ส่วนผสมที่ใช้งานของ Cistanche: Echinacoside ต่อการยับยั้งการอักเสบและผลต่อระบบประสาท

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com

เอชินาโคไซด์ หนึ่ง คล่องแคล่ว องค์ประกอบ ของ Cistanche เฮอร์บา, ความพยายาม a ป้องกันระบบประสาท ผล ใน a ไคนิค กรด หนู แบบอย่าง โดย ยับยั้งอักเสบ กระบวนการ และ กำลังเปิดใช้งาน ที่ Akt/GSK3 ทางเดิน

Cheng Wei Lu,a,b Hsi Lung Hsieh,c,d Tzu Yu Lin,a,b Ting Yang Hsieh,e Shu Kuei Huang,a และ Su Jane Wang^*,f,g

เอ็กไคนาโคไซด์เป็นสารประกอบหลักของ Cistanche Herb และมีฤทธิ์ในการยับยั้งการหลั่งของกลูตาเมตในสมอง เนื่องจากการมีส่วนร่วมของ excitotoxicity ที่เกิดจากกลูตาเมตขนาดใหญ่ในพยาธิสรีรวิทยาของโรคลมบ้าหมู เราได้สำรวจผลของยากันชักของ echinacoside ต่ออาการชักที่เกิดจากกรดไคนิกในหนู หนูมีการบริหารภายในช่องท้องเอ็กไคนาโคไซด์ก่อนฉีดเข้าช่องท้องด้วยกรดไคนิกเป็นเวลา 30 นาที ผลการศึกษาพบว่ารูปแบบพฤติกรรมคล้ายอาการชักที่เกิดจากกรดไคนิก เพิ่มความเข้มข้นของกลูตาเมต ทำให้เกิดการสูญเสียเซลล์ประสาทและการกระตุ้นไมโครเกลียล และกระตุ้นการแสดงออกของยีนไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบในฮิบโปแคมปัส การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากกรดไคนิกเหล่านี้พบว่าถูกทำให้อ่อนลงโดยเอ็กไคนาโคไซด์การปรับสภาพ นอกจากนี้ การลดลงของ Akt และไกลโคเจน synthase kinase 3 (GSK3 ) ฟอสโฟรีเลชัน ตลอดจนการแสดงออกของ Bcl-2 ในฮิบโปแคมปัส ถูกย้อนกลับโดยการปรับสภาพเอไคนาโคไซด์ ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า echinacoside ออกแรงต้านโรคลมบ้าหมูและป้องกันระบบประสาทในแบบจำลองหนูที่มีกรดไคนิคผ่านการยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบและกระตุ้นการส่งสัญญาณ Akt/GSK3 ดังนั้นการศึกษาในปัจจุบันจึงชี้ให้เห็นว่าอิไคนาโคไซด์อาจมีประโยชน์ในการป้องกันโรคลมบ้าหมู

คำสำคัญ:อิชินาโคไซด์; กรดไคนิค; โรคลมบ้าหมู; ผลป้องกันระบบประสาท; ฮิปโปแคมปัส

Echinacoside ใน cistanche

โรคลมชักเป็นโรคทางสมองที่แพร่หลายทั่วโลก ส่งผลกระทบต่อผู้คนมากกว่า 65 ล้านคน เกือบ 1 เปอร์เซ็นต์ของประชากรโลก 1) ยากันชักสังเคราะห์มีจำหน่ายทั่วไปในตลาดยา อย่างไรก็ตาม ยาเหล่านี้มีผลเฉพาะในผู้ป่วย 60–70 เปอร์เซ็นต์ และมีผลข้างเคียง2–4) ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องค้นหายาที่มีประสิทธิภาพและปลอดภัยกว่า พืชสมุนไพรเป็นตัวแทนของแหล่งที่มีศักยภาพของสารประกอบดังกล่าว^5,6)

