FGIN-1-27 เป็นตัวรับที่จับตัวยับยั้งไดอะซีแพมไมโตคอนเดรียลสังเคราะห์ (MDR)ตัวเร่งปฏิกิริยาที่แสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ต้านอะพอพโทซิส ต้านความวิตกกังวล และสเตียรอยด์ในการศึกษาต่างๆ ที่นี่เรารายงานสำหรับอันดับแรกเวลา, ประสิทธิภาพในการต่อต้านการสร้างเม็ดสีผิวของFGIN-1-27ในหลอดทดลองและในร่างกาย. FGIN-1-27 อย่างมากยับยั้งฐานและ - ฮอร์โมนกระตุ้นการสร้างเม็ดสี ( -MSH)-, 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-กลีเซอรอล (OAG)-และ Endothelin-1 (ET-1)-เหนี่ยวนำให้เกิดเมลาโนเจเนซิสโดยไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ดแสดงให้เห็นว่า FGIN-1-27 ไม่ได้ยับยั้งโดยตรงกิจกรรมไทโรซิเนส แสดงว่า FGIN-1-27 ไม่ใช่ตัวยับยั้งไทโรซิเนสโดยตรง. แม้ว่าจะไม่สามารถปรับกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของไทโรซิเนสของเห็ดในหลอดทดลอง, FGIN-1-27 ลดระดับการแสดงออกของโปรตีนสำคัญที่ทำหน้าที่ในการสร้างเมลาโนเจเนซิส FGIN-1-27 เล่นฟังก์ชันเหล่านี้โดยการยับยั้ง PKA/CREB, PKC- และเส้นทาง MAPK เมื่อปิดการใช้งานแล้วลดการแสดงออกของ MITF, ไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 และยับยั้งกิจกรรมไทโรซิเนส,ในที่สุดยับยั้งการสร้างเม็ดสี ในระหว่างในร่างกายการทดลองFGIN-1-27 ยับยั้งการสร้างเม็ดสีในร่างกายของปลาเซเบราฟิชและลดการเกิดรังสี UVBรอยดำในผิวหนังหนูตะเภา แต่ไม่ใช่การลดลงของจำนวนเซลล์เมลาโนไซต์ของเราผลการวิจัยระบุว่า FGIN-1-27 ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์และยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสในทั้งสองอย่างในหลอดทดลองและในร่างกายโมเดล มันอาจพิสูจน์ได้ว่ามีประโยชน์มากในฐานะกสารทำให้ผิวขาวที่ปลอดภัยยิ่งขึ้น

จากการศึกษาที่เกี่ยวข้องพบว่ากระท่อมเป็นสมุนไพรที่ขึ้นชื่อว่า "สมุนไพรมหัศจรรย์อายุยืน" มีส่วนประกอบหลักคือ cistanoside ซึ่งมีฤทธิ์ต่างๆ เช่นสารต้านอนุมูลอิสระ, ต้านการอักเสบและการส่งเสริมการทำงานของภูมิคุ้มกัน กลไกระหว่าง cistanche และผิวขาวอยู่ในผลต้านอนุมูลอิสระของ cistanche glycosidesเมลานินในผิวหนังของมนุษย์ผลิตโดยปฏิกิริยาออกซิเดชันของไทโรซีนที่เร่งปฏิกิริยาโดยไทโรซิเนสและปฏิกิริยาออกซิเดชั่นต้องการการมีส่วนร่วมของออกซิเจน ดังนั้นอนุมูลอิสระของออกซิเจนในร่างกายจึงกลายเป็นปัจจัยสำคัญที่ส่งผลต่อการผลิตเมลานิน Cistanche มี cistanoside ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระและสามารถลดการสร้างอนุมูลอิสระในร่างกายได้ยับยั้งการสร้างเมลานิน.

