การฉีดวัคซีน DNA ทำให้เกิดภูมิคุ้มกันป้องกันการติดเชื้อ SARS CoV-2 ในหนูแฮมสเตอร์

รูปที่ 2 การตอบสนองของแอนติบอดีในหนูหลังการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีน SARS-CoV และ SARS-CoV-2 S DNA

(A) หนู BALB/c (n=4 ต่อกลุ่ม) ได้รับการฉีดวัคซีนเข้ากล้ามสองครั้งในช่วงเวลา 3- สัปดาห์โดยมีพลาสมิดที่ระบุ 100 ไมโครกรัม ตามด้วยอิเล็กโตรโพเรชั่น ตัวอย่างซีรั่มถูกเก็บ ณ จุดเวลาที่ระบุหลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก (BD, F, G) แอนติบอดีต่อโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2, บริเวณ S2 และ RBD ได้รับการประเมินโดย ELISA (E, H) แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่เกิดจากวัคซีนเพื่อต้าน SARS-CoV-2 ได้รับการประเมินโดยการทดสอบการทำให้เป็นกลาง ไทเทอร์แอนติบอดีจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และไทเทอร์การทำให้เป็นกลางจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ยเรขาคณิตด้วยช่วงความเชื่อมั่น 95% *หน้า<0.05 by the Mann-Whitney test.

เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมว่าการแทนที่ลำดับผู้นำสามารถเพิ่มการหลั่งโปรตีนได้หรือไม่ เราใช้ลำดับผู้นำจากตัวกระตุ้นเนื้อเยื่อ-พลาสมิโนเจนเพื่อหลอมรวมโปรตีน SARS-CoV-2 S ในรูปแบบต่างๆ ตัวแปรทั้งหมดมีบริเวณ RBD ของโปรตีน SARS-CoV-2 S หลังจากการฉีดวัคซีน DNA สองโดส ซีรั่มที่เก็บในสัปดาห์ที่ 4 และสัปดาห์ที่ 6 จะถูกวิเคราะห์เพื่อหาแอนติบอดี IgG และไตเตอร์ของแอนติบอดีที่เป็นกลาง การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย ptSARS2-S กระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีไทเทอร์ต่อโปรตีน S แบบเต็มความยาวในสัปดาห์ที่ 4 สูงกว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย ptRBD, ptRBDTM และ ptSdTM (รูป S1A). ไทเทอร์แอนติบอดีต้าน RBD ของการสร้างภูมิคุ้มกัน ptRBD สูงกว่าไตเตอร์ของแอนติบอดี ptSARS2-S (1496.2 เทียบกับ 530.9, p=0.057) ในสัปดาห์ที่ 4 (รูป S1B). อย่างไรก็ตาม การฉีดวัคซีน ptRBD และ ptSARS2-S ทำให้เกิดระดับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในระดับที่ใกล้เคียงกันในสัปดาห์ที่ 4 (รูป S1C). ผลลัพธ์เดียวกันนี้ถูกพบในการวิเคราะห์ซีรั่มสัปดาห์ที่ 6; การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย ptRBD ทำให้เกิดระดับของแอนติบอดีต่อต้าน RBD ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการสร้างภูมิคุ้มกันของ ptSARS2-S (12589.3 เทียบกับ 1000.0, p=0.028) แต่มีระดับเดียวกันของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง (9.3 เทียบกับ 9.6 (log2)) (รูปที่ 2F, 2G และ 2H) เนื่องจากตัวแปรที่หลอมรวมลำดับผู้นำ tPA ไม่ได้กระตุ้นให้เกิดไทเทอร์แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางสูงกว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pSARS2-S เราจึงใช้ pSARS2-S เพื่อการตรวจสอบเพิ่มเติม