ในยาสมุนไพรจีนโบราณ Cistanche Herba ถูกนำมาใช้ในการรักษาโรคลมบ้าหมูมาอย่างยาวนาน7,8)เอ็กไคนาโคไซด์เป็นส่วนประกอบหลักของ Cistanche Herba9) และมีคุณสมบัติทางเภสัชวิทยามากมาย เช่น สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต้านมะเร็งผิวหนัง ตับ และกิจกรรมปรับภูมิคุ้มกัน10,11) นอกจากนี้ ยังมีรายงานอีกว่าเอ็กไคนาโคไซด์สามารถเข้าสู่สมองและกระตุ้นการป้องกันระบบประสาท12–16) ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นแล้วว่า อิไคนาโคไซด์ช่วยลดการปล่อยกลูตาเมตในขั้วเส้นประสาทสมองของหนู17) เนื่องจากกลูตาเมตเป็นสารสื่อประสาทกระตุ้นที่สำคัญในสมองของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและมีบทบาทสำคัญในพยาธิสรีรวิทยาของโรคลมบ้าหมู 18,19) เราแนะนำว่าอิไคนาโคไซด์มีฤทธิ์ต้านลมบ้าหมู เพื่อชี้แจงสมมติฐานนี้ ในการศึกษานี้จึงใช้แบบจำลองหนูกรดไคนิก

กรดไคนิคเป็นอนุพันธ์ของกลูตาเมตและการฉีดระบบเดียวไปยังสัตว์ฟันแทะส่งผลให้เกิดอาการชัก การอักเสบของเส้นประสาท และการเสื่อมหรือการตายของเซลล์ประสาทในประชากรที่เลือกของเซลล์ประสาทในสมอง20–22) การสลับกันทางพยาธิวิทยาเหล่านี้คล้ายกับโรคลมบ้าหมูกลีบขมับของมนุษย์23 ,24) การให้กรดไคนิกกับสัตว์ฟันแทะโดยทั่วไปถือว่าทำให้เกิดรูปแบบของโรคลมบ้าหมูที่เพียงพอ จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาใดที่ตรวจสอบคุณสมบัติของยากันชักและป้องกันระบบประสาทของเอ็กไคนาโคไซด์ในรูปแบบสัตว์ฉีดกรดไคนิก ดังนั้น การศึกษาของเราจึงมุ่งที่จะประเมินผลกระทบและกลไกที่เป็นไปได้ของเอ็กไคนาโคไซด์การให้ยาล่วงหน้าในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยกรดไคนิก

วัสดุและวิธีการ

กิจกรรมสัตว์และอาการชัก

หนู Sprague–Dawley เพศผู้ (BioLASCO, ไทเป, ไต้หวัน) ที่มีน้ำหนัก 150–200 กรัมถูกใช้ตลอดการศึกษา หนูถูกสุ่มให้เป็นสี่กลุ่มดังนี้: i) กลุ่มที่ 1: กลุ่มที่บำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (กลุ่มควบคุม); ii) กลุ่มที่ 2: กลุ่มที่ได้รับกรดไคนิก; iii) กลุ่ม 3:เอ็กไคนาโคไซด์10 มก./กก. บวกกับกลุ่มกรดไคนิก; iv) กลุ่มที่ 4:เอ็กไคนาโคไซด์50 มก./กก. บวกกับกลุ่มกรดไคนิก Echinacoside (ChemFaces, Wuhan, PRC) ถูกฉีด (การบริหารให้ภายในช่องท้อง) 30 นาทีก่อนการฉีดในช่องท้องด้วยกรด kainic (15 มก./กก.) กิจกรรมการชักได้รับการประเมินในช่วงระยะเวลา 4 ชั่วโมงหลังการฉีดกรดไคนิกตามมาตราส่วนของราซีน.25) ขนาดยาและตารางการให้ยาถูกเลือกบนพื้นฐานของการศึกษาก่อนหน้านี้22,26,27) การทดลองกับสัตว์ได้รับการอนุมัติโดยสถาบัน คณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ที่มหาวิทยาลัยคาธอลิก Fu Jen และดำเนินการตามโปรโตคอลที่ออกซึ่งเป็นไปตาม National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory (NAC 2011)

