ตอนที่ Ⅰ: ผลของสารสกัด Cistanche Tubulosa ต่อการทำงานของระบบสืบพันธุ์เพศชายในหนูเบาหวานที่กระตุ้นด้วยสเตรปโตโซโตซิน-นิโคตินาไมด์

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He และ Shu-Chun Cheng

เชิงนามธรรม:โรคเบาหวานเป็นโรคเรื้อรังที่มีภาวะน้ำตาลในเลือดสูงเนื่องจากระดับอินซูลินลดลงหรือเนื้อเยื่อไม่สามารถใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพ ภาวะมีบุตรยากเป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นผลลัพธ์ที่สำคัญของโรคเบาหวานและส่งผลต่อระบบสืบพันธุ์เพศชายโดยทำให้เกิดการด้อยค่าของตัวอสุจิและความผิดปกติของอวัยวะสืบพันธุ์Cistanche tubulosaเป็นพืชกาฝากที่มีความสามารถในการปรับปรุงความจำ ภูมิคุ้มกัน และความสามารถทางเพศ ลดความอ่อนแอ และลดอาการท้องผูก การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่การตรวจสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบและการป้องกันของ echinacoside (ECH) ในสารสกัดจาก Cistanche tubulosa(CTE) เกี่ยวกับระบบสืบพันธุ์เพศชายของหนูเบาหวาน ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และป้องกันของ CTE ได้รับการประเมินโดยวิธีในหลอดทดลองและในร่างกาย ผลลัพธ์ในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่า ECH ยับยั้งการผลิตชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) และปรับปรุงการแสดงออกของโปรตีน StAR, CYP11A1, CYP17A1 และ HSD17p3 การวิเคราะห์ ภายในร่างกาย ดำเนินการด้วยอิชินาโคไซด์ (ECH) สามขนาด (80, 160 และ 320 มก./กก.) ใน CTE โดยรวมแล้ว 0.571 มก./กก. ของ rosiglitazone (RSG) ถูกบริหารให้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก โรคเบาหวานเกิดจากสเตรปโตโซโตซิน (STZ) (65 มก./กก.) และนิโคตินาไมด์ (230 มก./กก.) ร่วมกับอาหารที่มีไขมันสูง (45 เปอร์เซ็นต์) การศึกษาในร่างกายยืนยันว่า ECH ช่วยเพิ่มระดับน้ำตาลในเลือด ความต้านทานต่ออินซูลิน ความต้านทานต่อเลปติน และลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน มันสามารถฟื้นฟูคิสเปปติน 1 (KiSS1), G รีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีน GPR 54, ตัวยับยั้งการส่งสัญญาณไซโตไคน์ 3 (SOCS-3) และเซอร์ทูอิน 1 (SIRT1) การแสดงออกของกรดไรโบนิวคลีอิก (mRNA) ของผู้ส่งสารในไฮโปทาลามัสและฟื้นฟูเพศ ระดับฮอร์โมน ดังนั้นการศึกษานี้จึงยืนยันผลของสารต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และสเตียรอยด์ของ CTE

คำสำคัญ:โรคเบาหวาน; ภาวะมีบุตรยาก;สารสกัดจากซิสแทนเช่ ทูบูโลซ่า (CTE); อิไคนาโคไซด์ (ECH); กิจกรรมต้านการอักเสบ ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ผลของการสร้างสเตียรอยด์

การรักษาโรคเบาหวาน:สารสกัดจาก Cistanche tubulosa(ซีทีอี)