การจับกันอย่างแข่งขันของซีรั่มแอนติบอดีและ ACE2 กับ SARS-CoV-2 RBD

เพื่อตรวจสอบความสามารถของซีรั่มแอนติบอดีในการรบกวนการทำงานของ ACE2-RBD เราได้ทำการทดสอบทางเซรุ่มวิทยาแบบแข่งขันกับ SARS-CoV-2 ในการสอบวิเคราะห์นี้ ซีรัมแอนติบอดีถูกเติมไปยังเพลต ELISA ที่เคลือบล่วงหน้าด้วยโปรตีน RBD ของ SARS-CoV-2 ตามด้วยการเติมโปรตีน ACE2 ของมนุษย์ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางจำเพาะต่อ SARS-CoV-2 RBD ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง ดังแสดงในรูปที่ 3, ซีรัมแอนติบอดีจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน pSARS2-S จับกับ RBD และจับ ACE2 ที่ถูกบล็อก ซึ่งเทียบเท่ากับแอนติบอดีอ้างอิงประมาณ 353 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในขณะที่ซีรั่ม pSARS-S เทียบเท่ากับแอนติบอดีอ้างอิง 56 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ดังนั้น ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันของ pSARS2-S สามารถกระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีที่แข่งขันกันซึ่งขัดขวางการจับของ SARS-CoV-2 RBD กับตัวรับ ACE2 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับ ELISA titer เทียบกับ SARS-CoV2 RBD (รูปที่ 2D) และได้รับการสนับสนุนจากการศึกษาเกี่ยวกับความแตกต่างของลำดับ RBD ระหว่าง SARS-CoV และ SARS-CoV-2 [24].

รูปที่ 3 กิจกรรมการแข่งขันของซีรั่มของหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันต่อปฏิกิริยาระหว่าง RBD/ACE2

หนู BALB/c (n=4 ต่อกลุ่ม) ได้รับการก่อภูมิคุ้มกันสองครั้งในช่วงเวลา 3- สัปดาห์โดยมีเวกเตอร์, pSARS-S หรือ pSARS 100 ไมโครกรัม2- S ตามด้วยอิเล็กโตรโพเรชัน ตัวอย่างซีรั่มถูกเก็บในสัปดาห์ที่ 8 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก แอนติบอดีในซีรั่มที่แข่งขันกับ ACE2 สำหรับการจับ RBD ได้รับการประเมินโดยการสอบวิเคราะห์ทางซีรัมวิทยา SARS-CoV{8}} แบบแข่งขัน กิจกรรมการแข่งขันของซีรั่มของเมาส์แสดงเป็นระดับที่เทียบเท่าของแอนติบอดีต่อต้าน RBD (SARS-CoV-2 สไปค์โปรตีน) (แอนติบอดีอ้างอิง) แอนติบอดีไทเทอร์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM *หน้า<0.05 by the Mann-Whitney test.

วัคซีน SARS-CoV-2 S DNA กระตุ้นภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาว และเสนอการป้องกันข้ามกลุ่มต่อ SARS-CoV-2 ด้วยการกลายพันธุ์ D614G

โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การบำรุงรักษาไทเทอร์แอนติบอดี IgG ในระยะยาวต่อ S แบบเต็มความยาวพบได้ที่ 20 สัปดาห์หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก (รูปที่ 4A). ค่าเฉลี่ยทางเรขาคณิตของไทเตอร์ (log2) สำหรับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางสำหรับ SARS-CoV-2 อยู่ที่ 10.8 ในสัปดาห์ที่ 8 หลังการฉีดวัคซีน pSARS2-S ซึ่งลดลงเล็กน้อยเป็น 9.1 ในสัปดาห์ที่ 12 และเหลือ 8.8 ในสัปดาห์ที่ 20 (รูปที่ 4B). ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันโรคด้วย pSARS2-S ให้การตอบสนองทางร่างกายต่อ SARS-CoV-2 เป็นเวลานาน นอกจากนี้ วัคซีน pSARS2-S DNA ที่มีจีโนไทป์ D614 ยังชักนำให้เกิดการตอบสนองของแอนติบอดีที่เป็นกลางต่อไวรัสที่มีการกลายพันธุ์ของ D614G (รูปที่ 4ค) ซึ่งคล้ายกับไทเทอร์การทำให้เป็นกลางต่อจีโนไทป์ D614 ดังนั้น pSARS2-S จึงสามารถให้การป้องกันข้ามสายพันธุ์กับ SARS-CoV สายพันธุ์ D614G ที่แพร่หลายและโดดเด่นที่สุดได้-2

รูปที่ 4 วัคซีน SARS-CoV-2 S DNA กระตุ้นภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาวและการป้องกันข้ามกับ SARS-CoV-2 ด้วยการกลายพันธุ์ D614G