การกำหนดระดับกลูตาเมต

สี่ชั่วโมงหลังจากการบำบัดด้วยกรดไคนิก หนูเหล่านี้ถูกสังเวยโดยการตัดหัว สมองทั้งหมดถูกผ่าและรวบรวมฮิบโปแคมปัสของหนูแต่ละตัวเพื่อทำการวิเคราะห์ ความเข้มข้นของกลูตาเมตของเนื้อเยื่อสมองส่วนฮิปโปแคมปัสถูกกำหนดตามวิธีการที่อธิบายโดยการศึกษาก่อนหน้านี้28,29)

การย้อมสี Neutral Red และ Fluoro-Jade B

สามวันหลังจากการฉีดกรดไคนิก หนูถูกทำให้หมดความรู้สึกโดยใช้คลอรัลไฮเดรต (650 มก./กก.) และถ่ายผ่านช่องหัวใจด้วยสารละลายตรึงที่มีพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ในสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ (PBS, pH 7.4) สมองจะถูกลบออกทันทีหลังจากการให้เลือดไปเลี้ยง และเก็บไว้ใน 4 เปอร์เซ็นต์พาราฟอร์มัลดีไฮด์ค้างคืนที่ 4 องศา หลังจากการตรึง สมองถูกแช่ซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์ที่ 4 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วและส่วนที่มีความหนา 30-µm ถูกตัดโดยใช้ไมโครโทมแช่แข็ง ส่วนลอยอิสระถูกย้อมด้วยสีแดงกลาง (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) และ Fluoro-Jade B (Millipore, CA, USA) Fluoro-Jade B-positive cells ในบริเวณ CA3 ของ hippocampus ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้^30,31)

อิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนต่างๆ ถูกล้างด้วย {{0}}.1 M PBS และปิดกั้นด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์เซรั่มของแพะปกติใน {{20}} 1 M PBS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิ (โมโนโคลนัลแอนติ-OX-42 แอนติบอดีของเมาส์, 1: 1000; AbD Serotec, Oxford, UK) ดำเนินการสองครั้งในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา หลังจากล้างด้วย PBS ซ้ำแล้วซ้ำอีก ส่วนต่างๆ จะถูกฟักด้วยอิมมูโนโกลบูลิน G (IgG) ต้านหนูเมาส์ที่มีไบโอตินิลเลต (1: 200) เป็นเวลา 90 นาที บำบัดด้วยสารละลาย avidin-biotin complex (ABC) (1: 1000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ห้อง และทำปฏิกิริยากับ 0.025 เปอร์เซ็นต์ 3,3′-diaminobenzidine และ 0.0025 เปอร์เซ็นต์ H2O2 จนกระทั่งได้ความเข้มของคราบที่ต้องการ ส่วนต่างๆ ถูกติดตั้งบนสไลด์โดยใช้โปรโตคอลมาตรฐาน สไลด์ที่เปื้อนได้รับการตรวจสอบและถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์ (Olympus, Tokyo, Japan)31) การวิเคราะห์เซลล์ microglial และความยาวของกระบวนการดำเนินการด้วย ImageJ³²)

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน

ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้33) โดยสังเขป บริเวณ CA3 ของฮิปโปแคมปัสถูกเอาออกและตรึงไว้ในบัฟเฟอร์ที่มีพาราฟอร์มัลดีไฮด์ร้อยละ 4 และกลูตาราลดีไฮด์ร้อยละ 2.5 ที่ 4 องศาเป็นเวลา 24-36 ชั่วโมง หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว บริเวณ CA3 จะถูกโพสต์ฟิกซ์ใน 1 เปอร์เซ็นต์ osmium tetroxide เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ถูกทำให้แห้งด้วยเอธานอล และฝังอยู่ในอีพอกซีเรซิน ส่วนที่บางเฉียบ (70 นาโนเมตร) ถูกเตรียมโดยใช้ ultramicrotome (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยยูแรนิลอะซิเตตและตะกั่วซิเตรต และสังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (รุ่น JEM-1400, JEOL Ltd., โตเกียว, ญี่ปุ่น)

PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ

การแยก RNA และ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 34,35) RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากฮิบโปโดยใช้ mirVana™ miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต deoxyribonuclease (DNase) I. cDNA ถูกสังเคราะห์โดย (NoScript reverse transcription system kit; Promega, Madison, WI, USA) และใช้สำหรับ SYBR Green (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) เชิงปริมาณ real- การขยายเวลา PCR ด้วยไพรเมอร์เฉพาะโดยใช้ระบบ LightCycler 480 (Roche Diagnostics) โปรโตคอลประกอบด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเริ่มต้นที่ 95 องศาเป็นเวลา 3 นาที ตามด้วยการเปลี่ยนสภาพเป็น 45 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 10 วินาที การหลอมที่ 56 องศาเป็นเวลา 30 วินาที ระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายแต่ละยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นระดับของ mRNA ของกลีซาลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) การเหนี่ยวนำแบบพับคำนวณโดยใช้วิธี2−ΔΔCTตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้³⁴)

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

สารสกัดโปรตีน 20 ไมโครกรัมจากฮิปโปแคมปัสถูกแยกด้วยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE) 10 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยการถ่ายโอนอิเล็กโตรโฟรีติกไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีน ไดฟลูออไรด์ (PVDF) เมมเบรนถูกปิดกั้นโดยใช้นมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง และบ่มด้วยแอนติบอดีที่เหมาะสมในนมพร่องมันเนย 1 เปอร์เซ็นต์ในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา ตามด้วยบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แอนติบอดีปฐมภูมิคือโมโนโคลนอลแอนติบอดีของกระต่ายที่ต่อต้าน Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), ไกลโคเจนซินเทสไคเนส 3 (GSK3 ) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl-2 ( 1: 1000) และ -actin (1: 2000) ที่ได้รับจาก Cell Signaling Technology (MA, USA) แอนติบอดีต้านกระต่ายของแพะที่คอนจูเกตเปอร์ออกซิเดสทุติยภูมิ (1: 5000) ได้มาจากซานตาครูซ (CA, USA) แถบแสดงภาพด้วยเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham, Buckinghamshire, UK) โดยใช้ระบบวิเคราะห์ภาพเจล วัดความเข้มของแต่ละแถบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Syngene (Synop tics, Cambridge, UK)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลแสดงเป็นค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดย t-test ของนักเรียนแบบสองด้านเมื่อเปรียบเทียบสองกลุ่มและโดย ANOVA ทางเดียวกับการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey หลังการทดสอบเฉพาะเมื่อเปรียบเทียบมากกว่าสองกลุ่ม การวิเคราะห์เสร็จสิ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) พี<0.05 was="" considered="" statistically="">

ผลลัพธ์

ผลของ Echinacoside ต่ออาการชักที่เกิดจากกรด Kainic และการเพิ่มขึ้นของระดับ Hippocampal Glutamate

เพื่อประเมินผลการป้องกันระบบประสาทของเอ็กไคนาโคไซด์ต่อ excitotoxicity ที่เกิดจากกรดไคนิก หนูได้รับการบำบัดด้วยเอ็กไคนาโคไซด์(5, 10 และ 50 มก./กก. การบริหารในช่องท้อง) เป็นเวลา 30 นาทีก่อนการฉีดเข้าช่องท้องด้วยกรดไคนิก (15 มก./กก.) การฉีดเข้าช่องท้องด้วยกรดไคนิก (15 มก./กก.) ทำให้เกิดอาการชักโดยมีเวลาแฝงและคะแนน 92.5±5.3 นาที และ 4.9±0.1 ตามลำดับ (รูปที่ 1A, B) เวลาแฝงในการจับกุมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ[F(2, 43)=40.2, p<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; มะเดื่อ 1A, B). เมื่อพิจารณาจากการลดทอนฤทธิ์ของอาการชักที่เห็นได้ชัดเจนด้วย echinacoside 10 หรือ 50 มก./กก. ยา echinacoside สองขนาดนี้จึงถูกนำมาใช้ในการทดลองครั้งต่อๆ ไป เพื่อประเมินกลไกที่รองรับความสามารถของ echinacoside ในการยับยั้งการชักที่เกิดจากกรดไคนิก รูปที่ 1C แสดงว่าระดับความสูงของระดับฮิปโปแคมปัลกลูตาเมตถูกบันทึกไว้ในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยกรดไคนิกที่ 4 ชั่วโมงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (กลุ่มควบคุม; p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

