การประเมินผลของ Calcium Alginate Airgel แบบรับประทานเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้และการทำงานของตับและไตของหนู Wistar

ติดต่อ:ali.ma@wecistanche.com

โมฮัมหมัด AA Al-Najjar et al

เชิงนามธรรม

การศึกษานี้ประเมินผลของแคลเซียมอัลจิเนตแอโรเจลในฐานะพาหะยาที่มีศักยภาพในตับและการทำงานของไตและจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูไวสตาร์ การศึกษา alginate airgel จัดทำขึ้นในรูปของอนุภาคนาโนโดยใช้เทคนิคการตัดแบบเจ็ต และมีลักษณะเฉพาะในแง่ของพื้นที่ผิวจำเพาะ ลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายนอก และการกระจายขนาดอนุภาค สำหรับการศึกษาในร่างกาย ให้แคลเซียมอัลจิเนตแอโรเจลและตับและการทำงานของไตได้รับการทดสอบเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์และสี่สัปดาห์ในสองการศึกษาที่แตกต่างกัน ในระหว่างการศึกษา ในร่างกาย ในระยะสั้น ตัวอย่างอุจจาระถูกรวบรวมสำหรับการสกัด DNA ของแบคทีเรีย ตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับยีน 16S rRNA เพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้ ผลการวิจัยพบว่า แอลจิเนตแอโรเจลที่เตรียมไว้มีพื้นที่ผิวจำเพาะ BET เฉลี่ยประมาณ 540 ตร.ม./กรัม โดยมีปริมาตรรูพรุน 7.4 ซีซี/กรัม และความกว้างของรูพรุน 30-50 นาโนเมตร จากการศึกษาในร่างกายพบว่าระดับของการศึกษาไตและเอนไซม์ตับไม่เกินระดับสูงสุดของช่วงปกติ การศึกษาจุลินทรีย์ในลำไส้แสดงให้เห็นรูปแบบที่แตกต่างกัน แบคทีเรียบางกลุ่ม เช่น Clostridia และ Bacteriodia เพิ่มขึ้นในช่วงแอโรเจลระบอบการปกครองและเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องหลังจากหยุด airgel ขณะที่กลุ่มอื่นๆ เช่น Erysipelotricia และ Candidatus Sacha แบคทีเรียเพิ่มขึ้นในช่วงแอโรเจลการรักษาแล้วลดลงอีกครั้งหลังจากผ่านไปหนึ่งเดือน สมาชิกของกลุ่ม Bacilli มีแนวโน้มเฉพาะ นั่นคือ หลังจากที่เป็นกลุ่มที่มีมากที่สุด (63 เปอร์เซ็นต์) ในเวลา 0 ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของพวกเขาลดลงอย่างมากจนกระทั่งถึง < 5="" เปอร์เซ็นต์;="">

Cistancheป้องกันท่อทูบูโลซ่าไตโรค ผลข้างเคียง cistanche คลิก.

บทนำ

แอโรเจลคำศัพท์เกิดขึ้นเป็นครั้งแรกในปี 1931 โดยซามูเอล คิสเลอร์ ผู้ซึ่งนิยามคำศัพท์เหล่านี้เป็นวัสดุที่คงรูพรุนและโครงสร้างเครือข่ายไว้เหมือนเดิมเมื่อแลกเปลี่ยนของเหลวในรูพรุนกับแก๊ส [1] หลังจาก 60 ปีของการค้นพบ ออร์แกนิคแอโรเจลได้รับการเสนอสำหรับการใช้งานทางชีวการแพทย์และการนำส่งยาเนื่องจากพื้นที่ผิวด้านในขนาดใหญ่และโครงสร้างรูพรุนเปิด [2] คุณสมบัติที่โดดเด่นของประเภทวัสดุนี้ไม่เพียงแต่เพิ่มประสิทธิภาพในการโหลด แต่ยังปรับปรุงการดูดซึม ความเสถียร และการปล่อยจลนศาสตร์ของโมเลกุลที่โหลด