หนู BALB/c (n=4 ต่อกลุ่ม) ได้รับการสร้างภูมิต้านทานเข้ากล้ามสามครั้งในช่วงเวลา 3- สัปดาห์โดยมีเวกเตอร์, pSARS-S หรือ pSARS 100 ไมโครกรัม2- S ตามด้วยอิเล็กโตรโพเรชัน ตัวอย่างซีรั่มถูกเก็บ ณ จุดเวลาที่ระบุหลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก (A) แอนติบอดีต่อโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ได้รับการประเมินโดย ELISA (B, C) ฤทธิ์การทำให้เป็นกลางที่เกิดจากวัคซีนเพื่อต่อต้าน SARS-CoV-2 ด้วยจีโนไทป์ D614 หรือ G614 ได้รับการประเมินโดยการสอบวิเคราะห์การทำให้เป็นกลาง ไทเทอร์แอนติบอดีจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และไทเทอร์การทำให้เป็นกลางจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ยเรขาคณิตด้วยช่วงความเชื่อมั่น 95% *หน้า<0.05 by the Mann-Whitney test.

การเหนี่ยวนำของการตอบสนองแบบเอนเอียง1- หรือ2-

ทีเซลล์เอฟเฟคเตอร์ CD4+ สามารถแบ่งย่อยออกเป็นชุดย่อยการทำงานหลักสองชุด คือ Th1 และ Th2 โดยมีพื้นฐานอยู่บนไซโตไคน์ที่ถูกคัดหลั่งเมื่อถูกกระตุ้น เซลล์ Th1 ผลิตไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ (IFN-) และมีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีเซลล์เป็นสื่อกลางต่อแบคทีเรียและไวรัสในเซลล์ ในขณะที่เซลล์ Th2 หลั่งออกมาส่วนใหญ่ช่วยให้บีเซลล์ผลิตแอนติบอดี แต่ยังส่งเสริมภูมิคุ้มกันที่มีอีโอซิโนฟิลเป็นสื่อกลาง (IL-5 และ IL{ {9}}) ซึ่งส่งผลให้เกิดการตอบสนองทางร่างกายหรือการแพ้ [25, 26] นอกจากนี้ กลไกที่ขึ้นกับเซลล์ Th2 อาจมีส่วนทำให้เกิดโรคทางเดินหายใจที่เพิ่มขึ้นที่เกี่ยวข้องกับวัคซีน (VAERD) ดังที่แสดงไว้ในการศึกษาเกี่ยวกับตัวเลือกวัคซีน SARS-CoV27, 28] ซึ่งเน้นย้ำว่าการตอบสนองของทีเซลล์ที่สมดุลเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการพัฒนาวัคซีนป้องกันโควิด-19 ที่ปลอดภัย [29] เพื่อแก้ไขปัญหานี้ หนู BALB/c และ C57BL/6 ได้รับการภูมิคุ้มกันด้วยเวกเตอร์, pSARS-S และ pSARS2-S สองครั้งในช่วงเวลา 3- สัปดาห์ หนูถูกสังเวย 7 วันหลังการฉีดวัคซีนครั้งที่สอง และเซลล์ม้ามถูกกระตุ้นด้วยโปรตีน SARS-CoV-2 S (5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 3 วัน ในหนูเมาส์ BALB/c (รูปที่ 5A–5D) การหลั่งของไซโตไคน์ประเภท Th1 IFN- (19641.3 pg/mL ± 8823.5) และ IL-2 (599.5 pg/mL ± 37.7) มีสูงหลังการกระตุ้นด้วย S โปรตีนใน pSARS2- กลุ่มการสร้างภูมิคุ้มกัน แต่ตรวจพบระดับต่ำมากของไซโตไคน์ประเภท Th2 IL-5 (18.1 pg/mL ± 11.8) และ IL-13 (567.2 pg/mL ± 166.2) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันถูกพบในหนู C57BL/6, กลุ่มการสร้างภูมิคุ้มกัน pSARS2-S กระตุ้นให้เกิดปริมาณ IFN- (33918.8 pg/mL ± 11646.1) และ IL-2 (800.3 pg/mL ± 109.5) ที่สูงกว่านั้น ของ IL-5 (4.6 พิโกกรัม/มิลลิลิตร ± 2.9) และ IL-13 (545.7 พิโกกรัม/มิลลิลิตร ± 117.4) (รูปที่ 5E–5H). ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า pSARS2-S สามารถกระตุ้น1-การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีอคติได้