คลิกที่ Cistanche Tubulosa

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

การแนะนำ

การสร้างเมลาโนเจเนซิสเป็นหน้าที่ที่สำคัญที่สุดของเมลาโนไซต์ในผิวหนัง มีการชี้แจงปัจจัยสำคัญหลายประการที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเมลาโนเจเนซิส (Raposo and Marks, 2007; Noguchi et al., 2014) เอนไซม์สำคัญที่ควบคุมการสร้างเมลาโนเจเนซิสคือไทโรซิเนส และทำหน้าที่ร่วมกับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 1 (TRP1) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 2 (TRP2) เพื่อส่งเสริมการสังเคราะห์เมลานิน (Zhu et al., 2015) ปัจจัยสำคัญอีกประการหนึ่งที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีคือปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับ microphthalmia (MITF) ซึ่งไม่เพียงควบคุมการเพิ่มจำนวนและการอยู่รอดของเมลาโนไซต์ แต่ยังควบคุมการแสดงออกของไทโรซิเนส TRP1 และ TRP2 (Kawasaki et al., 2008; Levy and Fisher, 2011 ). สิ่งเร้าจากสิ่งแวดล้อม เช่น การฉายรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) มีบทบาทสำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิส (Abdel-Naser et al., 2003) เมื่อได้รับรังสียูวี เซลล์เคราติโนไซต์และเมลาโนไซต์ที่ถูกกระตุ้นจะผลิตฮอร์โมนกระตุ้นการสร้างเซลล์เมลาโนไซต์ ( -MSH), ไดเอซิลกลีเซอรอล (DAG) และเอนโดเทลิน-1 (ET-1) (D'Mello et al., 2559; แบ ฮาร์โบ แอนด์ พาร์ค, 2555). เมื่อฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH) จับกับเมลาโนคอร์ติน-1 รีเซพเตอร์ (MC1R) ในเมลาโนไซต์ มันสามารถเพิ่มระดับภายในเซลล์ของ cyclic adenosine monophosphate (cAMP) และกระตุ้นโปรตีนไคเนส A (PKA)/ (CREB) ) ทางเดิน ในที่สุดส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิส (Corre et al., 2004; Rzepka et al., 2016) ไดอะซิลกลีเซอรอล (DAG) จำเป็นต่อการกระตุ้นโปรตีนไคเนส C- (PKC-) ในเซลล์เมลาโนไซต์ ซึ่งเพิ่มการทำงานของไทโรซิเนสและกระตุ้นให้เกิดการสร้างเม็ดสี (Kim et al., 2006; Kawaguchi et al., 2012; Yuan and Jin, 2018 ). 1-Oleoyl-2- acetyl-sn-glycerol (OAG) เป็นอะนาล็อก DAG สังเคราะห์ที่เมมเบรนซึมผ่านได้ซึ่งถูกใช้อย่างกว้างขวางในฐานะตัวกระตุ้นทางเภสัชวิทยาของ PKC- (Rainbow et al., 2011) Endothelin-1 (ET- 1) กระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนไซต์ผ่านการกระตุ้นของวิถีไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจน (MAPK) (Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2015)

เมลานินมีบทบาทสำคัญในการปกป้องผิวจากอันตรายของรังสีอัลตราไวโอเลต เช่น มะเร็งผิวหนังและอายุที่มากขึ้น (Slominski et al., 2004) อย่างไรก็ตาม การผลิตที่มากเกินไปและการสะสมของเมลานินที่ผิดปกติทำให้เกิดปัญหาด้านความงามของผิวหนัง เช่น ฝ้า กระ และจุดด่างดำ (Jadotte and Schwartz, 2010) สารประกอบไวท์เทนนิ่งที่ใช้งานอยู่หลายชนิด รวมทั้งกรดโคจิกและอาร์บูติน ได้รับการอนุมัติให้เป็นสารเติมแต่งเครื่องสำอางแล้ว (Kim et al., 2008) แต่มีรายงานว่าอาร์บูตินมีผลทำลายเซลล์และกรดโคจิกสามารถกระตุ้นให้เกิดมะเร็งได้ (Singh et al., 2016) ดังนั้นการค้นพบสารทำให้ผิวขาวที่มีประสิทธิภาพและปลอดภัยยิ่งขึ้นจึงเป็นสิ่งสำคัญยิ่ง