วิจัยเกี่ยวกับแอโรเจลสำหรับการบริหารยาในช่องปากเริ่มแรกเน้นการใช้ซิลิกาแอโรเจลเนื่องจากคุณสมบัติทางเคมีของโซลเจลที่ยืดหยุ่นและเป็นที่รู้จักกันดี เช่นเดียวกับความเป็นไปได้ในการทำให้เกิดอนุพันธ์ [3] อย่างไรก็ตาม การใช้ซิลิกาแอโรเจลในสูตรผสมทางเภสัชกรรมที่ออกแบบมาสำหรับการบริหารให้ทางปากยังคงก่อให้เกิดความกังวลบางประการเนื่องจากความสามารถในการย่อยสลายทางชีวภาพที่จำกัดของพวกมัน ดังนั้นจึงมีความจำเป็นต้องพัฒนาตัวพา airgel ที่เข้ากันได้ทางชีวภาพและย่อยสลายได้ทางชีวภาพ อาจเป็นไปได้โดยใช้วัสดุอินทรีย์ธรรมชาติหรือโพลีเมอร์ที่ย่อยสลายได้ทางชีวภาพ เช่น แอลจิเนต [4] กรดไฮยาลูโรนิก [5] ไคโตซาน เซลลูโลส [6] และโปรตีน [7]

แอลจิเนต (Alg) ที่สกัดจากสาหร่ายสีน้ำตาลเป็นโคพอลิเมอร์เชิงเส้นที่ประกอบด้วย ß-1,4-กรด D-mannuronic และโมโนเมอร์ของกรด -L-guluronic ซึ่งมีรูปแบบคล้ายบล็อกเหมือนกันหรือต่างกันกระจาย . มีการใช้แอลจิเนตในอุตสาหกรรมอาหารและยาเพราะไม่มีพิษ ราคาไม่แพง ย่อยสลายได้ทางชีวภาพ และเข้ากันได้ทางชีวภาพ [8, 9] ไอออนบวกหลายไอออน เช่น Ca2 plus , Ba2 plus หรือ Sr2 plus สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามไอออนของ Alg โดยเปลี่ยนจากรูปแบบที่ละลายได้ไปเป็นรูปแบบที่ไม่ละลายน้ำ (เจล)

Alg มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในผลิตภัณฑ์อาหารและเป็นสารเติมแต่งทางเภสัชกรรม เช่น สารก่อเจลและสารช่วยแตกตัวของยาเม็ด [10, 11] มันยังถูกใช้ในงานด้านชีวการแพทย์ รวมถึงการนำส่งยาและวิศวกรรมเนื้อเยื่อ [12] เช่นเดียวกับเส้นใยอาหารอื่นๆ ที่กินได้ Alg และอนุพันธ์ของโอลิโกเมอร์ของ Alg มีความทนทานต่อการย่อยด้วยเอนไซม์ภายในร่างกายของมนุษย์ อย่างไรก็ตาม จุลินทรีย์ในลำไส้ของมนุษย์สามารถย่อยได้อย่างมีนัยสำคัญ [13] แม้จะมีความสำคัญ แต่ก็ยังไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับจุลินทรีย์ในลำไส้ซึ่งมีหน้าที่ในการย่อยสลาย Alg