รูปที่ 5 การตอบสนองของทีเซลล์ในหนูหลังการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีน pSARS-S และ SARS2-S DNA

หนู BALB/c (AD) และ C57BL/6 (EH) (n=4 ต่อกลุ่ม) ได้รับการภูมิคุ้มกันในกล้ามเนื้อสองครั้งที่ช่วง 3- สัปดาห์ด้วยเวกเตอร์, pSARS-S หรือ pSARS 100 ไมโครกรัม{{ 8}}S ตามด้วยอิเล็กโตรโพเรชัน เซลล์ม้ามถูกรวบรวมในสัปดาห์ที่ 4 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก และระดับของ IFN- (A, E), IL{11}} (B, F), IL{12}} (C, G) และ IL ที่หลั่งออกมา -13 (D, H) ได้รับการประเมินหลังการฟื้นฟูด้วยโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 ชนิดลูกผสม แอนติบอดีไทเทอร์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM *หน้า<0.05 by the Mann-Whitney test.

ความท้าทายด้านประสิทธิภาพในการป้องกันโรคของวัคซีน DNA ต่อโรค SARS-CoV-2

เพื่อสำรวจประสิทธิภาพในการป้องกันของการฉีดวัคซีน pSARS2-S หนูแฮมสเตอร์ซีเรียได้รับการฉีดวัคซีนสองครั้งด้วย DNA 100 ไมโครกรัมในช่วงเวลา 3- สัปดาห์ และฉีดเข้าจมูกด้วยไวรัส SARS-CoV-2 ในสัปดาห์ที่ 7 (รูปที่ 6A). หลังการฉีดวัคซีน ซีรั่มในสัปดาห์ที่ 4 และสัปดาห์ที่ 6 ถูกรวบรวมสำหรับไทเตอร์ของแอนติบอดีต้านเข็ม (IgG) และการวิเคราะห์ไทเทอร์ของแอนติบอดีที่เป็นกลาง การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pSARS2-S กระตุ้นระดับไทเทอร์แอนติบอดีต่อต้านสไปค์ที่สูงกว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย ptRBD ในสัปดาห์ที่ 4 (1584.9 เทียบกับ 50.1) และสัปดาห์ที่ 6 (1995.3 เทียบกับ 63.1) ในแฮมสเตอร์ (รูปที่ 6B). สอดคล้องกับไทเทอร์ของแอนติบอดีต่อต้านสไปค์ ซีรั่มของหนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับภูมิคุ้มกันโรค pSARS2- เพิ่มไทเทอร์ของแอนติบอดีที่เป็นกลางได้สูงมาก (6.5 ในสัปดาห์ที่ 4 และ 6.4 ในสัปดาห์ที่ 6 (log2)) แต่ซีรั่มของเวกเตอร์หรือ หนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับวัคซีน ptRBD ไม่ได้ (รูปที่ 6ค). หลังจากการท้าทายด้วย SARS-CoV-2 น้ำหนักตัวของหนูแฮมสเตอร์จะได้รับการตรวจสอบทุกวัน การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าระดับไตเตอร์ของไวรัสในปอดของหนูแฮมสเตอร์สูงถึงระดับสูงที่ 3 วันหลังการทดลอง [30] ดังนั้นแฮมสเตอร์ครึ่งหนึ่งจากแต่ละกลุ่มจึงถูกสังเวยในวันที่ 3 และวิเคราะห์ปริมาณไวรัสในปอด น้ำหนักตัวของหนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับการฉีดวัคซีนเวกเตอร์ค่อยๆ ลดลง และเปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวที่สูญเสียไปคือ 11.1% ที่ 6 วันหลังการท้าทาย ในทางตรงกันข้าม การสร้างภูมิคุ้มกันโรคด้วย pSARS2- ช่วยปกป้องแฮมสเตอร์จากการลดน้ำหนักของร่างกาย (รูปที่ 6D). นอกจากนี้ ระดับไทเทอร์ของไวรัสที่ติดเชื้อและจำนวนสำเนา RNA ของไวรัสในกลุ่ม pSARS2-S แสดงการลดลง 2.29 และ 1.37 log10 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเวกเตอร์ (รูปที่ 6E และ 6F). ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันโรคด้วย pSARS2-S ช่วยป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในหนูแฮมสเตอร์ซีเรีย