ผลของ Echinacoside ต่อการบาดเจ็บของเส้นประสาทที่เกิดจากกรด Kainic ในเขต CA3 ของฮิบโปแคมปัส

ระดับของความเสียหายของเส้นประสาทได้รับการประเมิน 3 วันหลังการฉีดกรดไคนิกผ่านการย้อมสีแดงที่เป็นกลางหรือ Fluoro-Jade B เพื่อตรวจหาเซลล์ประสาทที่รอดตายและเซลล์ประสาทที่เสื่อมสภาพตามลำดับ การย้อมสีแดงที่เป็นกลางเผยให้เห็นการสูญเสียเซลล์ประสาทที่ชัดเจนใน CA3 ของหนูที่ฉีดกรดไคนิก เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (กลุ่มควบคุม; p<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">เอ็กไคนาโคไซด์การปรับสภาพ (10 หรือ 50 มก./กก.) ช่วยลดการสูญเสียเซลล์ประสาทที่เกิดจากกรดไคนิกอย่างมีประสิทธิภาพใน CA3 [F(2, 13)=11.6, p<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">เอ็กไคนาโคไซด์สัตว์ที่ได้รับการบำบัดแสดงการเรืองแสง Fluoro-Jade B FL ที่ลดลงในบริเวณ CA3 ของฮิบโปแคมปัสหลังการฉีดกรดไคนิก (p<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

ผลของ Echinacoside ต่อการกระตุ้น Microglia ที่กระตุ้นด้วยกรด Kainic และการแสดงออกของยีนของการอักเสบของ Proinflflammatory

ไซโตไคน์ในฮิปโปแคมปัส ในรูปแบบสำหรับอาการชักที่เกิดจากกรดไคนิกและการตายของเซลล์ประสาทฮิปโปแคมปัส การกระตุ้นไมโครเกลียลและการผลิตไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบจะเพิ่มขึ้นในฮิบโปแคมปัส 36,37) เพื่อตรวจสอบว่าเอ็กไคนาโคไซด์ส่งผลต่อการตอบสนองต่อการอักเสบในฮิบโปแคมปัสของหนูที่ฉีดกรดไคนิก การกระตุ้นไมโครเกลียถูกวิเคราะห์โดยใช้แอนติบอดีต้าน OX42 ในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (กลุ่มควบคุม) เซลล์ microglial ในบริเวณ CA3 มีขนาดเล็กและกระบวนการของพวกมันยาวและบาง (รูปที่ 4A) อย่างไรก็ตาม จำนวนเซลล์ microglial ที่ถูกกระตุ้นในบริเวณ CA3 ของหนูที่ฉีด KA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ร่างกายของเซลล์ microglial ถูกขยาย (p<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">เอ็กไคนาโคไซด์(10 หรือ 50 มก./กก.)-หนูที่ได้รับการบำบัดแล้ว จำนวนเซลล์ไมโครไกลอัลที่ถูกกระตุ้นลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และร่างกายของเซลล์ไมโครเกลียนั้นบาง [F(2, 13)=6.2, p<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

ผลของ Echinacoside ต่อการลดลงที่เกิดจากกรด Kainic ในระดับของ Hippocampal Phospho-Akt, Phospho-Glycogen Synthase Kinase 3 และ Bcl-2

ระดับของ phosphorylated Akt (pAkt) (Ser473), phosphorylated GSK3 (pGSK3 ) (Ser9) และ Bcl-2 ถูกตรวจสอบในฮิบโปแคมปัส (รูปที่ 6) การแสดงออก pAkt, pGSK-3 และ Bcl-2 ในฮิบโปแคมปัสลดลงอย่างมากในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยกรดไคนิกที่ 4 ชั่วโมงเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (กลุ่มควบคุม) (p<0.001). however,="" pretreatment="" with="">เอ็กไคนาโคไซด์(10 หรือ 50 มก./กก.) เพิ่มระดับของ pAkt, pGSK3 และ Bcl-2 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วยกรดไคนิกเพียงอย่างเดียว [pAkt, F(3, 19)=69.5, p<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