หน่วยงานความปลอดภัยด้านอาหารแห่งยุโรป (EFSA) ได้ประกาศความปลอดภัยของกรดอัลจินิกและเกลือของกรด รวมถึงผลิตภัณฑ์จากการหมัก การทดสอบในร่างกายสำหรับการดูดซึมและการขับถ่ายของสารละลายในน้ำและสารแขวนลอยของกรดอัลจินิกและเกลือของกรดอัลจินิกในสัตว์แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์เหล่านี้ไม่สามารถดูดซึมหรือเผาผลาญในทางเดินอาหารได้โดยไม่คำนึงถึงรูปแบบที่ใช้ระหว่างการบริหาร อย่างไรก็ตาม พวกมันจะถูกย่อยสลายบางส่วนโดยการหมักในระหว่างที่พวกมันเคลื่อนผ่านลำไส้ใหญ่โดยการกระทำของจุลินทรีย์ในลำไส้ที่ไม่ใช้ออกซิเจน ทำให้เกิดการขยายตัวของ Caecal ซึ่ง EFSA พิจารณาว่าเป็นกระบวนการปรับตัวที่เกี่ยวข้องกับปริมาณสูงที่ทดสอบว่าเป็นวัตถุเจือปนอาหาร [14] . อย่างไรก็ตาม ไม่มีการศึกษาในร่างกายก่อนหน้านี้ที่ตรวจสอบผลของแคลเซียมอัลจิเนต (Ca-Alg) ในรูปแบบของแอโรเจลต่อตับ, ไต,หรือกลุ่มแบคทีเรียในลำไส้

Gut microbiota เป็นส่วนประกอบสำคัญของระบบย่อยอาหารของมนุษย์ เนื่องจากช่วยในการย่อยสลายอาหารที่กินเข้าไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ร่างกายมนุษย์ไม่มีเอ็นไซม์ที่จำเป็น [15, 16] จุลินทรีย์ในลำไส้ยังสามารถยับยั้งการบานของจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคได้ด้วยการแข่งขันกับพวกมันในทรัพยากรของสารอาหาร หรือโดยการผลิตสารเคมีเพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์เหล่านั้น อย่างไรก็ตาม มีการแสดงให้เห็นว่าการย่อยสลายของเส้นใยที่ย่อยได้ เช่น Alg ส่วนใหญ่เกิดจากแบคทีเรียหมักในลำไส้ใหญ่ [17] ผลิตภัณฑ์ของกระบวนการนี้คือกรดไขมันสายสั้น (SCFA) ซึ่งมีประโยชน์ต่อการอักเสบของลำไส้ใหญ่และทำหน้าที่เป็นสารต้านมะเร็ง Brownlee และคณะ รายงานว่าการฟักตัวของ Alg และจุลินทรีย์ในอุจจาระของมนุษย์แสดงให้เห็นว่าการเสื่อมสภาพของ Alg ส่วนใหญ่มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงในจุลินทรีย์ในลำไส้ นอกจากนี้ การฟักตัวดังกล่าวจะนำไปสู่การผลิต SCFA และก๊าซหลังจาก 24 ชั่วโมง [17]

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

เกลือโซเดียมของกรดอัลจินิกจัดทำโดย BASF ประเทศเยอรมนี แคลเซียมคลอไรด์ (CaCl2) ซื้อมาจาก Th. Geyer GmbH & Co. KG ประเทศเยอรมนี ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (ความบริสุทธิ์ 99.5 เปอร์เซ็นต์) ถูกจัดหาโดยแพรกซ์แอร์ (ประเทศเยอรมนี) เอทานอล 99.8 เปอร์เซ็นต์ได้มาจากคาร์ล โรท (ประเทศเยอรมนี) ใช้สารเคมีทั้งหมดตามที่ได้รับ ชุดตรวจวินิจฉัยเชิงพาณิชย์ใช้เพื่อวัด ALP และซื้อชุดครีเอตินีนจาก Biostsystems SA ประเทศสเปน ชุดแยก DNA PowerMax SoilDNA ของ MO BIO ถูกซื้อจาก MO BIO Laboratories สหรัฐอเมริกา ใช้น้ำปราศจากไอออนตลอดการศึกษา

