคิดที่ว่า MYO9A เป็นยีนของผู้สมัคร FSGS และ p.Arg701* MYO9A เป็นตัวแปรที่เกี่ยวข้องกับ FSGS ของมนุษย์ โดยอิงตามหลักเกณฑ์ของ American College of Medical Genetics เพื่อระบุสาเหตุโดยใช้อัลกอริธึมการทำนายยีน ความถี่อัลลีล แบบจำลองสัตว์ทดลอง และการทดสอบการทำงาน43,44 พี่น้องตระกูล proband ที่มี p.Arg701* MYO9A ไม่มีการกลายพันธุ์ในยีนที่ก่อให้เกิด FSGS ที่ทราบจนถึงปัจจุบัน และไม่มีหลักฐานที่บ่งชี้ถึงสาเหตุรองของ FSGS ตัวแปรนี้รวมกันเป็นกลุ่มเล็ก ๆ ตามรูปแบบการสืบทอด autosomal ที่โดดเด่นพร้อมการแสดงออกของตัวแปร MYO9A p.Arg701* ถูกคาดการณ์ว่าจะเป็นตัวแปรที่สูญเสียฟังก์ชัน ไม่มีอยู่ในกลุ่มควบคุม และมีความถี่อัลลีล<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

การตรวจคัดกรอง WES ของกลุ่มเด็ก FSGS ที่ไม่เกี่ยวข้องกลุ่มใหญ่และผู้ใหญ่วัยหนุ่มสาว41 พบผู้ป่วย 2 รายที่มี MYO9A missense ที่แตกต่างกัน (p.Asp156Gly และ p.Glu765Asp) ตัวแปร missense MYO9A ทั้งสองแบบเกี่ยวข้องกับสารตกค้างที่มีการอนุรักษ์สูง มีความถี่อัลลีลเล็กน้อย<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

รูปที่ 3|การแสดงออกของ Glomerular Myo9A ในแบบจำลองหนูเมาส์โรคไต (a) กลุ่มอาการของโรคไตพัฒนาการที่เกิดจากการแสดงออกของ Vegfa 31: อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แสดง Myo9A (สีแดง) ในโกลเมอรูไลจากปกติ 2-หนูอายุหนึ่งสัปดาห์ที่ไม่ถูกกระตุ้น และลดการแสดงออกของ Myo9A ในโกลเมอรูลีจากหนูที่เป็นโรคไตแสดงออกมากเกินไป Vegfa ในขณะที่โพโดซิน (สีเขียว) ไม่เปลี่ยนแปลง (b) โรคเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโตซินที่มีหรือไม่มีการแสดงออกของ Vegfa มากเกินไป32: อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตรวจพบ Myo9A (สีเขียว) ในโกลเมอรูไลจากไตเบาหวานที่ไม่ได้เกิดจากไต (การควบคุม DM) และลดอิมมูโนรีแอคทีฟ Myo9A ในโกลเมอรูไลจากหนูที่เป็นเบาหวานที่แสดงออกมากเกินไป Vegfa ที่พัฒนาเป็นภาวะไตจากเบาหวาน (DN) 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (สีน้ำเงิน) แสดงนิวเคลียสจากทั้งสองส่วนด้วยโกลเมอรูไลที่วาดเส้น (เส้นสีขาวที่ฟักออก) แท่ง=50 มม. เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www. ไต-สากล.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>การกลายพันธุ์ของ T แทนที่การเข้ารหัส CGA Arg (R) ด้วย TGA ซึ่งเป็นโคดอนหยุดที่คาดการณ์การสิ้นสุดการแปลที่กรดอะมิโน 701 (b) กรดเป็นระยะที่เป็นตัวแทน – Schiff เปื้อนจากไตกลายพันธุ์ Myo9AR701X/R701X Homozygous ที่มีอายุหนึ่งสัปดาห์แสดงการผิดปกติของไต การขยายท่อ และการหล่อโปรตีน บาร์=20 มม. (c) กรดเป็นระยะที่เป็นตัวแทน – คราบชิฟฟ์จากไต Myo9AR701X/þ ที่แตกต่างกันอายุ 2- สัปดาห์แสดงเนื้อเยื่อวิทยาปกติ บาร์=20มม. (ง) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านที่เป็นตัวแทนจากโกลเมอรูลัส Myo9AR701X/R701X อายุสัปดาห์ แสดงการเคลื่อนตัวของกระบวนการที่เท้าขนาดใหญ่ (ลูกศรสีขาว) ไม่มีไดอะแฟรมร่อง แทนที่ด้วยรอยแยกที่ยึดติด (ลูกศรสีดำ) และชั้นใต้ดินของไตที่หนาและไม่สม่ำเสมอ เมมเบรน (GBM) บาร์ =1มม. (จ) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านที่เป็นตัวแทนจาก โกลเมอรูลัสเฮเทอโรไซกัส Myo9AR701X/þ อายุสัปดาห์ แสดงให้เห็นกระบวนการที่เท้าปกติ (ลูกศรบางสีดำ) และไดอะแฟรมกรีดปกติ (ลูกศรบางสีขาว) บาร์ =1มม. (f) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านจาก 2-ครอก WT อายุหนึ่งสัปดาห์แสดงให้เห็นสิ่งกีดขวางการกรองไตตามปกติ: กระบวนการของเท้าบางที่เชื่อมโยงด้วยไดอะแฟรมแบบผ่า เซลล์บุผนังหลอดเลือดที่หุ้ม (EC) และ GBM แบบบาง บาร์ =1มม. (g) ปริมาณของการขจัดรอยเท้าในกระบวนการที่อายุ 2 สัปดาห์: ไต Myo9AR701X/R701X ที่เป็น homozygous แสดงกระบวนการที่เท้าเหยียบน้อยกว่า (FPs)/mm GBM มากกว่า WT หรือ Myo9AR701X/þ ครอก heterozygous ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้าอย่างรุนแรง P < 0.0001="" (การวิเคราะห์ความแปรปรวน)="" (h)="" coomassie="" blue="" stain="" ของ="" sodium="" dodecyl="" sulfate-polyacrylamide="" gel="" electrophoresis="" แก้ไขแล้ว="" ตัวอย่างปัสสาวะพบว่ามี="" albuminuria="" (alb)="" ทั้งใน="" myo9ar701x/r701x="" (="" plus="" )="" และ="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" plus="" )="" ในขณะที่ปัสสาวะ="" wt="" ไม่มีอัลบูมิน="" เซรั่มอัลบูมินจากวัว="" (10="" มก.)="" ทำหน้าที่ควบคุมน้ำหนักโมเลกุล="" พ็อด,="" โพโดไซต์.="" หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้="" โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่="">