1. บทนำ

โรคเบาหวาน (DM) เป็นภาวะที่มีระดับน้ำตาลในเลือดเพิ่มขึ้นเนื่องจากตับอ่อนผลิตอินซูลินไม่เพียงพอหรือร่างกายไม่สามารถใช้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ จากข้อมูลของ WHO จำนวนผู้ป่วยโรคเบาหวานเพิ่มขึ้นจาก 108 ล้านคนในปี 1980 เป็น 422 ล้านคนในปี 2014 [1] มีสี่ประเภทหลัก: ก่อนเบาหวาน (ระยะก่อนเบาหวาน), ชนิดที่ 1 (ที่ตับอ่อนไม่สามารถผลิตอินซูลิน), ชนิดที่ 2 (ร่างกายล้มเหลวในการใช้อินซูลิน) และเบาหวานขณะตั้งครรภ์ (ซึ่งเกิดขึ้นระหว่างตั้งครรภ์) ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเกิดขึ้นเนื่องจากความไม่สมดุลระหว่างการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) และสารต้านอนุมูลอิสระ [2] ในที่สุดก็นำไปสู่ภาวะเบาหวาน ภาวะแทรกซ้อนของโรคเบาหวาน ได้แก่ ไตวาย เส้นประสาทถูกทำลาย ตาบอด โรคหลอดเลือดสมอง หัวใจวาย ทารกในครรภ์เสียชีวิต และภาวะมีบุตรยาก [1]. การศึกษาแสดงให้เห็นว่านิวเคลียสของอสุจิ, กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) และไมโตคอนเดรียได้รับความเสียหายอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยเบาหวานชาย [3] ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันระหว่างการขนส่งอสุจิจะเปลี่ยนแปลงกระบวนการของระบบสืบพันธุ์เพศชาย [4,5]

กระบวนการสร้างสเปิร์มนั้นควบคุมโดยแกน hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG) ฮอร์โมนที่ปลดปล่อย gonadotropin (GnRH) ที่ผลิตโดยมลรัฐจะกระตุ้นการผลิตฮอร์โมน luteinizing (LH) และฮอร์โมนกระตุ้นรูขุมขน (FSH) เซลล์ Leydig อยู่ติดกับท่อ seminiferous และผลิตฮอร์โมนเพศชายภายใต้การควบคุมของ LH FSH กระตุ้นการผลิตโปรตีนที่จับกับแอนติเจน (ABP) ที่ช่วยส่งผ่านฮอร์โมนเพศชาย ดังนั้นภาวะมีบุตรยากและปัญหาอื่น ๆ ส่วนใหญ่เกิดขึ้นเนื่องจากการรบกวนที่เกิดขึ้นในแกน HPG การให้ยาสเตรปโตโซโตซิน-นิโคตินาไมด์ร่วมกันทำให้เกิดโรคเบาหวานในหนูทดลอง Streptozotocin เป็นสารเคมีที่เป็นพิษต่อเซลล์ p ที่ผลิตอินซูลินในตับอ่อนและ nicotinamide เป็นวิตามินที่ละลายน้ำได้ซึ่งช่วยปกป้องเซลล์ p จากความเสียหายทั้งหมด [6]

Cistanche tubulosa เป็นพืชในทะเลทรายที่เรียกว่า "Rou Cong-Rong" [7] เป็นพืชกาฝากที่ไม่ใช่คลอโรฟิลล์ที่เติบโตส่วนใหญ่บนรากของต้น Calotropis Procera และกระจายอยู่ทั่วไปในดินแดนที่แห้งแล้งของกานซู ชิงไห่ ซินเจียง มองโกเลีย อิหร่าน และอินเดีย ชื่อสามัญของ Cistanche tubulosa คือ "Desert Hyacinth" เป็นที่ยอมรับอย่างกว้างขวางในการแพทย์แผนจีน และได้ชื่อว่า "โสมแห่งทะเลทราย" มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านการแพทย์เพื่อรักษาภาวะตกขาวผิดปกติ, โรคเลือดออกในช่องท้อง, โรคไตเรื้อรัง, อาการท้องผูก, ความอ่อนแอ, และภาวะมีบุตรยาก องค์ประกอบทางเคมีของCistanche tubulosaประกอบด้วยฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ไม่ระเหย (PHGs), อิริดอยด์, ลิกแนน, น้ำมันระเหย, อัลดิทอล, โอลิโกแซ็กคาไรด์และโพลีแซคคาไรด์ [8] การศึกษาแสดงให้เห็นว่า echinacoside จากสมุนไพรนี้ปกป้องไฟโบรบลาสต์ที่เสียหายโดยควบคุมระดับ ROS [9] สารประกอบนี้สร้างสารต้านอนุมูลอิสระ vasorelaxation และกิจกรรมต้านการอักเสบร่วมกับการป้องกันระบบประสาทและโรคกระดูกพรุน [10,11]

การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลของสารสกัด Cistanche tubulosaมี ECH เกี่ยวกับความผิดปกติของระบบสืบพันธุ์ของหนูเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโตซิน-นิโคตินาไมด์

Cistanche tubulosa

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.วัสดุ

ECH และ CTE ซื้อมาจาก Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) Advanced glycation endproducts (AGEs) ถูกซื้อจาก Biovision (San Francisco, CA, USA) ไลน์เซลล์ LC-540 และ TM3 ถูกซื้อจากสถาบันวิจัยและพัฒนาอุตสาหกรรมอาหาร (ซินจู๋ ไต้หวัน) หนูตัวผู้ Sprague-Dawley (SD) อายุห้าสัปดาห์ถูกซื้อมาจากศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ (ไทเป ประเทศไต้หวัน) Feed Lab Diet® ซื้อมาจาก PMI Nutrition International, Inc. (ไทเป ไต้หวัน) 2,2-ไดฟีนิล-1-พิคริลไฮดราซิล (DPPH) ได้รับจากซิกมา (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา) เมทานอลและ4-(2-ไฮดรอกซีเอทิล)-1-กรดพิเพอราซินีเอทาเนสซัลโฟนิก (HEPES) ยังถูกซื้อจากซิกมาอีกด้วย สื่อ Eagle/F12 ดัดแปลงของ Dulbecco และ trypsin-EDTA ได้มาจาก GIBCO (นิวยอร์ก, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) 3-(4, 5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2, 5-ไดฟีนิลเตตราโซเลียม โบรไมด์ (MTT), ไดคลอโร-ไดไฮโดร-ฟลูออเรสซีน ไดอะซิเตต (DCFH-DA), ซื้อไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) และไนโตรบลู เตตราโซเลียม (NBT) จากซิกมา ชุดเอนไซม์กลูโคสได้มาจาก Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan ชุดอุปกรณ์อินซูลิน ELISA ซื้อมาจาก Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Sweden) T-PER Tissue Protein Extraction Reagent ได้มาจาก Thermo Scientific (Chicago, IL, USA) แอนตี้-ฮิวแมน/เมาส์/หนู นิวเคลียส แฟกเตอร์-คัปปา บี NF-kB โพลีโคลนอล แอนติบอดี ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ ซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา แอนติ-เมาส์/ตัวรับหนูสำหรับโพลีโคลนอลแอนติบอดีขั้นปลาย (RAGE) แอนติ-มนุษย์/เมาส์/หนู/หนู StAR และไซโตโครม P450 17A1 โมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ซื้อมาจาก Gene Tex (เออร์ไวน์ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา). โพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อต้านมนุษย์/เมาส์/หนู CYP11A1 ได้มาจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ (เบเวอร์ลี, PA, สหรัฐอเมริกา) ซื้อรีเอเจนต์ easy-Blue จาก Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA) Agarose และ DNA marker 100 bp ได้มาจาก Promega, Corporation (Madison, WI, USA) RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ซื้อมาจาก QIAGEN, Hilden, Germany

2.2.วิธีการ

2.2.1. การวิเคราะห์ในหลอดทดลอง

LC{0}} และการเพาะเลี้ยงเซลล์ TM3: สายพันธุ์ของเซลล์ LC-540 ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 OC ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) ที่เสริมด้วยโซเดียมไบคาร์บอเนต (1.5 ก./ลิตร), L -กลูตามีน (2 mM), กรดอะมิโนที่ไม่จำเป็น (0.1 mM), โซเดียม ไพรูเวต (1.0 mM) และซีรัมของทารกในครรภ์ (FBS) (10 เปอร์เซ็นต์) ใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 incubator (CO2 incubator, Napco 5410, ไต้หวัน). สายเซลล์ TM3 ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางอินทรีดัดแปลง Dulbecco/s (DMEM) ที่เสริมด้วยกลูโคส (4.5 กรัม/ลิตร), โซเดียม ไพรูเวต (0.5 มิลลิโมลาร์), แอล-กลูตามีน (2.5 มิลลิโมลาร์), โซเดียม ไบคาร์บอเนต (1.2 กรัม/ลิตร), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 15 mM) และ fetal calf serum (FCS, 10 เปอร์เซ็นต์ ) หรือ horse serum (5 เปอร์เซ็นต์ ) ที่ 37 OC ใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ศูนย์บ่มเพาะ