วิธีการ

การเตรียมอนุภาคแอโรเจล

ขั้นตอนแรกในการเตรียมอนุภาคแอโรเจลคือการเตรียมสารละลายสต็อค สำหรับผงโซเดียมแอลจิเนต (Alg) นั้นถูกเติมลงในน้ำกลั่นที่ความเข้มข้น 1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก และถูกเก็บไว้ภายใต้การกวนด้วยแม่เหล็กข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง เพื่อเตรียมอนุภาคไฮโดรเจล วิธีการที่อธิบายโดย Preibisch et al. [18] ถูกติดตาม โดยใช้ Jet Cutter Type S จาก genia Lab, Braunschweig (เยอรมนี) ในกระบวนการตัดด้วยเจ็ทคัท สารละลายแอลจิเนตถูกขับออกทางหัวฉีด (เส้นผ่านศูนย์กลาง 350 ไมโครเมตร) โดยลมอัด (1–3 บาร์) เพื่อสร้างไอพ่น (อัตราการไหลของมวล 1 กรัม/วินาที) เครื่องบินเจ็ตถูกตัดในอนุภาคแยกด้วยจานหมุน (40 สายที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางลวด 100 ไมโครเมตรของจานตัด อัตราส่วนกระบอกสูบ 5) หลังจากผ่านแผ่นดิสก์ สารละลายโพลีเมอร์จะตกลงไปในอ่างเจลที่มีสารละลาย CaCl2 5 กรัม/ลิตร เพื่อหลีกเลี่ยงการรวมตัวของอนุภาคเจล ปริมาตรของอ่างเจลมีอย่างน้อยสี่เท่าของปริมาตรรวมของสารละลายไบโอโพลีเมอร์ที่ผ่านกระบวนการแปรรูป และเนื้อหาของอ่างจะถูกกวนด้วยแท่งแม่เหล็ก (60 รอบต่อนาที) ระยะห่างระหว่างหัวฉีดและอ่างเจลอยู่ที่ 50–70 ซม. หลังจากรวบรวมอนุภาคเจล กวนต่อเป็นเวลา 60 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าเจลสมบูรณ์และเพื่อหลีกเลี่ยงการรวมตัว จากนั้นอนุภาคที่เป็นเจลถูกแยกออกจากอ่างเจลด้วยการกรองและถูกดำเนินการเพื่อการแลกเปลี่ยนตัวทำละลาย

การแลกเปลี่ยนตัวทำละลาย (น้ำเป็นเอทานอล) ถูกดำเนินการบนอนุภาคที่เก็บรวบรวมแบบขั้นตอน (30,60, 90, 100 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร/ปริมาตร เอทานอล) เพื่อให้แน่ใจว่ามีการแลกเปลี่ยนที่สมบูรณ์ ความหนาแน่นของของเหลวที่แช่หลังจากขั้นตอนการแลกเปลี่ยนตัวทำละลายสุดท้ายถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดความหนาแน่น (DMA4500, Anton PaarCompany, Austria) จากนั้นจึงคำนวณความหนาแน่นใหม่เป็นปริมาณเอทานอล อนุภาคแอลโคเจลที่เป็นผลลัพธ์ถูกบรรจุลงในกระดาษกรองในที่สุด และทำให้แห้งด้วย CO2 วิกฤตยิ่งยวดในหม้อนึ่งความดันที่อุณหภูมิคงที่ 50˚C และความดัน 120 บาร์ กำหนดอัตราการไหลต่อเนื่องของ CO2 (20–80 กรัม/นาที) จนกระทั่งสกัดเอทานอลจนเสร็จ (2–4 ชั่วโมง) หลังจากนั้น ได้ดำเนินการลดแรงดันของหม้อนึ่งความดันอย่างช้าๆ (1–3 บาร์/นาที) เมื่อถึงความดันแวดล้อม หม้อนึ่งความดันถูกเปิดและไมโครสเฟียร์ของแอโรเจลของแคลเซียม แอลจิเนต (ซึ่งแสดงเป็น Ca-Alg ต่อไปนี้) ถูกรวบรวมและเก็บไว้ในภาชนะที่ปิดสนิทภายใต้สภาวะแห้ง

ลักษณะของอนุภาคแอโรเจล

พื้นที่ผิวจำเพาะของอนุภาคแอโรเจลถูกวัดผ่านการดูดซับ/การดูดซับไนโตรเจนที่อุณหภูมิต่ำ (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Germany และ Micromeritics TriStar II 3020, Germany) ก่อนการวัด ตัวอย่างถูกทำให้แห้งเป็นเวลา 20 ภายใต้สุญญากาศ (< 1="" mpa)="" at="">