รูปที่ 5|Myo9AR7 ที่แตกต่างกันในผู้ใหญ่{{20}}การวิเคราะห์ฟีโนไทป์ของหนู Knockin 1X/D (a) คราบกรด-Schiff (PAS) ที่เป็นตัวแทนจากไต Myo9AR701X/þ ที่มีอายุ 4-เดือน แสดง glomerulus ที่มีเส้นโลหิตตีบปล้องโฟกัสที่กว้างขวางและการแพร่กระจายของ mesangial บาร์=50 มม. (b) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดที่เป็นตัวแทนจากไต Myo9AR701X/þ อายุเดือนที่=50 แสดงให้เห็นการเคลื่อนตัวของกระบวนการที่เท้าเป็นวงกว้าง (ลูกศรสีขาว) การแทนที่ไดอะแฟรมแบบผ่าบางส่วน (ลูกศรสีดำบาง) โดยทางแยก (ลูกศรสีดำหนา). บาร์ =2 มม. (c) ปริมาณของการลดขนาดการเคลื่อนตัวของเท้าในหนูเมาส์ Myo9AR701X/þ กลายพันธุ์ที่โตเต็มวัย: อายุ 4 เดือนที่แตกต่างกัน (Het) Myo9AR701X/ þ แสดง 2.2±0.06 FP/mm เมื่อเทียบกับชนิดพันธุ์ป่า (WT) ) 3.7±0.13 FP/มม. ****พี่<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (e) ปริมาตรของปัสสาวะ (24 ชั่วโมง) และ (f) น้ำหนักตัวไม่แตกต่างกันใน WT (n=18) และ Myo9AR701X/þ (Het, n=16) หนูเมาส์ (g,j) PAS ที่เป็นตัวแทนจาก Myo9AR701X/þ (g) และ WT (j) ไต: (g) แสดงให้เห็นเส้นโลหิตตีบโฟกัสระยะแรก (ลูกศร) และการแพร่กระจายของ mesangial ใน 2 glomeruli ปกติกลับไปกลับ tubules และไม่มีการแทรกซึม; (j) แสดงโกลเมอรูไลปกติและทูบูลในไต WT แท่ง=50 มม. (h,k) Confocal microscopy ของ Myo9A/ Megalin immunofluorescence: (h) Myo9AR701X/þ ไตแสดงสัญญาณ Myo9A (สีแดง) ที่จำกัด (หัวลูกศร) ในเซลล์รูปท่อใกล้เคียงที่ติดฉลากด้วยเมกาลิน (สีเขียว) ท่อใกล้เคียงจะไม่ถูกขยาย (k) ไต WT แสดง Myo9A (หัวลูกศร) ที่ต่อเนื่องกับเมกาลินในเซลล์ท่อใกล้เคียง แท่ง=25 มม. (i,l) Confocal microscopy ของ Myo9A/Aquaporin2 (AQP2) immunofluorescence: (i) Myo9AR701X/þ ไตแสดง Myo9A ที่จำกัด (สีแดง) ใน glomerulus (หัวลูกศร), Myo9A ไม่ถูกตรวจพบในส่วนปลายของ nephron ที่ติดฉลากด้วย AQP2 (สีเขียว) ซึ่งไม่ขยาย; (l) ไต WT แสดงการย้อมสี Myo9A ในโกลเมอรูลัสและการย้อมสี AQP2 ในส่วนปลายของเนฟรอน แท่ง=25 มม. EC, เซลล์บุผนังหลอดเลือด; FP, เท้าโปรเซสไซโตพลาสซึม; GBM, เมมเบรนชั้นใต้ดินของไต หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org