อภิปรายผล

หลักฐานบ่งชี้ว่ากลูตาเมตมีบทบาทสำคัญในพยาธิสรีรวิทยาของโรคลมชัก^17,18) สมมติฐานกลูตาเมตริกของโรคลมบ้าหมูแสดงให้เห็นว่ากระบวนการ epileptogenic เกี่ยวข้องกับความเข้มข้นของกลูตาเมตที่เพิ่มขึ้นในสมองและการลดลงของความเข้มข้นของสารสื่อประสาทนี้สามารถผลิตฤทธิ์กันชักได้^38–40) จากการศึกษาห้องปฏิบัติการของเราพบว่าเอ็กไคนาโคไซด์สามารถลดการปล่อยกลูตาเมตจากปลายประสาท และแนะนำว่าอิไคนาโคไซด์มีแนวโน้มที่จะมีฤทธิ์ต้านลมบ้าหมู17) ข้อเสนอแนะนี้ได้รับการยืนยันในการศึกษาปัจจุบันโดยใช้แบบจำลองหนูที่ฉีดกรดไคนิก กรดไคนิก ซึ่งเป็นอนุพันธ์ของกลูตาเมต มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการกระตุ้นโรคลมบ้าหมูในการศึกษาในสัตว์ทดลอง เนื่องจากลักษณะทางระบบประสาทและทางชีวเคมีของกรดไคนิคนั้นคล้ายคลึงกับในมนุษย์^23,24)

การฉีดกรดไคนิกเข้าไปในหนูทำให้เกิดอาการชักและความเสียหายของเส้นประสาท โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริเวณ CA3 ของฮิบโปแคมปัส^41–43) นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่เกิดจากกรดไคนิกยังสัมพันธ์กับการปลดปล่อยกลูตาเมตจำนวนมาก^41,44,45) ตามข้อตกลงกับการค้นพบนี้ เราสังเกตว่าการให้กรดไคนิกในช่องท้อง (15 มก./กก.) ทำให้เกิดพฤติกรรมการชัก ระดับกลูตาเมตในฮิบโปแคมปัสเพิ่มขึ้น และทำให้เซลล์เสี้ยมสูญเสียไปในภูมิภาค CA3 ของฮิปโปแคมปัส การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพที่เกิดจากกรดไคนิกเหล่านี้ถูกทำให้อ่อนลงโดยการปรับสภาพภายในช่องท้องด้วยเอ็กไคนาโคไซด์(10 หรือ 50 มก./กก.) นอกจากนี้ การบาดเจ็บของเซลล์ประสาท CA3 ของฮิปโปแคมปัสที่ประเมินโดยการสลับโครงสร้างแบบพิเศษด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านยังได้รับการบรรเทาโดยเอ็กไคนาโคไซด์ในหนูที่มีกรดไคนิค นอกจากนี้ยังพบ autophagosomes จำนวนมากขึ้นในเซลล์ CA3 หลังการให้กรดไคนิก การปรับสภาพด้วย echinacoside ยับยั้งการก่อตัวของ autophagosomes ที่เพิ่มขึ้น การศึกษาก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้น autophagy เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ประสาทที่เกิดจากกรด kainic และการยับยั้งกระบวนการ autophagy ดูเหมือนจะป้องกันระบบประสาท^46,47) แม้ว่ากลไกที่อยู่ภายใต้ฤทธิ์ต้านโรคลมชักของเอ็กไคนาโคไซด์จำเป็นต้องมีการสำรวจเพิ่มเติม ฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทของอิชินาโคไซด์ในแบบจำลองสัตว์ที่มีกรดไคนิกอาจเป็นผลมาจากฤทธิ์ต้านโรคลมชักผ่านการยับยั้งความเป็นพิษของกลูตาเมตและการกระตุ้น autophagy