การหาค่าความอยู่รอดได้ของเซลล์ของเอไคนาโคไซด์ (ECH): 3-(4, 5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2,5- รีเอเจนต์ไดฟีนิลเตตราโซเลียมโบรไมด์ (MTT) คือ ใช้สำหรับการทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ ความเข้มข้นของเซลล์ถูกปรับเป็น 2 x 105 เซลล์ / มล. ในจานหลุม 96-หลุม จากนั้น 20 卩L ของ ECH (เจือจางในอาหาร 2 เปอร์เซ็นต์) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 OC ในตู้บ่ม CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ต่อมา รีเอเจนต์ MTT 100 卩L ถูกเติมและบ่มสำหรับ 4hat37 OC ภายใต้สภาวะที่มืด วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตร (เครื่องอ่าน ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, สวิตเซอร์แลนด์)

Restive CeH viabiHiy ( เปอร์เซ็นต์ )=[(ตัวอย่างที่ 570 nm — Ablank ที่ 570 nm)]/[(Acontrol ที่ 570 — Ablank ที่ 570)] x 100

Nitroblue Tetrazolium (NBT) Reduction Assay และ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay: จำนวนเซลล์ถูกปรับเป็น 1x 1{{10}}6 เซลล์/มล. . จากนั้น 50 มก./มล. ของ ECH, เรสเวอราทรอล (RES) และผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่เป็นไกลเคชั่นขั้นสูง (AGE) (กลุ่มควบคุม) ถูกเติมและเพาะเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่ 37OC จากนั้น สารละลาย NBT 0.3 มล. (0.1 มก./มล. NBT, FBS 5 เปอร์เซ็นต์ และไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 3 เปอร์เซ็นต์ (DMSO) ที่ละลายใน 10 มล. DMEM) ถูกเติมและบ่มที่ 37 OC ใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการปั่นแยก (ที่ 800 xg เป็นเวลา 3 นาที) ส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกลบออกและ 200 卩L DMSO ถูกเติมและเขย่าเป็นเวลา 5 นาทีในเครื่องกำเนิดความถี่อัลตราโซนิก (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan) วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 630 นาโนเมตร สำหรับการทดสอบความรุนแรงของ DPPH นั้น Trolox (ในแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์) ถูกนำมาเป็นมาตรฐาน จากนั้น 75 卩L ของสารละลาย DPPH 0.5 mM ถูกผสมกับตัวอย่าง 25 卩L และปล่อยให้ทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที ของผสมถูกเขย่าและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตร

การวิเคราะห์เนื้อหาชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS): หมายเลขเซลล์ถูกปรับเป็น 2 x 105 เซลล์/มล. ในจาน 12-หลุมที่มี FBS 2 เปอร์เซ็นต์ จากนั้น 50 卩L/มล. ของ ECH, RES และ AGEs ถูกเติมลงในจานและบ่มที่ 37 OC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจาก 24 ชม. 2Z,7Z-ไดคลอโรฟลูออเรสซีน-ไดอะซิเตต (DCFH-DA) ถูกเติมและบ่มที่ 37 OC เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการปั่นเหวี่ยง (400x ก., 5 นาที), ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกำจัดออกและเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) หลังจากที่เซลล์ถูกแขวนลอยใน 1 มล. ของ PBS และระดับของ ROS ถูกกำหนดหาโดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA)