รูปที่ 6|การแสดงออกของ Myo9A และปฏิสัมพันธ์ของ Myo9A-actin-calmodulin ในไตและพอดไซต์ของ Myo9AR701X (a) Immunofluorescence ตรวจพบ Myo9A และ podocin ของไต: Myo9A glomerular immunostaining (สีแดง) มีความแข็งแรงในไต wild-type (WT) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน Myo9AR701X/þ glomeruli และไม่พบใน Myo9AR701X/R701X glomeruli podocin (สีเขียว) แปลเป็น podocytes ในหนูทุกตัว podocyte-Myo9A การรวมบางส่วนจะแสดงโดยการผสาน (สีเหลือง) แท่ง=50 มม. (b) Immunoblotting: การแสดงออกของ Myo9A (280 kDa) ที่ไม่เสียหายจะลดลงเหลือประมาณครึ่งหนึ่งในไต Myo9AR701X/þ (heterozygous [Het]) และตรวจไม่พบในไต Myo9AR701X/R701X (homozygous [Hom]) * แถบเล็กกว่า (<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-การแสดงออกของ Myo9A ลดลงเท่าตัวโดย DNA array ที่รายงานในหนูเบาหวาน Zucker.49 เมื่อรวมกันแล้ว ข้อมูลการแสดงออกของ Myo9A แนะนำว่า Myo9A อาจมีบทบาทในอุปสรรคการกรองไต

เพื่อให้เข้าใจถึงความเกี่ยวข้องของการกลายพันธุ์ที่ไร้สาระของ p.Arg701* MYO9A ในร่างกาย เราจึงสร้างเมาส์แบบน็อคอิน Myo9AR701X โดยการแก้ไขยีน การกลายพันธุ์ Homozygous Myo9AR701X/R701X พัฒนา hydrocephalus ก้าวหน้า ส่งผลให้เสียชีวิตเมื่ออายุ 3 สัปดาห์ซึ่งคล้ายกับหนู Myo9A-null 14 เมื่ออายุได้ 2 สัปดาห์ ไต Myo9AR701X/R701X ที่เป็น homozygous เผยให้เห็นฟีโนไทป์ของ glomerulo-tubular ที่รุนแรง: FPE ที่กว้างขวาง, ความผิดปกติของ GBM, และความขาดแคลนของไดอะแฟรมกรีดและท่อขยายที่เกี่ยวข้องกับอัลบูมินูเรีย หนูทดลอง Myo9A-null ที่โตเต็มวัยได้แสดงทูบูโลพาทีส่วนต้น, ปัสสาวะมาก และโปรตีนในปัสสาวะที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ 15 น่าเสียดายที่ไม่มีข้อมูลโครงสร้างพิเศษของไตรวมอยู่ในรายงาน น่าแปลกใจที่ Myo9A อายุตั้งแต่ 3- ถึง 6- เดือน - หนูที่เป็นโมฆะไม่ยอมจำนนต่อ hydrocephalus แบบก้าวหน้าตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เนื่องจาก Myo9AR701X/R701X มิวแทนต์ที่เป็นโฮโมไซกัสไม่สามารถอยู่รอดได้จนถึงวัยผู้ใหญ่ เราจึงสามารถยืนยันได้เฉพาะฟีโนไทป์ของไตในระยะแรกที่อธิบายไว้ในที่นี้เท่านั้น การขยายตัวของท่อที่สังเกตได้ในการกลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/R701X ที่มีอายุ 2- สัปดาห์อาจแสดงถึงหลักฐานเบื้องต้นของ tubulopathy ที่อธิบายไว้ในหนู Myo9A-null ที่เป็นผู้ใหญ่

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-พับในโพโดไซต์ปฐมภูมิ (c), Western blots เป็นตัวแทนของ n=3 ถึง 4 การทดลองอิสระ, ไลเซทที่รวมกันจากหนู 3 ตัวแต่ละตัว, การหาปริมาณ (ค่าเฉลี่ย± SD), การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) (a ) หรือ t-test ที่ไม่ได้จับคู่ (b,c) *ป<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

การค้นพบที่สำคัญของการศึกษานี้คือ Myo9AR701X/þ แบบน็อคอินในหนูทดลองมีความผิดปกติทางฟีโนไทป์เมื่อแรกเกิด แต่พัฒนาอัลบูมินูเรีย, FSGS และ podocyte FPE เมื่ออายุ 4 เดือน ซึ่งแสดงให้เห็นว่า p.Arg701* Myo9A เป็นการกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิด FSGS ใน หนูผู้ใหญ่ การเปลี่ยนแปลงทางจุลกายวิภาคและโครงสร้างพื้นฐานของไตที่กลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/þ อย่างน่าทึ่ง ได้สรุปลักษณะการวินิจฉัยของการตรวจชิ้นเนื้อไตของโพรแบนด์ นอกจากนี้ หนูทดลอง Myo9AR701X/þ กลายพันธุ์พัฒนาอัลบูมินูเรียอย่างมีนัยสำคัญมากกว่าอัลบูมินูเรียที่มีปริมาณมาก ซึ่งทำให้เกิดโปรตีนในปัสสาวะที่ไม่ใช่ไตที่สังเกตพบในพี่น้องที่มีปัญหาและในผู้ป่วย FSGS ที่เริ่มมีอาการจำนวนมาก50 มีข้อเสนอแนะว่าการลบ Myo9A อาจทำให้เกิดโรคเส้นโลหิตตีบไตรองจากท่อปัสสาวะโพลียูริก .15 ไมโอซินที่ผิดปกติมีส่วนเกี่ยวข้องในการดูดซึมอัลบูมินกลับคืนมาโดยท่อใกล้เคียงผ่านการโต้ตอบกับ Dab2 และคิวบิลิน แต่ยังไม่มีการแสดงให้เห็นความเกี่ยวข้องของ Myo9A ในกระบวนการนี้51 เราไม่ได้ตรวจพบหลักฐานใดๆ ของ tauopathies เช่น polyuria, tubular dilatation, atrophy หรือการกระจายที่ผิดปกติของเครื่องหมายท่อส่วนปลายหรือส่วนปลายในหนู Myo9AR701X/þ ที่โตเต็มวัย ข้อมูลเหล่านี้ไม่สนับสนุนสมมติฐานที่ว่า FSGS ที่สังเกตพบในหนู Myo9AR701X/þ เป็นผลมาจากสิ่งกีดขวางหรือข้อบกพร่องของท่อ