การอักเสบของระบบประสาทมีส่วนอย่างมากในการชะลอความเสียหายของสมองหลังจากได้รับบาดเจ็บเฉียบพลันและส่งผลเสียต่อผลลัพธ์ทางระบบประสาท²⁷) การตอบสนองการอักเสบ เช่น การกระตุ้นไมโครเกลียและการผลิตไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ ได้รับการอธิบายไว้ในโรคลมบ้าหมูของมนุษย์และในแบบจำลองการทดลองของโรคลมบ้าหมู^36,48) นอกจากนี้ การปล่อยไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบจากเซลล์ไมโครเกลียที่กระตุ้นจะส่งเสริมความเสียหายของเส้นประสาทที่เกิดจากกรดไคนิกในฮิบโปแคมปัส^36,37) เราแสดงให้เห็นว่าในขณะที่กรดไคนิกเพิ่มการกระตุ้นของไมโครเกลียและการแสดงออกของยีนของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (อินเตอร์ลิวคิน-1 อินเตอร์ลิวคิน-6 และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก- ) ในฮิบโปแคมปัส ผลกระทบเหล่านี้ถูกระงับโดยเอ็กไคนาโคไซด์การปรับสภาพ ดังนั้น เราขอแนะนำว่าเอ็กไคนาโคไซด์ผ่านการยับยั้งกระบวนการอักเสบอาจส่งผลต่อฤทธิ์ต้านโรคลมชักและการป้องกันระบบประสาทในแบบจำลองสัตว์กรดไคนิก ตามที่ได้สังเกตจากการศึกษาก่อนหน้านี้ ยาหลายชนิดและผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติยังให้ฤทธิ์กันชักและป้องกันระบบประสาทต่ออาการชักที่เกิดจากกรดไคนิกด้วยฤทธิ์ต้านการอักเสบของยาดังกล่าว^31,33,35)

น้ำตกสัญญาณโปรตีนไคเนสจำนวนมากถูกกระตุ้นโดยกรดไคนิกซึ่งมีบทบาทสำคัญในการป้องกันระบบประสาท ในบรรดาผู้ที่ดูเหมือนจะมีส่วนร่วมอย่างมากโดยเฉพาะคือ Akt^49,50,) Akt ไกล่เกลี่ยผลกระทบต่อระบบประสาทโดยกระตุ้นซับสเตรตดาวน์สตรีมต่างๆ ซึ่งรวมถึง GSK-3 และ Bcl-2 Akt phosphorylates GSK-3 ที่ Ser9 ซึ่งนำไปสู่การหยุดทำงานและการเสริมแรงของการอยู่รอดของเซลล์ประสาท51) เนื่องจากรูปแบบที่ออกฤทธิ์ของ GSK-3 กระตุ้นเส้นทางการตายของไมโตคอนเดรีย^52,53) Bcl-2 เป็นสมาชิกหลักของกลุ่มแอนติ-อะพอพโทซิส Bcl-2 และมีบทบาทสำคัญในการยับยั้งการตายของเซลล์อะพอพโทติกที่มีไมโตคอนเดรียเป็นสื่อกลาง ตัวอย่างเช่น Bcl-2 สามารถปกป้องความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและปิดกั้นการปลดปล่อยไซโตโครมซีจากไมโตคอนเดรีย ซึ่งนำไปสู่การอยู่รอดของเซลล์และการยับยั้งการตายของเซลล์⁵⁴) ยังมีรายงานอีกด้วยว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ Bcl-2 ปกป้องเซลล์ประสาทจากการดูถูก excitotoxic ในหลอดทดลองและในร่างกาย 54,55) การศึกษาในปัจจุบันพบว่ามีฟอสโฟรีเลชั่น Akt (Ser473) และ GSK3 (Ser9) ที่ลดลง รวมทั้งการแสดงออกของ Bcl-2 ในฮิบโปแคมปัสของหนูที่ได้รับกรดไคนิก ซึ่งเป็นไปตามการศึกษาก่อนหน้านี้^56,57) นอกจากนี้ การปรับสภาพเอไคนาโคไซด์ช่วยการลดลงที่เกิดจากกรดไคนิกใน pAkt และ pGSK3 รวมทั้งการแสดงออกของ Bcl-2 ดังนั้น ฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทของเอ็กไคนาโคไซด์ในแบบจำลองสัตว์ที่มีกรดไคนิกอาจถูกสื่อกลางบางส่วนโดยการป้องกันการปรับลดวิถีทาง Akt/GSK-3 /Bcl-2 ซึ่งส่งผลให้การอยู่รอดของเซลล์ประสาทเพิ่มขึ้น