Mitochondrial diazepam binding inhibitor receptor (MDR) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสังเคราะห์ไขมันและสเตียรอยด์ และกระจายอย่างกว้างขวางในเนื้อเยื่อรอบข้างรวมถึงผิวหนัง (Alho et al., 1993) ในการศึกษาก่อนหน้านี้ diazepam, MDR agonist หนึ่งตัว, ควบคุมการสร้างเม็ดสีผ่านทาง PKA/CREB pathway (Lv et al., 2019) นอกจากนี้ การค้นพบล่าสุดชี้ให้เห็นว่าการเปิดใช้งาน MDR เพิ่มจำนวนของเมลาโนไซต์ใหม่ในปลาม้าลายเล็กน้อย (Allen et al., 2020) เมื่อเปรียบเทียบกับไดอะซีแพม FGIN-1-27 (N, N-Dihexyl-2-(4-ฟลูออโรฟีนิล)อินโดล-3- อะซีตาไมด์) แสดงความสัมพันธ์และความจำเพาะที่ค่อนข้างสูงกว่าสำหรับ MDR (ฟรีแมน และ หนุ่ม, 2543). FGIN-1–27 ได้แสดงให้เห็นฤทธิ์ของการกระตุ้นเซลล์อะพอพโทซิสและสเตียรอยด์ (Lacapère และ Papadopoulos, 2003) เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีรายงานว่า FGIN-1-27 สร้างฤทธิ์ต้านความวิตกกังวลและต่อต้านความตื่นตระหนกในร่างกาย (Lima-Maximino et al., 2018) อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีรายงานผลของ FGIN-1-27 ต่อการสร้างเม็ดสีในหลอดทดลองและในร่างกาย

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

FGIN-1-27(N, N-Dihexyl-2-(4-fluorophenyl)indole-3-acetamide), OAG (1-Oleoyl-2-acetyl-sn -กลีเซอรอล) และแอนติบอดีต่อ PKC- (1:200), p-PKA cat (ฟอสโฟ T197)(1:200), PKA cat (1:500), p-CREB (1:200), CREB(1:200), p-ERK(1:200), ERK (1:200), p-p38 (1:200), p38 (1:200), p-JNK (1:200),และ JNK (1:200) ได้มาจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ(แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา). ไทโรซิเนสจากเห็ด -MSH, ET-ได้รับ 1(เอนโดเทลิน-1) และ PTU(N-ฟีนิลไทโอยูเรีย)จากอะลาดิน (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) แอนติบอดีต่อต้านไทโรซิเนส (1:1,000), TRP-1(1:1,000), TRP-2 (1:1,000), MITF(1:2000), และ -actin (1:3,000) ได้มาจาก Abcam(เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร). น้ำยาย้อมสีเมลานิน Masson-Fontanaถูกซื้อมาจาก SenBeiJia Biological Technology (หนานจิง,จีน). ซื้อชุด RT-qPCR จาก Takara Biomedicalเทคโนโลยี (ปักกิ่ง ประเทศจีน) บัฟเฟอร์การสลายเซลล์และโปรตีน BCAชุดทดสอบได้มาจาก Beyotime Biotechnology (Shanghai,จีน).

การเพาะเลี้ยงเซลล์

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความมีชีวิตของเซลล์ SK-MEL-2 และ HEM ถูกวัดผ่านการทดสอบ MTT (Zhou et al., 2014) เซลล์ SK-MEL-2 และ HEM ถูกชุบตามลำดับในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 2×104 เซลล์ต่อหลุม FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4, 8, 16 μM) ถูกนำไปใช้กับเซลล์ SK-MEL-2 และ HEM เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เติมสารละลาย MTT (20 ไมโครลิตร) ลงในแต่ละหลุมของจานหลุม 96- เป็นเวลาอีก 4 ชั่วโมง หลังจากนำสารละลายออกแล้ว DMSO (200 μL) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและตรวจสอบค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (BioTek Instruments)

การทดสอบเมลานิน

SK-MEL-2 เซลล์และ HEM ถูกชุบตามลำดับใน 6-เพลตหลุมที่ความเข้มข้น 5×105 เซลล์ต่อหลุม หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมงที่ 37 องศา FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) ถูกนำไปใช้กับเซลล์ SK-MEL-2 และ HEM เซลล์ถูกบ่มอีก 48 ชั่วโมง, ล้างด้วย PBS, ตามด้วยการสลายด้วยบัฟเฟอร์การสลายเซลล์เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส และไลซีนถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เมลานินทั้งหมดในเม็ดเซลล์ถูกละลายในสารละลาย NaOH 100 ไมโครลิตร (1 โมล/ลิตร ที่มี DMSO 10 เปอร์เซ็นต์) ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (Lv et al., 2015) วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (BioTek Instruments)

การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนส

กิจกรรมไทโรซิเนสระดับเซลล์ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (Lv et al., 2020) เซลล์ SK-MEL-2 ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) หรือ OAG (200 μM) เป็นเวลา 12 ชั่วโมงหรือ 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงสลาย ด้วยบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ เซลล์ไลเซทถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เพื่อให้ได้ส่วนเหนือตะกอนสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมของไทโรซิเนส ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยชุด BCA ที่มี bovine serum albumin (BSA) เป็นมาตรฐาน 100 μL PBS (0.1 M, pH 6.5) ที่มีโปรตีน 30 ug ผสมกับ L-DOPA 100 μL (0.1 เปอร์เซ็นต์) แล้วบ่มที่ 37 องศา C นาน 1 ชม. วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (BioTek Instruments)

ผลกระทบโดยตรงของ FGIN{{0}} ต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนสได้ดำเนินการตามวิธีการก่อนหน้านี้ (Tomita et al., 2010; Lv et al., 2020) 100 ไมโครลิตร PBS (0.1 โมลาร์, pH 6.5) ที่มีความเข้มข้นต่างกันของ FGIN-1-27 ผสมกับเห็ดไทโรซิเนส (10 หน่วย) และแอล-ไทโรซีน 50 ไมโครลิตร (0.05 เปอร์เซ็นต์ ) แล้วบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 10 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (BioTek Instruments)

Masson–Fontana Ammoniacal Silver Staining

สำหรับการตรวจจับเม็ดสีเมลานิน เซลล์ SK-MEL-2 ถูกชุบบนจาน 6-หลุมที่มีฝาปิดแก้ว 13- มม. ในอาหารเลี้ยงเชื้อ 2.0 มล. (10 ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์) ในแต่ละหลุม ที่ 48 ชั่วโมงหลังการบริหารให้ เซลล์ถูกตรึงด้วยฟอร์มาลิน (บัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์) เป็นเวลา 20 นาที

เซลล์และสไลด์ผิวหนังถูกย้อมสีตามวิธีการย้อมสีแอมโมเนียของ Masson–Fontana (Lee et al., 2013) เซลล์และสไลด์ผิวหนังถูกบ่มด้วยน้ำยาย้อมสีเมลานิน Masson-Fontana เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างเซลล์และสไลด์ผิวหนังในน้ำกลั่น 3 ครั้ง และบ่มด้วยสารละลายไฮโปเป็นเวลา 7 นาที หลังจากการล้างด้วยน้ำกลั่นอย่างละเอียด เซลล์และสไลด์ผิวหนังถูกย้อมด้วยคราบสีแดงที่เป็นกลางเป็นเวลา 7 นาที สังเกตเซลล์และสไลด์ของผิวหนังโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Ti2-U

อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับ S-100

อิมมูโนฮิสโตเคมีของ S-100 ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Lee et al., 2013) สไลด์ถูกปิดกั้นด้วย BSA 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นบ่มในแอนติบอดีปฐมภูมิต่อต้าน S-100 (Dako, Carpentaria, CA) ที่เจือจางในสารละลายปิดกั้นข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ในวันถัดไป สไลด์ ถูกล้างด้วย TBST 4 ครั้ง และบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (Dako, Carpentaria, CA) จากนั้นนำสไลด์มาบำบัดด้วยอะมิโนเอทิลคาร์บาโซลเพื่อพัฒนาส่วนต่างๆ สังเกตเห็นการเลื่อนของผิวหนังโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Ti2-U

Reverse Transcription-Quantitative PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Lv et al., 2020) โดยสังเขป SK-MEL-2 RNA ของเซลล์ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol และหาปริมาณด้วยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก cDNA แบบเกลียวเดี่ยวถูกสังเคราะห์โดยใช้ SuperScript II Reverse transcriptase ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณ SYBR-Green ดำเนินการด้วยระบบตรวจจับลำดับ ABI PRISM (ระบบชีวภาพประยุกต์) และชุดไพรเมอร์ที่ผ่านการตรวจสอบล่วงหน้า ตัวอย่างทั้งหมดถูกเรียกใช้เป็นสามเท่า รอบเกณฑ์ถูกวางไว้ในส่วนลอการิทึมของเส้นโค้งการขยาย และผลลัพธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับ GAPDH ความแตกต่างของการพับระหว่างสองตัวอย่างถูกกำหนดโดยวิธี delta-delta Cq ลำดับไพรเมอร์ของยีน Mitf คือ 5′-AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG-3′, 5′-AACTTGATT CCAGGCTGATGATGTC-3′