ในทางกลไก เราพิจารณาแล้วว่า Myo9A mRNA และโปรตีน Myo9A แบบเต็มความยาวจะลดลง w50 เปอร์เซ็นต์ ขอแนะนำอย่างยิ่งว่าการกลายพันธุ์นั้นนำไปสู่ ​​Myo9A haploinsufficiency อันเนื่องมาจากการสลายตัวของ mRNA ที่ไร้สาระ 42 เนื่องจากการกลายพันธุ์ของจุด Myo9AR701X ถูกแปลเป็น exon 14 จาก 42, Myo9A mRNA กฎระเบียบเป็นไปตามกฎการสลายตัวของ mRNA ที่ไร้สาระตามมาตรฐานสำหรับการกลายพันธุ์ที่ถูกตัดทอนที่อยู่ต้นน้ำของ exon ล่าสุด 42,52 สอดคล้องกับสิ่งนี้ hydrocephalus และการเสียชีวิตก่อนวัยอันควรได้รับการสังเกตใน myo9AR701X/R701X กลายพันธุ์เลียนแบบ Myo9A null mice.14 เราพิจารณาแล้วว่า การลดการแสดงออกของโปรตีน Myo9A ลง 50 เปอร์เซ็นต์ในไตที่กลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/þ และพ็อดโดไซต์ปฐมภูมิ เช่นเดียวกับในพอดโดไซต์ที่เป็นอมตะของ Myo9AKD นั้นลดลงตามสัดส่วนระหว่าง Myo9A, แอคติน และคาโมดูลิน การค้นพบนี้สนับสนุนการตีความว่า Myo9A haploinsufficiency เป็นพื้นฐานสำหรับปฏิสัมพันธ์ Myo9A-actin-calmodulin ที่ลดลงซึ่งพบในการกลายพันธุ์ของ Myo9AR701X/þ

การค้นพบที่สำคัญของงานนี้ก็คือ p.Arg701* Myo9A ทำให้เกิดการสูญเสียฟังก์ชัน Rho-GAP ส่งผลให้ RhoA ที่แอคทีฟเพิ่มขึ้นในไตทั้งตัวของ Myo9AR701X, โกลเมอรูไลที่แยกได้ และโพโดไซต์ปฐมภูมิ นอกจากนี้ โพโดไซต์กลายพันธุ์ Myo9AR701X/þ ยังแสดงให้เห็นการยึดติดและการเคลื่อนไหวที่ลดลงโดยขึ้นกับ RhoA การส่งสัญญาณ Myo9A-GAP ช่วยลด RhoA ที่ใช้งานอยู่และมีผลเพียงเล็กน้อยต่อ Rac1 และ Cdc42.9,53 Rho-GAP ที่สูญเสียฟังก์ชันเพิ่มขึ้นกิจกรรม Rho-GTPaseและนำไปสู่การบาดเจ็บของ podocyte, โปรตีนในปัสสาวะ และ FSGS.3,18,20 ดังนั้น พฤติกรรมที่ผิดปกติของ Myo9AR701X/þ กลายพันธุ์ podocytes อาจนำไปสู่การพัฒนาของ FPE และ FSGS เมื่อเวลาผ่านไปในหนู Myo9AR701X/þ ข้อมูลของเราสอดคล้องกับรายงานผลของการควบคุม RhoA ที่ผิดปกติต่อการทำงานของ podocyte ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง 54–56