เอ็กไคนาโคไซด์เป็นผู้สมัครการรักษาที่มีศักยภาพใหม่ นี้เป็นเพราะเอ็กไคนาโคไซด์สามารถเข้าสู่สมองและแสดงประโยชน์มากมาย⁵⁸) การศึกษาจำนวนมากได้แสดงให้เห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ลดความเสียหายของสมองและบรรเทาความบกพร่องของมอเตอร์หรือหน่วยความจำในแบบจำลองการทดลองต่างๆ ในร่างกาย^12,14,15,59) แม้ว่ากลไกที่รองรับผลกระทบต่อระบบประสาทของเอ็กไคนาโคไซด์ในสมองจำเป็นต้องมีการอธิบาย การยับยั้งการอักเสบของเส้นประสาท การต้านอนุมูลอิสระ การขับอนุมูลอิสระที่ปราศจากออกซิเจน และการสร้างเซลล์ประสาทที่เพิ่มขึ้นนั้นเกี่ยวข้อง^14–16) นอกเหนือจากกลไกที่เป็นไปได้เหล่านี้แล้ว¹⁷) และผลลัพธ์ในปัจจุบันชี้ให้เห็นว่าการยับยั้งการกระตุ้นมากเกินไปของกลูตาเมตอาจมีส่วนทำให้เกิดผลในการป้องกันระบบประสาทและยากันชักของเอ็กไคนาโคไซด์ในสมอง สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนโดยข้อเท็จจริงที่ว่ากิจกรรมชักที่เกิดจากกรดไคนิก การอักเสบของเส้นประสาท และความเสียหายของสมองนั้นสัมพันธ์กับการปล่อยกลูตาเมตที่มากเกินไปและการกระตุ้นตัวรับกลูตาเมต^44,45) นอกจากนี้ ยากันชักที่ใช้ทางคลินิกหลายชนิดได้รับการแสดงเพื่อลดกิจกรรมการจับกุมที่เกิดจากกรดไคนิก 60,61) และลดการปล่อยกลูตาเมตในเนื้อเยื่อสมองของมนุษย์และหนู^62,63) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าระดับกลูตาเมตที่ลดลงมีความสำคัญต่อผลทางเภสัชบำบัดของยากันชัก

โดยสรุป ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าเอ็กไคนาโคไซด์ผ่านการยับยั้งกระบวนการอักเสบ การลดการกระตุ้นมากเกินไปที่มีกลูตาเมตเป็นสื่อกลาง ตลอดจนการเพิ่มการกระตุ้น Akt/GSK-3 และการแสดงออกของ Bcl-2 มีผลต้านโรคลมบ้าหมูและป้องกันระบบประสาทในหนูที่ได้รับการฉีดกรดไคนิกอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าบทบาทของเอ็กไคนาโคไซด์ในผู้ป่วยโรคลมบ้าหมูต้องได้รับการประเมินเพิ่มเติม ผลการวิจัยของเราชี้ให้เห็นว่าอาจเป็นแนวทางที่มีคุณค่าในการรักษาโรคลมบ้าหมู

รับทราบ

ผู้เขียนขอขอบคุณ Mr. Yen-Sheng Wu จากห้องปฏิบัติการกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของ Tzong Jwo Jang วิทยาลัยแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยคาธอลิก Fu Jen งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากกระทรวงวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (MOST 103-2320-B-030-001 MY3)

ขัดผลประโยชน์

ผู้เขียนประกาศไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์