การตรวจสอบสัณฐานวิทยาภายนอกของอนุภาคแอโรเจลที่เตรียมไว้นั้นดำเนินการผ่านการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM) (Zeiss Supra VP55, Jena, Germany) ที่แรงดันความเร่ง 3 kV และระยะการทำงาน 9.0– 9.4 มม. ตัวอย่างถูกเคลือบด้วยทองคำ (ความหนา 10 นาโนเมตร) ก่อนการถ่ายภาพเพื่อลดการชาร์จและปรับปรุงความคมชัดของภาพ

การวัดการกระจายขนาดอนุภาคดำเนินการสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่างซึ่งประกอบด้วยอนุภาคประมาณ 10000 อนุภาค การวิเคราะห์ภาพแบบไดนามิกดำเนินการโดยใช้ aCamsizer XT พร้อมโมดูล X-Jet (Retsch GmbH ประเทศเยอรมนี) ที่มีแรงดันอากาศที่ 50 kPa

การทำงานของตับและไต และการศึกษาเกี่ยวกับจุลินทรีย์ในลำไส้

การศึกษานำร่องได้ดำเนินการกับสัตว์จำนวนไม่มากที่แบ่งออกเป็นกลุ่มต่างๆ เพื่อให้ครอบคลุมสารบำบัดที่มีขนานยาสี่ระดับ ดำเนินการในช่วงเวลาสั้น ๆ (1 สัปดาห์) เพื่อดูปริมาณสูงสุดที่เป็นไปได้ของ Ca-Alg aerogels ที่ไม่มีผลกระทบสำคัญต่อการทำงานของไตหรือตับ และไม่แสดงสัญญาณของการเจ็บป่วยหรือการตาย ปริมาณถูกเลือกอย่างรอบคอบโดยพิจารณาจาก LD50 ทางปากที่รายงานของอัลจิเนต (มากกว่า 5,000 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) [19] ถึงกระนั้น ปริมาณยาสูงสุดที่เป็นไปได้ที่ไปถึงโดยมีการกวนสัตว์น้อยที่สุดคือ 2,000มก./กก. ของน้ำหนักตัว

ในส่วนที่สองของการศึกษา สัตว์เหล่านี้ได้รับยาในปริมาณคงที่เป็นเวลาสองสัปดาห์ เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงอายุและน้ำหนักและสภาพการเลี้ยงในระหว่างการศึกษานี้ แนวทางขององค์การเพื่อความร่วมมือทางเศรษฐกิจและการพัฒนา (OECD) ได้ปฏิบัติตาม (รหัสหมายเลข 206) โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรม (IRB หมายเลขการอนุมัติ: 2019-PHA-12 แนบมากับไฟล์ S1) ของ Applied Science Private University (ASU) ประเทศจอร์แดน เจ้าหน้าที่ทุกคนในโรงเลี้ยงสัตว์ที่ ASU ได้รับการฝึกอบรมมาอย่างดีเพื่อติดตามการเปลี่ยนแปลงใดๆ ที่อาจเกิดขึ้นกับสัตว์อันเป็นผลมาจากการแทรกแซง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง พวกเขาตรวจสอบพารามิเตอร์ต่างๆ เช่น การเปลี่ยนแปลงของน้ำหนัก พฤติกรรมที่ผิดปกติ ขนเป็นขุย การเคลื่อนไหวที่ลดลง ท่าทางของร่างกาย หรือการแสดงออกของเครื่องหมายของเหลวในร่างกายที่เฉพาะเจาะจง ในกรณีที่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างร้ายแรงในสถานะสัตว์ พวกเขาสามารถใช้โปรโตคอลจุดสิ้นสุดที่มีมนุษยธรรมซึ่งได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมที่ ASU ในตอนท้ายของการทดลอง หนูถูกกำจัดโดย exsanguination ภายใต้การดมยาสลบโดยใช้โซเดียมไธโอเพนทอล 2.5 เปอร์เซ็นต์ (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) ที่ 20 มก./กก. ทางหลอดเลือดดำ