เนื่องจาก Myo9A เชื่อมโยงข้ามแอกตินและกระตุ้นการก่อตัวของการรวมกลุ่มของแอคติน ในหลอดทดลอง ในช่วงเวลา 36-นาโนเมตร ปกติโดยทำปฏิกิริยาร่วมกันกับแอคตินและคาโมดูลิน สารสัมพันธ์ของปฏิกิริยาของพวกมันจึงมีความสำคัญ 16 ดังนั้น ความไม่เพียงพอของ Myo9A จึงมีแนวโน้ม เพื่อลดการเชื่อมโยงและการรวมกลุ่มของแอคตินที่เป็นสื่อกลางของ Myo9A โดยให้ไซต์น้อยลงตามเส้นใยแอคตินที่เกิดการหยุดทำงานของ RhoA ซึ่งจะเปลี่ยนแปลงไดนามิกของแอคตินในบริเวณใกล้เคียงและพฤติกรรมของ podocyte ในระดับเซลล์ Rho-associated kinase inhibitor Y27632 คืนค่าสิ่งที่แนบมาและข้อบกพร่องในการย้ายข้อมูลบางส่วนที่เกิดจาก Myo9AR701X/þ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับ RhoA effectors ดาวน์สตรีมเพิ่มเติม เช่น mDia1 อีกทางเลือกหนึ่ง การเชื่อมโยงข้ามของแอคตินที่ลดลงใน Myo9AR701X/þ อาจส่งผลโดยตรงต่อการยึดติดและการย้ายถิ่นของโพโดไซต์ Myo9A haploinsufficiency อาจส่งผลกระทบต่อกลไกการค้ามนุษย์เช่นกัน7–9 กลไกระดับโมเลกุลที่แม่นยำซึ่ง Myo9A ควบคุมพลวัตของแอคติน podocyte ยังคงได้รับการชี้แจง โดยสรุป เราระบุ Myo9A เป็นองค์ประกอบใหม่ของอุปกรณ์โครงร่างโครงกระดูกของ podocyte และการกลายพันธุ์ของ MYO9A ที่ไร้สาระซึ่งเกี่ยวข้องกับ MYO9A เป็นยีนตัวเลือกสำหรับ FSGS ของมนุษย์ โดยการสร้างโปรตีนในปัสสาวะของมนุษย์/ฟีโนไทป์ FSGS ใน Myo9AR701X/þ หนูที่เคาะและโดย autosomal การแบ่งแยกที่เด่นชัดของฟีโนไทป์ในเครือญาติขนาดเล็ก โดยรวมแล้ว ข้อมูลแนะนำอย่างยิ่งว่า Myo9A haploinsufficiency เป็นพื้นฐานระดับโมเลกุลสำหรับฟีโนไทป์ที่สังเกตพบในหนู Myo9AR701X/þ ที่เป็นผู้ใหญ่ เราแสดงให้เห็นว่าสิ่งที่แนบมาและการย้ายถิ่นมีความบกพร่องใน Myo9AR701X/þ podocytes กลายพันธุ์ของ knockin ซึ่งเกี่ยวข้องกับทั้งกิจกรรม RhoA ที่เพิ่มขึ้นและปฏิสัมพันธ์ Myo9A-actin-calmodulin ที่ลดลง เนื่องจาก Myo9A ทำให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามและการรวมกลุ่มของแอกตินที่อัตราส่วน 1:1 โมลาร์ 16 และการสังเกตของเราว่า Myo9AR701X/þ นำไปสู่ความไม่เพียงพอของฮาโปโลน การหลุดลอกของ podocyte และการทำงานล่วงเวลาของ FSGS เราคาดการณ์ว่า Myo9A อาจมีความสำคัญสำหรับพลวัตของแอคตินของโพโดไซต์ตามปกติ โปรตีนที่จับกับแอกติน (ACTN4, INF2) เป็นที่ทราบกันว่าทำให้เกิด FSGS ที่เด่นในตัวเองในผู้ใหญ่เมื่อกลายพันธุ์ มีการรับประกันการศึกษาเพิ่มเติมเพื่ออธิบายว่า Myo9A มีปฏิสัมพันธ์กับ podocyte RhoA, cytoskeletal และ slit diaphragm protein อย่างไร และข้อบกพร่องที่เป็นสื่อกลาง Myo9A ใน actin cross-link และการสร้าง Bundle จะเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง podocyte cytoskeleton โดยตรงหรือไม่ ข้อจำกัดของการศึกษานี้เพื่อสร้างสาเหตุรวมถึงการไม่สามารถขยายสายเลือดของยีน proband และการขาดเครือญาติเพิ่มเติมที่มีการกลายพันธุ์แบบเดียวกัน จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบการค้นพบ WES ของเราในผู้ป่วยเพิ่มเติมที่มี FSGS ในครอบครัวหรือเป็นระยะๆ ก่อน p.Arg701*รุ่น MYO9Aถือได้ว่าเป็นสาเหตุของโรค และข้อมูลนี้สามารถนำไปใช้ในการตัดสินใจทางคลินิก

การเปิดเผยข้อมูล

ผู้เขียนทั้งหมดประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนจาก National Institutes of Health ให้ทุนแก่ AT (NIH-RO1DK109434) และ Yale Center for Mendelian Genomics (NIH-U54-HG006504)

เราขอขอบคุณ M. Saleem (มหาวิทยาลัยบริสตอล สหราชอาณาจักร) ที่จัดหาเซลล์พอดไซต์ของมนุษย์ที่เป็นอมตะ G. Moeckel (Yale School of Medicine, Department of Pathology) ที่ให้ภาพชิ้นเนื้อ, S. Ishibe Lab (Yale School of Medicine, Department of Medicine/ Nephrology) สำหรับคำแนะนำเกี่ยวกับการแยก podocyte และการทดสอบการยึดเกาะ T. Ardito (Yale School of Medicine, Department of Pathology) และ V. Kakade (Yale School of Medicine, Department of Medicine/Nephrology) สำหรับการสนับสนุน IF