การวิเคราะห์ Western Blot

ได้สารแขวนลอยโปรตีนตามวิธีที่กล่าวข้างต้น โปรตีนภายในเซลล์ที่สกัดได้ (30 มก.) ถูกแยกออกโดย SDS-PAGE (ร้อยละ 10) และจากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลิดีน แอล ฟลูออไรด์ (PVDF) ตามโปรโตคอลมาตรฐานการถ่ายโอนแบบเปียก เมมเบรนถูกปิดกั้นโดยใช้ BSA 2.5 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สัมผัสกับแอนติบอดีปฐมภูมิที่เหมาะสมที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสข้ามคืน และล้างด้วย TBST 4 ครั้ง เยื่อสัมผัสกับ Goat Anti-Rabbit IgG ที่มีฉลาก HRP (1:1,000) หรือ Goat Anti-Mouse IgG (1:1,000) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและล้างด้วย TBST 4 ครั้ง (Liao et al., 2017) จากนั้น เยื่อจะถูกทำให้มองเห็นได้โดยใช้ระบบการสร้างภาพแบบเคมิลูมิเนสเซนซ์แบบมัลติฟังก์ชั่น (Tanon 4600) การควบคุมภายในจากหยดเดียวกันถูกตรวจสอบด้วยแอนติแอกติน

การประเมินตามฟีโนไทป์และการกำหนดปริมาณเมลานินใน Zebrafish

ปลาเซเบราฟิชที่โตเต็มวัยถูกเก็บไว้ในถังที่มีสภาวะต่อไปนี้: 28.5 องศา โดยมีรอบแสง/มืด 14/10 ชั่วโมง ตัวอ่อนได้มาจากการวางไข่ตามธรรมชาติซึ่งถูกกระตุ้นในตอนเช้าด้วยการเปิดไฟ การเก็บตัวอ่อนเสร็จสิ้นภายใน 30 นาที การประเมินตามฟีโนไทป์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Choi et al., 2007) โดยสังเขป เอ็มบริโอที่ซิงโครไนซ์ถูกรวบรวมและจัดเรียงโดยปิเปต (3-4 เอ็มบริโอต่อหลุมใน 96-จานหลุมที่มีตัวกลางเอ็มบริโอ 200 ul) FGIN-1-27 และ PTU ถูกละลายใน 0.1 เปอร์เซ็นต์ DMSO จากนั้นเติมลงในอาหารเลี้ยงตัวอ่อนตั้งแต่ 35 ถึง 60 ชั่วโมง (การเปิดรับแสง 25 ชั่วโมง) ผลกระทบต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสของซีเบฟิชถูกสังเกตภายใต้สเตอรีโอไมโครสโคป

โมเดลหนูตะเภาที่เกิดจากการสร้างเม็ดสีมากเกินไปด้วยรังสี UVB

หนูตะเภาสีน้ำตาลแปดตัว (6 สัปดาห์ น้ำหนักประมาณ 300 กรัม) ได้มาจากสถาบันวิทยาศาสตร์สัตว์ทดลอง (ปักกิ่ง ประเทศจีน) หนูตะเภาถูกเลี้ยงแยกกันในห้องควบคุมอุณหภูมิภายใต้สภาวะห้องปฏิบัติการมาตรฐาน โดยมีวงจรแสง 12 ชม./มืด 12 ชม. (เปิดไฟเวลา 9:00 น. ถึง 21:00 น.) พร้อมกับ อุณหภูมิคงที่ (23 ± 3 องศา ) และความชื้น (50 ± 10 เปอร์เซ็นต์ ) พื้นที่แยกต่างหาก (วงกลมเส้นผ่านศูนย์กลาง 1 ซม.) ที่ด้านหลังของสัตว์แต่ละตัวได้รับรังสี UVB 500 mJ/ cm2 (Sigma SH-4, เซี่ยงไฮ้, จีน) วันละครั้งเป็นเวลา 1 สัปดาห์ (Fujimoto et al., 1988; ลี และคณะ, 2556). จากนั้นกระสายยา (PEG400/ EtOH 7:3) และ FGIN-1-27 (1 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกให้แก่บริเวณที่มีเม็ดสีมาก (สารละลาย 20 ul ต่อวงกลม) สองครั้งต่อวันเป็นเวลา 3 สัปดาห์ ระดับของเม็ดสีถูกวัดโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (YS3010, 3nh, เซินเจิ้น, จีน) ค่า ΔL ถูกกำหนดตามค่า L ที่วัดโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ ดังนี้: ΔL L (ที่วัดในแต่ละวัน)-L (ที่วันที่ 0) ขั้นตอนสัตว์ทั้งหมดสำหรับการศึกษานี้ดำเนินการตาม "คู่มือ NIH สำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง" และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยฉางโจว

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์

FGIN-1-27 ยับยั้ง -MSH, OAG หรือ ET-1-กระตุ้นการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ SK-MEL-2

ก่อนตรวจสอบผลกระทบของ FGIN-1-27 (รูปที่ 1A) ต่อการสร้างเม็ดสี การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลกระทบของ FGIN-1-27 ต่อการเติบโตของเซลล์ SK-MEL-2 ดังที่แสดงในรูปที่ 1B FGIN-1-27 ไม่มีผลต่อการเติบโตของเซลล์ SK-MEL- 2 ที่ช่วงการให้ยา 1–16 ไมโครโมลาร์หลังจาก 48 ชั่วโมง ในการทดสอบปริมาณเมลานิน FGIN-1-27 ยับยั้งการสร้างเม็ดสีพื้นฐาน (รูปที่ 1C) -MSH เป็นลิฟต์ของค่ายภายในเซลล์ ซึ่งกระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสอย่างมีนัยสำคัญ (Rzepka et al., 2016; Corre et al., 2004; Lee et al., 2013) FGIN-1-27 ยังยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก MSH (รูปที่ 1C) การย้อมด้วยแอมโมเนียแคลสีเงินของ Masson–Fontana อย่างสม่ำเสมอบ่งชี้ว่า FGIN-1-27 ลดความเข้มข้นของเมลานินในเซลล์ SK-MEL-2 อย่างมีนัยสำคัญโดยมีหรือไม่มี -MSH (รูปที่ 1D) นอกจากนี้ OAG ยังเป็นลิฟต์ของ PKC และ ET-1 เป็นตัวกระตุ้นของเส้นทาง MAPK ซึ่งทั้งสองอย่างนี้สามารถส่งเสริมการสังเคราะห์เมลานิน (Kim et al., 2006; Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2558). ดังที่แสดงในรูปที่ 1E และ 1F, FGIN-1-27 ยังยับยั้ง OAG หรือ ET{34}}ที่เหนี่ยวนำให้เกิดเมลาโนเจเนซิสอย่างชัดเจน

FGIN-1-27 ระงับการแสดงออกของ Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 และลดกิจกรรม Cellular Tyrosinase

การสร้างเมลาโนเจเนซิสถูกควบคุมโดยเอนไซม์ที่สำคัญ 3 ชนิด ได้แก่ ไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 (Zhu et al., 2015) -MSH และ ET-1 ส่งเสริมการสังเคราะห์เมลานินโดยเพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์สร้างเม็ดสีที่สำคัญ 3 ชนิด (Regazzetti et al., 2015; Lee et al., 2013) ในการตรวจสอบว่าผลการฟอกสีฟันของ FGIN-1-27 เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของโปรตีนเหล่านี้หรือไม่ เราศึกษาผลของ FGIN-1-27 ต่อการแสดงออกของไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP{{10 }} ผ่านการวิเคราะห์แบบ Western-blot ดังที่แสดงในรูปที่ 2A FGIN-1-27 ยับยั้งการแสดงออกของไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 โดยมีหรือไม่มี -MSH FGIN-1-27 ยังกลับรายการ ET-1- เหนี่ยวนำไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 ที่เพิ่มขึ้นอย่างสม่ำเสมอ (รูปที่ 2B) ซึ่งแตกต่างจาก -MSH และ ET-1 OAG ส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยเพิ่มกิจกรรมไทโรซิเนสของเซลล์โดยตรง (D'Mello et al., 2016) ดังแสดงในรูปที่ 2C และ 2D การบำบัดด้วย FGIN-1-27 12 ชั่วโมงยับยั้งการเพิ่มกิจกรรมไทโรซิเนสของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย OAG และไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของไทโรซิเนส นอกจากนี้ การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ดได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลกระทบโดยตรงของ FGIN-1-27 ต่อกิจกรรมไทโรซิเนส ดังแสดงในรูปที่ 2E FGIN-1-27 ไม่ส่งผลต่อการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสของเห็ด ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า FGIN-1-27 ยับยั้งการแสดงออกของไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 และลดกิจกรรมของไทโรซิเนสระดับเซลล์ แต่ไม่มีผลโดยตรงต่อกิจกรรมของเอนไซม์ของไทโรซิเนส