รูปที่ 6 ประสิทธิภาพในการป้องกันโรคของวัคซีน SARS-CoV-2 S DNA ในแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2-

(A) ระยะเวลาของการฉีดวัคซีน DNA และความท้าทายของ SARS-CoV-2 หนูแฮมสเตอร์ซีเรียได้รับการฉีดวัคซีนเข้ากล้ามสองครั้งในช่วงเวลา 3- สัปดาห์ด้วยการควบคุม 100 ug, pSARS-S หรือ pSARS2- S ตามด้วยการใช้กระแสไฟฟ้า ตัวอย่างซีรั่มถูกเก็บโดยการเก็บตัวอย่างเลือดเรโทรออร์บิทัลในสัปดาห์ที่ 4 และ 6 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ใน 4 สัปดาห์หลังการฉีดวัคซีนครั้งที่สอง หนูแฮมสเตอร์ซีเรียถูกท้าทายด้วย 105 TCID50 SARS-CoV-2 ในจมูก (B) แอนติบอดีต่อโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ได้รับการประเมินโดย ELISA (C) ฤทธิ์การทำให้เป็นกลางที่เกิดจากวัคซีนเพื่อต้าน SARS-CoV-2 ได้รับการประเมินโดยการทดสอบการทำให้เป็นกลาง (D) การเปลี่ยนแปลงของน้ำหนักตัว (%) ของแฮมสเตอร์ถูกบันทึกทุกวันหลังจากการท้าทาย SARS-CoV-2 การหาระดับไวรัส (E) และสำเนา RNA ของไวรัส (F) ในปอดของหนูแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2- ที่ 3 วันหลังการทดสอบถูกกำหนดโดยการทดสอบ TCID50 และ qRT-PCR ตามลำดับ ไทเทอร์แอนติบอดีจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และไทเทอร์การทำให้เป็นกลางจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ยเรขาคณิตด้วยช่วงความเชื่อมั่น 95% *หน้า<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