และการถ่ายภาพคอนโฟคอล SueAnn Mentone (Yale School of Medicine, Department of Cell and Molecular Physiology) สำหรับการมีส่วนร่วมในการศึกษา EMglomerulosclerosis ปล้องโฟกัสผู้ป่วยและครอบครัว และสถาบัน National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases repository (FSGS-CT, NCT00135811) เพื่อจัดเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอ

วัสดุเสริม

ไฟล์เสริม (PDF)

วิธีการเสริม การวิเคราะห์ข้อมูล WES และชีวสารสนเทศ การสร้างหนู Myo9AR701X แบบน็อคอิน และวิธีการแบบละเอียดอื่นๆ

รูปที่ S1 Immuno-EM แปลการแสดงออกของ Myo9A เป็น glomerular podocytes ของหนูเมาส์และเยื่อบุผิวท่อ

รูปที่ S2 Myo9AR701X/R701X ทำให้เกิดภาวะน้ำคั่งในทารกแรกเกิด

รูปที่ S3 มิญชวิทยาของไตหลังคลอดในหนูกลายพันธุ์ Myo9AR701X

รูปที่ S4 การทดสอบการย้ายถิ่นของ Podocyte (การทดสอบบาดแผล)

ตาราง S1 รายการตัวแปรทั้งหมดที่ใช้ร่วมกันโดยพี่น้อง Proband

ตาราง S2 รายชื่อยีน FSGS-proteinuria-NS 64 ยีนที่สอบปากคำในกลุ่ม FSGS-CT ข้อมูลอ้างอิงเพิ่มเติม

ข้อมูลอ้างอิง

1. วิกกินส์ อาร์ซี สเปกตรัมของ podocytopathies: ภาพรวมของโรคไต ไตอินเตอร์ 2007;71:1205–1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S และอื่น ๆ สาเหตุจากยีนเดี่ยวใน 29.5 เปอร์เซ็นต์ของกรณีของโรคไตที่ดื้อต่อสเตียรอยด์ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2015;26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S และอื่น ๆ การกลายพันธุ์ของ ARHGDIA ทำให้เกิดโรคไตผ่านการส่งสัญญาณ RHO GTPase ที่บกพร่อง เจ คลิน อินเวสท์ 2013;123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U และอื่น ๆ การโคลนนิ่งและการแสดงออกของพัฒนาการของยีน myosin IXA (MYO9A) ที่ไม่เป็นทางการในภูมิภาค Bardet-Biedl syndrome (BBS4) ที่โครโมโซม 15q22- q23 จีโนมิกส์ 1999;59:150–160.

5. Bayram Y, Karaca E, Coban Akdemir Z และอื่น ๆ สาเหตุระดับโมเลกุลของ arthrogryposis ในหลายครอบครัวที่ส่วนใหญ่เป็นแหล่งกำเนิดของตุรกี เจ คลิน อินเวสท์ 2016;126:762–778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS และอื่น ๆ การระบุการกลายพันธุ์ในยีน MYO9A ในผู้ป่วยโรค myasthenic แต่กำเนิด สมอง. 2016;139:2143–2153.

7. Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Myosins: การจัดระเบียบโดเมน, คุณสมบัติของมอเตอร์, บทบาททางสรีรวิทยาและการทำงานของเซลล์ Handb Exp Pharmacol. 2017;235:77–122.

8. Liu KC, Cheney RE. Myosins ในรอยต่อของเซลล์ สถาปัตยกรรมชีวภาพ 2012;2:158–170.

9. Omelchenko T, Hall A. Myosin-IXA ควบคุมการย้ายเซลล์เยื่อบุผิวโดยรวมโดยกำหนดเป้าหมายกิจกรรม RhoGAP ไปยังจุดเชื่อมต่อของเซลล์และเซลล์ เคอร์ ไบโอล. 2012;22:278–288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S และอื่น ๆ ผู้ป่วยที่มีอาการ Epstein-Fechtner เนื่องจากการกลายพันธุ์ของ MYH9 R702 จะทำให้เกิดโรคไตวายเรื้อรัง ไตอินเตอร์ 2010;78:207–214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R และอื่น ๆ การกลายพันธุ์ของ MYO1E และ glomerulosclerosis ในครอบครัวในวัยเด็ก N Engl เจ เมด. 2011;365:295–306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T และอื่น ๆ การหยุดชะงักของ Myosin 1e ส่งเสริมการบาดเจ็บของ podocyte เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2009;20:86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ และอื่น ๆ หน้าที่ของเซลล์ของไมโอซินคลาส IX ในเยื่อบุผิวและเซลล์ภูมิคุ้มกัน Biochem Soc ทรานส์. 2011;39:1166–1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV และอื่น ๆ Myosin IXa ควบคุมความแตกต่างของเยื่อบุผิวและการขาดสารนี้ส่งผลให้เกิด hydrocephalus โมลไบโอเซลล์. 2552;20:5074–5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarimboli G, และคณะ RhoGAPmyosin IXa เป็นตัวควบคุมการทำงานของท่อไต แอม เจ ฟิสิออล รีนัล ฟิสิออล 2015;309:F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, และคณะ การจัดระเบียบตนเองของเครือข่ายแอคตินโดยโมโนเมอร์ไมโอซิน Proc Natl Acad Med สหรัฐอเมริกา A. 2016;113: E8387–E8395