สัตว์

ในการศึกษาทั้งระยะสั้นและระยะยาวในสัตว์ทดลอง หนู Wistar Rat ที่มีสุขภาพดีอายุสิบสัปดาห์ที่มีน้ำหนักเฉลี่ย 240 ± 37 กรัม ถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิ 21–23 ˚C และความชื้น 35 เปอร์เซ็นต์ –70 เปอร์เซ็นต์ ในห้องควบคุมด้วยแสง 12 ชม. – รอบมืด 12 ชม. หนูถูกระบุและจัดแยกไว้ในกรงแบบใสเพื่อให้สังเกตได้ง่ายโดยไม่รบกวนพฤติกรรมของหนู เศษไม้ใช้เป็นเครื่องนอน หนูได้รับอาหารที่มีขายตามท้องตลาด (คีมจับอาหารในท้องที่ ประเทศจอร์แดน) และให้น้ำจืดฟรี

จำนวนหนูต่อกลุ่มในการทดลองต่างๆ ได้รับการคัดเลือกตามผลงานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ (ตัวอย่าง; [20-22]) และขึ้นอยู่กับกฎระเบียบที่เข้มงวดเกี่ยวกับ "การดูแลและการใช้สัตว์" ในระดับประเทศและระดับสากล ซึ่งเน้นที่การลด จำนวนสัตว์ที่ใช้ในการศึกษาวิจัย ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง "โปรแกรมการดูแลและการใช้สัตว์" ที่มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เบิร์กลีย์ (https://acuc.berkeley.edu/about.html) และแนวทางการใช้สัตว์ของนอร์เวย์ (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/)

การศึกษานำร่องในร่างกาย (7 วันซ้ำปริมาณ)

ให้ยารับประทานซ้ำเป็นระยะเวลาหนึ่งสัปดาห์เพื่อกำหนดขนาดยาสูงสุดที่เป็นไปได้ของแอโรเจล ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความปลอดภัยในหนู Wistar Ca-Alg airgel ถูกบริหารให้ทางปากที่ระดับขนาดยา 50, 100, 250 และ 500 มก. ในขนาดยาเฉลี่ย 200, 400,1000 และ 2000 มก./กก. (น้ำหนักตัวโดยน้ำหนัก) ตามลำดับ ผลลัพธ์ถูกเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวกสองกลุ่มที่ได้รับโซเดียม แอลจิเนต (Na-Alg) บริสุทธิ์ 50 และ 500 มก. ซึ่งสัมพันธ์กับระดับขนาดยาเฉลี่ย 200 และ 2,000 มก./กก. ของน้ำหนักตัวตามลำดับ ในที่สุด กลุ่มก่อนหน้าของการรักษาด้วย Ca-Alg airgel และ Na-Alg ทั้งหมดถูกอ้างอิงถึงกลุ่มควบคุม (ยาหลอก) กลุ่มหลังได้รับบัฟเฟอร์ฟอสเฟตในขนาดยาที่เทียบเท่ากับขนาดยาสูงสุดเมื่อถูกบริหารให้เป็นระบบพาหะสำหรับสารทดสอบ กลุ่มควบคุมและบำบัดสำหรับการศึกษานำร่องประกอบด้วยหนู 4 ตัว/กลุ่ม (ตัวเมีย 2 ตัวและตัวผู้ 2 ตัว/กลุ่ม) ผงแข็งของ Ca-Alg airgel และ Na-Alg ถูกแขวนลอยตามลำดับในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 7.4) และผสมให้เข้ากันโดยตรงก่อนการให้ยาทางปาก เนื่องจากหนูปฏิเสธที่จะกินพวกมันในสภาพแห้ง สำหรับทุกกลุ่ม การให้ยาแก่หนูในเวลาเดียวกันทุกวันโดยใช้สายยางทางปาก

การศึกษาการสัมผัสร่างกายในระยะยาว (การศึกษาปริมาณรังสีซ้ำ 15 วัน)