FGIN-1-27 ลดนิพจน์ MITF

MITF เป็นปัจจัยการถอดรหัสหลักที่กระตุ้นการแสดงออกของไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 (Kawasaki et al., 2008; Levy and Fisher, 2011) ดังแสดงในรูปที่ 3A FGIN-1-27 ยับยั้งการถอดความ MITF เรายังวัดการแสดงออกของ MITF หลังจากเซลล์ SK-MEL-2 ได้รับการบำบัดด้วย -MSH เมื่อมีหรือไม่มี FGIN-1-27 ดังที่แสดงในรูปที่ 3B -MSH ส่งเสริมการแสดงออกของ MITF อย่างมีนัยสำคัญ น่าสนใจ การแสดงออกของ MITF ลดลงอย่างมากเมื่อมี FGIN-1-27 FGIN-1-27 ยังยับยั้ง ET-1-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของ MITF อย่างต่อเนื่อง (รูปที่ 3C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า FGIN-1-27 ยับยั้งการแสดงออกของ MITF

FGIN-1-27 ลดการแสดงออกของ PKC- , p-PKA Cat, p-CREB, p-p38 และ p-ERK

PKA, PKC และ MAPK เป็นเส้นทางการถ่ายทอดที่สำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิส (D'Mello et al., 2016) ค่ายผู้ส่งสารที่สองสามารถเปิดใช้งาน PKA ซึ่ง phosphorylates CREB ส่งเสริมการแสดงออกของ MITF ในที่สุด (Corre et al., 2004; Rzepka et al., 2016) วิถี PKC- -ที่ขึ้นอยู่กับการควบคุมการสร้างเมลาโนเจเนซิสผ่านการกระตุ้นของไทโรซิเนส (Kim et al., 2006; Kawaguchi et al., 2012; Yuan and Jin, 2018) มีรายงานว่า MAPK รวมถึง p38, โปรตีนไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK) และ c-jun N-terminal kinase (JNK) เพื่อควบคุมการสร้างเม็ดสี (Zhou et al., 2014) เพื่อให้เข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลของการควบคุมการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดย FGIN-1-27 เราได้วัดเส้นทางการถ่ายโอนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี ดังที่แสดงในรูปที่ 4 FGIN-1-27 ลดการแสดงออกของ PKC- , p-PKA cat, p-CREB, p-p38 และ p-ERK อย่างเห็นได้ชัด

FGIN-1-27 ยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนไซต์ของมนุษย์

การยับยั้ง FGIN-1-27 ต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสได้รับการประเมินในเซลล์เมลาโนไซต์ผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์ (HEM) ดังที่แสดงในรูปที่ S1 เพิ่มเติม FGIN-1-27 ไม่มีผลต่อการเจริญเติบโตของ HEM ที่ช่วงการให้ยา 1–16 ไมโครโมลาร์หลังจาก 48 ชั่วโมง ดังที่แสดงในรูปที่ 5A FGIN-1-27 ยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสใน HEM อย่างมีนัยสำคัญ การวิเคราะห์แบบ Western blotting ชี้ให้เห็นว่า FGIN-1-27 ลดระดับการแสดงออกของไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 ใน HEM (รูปที่ 5B) ดังที่แสดงในรูปเพิ่มเติม S2 การรักษา FGIN- 1-27 12 ชั่วโมงยับยั้งการเพิ่มขึ้นของกิจกรรมไทโรซิเนสของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย OAG ใน HEM นอกจากนี้ เรายังวัดการแสดงออกของ MITF หลังจาก HEM บำบัดด้วย -MSH เมื่อมีหรือไม่มี FGIN-1-27 ดังที่แสดงในรูปที่ 5C การแสดงออกของ MITF ลดลงอย่างมากเมื่อมี FGIN-1-27 นอกจากนี้ เช่นเดียวกับในเซลล์ SK-MEL-2 การมีส่วนร่วมของ PKC- , PKA และ MAPK ใน FGIN-1-27-สารต้านการสร้างเม็ดสีที่เป็นสื่อกลางก็ได้รับการยืนยันใน HEM (รูปที่ 5D)

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501