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C และอื่น ๆ Synaptopodin ประสานการจัดระเบียบแอคตินและการเคลื่อนที่ของเซลล์ผ่านการควบคุมการส่งสัญญาณ RhoA แนท เซลล์ ไบโอล. 2006;8:485–491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. บทบาทของ Rho-GTPases และโปรตีนควบคุมในการทำงานของไต podocyte แคน เจ ฟิสิออล ฟาร์มาคอล 2013;91:773–782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ และอื่น ๆ การกลายพันธุ์ในยีน formin INF2 ทำให้เกิด glomerulosclerosis ในปล้องโฟกัส แนท เจเนท. 2010;42:72–76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H และอื่น ๆ Arhgap24 หยุดการทำงานของ Rac1 ใน podocytes ของเมาส์ และรูปแบบการกลายพันธุ์นั้นสัมพันธ์กับ glomerulosclerosis เจ คลิน อินเวสท์ 2011;121:4127–4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, และคณะ การวินิจฉัยทางพันธุกรรมโดยการดักจับทั้งตัวและการจัดลำดับดีเอ็นเอขนานกันอย่างหนาแน่น Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106:19096–19101.

22. Choi M, Scholl UI, Yue P และอื่น ๆ การกลายพันธุ์ของช่องKþในต่อมหมวกไตที่ผลิต adenomas และความดันโลหิตสูงทางพันธุกรรม ศาสตร์. 2011;331:768–772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D และอื่น ๆ The Centers for Mendelian Genomics: การริเริ่มขนาดใหญ่แบบใหม่เพื่อระบุยีนที่เป็นสาเหตุของภาวะ Mendelian ที่หาได้ยาก Am J Med Gen. 2012;158A:1523–1525.

24. Li H, Durbin R. การจัดตำแหน่งการอ่านระยะสั้นที่รวดเร็วและแม่นยำด้วยการแปลง Burrows-Wheeler ชีวสารสนเทศศาสตร์ 2552;25:1754–1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E และอื่น ๆ ชุดเครื่องมือการวิเคราะห์จีโนม: กรอบงาน MapReduce สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลการจัดลำดับดีเอ็นเอยุคหน้า ความละเอียดของจีโนม 2010;20:1297–1303.