การระบุและการวิเคราะห์เชิงปริมาณของโปรตีน: สกัดโปรตีนโดยใช้รีเอเจนต์การสกัดโปรตีน (T-PER) ความหนาแน่นของเซลล์ถูกปรับเป็น 2 x 105 เซลล์/มล. ในจาน 12-หลุมและ 50 卩L/มล. ของ ECH, RES และรีเซพเตอร์สำหรับตัวต้านไกลเคชั่นขั้นปลาย (RAGE) ขั้นสูง และ AGEs ถูกเติมเข้าไปและ ฟักที่ 37 OC ในตู้ฟัก CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น, 400 卩L ของ T-PER ถูกเติม, ขูดออกจากเซลล์, และหมุนเหวี่ยงที่ 125,000xg เป็นเวลา 20 นาที (4 OC) ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมและเก็บไว้ที่ -80 OC (-80 OC ตู้แช่แข็ง, Nuaire, Plymouth, MN, USA) สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม ชุดกรด Bicinchoninic (BCA) ใช้สำหรับการหาปริมาณโปรตีน จากนั้น 10 卩L ของสารละลายเซลล์มาตรฐานและ 200 RL ของตัวทำปฏิกิริยา BCA ถูกเติมลงในเพลต 8-หลุมและบ่มที่ 37 O C ในตู้บ่ม CO2 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตร การวิเคราะห์การระบุโปรตีนถูกดำเนินการโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต (SDS)-โพลีอะคริลาไมด์ เจล (SDS-PAGE) อิเล็กโตรโฟรีซิส ตัวอย่างถูกเตรียมโดยการเพิ่มโปรตีนไลเซตไปยังบัฟเฟอร์การโหลดโปรตีน และการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตถูกดำเนินการเพื่อตรวจหาโปรตีนจำเพาะ

2.2.2.ในการวิเคราะห์ Vivo

การออกแบบแบบจำลองสัตว์: ซื้อหนู Sprague-Dawley (SD) เพศผู้อายุหกสิบ {{0}} สัปดาห์จากศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ (ไทเป ไต้หวัน) หนูแต่ละตัวถูกเลี้ยงแยกกันในกรงสแตนเลสสำหรับฆ่าเชื้อภายใต้อุณหภูมิที่ควบคุมได้ (23 土 1 องศา ) และความชื้น (40-60 เปอร์เซ็นต์ ) ด้วยวัฏจักรมืด 12 ชม. แสง/12 ชม. ให้อาหารและน้ำโดยอิสระ หนูแต่ละตัวถูกเลี้ยงในสัปดาห์แรกและให้อาหารหนูทดลอง 5001 เป็นอาหารหลัก ขั้นตอนทั้งหมดเป็นไปตามมาตรฐานของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน (IACUC Approval No. 101026) ของ National Taiwan Ocean University ประเทศไต้หวัน หลังจากการเลี้ยง หนูถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: กลุ่มควบคุม (Con) ที่เลี้ยงด้วยอาหารแล็บ 5001 และกลุ่มผู้ป่วยเบาหวานที่ได้รับอาหารที่มีไขมันสูง (HFD, 40 เปอร์เซ็นต์) สำหรับการทดลองทั้งหมด หลังจากได้รับ HFD เป็นเวลา 4 สัปดาห์ หนูกลุ่มที่เป็นเบาหวานถูกฉีดด้วยสเตรปโตโซโตซิน (65 มก./กก.) (STZ) เพื่อกระตุ้นให้เกิดโรคเบาหวาน (DM) ภายใน 15 นาทีของการฉีด STZ นิโคตินาไมด์ (230 มก./กก. น้ำหนักตัว) ถูกฉีด หนึ่งสัปดาห์หลังการฉีด ได้ทำการทดสอบความทนทานต่อกลูโคสในช่องปาก (OGTT) เพื่อตรวจสอบการชักนำให้เกิดโรคเบาหวาน (DM) ที่ประสบความสำเร็จ หลังจากนั้น สัตว์ถูกแบ่งออกเป็นหกกลุ่ม: กลุ่มควบคุม (เลี้ยงด้วยอาหารแล็บ 5001); กลุ่ม DM (DM บวก 45 เปอร์เซ็นต์ HFD); กลุ่ม DMR (DM บวก rosiglitazone: 0.571 มก./กก. BW) บวก 45 เปอร์เซ็นต์ HFD; กลุ่ม DME1 (DM บวก CTE: 80 มก./กก. BW) บวก 45 เปอร์เซ็นต์ HFD; กลุ่ม DME2 (DM บวก CTE: 160 มก./กก. BW) บวก 45 เปอร์เซ็นต์ HFD; และกลุ่ม DME4 (DM บวก CTE: 320 มก./กก. BW) บวก 45 เปอร์เซ็นต์ HFD โรซิกลิตาโซน (RSG) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก CTE สามขนาด (80, 160 และ 320 มก./กก.) ถูกใช้ตามคำแนะนำของคณะกรรมการอาหารและยาไต้หวัน (TFDA) แนวทางการประเมินการทำงานของอาหารเพื่อสุขภาพ ให้การรักษาจนกระทั่งสิ้นสุดการทดลอง หนูทดลองทั้งหมดถูกสังเวยหลังจาก 6 สัปดาห์ เก็บเลือดจากหนูที่ถูกปั่นเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา

Mian ส่วนผสมที่มีประสิทธิภาพของ cistanche tubulosa

ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกตรวจสอบเพื่อการวิเคราะห์ต่อไปนี้

การวัดน้ำตาลกลูโคส ไตรกลีเซอไรด์ และคอเลสเตอรอลรวม: การวัดน้ำตาลกลูโคสดำเนินการโดยชุดเครื่องมือเอนไซม์กลูโคส จากนั้น เติมตัวอย่างพลาสมาเลือด 20 ตัวอย่างไปยังรีเอเจนต์และเก็บไว้ที่ 37 องศาเป็นเวลา 5 นาที ไตรกลีเซอไรด์รวมและความเข้มข้นของโคเลสเตอรอลรวมถูกกำหนดโดยใช้ชุดเอนไซม์ไตรกลีเซอไรด์และโคเลสเตอรอล จากนั้น พลาสมาเลือด 10 ^L ถูกเติมลงในรีเอเจนต์ และการทดลองได้ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 510 นาโนเมตร

กลูโคสรวม/ไตรกลีเซอไรด์/โคเลสเตอรอลรวมในพลาสมา (มก./เดซิลิตร)=(-ABlank)/(มาตรฐาน - ABlank) x 200

ตัวอย่าง: การดูดซับของตัวอย่างเลือด, ABlank: ค่าการดูดกลืนแสงของชุดอุปกรณ์ที่ไม่มีตัวอย่าง, มาตรฐาน: ค่าการดูดกลืนแสงของรีเอเจนต์มาตรฐาน, 200: ค่ารีเอเจนต์มาตรฐานที่ความเข้มข้น 200 มก./เดซิลิตร

Insulin, Leptin และ Homeostatic Model Assessment-Insulin Resistance (HOMA-IR) Determination: กำหนดระดับอินซูลินโดยชุดตรวจอินซูลิน ELISA ที่นี่ พลาสมาเลือด 25 ตัวถูกเติมไปยังรีเอเจนต์และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร ปริมาณเลปตินทั้งหมดถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดทดสอบเอนไซม์เลปตินอิมมูโนเมตริก จากนั้น วิเคราะห์พลาสมา 100 รายการและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่าน ELISA การทดลองทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต ค่า HOMA-IR ถูกกำหนดหาจากสมการการประเมินแบบจำลองสภาวะสมดุล=ความเข้มข้นของอินซูลินในพลาสมาหลังอดอาหาร (mU/มล.) x ความเข้มข้นของกลูโคสในพลาสมาในการอดอาหาร (มิลลิโมล/ลิตร)/22.5

เปอร์ออกซิเดชันของไขมันในพลาสมา: ในที่นี้ {{0}}.5 มล. ของพลาสมาในเลือดถูกผสมกับรีเอเจนต์ 1 มล. (15 เปอร์เซ็นต์ , w/v กรดไตรคลอโรอะซิติกใน 0.25 N กรดไฮโดรคลอริก (HCl ) และ 0.375 เปอร์เซ็นต์ , w/v thiobarbituric acid ใน 0.25 N HCl) และวางลงในอ่างน้ำ (Water Bath, BUCHI461, Zurich, Switzerland) ที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที หลังจากการทำความเย็น, เติมเอ็น-บิวทานอล 1 มิลลิลิตร, เขย่าอย่างแรง, และปั่นเหวี่ยงที่ 1500xg เป็นเวลา 10 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 532 นาโนเมตร [12]

ความเข้มข้นของ Malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(ASample at532 nm - Ablank at532 nm)/ (Astandard ที่ 532 nm - Ablank ที่ 532 nm)] x 5

การกำหนดระดับฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนในพลาสมาและฮอร์โมนลูทีนไนซิ่ง (LH): ชุด ELISA เทสโทสเตอโรนถูกใช้เพื่อวัดระดับฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนในเลือด ใช้ชุด RIA เพื่อกำหนดความเข้มข้นของ LH จากนั้น เพิ่มพลาสมา 50 卩L และการคำนวณขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของฮอร์โมน LH-RP-3 (มาตรฐาน) ขั้นตอนต่อไปได้ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต

การหาความเข้มข้นของ Tumor Necrosis Factor (TNF)-a และ Interleukin-6 (IL-6): แอนติบอดีที่จับได้ถูกเจือจาง 250 ครั้งในบัฟเฟอร์เคลือบ เติมลงใน {{4} }จานหลุม (100 卩L/หลุม) และเก็บไว้ที่ 4 องศา C ค้างคืน ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกสำลักและล้างห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์การซัก (1 ครั้ง PBS, 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20) หลังจากการบ่ม (1 ชั่วโมง) ด้วยสารเจือจางสำหรับการสอบวิเคราะห์ 200 ^g เซลล์ถูกล้าง 5 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์การซักและ 100 ^L ของสารละลายมาตรฐาน TNF-a หรือตัวอย่างทดสอบถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากการล้าง 100 RL ของ IL-6 ที่ตรวจพบถูกเติมและบ่มที่อุณหภูมิห้อง 1hat ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกสำลักและล้าง 5 ครั้ง จากนั้น 480 RL ของเอนไซม์ avidin-horseradish peroxidase (HRP) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกสำลักและล้างห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์สำหรับล้าง จากนั้นเติมสารละลายซับสเตรต 100 RL และบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ต่อมา เติมสารละลายสต็อป 50 RL (กรดฟอสฟอริก 1 โมลาร์) ลงในแต่ละหลุมและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร

ประโยชน์ของ Cistanche Echinacoside: ต่อต้านอนุมูลอิสระ

การวิเคราะห์พารามิเตอร์อสุจิและอัณฑะ

การเก็บตัวอย่างอสุจิ: การเก็บตัวอย่างอสุจิดำเนินการตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ใน [13] เก็บสเปิร์มจาก supernatant และใช้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป

จำนวนอสุจิ การเคลื่อนที่ของอสุจิ และอสุจิผิดปกติ: จำนวนตัวอสุจิคำนวณโดยใช้เครื่องวัดเม็ดเลือดและสารละลายทริปแพนสีน้ำเงิน จากนั้นนำของเหลวของอสุจิ 100 RL ผสมกับสารละลาย trypan blue และคำนวณจำนวนอสุจิ การเคลื่อนที่ และตัวอสุจิที่ผิดปกติโดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์และกล้องจุลทรรศน์ [14]

Nitro blue Tetrazolium NBT Reduction และ Lipid Peroxidation ของอสุจิและอัณฑะ: วิเคราะห์ลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและการลด NBT ตามขั้นตอนเดียวกันของการวิเคราะห์ในพลาสมา

การหาค่าของ Superoxide Dismutase (SOD) และกิจกรรมของ Catalase: วิเคราะห์กิจกรรมของ Superoxide dismutase (SOD) โดยใช้ชุดเครื่องมือ RANSEL ที่นี่ {{0}}.05 มล. ของโฮโมจิเนตอัณฑะถูกเติมลงในสารละลายปฏิกิริยา 1.7 มล. (0.05 mM แซนทีน, 0.025 มิลลิโมลาร์ 2-({ {9}}ไอโอโดฟีนิล)- 3-(4-ไนโตรฟีนอล)-5-ฟีนิลเตตตราโซเลียม คลอไรด์ (INT)) หลังจากผสม แซนทีนออกซิเดส 0.25 มล. (80 U/L) ถูกเติมและทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 วินาทีที่อุณหภูมิห้อง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 505 นาโนเมตร ความเข้มข้นของโปรตีนของ homogenate ของอัณฑะถูกกำหนดโดยชุดทดสอบโปรตีน Bio-Rad DC และคำนวณกิจกรรมจำเพาะ (โปรตีน U/mg) กิจกรรม catalase (CAT) ถูกกำหนดตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [15]