จากผลลัพธ์จากส่วนก่อนหน้า เลือกขนาด 250 มก. ของ Ca-Alg airgel เพื่อรับการประเมินเพิ่มเติมสำหรับการศึกษาการสัมผัสสารในระยะยาว (15 วัน) หนู Wistar ถูกสังเกตพบสำหรับอาการไม่พึงประสงค์จากไตและ/หรือตับในทันทีหรือล่าช้า ผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นเมื่อสัมผัสกับ Ca-Alg airgel หรือเมื่อสัมผัสกับ Na-Alg ตามลำดับ ของ. สำหรับสารที่ทดสอบแต่ละชนิด ใช้กลุ่มสัตว์สามกลุ่มซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุม การบำบัด และกลุ่มดาวเทียม กลุ่มควบคุมประกอบด้วยหนู Wistar 6 ตัว/กลุ่ม (ตัวผู้ 3 ตัวเมีย 3 ตัว) ในขณะที่กลุ่มที่รักษาและกลุ่มดาวเทียมประกอบด้วยหนู Wistar 10 ตัว/กลุ่ม (ตัวผู้ 5 ตัวและตัวเมีย 5 ตัว) หนู Wistar ในกลุ่มบำบัดได้รับปริมาณสารทดสอบ 250 มก. (Ca-Alg airgel หรือ Na-Alg) ทุกวันเป็นเวลา 15 วันและเสียสละในวันที่ 16 ในขณะที่กลุ่มดาวเทียมได้รับการรักษาในระยะเวลาเดียวกัน เช่นเดียวกับกลุ่มการรักษา แต่ถูกเก็บไว้ภายใต้การสังเกตเพิ่มเติม 15 วันหลังการรักษา และพวกเขาเสียสละในวันที่ 30

เป็นมูลค่าการกล่าวขวัญว่าเป็นไปไม่ได้ที่จะทำการศึกษาทั้งสองของ Ca-Alg airgel และ Na-Alg ควบคู่กันไป ด้วยเหตุนี้จึงไม่สะดวกที่จะใช้กลุ่มควบคุมเดียวสำหรับทั้งสองกลุ่ม กลุ่มควบคุมเหล่านี้ได้รับบัฟเฟอร์ฟอสเฟตทางปากเป็นเวลา 15 วันเท่านั้น และต่อมาถูกเฝ้าติดตามเป็นเวลา 14 วันต่อไป จากการทดลองในระยะสั้น ผงของแข็งของ Ca-Alg airgel และ Na-Alg ยังถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 7.4) และผสมกันโดยตรงก่อนการบริหารช่องปาก สำหรับทุกกลุ่ม การบริหารให้หนูเริ่มในเวลาเดียวกันทุกวันโดยใช้สายยางทางปาก

การสังเกตทางคลินิกและพฤติกรรม

ตามแนวทางของ OECD 407 สัตว์ได้รับการตรวจสอบทุกวันสำหรับอาการทางคลินิกที่ผิดปกติใดๆ หรือการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมในช่วงระยะเวลาการศึกษา โดยให้ความสนใจเป็นพิเศษในช่วงสี่ชั่วโมงแรกหลังการให้สารทดสอบ สัตว์ในกลุ่มดาวเทียมและกลุ่มควบคุมถูกสังเกตพบเพิ่มเติมอีก 15 วันโดยไม่มีการบริหารให้บำบัด กลุ่มดาวเทียมช่วยให้สามารถตรวจหาสัญญาณทางคลินิกใดๆ ที่เกิดขึ้นในช่วงปลายๆ ที่บ่งชี้ถึงผลกระทบของตับและ/หรือไต ผ่านการวัดระดับอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และครีเอตินีน