26. Yang H, Wang K. คำอธิบายประกอบและการจัดลำดับความสำคัญของตัวแปร Genomic ด้วย ANNOVAR และ wanNOVAR แนท โพรโทค. 2015;10:1556–1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X และอื่น ๆ เปรียบเทียบการผสานรวมวิธีการทำนายอันตรายสำหรับ SNV ที่ไม่มีความหมายเหมือนกันในการศึกษาหาลำดับแบบทั้งหมด ฮัม โมล เจเนท. 2015;24:2125–2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, และคณะ เว็บเซิร์ฟเวอร์ SIFT: การทำนายผลของการแทนที่กรดอะมิโนต่อโปรตีน กรดนิวคลีอิก 2012;40:W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM และอื่น ๆ CADD: ทำนายอันตรายของตัวแปรต่างๆ ทั่วทั้งจีโนมมนุษย์ กรดนิวคลีอิก 2019;47:D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. การสร้างหนูดัดแปลงพันธุกรรมโดยใช้วิศวกรรมจีโนม CRISPR/Cas-mediated แนท โพรโทค. 2014;9:1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A และอื่น ๆ Podocyte vascular endothelial growth factor (Vegf₁₆₄) การแสดงออกที่มากเกินไปทำให้เกิดภาวะ glomerulosclerosis เป็นก้อนกลมอย่างรุนแรงในรูปแบบเมาส์ของโรคเบาหวานประเภท 1 เบาหวาน. 2011;54:1227–1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A และอื่น ๆ การเหนี่ยวนำของ podocyte VEGF164 การแสดงออกที่มากเกินไปในระยะต่าง ๆ ของการพัฒนาทำให้เกิดโรคไตวายเรื้อรังหรือโรคไตที่ดื้อต่อสเตียรอยด์ แอม เจ ปทุม. 2010;177:2225–2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T และอื่น ๆ การเชื่อมโยงเอนโดไซโทซิสที่อาศัยตัวรับและการส่งสัญญาณของเซลล์: หลักฐานสำหรับการสลายโปรตีนในเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีการควบคุมของเมกาลินในท่อใกล้เคียง เจ ไบโอล เคม. 2004;279:34302–34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK และอื่น ๆ Vascular endothelial growth factor receptor 2 อันตรกิริยาโดยตรงกับ nephrin เชื่อมโยงสัญญาณ VEGF-A กับแอคตินใน podocytes ของไต เจ ไบโอล เคม. 2011;286:39933–39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H และอื่น ๆ VEGF ที่จำเพาะต่อ Podocyte-a ที่เพิ่มขึ้นของการทำงานทำให้เกิดภาวะเกล็ดเลือดต่ำเป็นก้อนกลมในหนูเมาส์ eNOS null เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2014;25:1814–1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, และคณะ เซมาโฟรินที่มากเกินไป-3A นำไปสู่โรคไตที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่าง plexinA1-เนฟริน แอม เจ ปทุม. 2013;183:1156–1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM และอื่น ๆ talin1 ที่เกี่ยวข้องกับ Podocyte มีความสำคัญต่อการบำรุงรักษาสิ่งกีดขวางการกรองไต เจ คลิน อินเวสท์ 2014;124:1098–1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. วัฒนธรรม Podocyte: เทคนิคการค้า โรคไต (คาร์ลตัน). 2012;17:525–531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA ระเบียบ Rho โปรตีนจับ GTP ขนาดเล็กโดยการยึดเกาะของเซลล์และโครงร่างโครงร่าง EMBO เจ. 1999;18:578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E และอื่น ๆ การย่อยสลาย Proteasomal ของ Nck1 แต่ไม่ใช่ Nck2 ควบคุมการเปิดใช้งาน RhoA และการเปลี่ยนแปลงของแอคติน แนท คอมมูน. 2013;4:2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X และอื่น ๆ ลักษณะทางคลินิกและจุลพยาธิวิทยาของ apolipoprotein l1-โรคไตที่สัมพันธ์กันใน FSGS Clinical Trial เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2015;26:1443–1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. mRNA ที่ไร้สาระจะสลายไปในมนุษย์ได้อย่างรวดเร็ว เจเซลล์วิทย์. 2016;129:461–467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP และอื่น ๆ แนวทางสำหรับการตรวจสอบความเป็นเหตุของตัวแปรลำดับในโรคของมนุษย์ ธรรมชาติ. 2014;508:469–476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S และอื่น ๆ มาตรฐานและแนวทางปฏิบัติสำหรับการตีความลำดับตัวแปร: ข้อเสนอแนะที่เป็นเอกฉันท์ร่วมกันของ American College of Medical Genetics and Genomics และ Association for Molecular Pathology ยีนเมด 2015;17:405–424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, และคณะ ผลงานของยีนที่หายากต่อ FSGS ในครอบครัวและเป็นระยะๆ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2019;30:1625–1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G และอื่น ๆ สเปกตรัมข้อจำกัดการกลายพันธุ์วัดจากการเปลี่ยนแปลงในมนุษย์ 141,456 คน ธรรมชาติ. 2020;581:434–443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Autozygome และการยืนยันปริมาณงานสูงของยีนของโรค ยีนเมด 2019;21:736–742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I และอื่น ๆ การขาด MYO9A ในเซลล์ประสาทสั่งการเกี่ยวข้องกับการหลั่ง agrin ของกล้ามเนื้อประสาทที่ลดลง ฮัม โมล เจเนท. 2018;27:1434–1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémánt N, et al. กลุ่มอาการเมตาบอลิซึมมีอิทธิพลต่อรูปแบบการแสดงออกของยีนหัวใจที่ระดับการถอดรหัสในหนู ZDF เพศผู้ โรคหัวใจและหลอดเลือด. 2013;12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, และคณะ ฟีโนไทป์ทางคลินิกและทางพยาธิวิทยาของสาเหตุทางพันธุกรรมของ glomerulosclerosis ปล้องโฟกัสในผู้ใหญ่ Clin Kidney J. 2018;11:179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. endocytosis ที่อาศัยตัวรับในหลอดใกล้เคียง Annu รายได้ Physiol. 2017;79:425–448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC และอื่น ๆ ครอบครัว glucocorticoid receptor haploinsufficiency โดยการสลายตัวของ mRNA ที่ไม่ใช้ความรู้สึก, hyperplasia ต่อมหมวกไตและส่วนเกินของ mineralocorticoid ที่เห็นได้ชัด ป.ล. หนึ่ง 2010;5. e13563.

53. Yi F, Kong R, Ren J และอื่น ๆ Noncanonical Myo9b-RhoGAP เร่งการไฮโดรไลซิส RhoA GTP ด้วยกลไกสองนิ้วของอาร์จินีน เจ โมล ไบโอล. 2016;428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billing D และอื่น ๆ การควบคุมปฏิปักษ์ของแอกตินไดนามิกและการเคลื่อนที่ของเซลล์โดยช่อง TRPC5 และ TRPC6 สัญญาณวิทย์. 2010;26:3. รา77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA และอื่น ๆ กลไกของโปรตีนในปัสสาวะที่เกิดจาก Rho GTPases ไตอินเตอร์ 2012;81:1075–1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocyte GTPases ควบคุมไดนามิกของตัวกรองไต ไตอินเตอร์ 2012;81:1053–1055.

57. Cory G. การทดสอบรอยขีดข่วน วิธีการ โมลไบโอล. 2011;769:25–30.

ไตอินเตอร์เนชั่นแนล (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

ลิขสิทธิ์ ª 2021, International Society of Nephrology เผยแพร่โดย Elsevier Inc. นี่เป็นบทความเปิดการเข้าถึงภายใต้ใบอนุญาต CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

การติดต่อ: Alda Tufro, Department of Pediatrics/Nephrology, Yale University School of Medicine, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520, USA E-mail: alda.tufro@yale.edu 6 ปัจจุบันสังกัด: Nephrology, Children's National Hospital, Washington, DC, USA 7 สังกัดปัจจุบัน: Nephrology, Hospital for Sick Children, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada รับวันที่ 21 พฤษภาคม 2563; แก้ไขเมื่อ 4 ธันวาคม 2563; ยอมรับ 10 ธันวาคม 2020; เผยแพร่ออนไลน์ 4 มกราคม 2021