การอภิปราย

มีการเปิดตัวการทดลองทางคลินิกเกี่ยวกับวัคซีนป้องกันโควิด-19 มากกว่า 80 รายการ และการศึกษาภูมิคุ้มกันและความท้าทายของไวรัสในสัตว์เป็นขั้นตอนสำคัญในกระบวนการพัฒนาวัคซีน วัคซีน DNA สำหรับการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ได้รับการพัฒนาอย่างเข้มข้นสำหรับวิธีการจัดส่งที่แตกต่างกัน อิเล็กโตรโพเรชันเป็นแนวทางที่มีแนวโน้มว่าจะสามารถเพิ่มการส่ง DNA และแอนติเจนของอิมมูโนเจน ในร่างกายได้ มีรายงานการศึกษาวัคซีน DNA สองรายการโดย Yu และคณะ [13] และสมิธ และคณะ [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 การลดลงของปริมาณไวรัสในการล้างหลอดลมหลังการทดสอบ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม สมิธและคณะ พบว่าการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนูและหนูตะเภาด้วย INO-4800 (เข้ารหัส S โปรตีนแบบเต็มความยาว) ด้วยอิเล็กโตรโพเรชันสามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และบล็อกโปรตีน S ที่เกาะติดกับตัวรับ ACE2 แต่ได้ ไม่ได้ให้ข้อมูลความท้าทายของสัตว์ ในรายงานนี้ เราได้ประเมินตัวแปรต่างๆ สำหรับผู้สมัครรับวัคซีน DNA และพบว่า S โปรตีนแบบเต็มความยาวคลื่น (pSARS2-S) มีความเหมาะสมที่สุดสำหรับการศึกษาด้านภูมิคุ้มกันวิทยาเพิ่มเติม แม้ว่า SARS-CoV และ SARS-CoV-2 มีความคล้ายคลึงกัน 76% ใน S โปรตีนของพวกมัน [31, 32], การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pSARS-S ไม่สามารถกระตุ้นแอนติบอดีต่อ RBD ของโปรตีน SARS-CoV-2 S หรือทำให้ไตเตอร์ของแอนติบอดีเป็นกลางต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 (รูปที่ 2). แท้จริงแล้วแอนติบอดีต่อต้าน RBD มีบทบาทสำคัญในการป้องกันการติดเชื้อไวรัส อย่างไรก็ตาม การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย RBD เพียงอย่างเดียว (ptRBD) ทำให้เกิดไทเตอร์ของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางสูงในหนูเมาส์ แต่ไม่ใช่ในหนูแฮมสเตอร์ (รูปที่2Hและ6C). เราคาดการณ์ว่าผลลัพธ์นี้อาจเกิดจากการส่งสัญญาณเปปไทด์ (ตัวกระตุ้นเนื้อเยื่อ-พลาสมิโนเจน) ไม่สามารถอำนวยความสะดวกในการหลั่งโปรตีน RBD ในแฮมสเตอร์ กลไกโดยละเอียดต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมในอนาคต นอกจากนี้เรายังตั้งข้อสังเกตว่า ptRBDTM (การเข้ารหัสส่วนจาก RBD ไปยังโดเมนเมมเบรนของ S) การสร้างภูมิคุ้มกันทำให้เกิดไทเทอร์ของแอนติบอดีที่เป็นกลางต่ำกว่าการสร้างภูมิคุ้มกันของ ptRBD (รูปที่2HและS1C). ผลลัพธ์อาจสะท้อนถึงโครงสร้างที่ไม่เสถียรของโปรตีน RBD-TM เพื่อตรวจสอบการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th1/Th2 เพิ่มเติม ม้ามโตจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันถูกกระตุ้นด้วยโปรตีน SARS-CoV-2 S เราพบว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยโรค pSARS2-S ทำให้เกิดการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันแบบ Th1- ที่มีอคติอย่างรุนแรง โดยมีการหลั่ง IFN- - ในระดับที่สูงขึ้นหลังการกระตุ้น (รูปที่ 5) แต่การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pSARS-S ทำให้เกิดการหลั่ง IFN{1}} ในระดับต่ำเท่านั้น ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าปฏิกิริยาข้ามของการตอบสนองของทีเซลล์ระหว่างสไปค์โปรตีนของ SARS-CoV และ SARS-CoV-2 ไม่สูง (รูปที่ 5). นอกจากนี้ การสอบวิเคราะห์ IFN-ELISPOT เผยว่าการตอบสนองของทีเซลล์น้อยลงถูกตรวจพบต่อบริเวณ S1 ในหนูเมาส์ C57BL/6 และ BALB/c ที่ได้รับการก่อภูมิคุ้มกันด้วย pSARS-S (รูป S2) ซึ่งได้รับการสนับสนุนโดยการศึกษาของ Smith [12] ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าวัคซีนโรคซาร์สอาจไม่สามารถป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ได้เต็มที่ การพัฒนาวัคซีน DNA มีความสำคัญต่อการตอบสนองอย่างรวดเร็วต่อการติดเชื้อไวรัสโคโรนาที่แพร่ระบาด ดังนั้น ความสำเร็จของวัคซีน DNA ในการป้องกันโรคซาร์ส-CoV-2 จึงสามารถนำไปใช้กับโรคติดเชื้ออื่นๆ ที่เกิดขึ้นได้

โครงสร้างต่างๆ ที่ใช้ในวัคซีน DNA ของ SARS-SoV-2 กระตุ้นให้เกิดระดับไทเทอร์ของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในระดับต่างๆ ลำดับผู้นำ tPA ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มการแสดงออกของแอนติเจนและการหลั่งในวัคซีน DNA21, 33–35] อย่างไรก็ตาม ลำดับตัวนำ tPA ไม่ได้เพิ่มไทเทอร์ของแอนติบอดีในรายงานนี้อย่างมีนัยสำคัญ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีนเพิ่มเติม ลำดับผู้นำที่แตกต่างกันสามารถใช้เพื่อแทนที่ลำดับผู้นำดั้งเดิมของโปรตีนสไปค์ ลำดับผู้นำ IgE ถูกใช้ในวัคซีน DNA INO-4800 และวัคซีน MERS-CoV [5, 12] นอกจากนี้ ลำดับโปรตีนสไปค์ที่ถูกดัดแปลงอาจเพิ่มภูมิคุ้มกันของวัคซีนด้วย สไปค์โปรตีนที่มีความเสถียรได้รับการออกแบบโดยการกลายพันธุ์ตำแหน่งของฟิวรินและบริเวณอื่นๆ เพื่อสร้างโครงสร้างพรีฟิวชัน (S-2P) ที่สามารถเพิ่มการแสดงออกของสไปค์โปรตีน ~10-fold [36] วัคซีน DNA ในอุดมคติควรปรับโครงสร้างพลาสมิด DNA และระบบการนำส่งพลาสมิดให้เหมาะสมเพื่อเพิ่มระดับการแสดงออกของโปรตีน