การวิเคราะห์ชีวเคมีและอุจจาระในซีรัม

สเปน. เก็บตัวอย่างเลือดจากเส้นเลือดไซนัสโคจรของหนู Wistar ซึ่งจากนั้นก็นำไปใช้เพื่อแยกซีรั่ม เซรั่มที่เก็บรวบรวมจากตัวอย่างนี้ถูกถ่ายโอนไปยังหลอด Eppendorf ที่ปลอดเชื้อและเก็บไว้ในช่องแช่แข็งลึกเพื่อทดสอบพารามิเตอร์ทางชีวเคมีเพิ่มเติม เก็บตัวอย่างอุจจาระทุกวันที่สองเพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างชุมชนจุลินทรีย์ อุจจาระถูกรวบรวมในหลอดปิดฝาเกลียวขนาด 15 มล. ปลอดเชื้อและถูกเก็บไว้โดยตรงที่ -20˚C จนกระทั่งตัวอย่างทั้งหมดถูกรวบรวม สำหรับการศึกษาขนาดยาซ้ำ 15-วัน เฉพาะตัวอย่างเลือดที่ถูกเก็บเป็นรายสัปดาห์เพื่อวัดระดับของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และครีเอตินีน นั่นคือในวันที่ 0 วันที่ 7 วันที่ 14 วันที่ 21 และวันที่ 30 (วันที่ 21 และวันที่ 30 ใช้กับกลุ่มควบคุมและกลุ่มดาวเทียมเท่านั้น)

การวิเคราะห์ชุมชนจุลินทรีย์ในลำไส้

การสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างอุจจาระที่เก็บรวบรวมได้ดำเนินการโดยใช้ PowerMaxSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, USA) ของ MO BIO โดยทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต การทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) การทำให้บริสุทธิ์และการจัดลำดับของจีโนม DNA (gDNA) ได้ดำเนินการโดยใช้ Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, USA) การขยาย PCR ของยีน 16S rRNA และการจัดลำดับที่ตามมาทำได้โดยใช้ Illumina ไพรเมอร์ PCR ภูมิภาคแปรผัน 16SrRNA ยีน V4 ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R และ mod (GTNTTACGCGGCKGCTG) ที่มีบาร์โค้ดบนไพรเมอร์ไปข้างหน้าถูกใช้ใน 30 รอบโดยใช้ HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) หลังจากการขยายเสียง ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการตรวจสอบในเจลอะกาโรส 2 เปอร์เซ็นต์เพื่อตรวจสอบความสำเร็จของการขยายเสียงและความเข้มสัมพัทธ์ของแถบ

จากนั้นจึงนำผลิตภัณฑ์ PCR ที่รวมกลุ่มและทำให้บริสุทธิ์เพื่อเตรียมคลัง DNA ของ Illumina การจัดลำดับดำเนินการด้วย MR DNA ในการหาลำดับไมโครไบโอม (MiSeq) ตามแนวทางของผู้ผลิต ข้อมูลที่เรียงลำดับได้รับการประมวลผลโดยใช้ไปป์ไลน์การวิเคราะห์ MR DNA โดยสังเขป ลำดับถูกเชื่อมต่อ จากนั้นบาร์โค้ดหมด หลังจากนั้น ลำดับ <150 bpas="" และลำดับที่มีการเรียกฐานที่คลุมเครือจะถูกลบออก="" ลำดับถูกละทิ้งและหน่วยอนุกรมวิธานในการปฏิบัติงาน="" (outs)="" ถูกสร้างขึ้นและลบไคเมร่าออก="" otu="" ถูกกำหนดโดยการจัดกลุ่มที่ความแตกต่าง="" 3="" เปอร์เซ็นต์="" (ความคล้ายคลึงกัน="" 97="" เปอร์เซ็นต์)="" otu="" ขั้นสุดท้ายได้รับการจัดประเภทตามอนุกรมวิธานโดยใช้="" blastn="" เทียบกับฐานข้อมูลที่ได้รับการดูแลซึ่งมาจาก="" rdp-ii="" และ="" ncbi="" แพ็คเกจของการวิเคราะห์ทางสถิติต่างๆ="" ที่รวมอยู่ในซอฟต์แวร์="" "r"="" ถูกใช้สำหรับการจัดกลุ่มตามลำดับชั้น="" (เวอร์ชัน="" 3.5.1,="">