H&E (Hematoxylin และ Eosin) การย้อมสี

อัณฑะแช่ในฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส หั่นเนื้อเยื่อเป็นขนาดไมโครแล้วติดเข้ากับสไลด์ หลังจากการตรึง (95 เปอร์เซ็นต์เมทานอลบวก 5 เปอร์เซ็นต์กรดอะซิติก) สไลด์ถูกแช่ใน hematoxylin เป็นเวลา 3 นาที ล้างด้วยน้ำไหลเป็นเวลา 5 นาที แล้วแช่ด้วยแอลกอฮอล์ 50 เปอร์เซ็นต์ 70 เปอร์เซ็นต์ และ 90 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลาหนึ่งนาที หลังจากนั้นสไลด์ถูกย้อมด้วย eosin เป็นเวลา 10 วินาทีและแช่ในแอลกอฮอล์ 100 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลาหนึ่งนาทีจนสีซีดจาง ในที่สุด สไลด์ก็แช่ในไซลีนเป็นเวลาหนึ่งนาที ต่อมา สไลด์ถูกทำให้แห้งและผนึกด้วยอากาศ หลอดสีถูกวางลงในกล้องจุลทรรศน์เฟสคอนทราสต์แบบกลับด้าน (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, โตเกียว, ญี่ปุ่น) เพื่อสังเกตลักษณะทางสัณฐานวิทยา

การวิเคราะห์ไฮโปทาลามัส

ลำดับยีน KISS1 ของหนูเมาส์, G-protein coupled receptor (GPR) 54, ตัวยับยั้งการส่งสัญญาณไซโตไคน์ 3 (SOCS-3) และลำดับยีน sirtuin 1(SIRT1) ถูกระบุจากฐานข้อมูลยีน NCBI (ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ) และไพรเมอร์เฉพาะได้รับการออกแบบโดยใช้ Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการทดลองแสดงไว้ในตารางที่ 1

การสกัดกรดไรโบนิวคลีอิก (RNA) จากไฮโปทาลามัส การสกัด RNA จากไฮโปทาลามัสของสมองทำได้โดยใช้ RNeasy Lipid Tissue Mini Kit mRNA ที่ได้รับถูกวัดในเชิงปริมาณโดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) และปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ดีเอ็นเอของคำชมที่ได้รับจากการวิเคราะห์ RT ถูกเก็บไว้ที่ -20 องศาเพื่อใช้ในภายหลัง DNA ที่สกัดออกมาอยู่ภายใต้การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) โดยใช้ Taq polymerase จากนั้น 5~10 ^L ของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกนำและวิเคราะห์โดยอิเล็กโตรโฟรีซิสบนคอลลอยด์วุ้น 1.5 เปอร์เซ็นต์ ภาพถูกถ่ายในระบบภาพ UVP BioDoc-It กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกเสริมที่ถอดรหัสย้อนกลับ (cDNA) ถูกนำมาใช้และดำเนินการ PCR โดยใช้ IQ SYBR Green Supermix Kit ต่อมาวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ระบบออปติคัล iQTM 5 สกัดโปรตีนโดยใช้รีเอเจนต์การสกัดโปรตีน (T-PER) จากนั้น 20 มก. ของ homogenate อัณฑะถูกเติมลงใน 400 ^L ของ T-PER และหมุนเหวี่ยง (เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, Hettich CR-12, Tuttlingen, เยอรมนี) ที่ 4 องศา (125,000 xg) สำหรับ 20 นาที วิธีการต่อไปนี้คล้ายกับ "การวิเคราะห์การระบุและการหาปริมาณของโปรตีน" การวิเคราะห์ในหลอดทดลอง

2.3.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลการทดลองแสดงเป็นค่าเฉลี่ย 土 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Mean 土 SD) และข้อมูลได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 110, IBM, Armonk, New York, NY, USA วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) การเปรียบเทียบหลายกลุ่มของกลุ่มต่างๆ ถูกวิเคราะห์โดยการทดสอบของ Duncan ที่ค่า p <0.05>

ภาคต่อไป Ⅱ ต่อไป