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

แบบจำลองสัตว์มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาวัคซีนป้องกันโควิด-19 มีการใช้แบบจำลองสัตว์หลายชนิดเพื่อประเมินประสิทธิภาพของวัคซีนป้องกันโควิด-19 รวมถึงสัตว์ในตระกูลไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ [13, 37], หนูเมาส์แปลงพันธุ์ ACE2 ของมนุษย์ [38] และหนูแฮมสเตอร์ซีเรีย [39] หนูแฮมสเตอร์ซีเรีย ACE2 มีความคล้ายคลึงกันสูงกับ ACE2 ของมนุษย์ และความสัมพันธ์ที่ผูกพันกับ S โปรตีนของ SARS-CoV-2 ได้รับการคาดการณ์ไว้สูงกว่า ACE2 ของเมาส์ [40] นี่คือเหตุผลว่าทำไมหนูแปลงพันธุ์ ACE2 ของมนุษย์จึงถูกนำมาใช้เป็นแบบจำลองการท้าทาย SARS-CoV-2 แต่ไม่ใช่หนูพันธุ์ป่า การศึกษาการแพร่กระจายของเชื้อ SARS-CoV-2 แสดงให้เห็นว่าไวรัสสามารถแพร่เชื้อไปยังหนูแฮมสเตอร์ที่ไร้เดียงสาได้อย่างมีประสิทธิภาพผ่านการสัมผัสโดยตรงหรือผ่านละอองลอย [41] การติดเชื้อในจมูกของ SARS-CoV-2 สามารถทำซ้ำและกระตุ้นให้เกิดโรคในปอดของหนูแฮมสเตอร์ซีเรีย [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>ลดลง 5% จากการตรวจวัดพื้นฐาน) ซึ่งสัมพันธ์กับระยะเวลาของโรคที่ยาวนานขึ้น [42] การค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าหนูแฮมสเตอร์ซีเรียยังเป็นสัตว์ทดลองที่เหมาะสมสำหรับการประเมินวัคซีนป้องกันโควิด-19 จากความพร้อมของแบบจำลองสัตว์ เราเลือกแฮมสเตอร์เป็นแบบจำลองการท้าทาย SARS-CoV-2 เพื่อประเมินประสิทธิภาพของวัคซีน ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pSARS2-S แต่ไม่ใช่ ptRBD สามารถกระตุ้นให้เกิดไทเตอร์ที่สูงของแอนติบอดีต่อต้าน Spike IgG และไตเตอร์ของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง (รูปที่ 6B และ 6C). ด้วยเหตุนี้ หนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับภูมิคุ้มกันโรค pSARS2- แต่ไม่ใช่หนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย ptRBD จึงสร้างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อความท้าทายของ SARS-CoV-2 เราตั้งข้อสังเกตว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย ptRBD สามารถกระตุ้นให้เกิดระดับแอนติบอดีที่เป็นกลางในระดับสูงในหนู แต่ไม่ใช่ในหนูแฮมสเตอร์ ผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันอาจเป็นเพราะ RBD เพียงอย่างเดียวไม่สามารถแสดงออกมาได้อย่างเสถียรในแฮมสเตอร์ แบบจำลองของหนูแฮมสเตอร์ยังใช้เพื่อประเมินวัคซีนที่ใช้เวกเตอร์เป็นเวกเตอร์ของอะดีโนไวรัส ซีโรไทป์ 26 (Ad26) (Ad26) ของโควิด-19 การสร้างภูมิคุ้มกันเพียงครั้งเดียวด้วยวัคซีนที่ใช้เวกเตอร์ Ad26 ซึ่งแสดงโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ที่เสถียร ซึ่งกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีที่เป็นกลาง และป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV{-2 ทำให้เกิดการลดน้ำหนัก การเสียชีวิตบางส่วน และการจำลองแบบของไวรัส ในปอด [39] ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแบบจำลองหนูแฮมสเตอร์เหมาะสำหรับการประเมินประสิทธิภาพของวัคซีนป้องกันโควิด-19

ความพยายามมากมายในการพัฒนาวัคซีน SARS-CoV-2 ขึ้นอยู่กับประสบการณ์การวิจัยของ MERS-CoV และ SARS-CoV ทั่วโลก วัคซีนป้องกันโควิด-19 หลายรายการได้รับการอนุมัติให้ใช้ในกรณีฉุกเฉินในเดือนธันวาคม 2020 รวมถึงวัคซีนป้องกันโควิดที่ใช้ RNA และ adenovirus เป็นพาหะนำโรค-19 มีการพูดคุยถึงข้อดีและข้อเสียของแพลตฟอร์มวัคซีนต่างๆ [43] วัคซีนเวกเตอร์ Adenovirus อาจกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งกว่าวัคซีน DNA และ mRNA แต่ประสิทธิภาพของวัคซีนอาจลดลงได้ด้วยภูมิคุ้มกันที่มีอยู่ก่อนต่อเวกเตอร์โฆษณา [44] เมื่อเทียบกับวัคซีน DNA แล้ว วัคซีน mRNA ต้องการอุณหภูมิที่ต่ำมากในการจัดเก็บและขนส่ง [45] ดังนั้นวัคซีน DNA อาจเป็นแพลตฟอร์มวัคซีนที่มีศักยภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีฉุกเฉิน

การศึกษาของเราชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของวัคซีน DNA สำหรับมนุษย์ การศึกษาเพิ่มเติมสามารถตรวจสอบประสิทธิภาพของวัคซีน DNA ที่ส่งโดยใช้การฉีดเข้าใต้ผิวหนัง (ID) ซึ่งสะดวกกว่าสำหรับการใช้งานทางคลินิก เนื่องจากเข็มสำหรับการฉีด IM มีความลึกประมาณ 18 มม. ในมนุษย์ และส่งผลกระทบต่อเนื้อเยื่อมากกว่าการฉีด ID ด้วย EP นอกจากนี้ ควรทดสอบประสิทธิภาพของวัคซีนในหนูสูงอายุเพื่อเป็นต้นแบบในมนุษย์สูงอายุ เนื่องจากประชากรกลุ่มนี้จะได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงเป็นพิเศษเมื่อติดเชื้อ SARS-CoV-2 การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการตอบสนองของเซลล์ Th2 มีความเกี่ยวข้องกับโรคระบบทางเดินหายใจที่เพิ่มขึ้น (VAERD) หลังจากการฉีดวัคซีนไวรัสชนิดเชื้อตายเพื่อต่อต้าน RSV46], ไวรัสโรคหัด [47] และ SARS-CoV [27, 48] ในทางตรงกันข้าม มีกรณีที่รุนแรงน้อยกว่าของ SARS-CoV ซึ่งเป็นผลมาจากการเหนี่ยวนำการตอบสนองของเซลล์ Th1 ที่มีการรายงาน [49] ดังนั้น การตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันแบบอคติที่แข็งแกร่ง1-ที่เกิดจากวัคซีน DNA ชี้ให้เห็นว่าผลข้างเคียงไม่น่าจะเป็นปัญหาสำคัญ [50] นอกจากนี้ ความกังวลเกี่ยวกับวัคซีนที่ใช้โปรตีนได้รับการหยิบยกขึ้นมาเนื่องจากการใช้เกลืออลูมิเนียมหรือสารเสริมประเภทอิมัลชันน้ำมันในน้ำ ซึ่งนำไปสู่2-การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันแบบลำเอียงและเพิ่มผลข้างเคียงที่อาจเกิดขึ้น [51, 52] โดยสรุป วัคซีน DNA ของโควิด-19 อาจมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการแพร่ระบาดของโควิด-19 ในอนาคตอันใกล้นี้

อ้างอิง

1. พัก เอ, อเดกโบเย โอเอ, อเดคุนเล ไอ, ราห์มาน KM, แม็คไบรด์ อีเอส, ไอเซน ดีพี. ผลที่ตามมาทางเศรษฐกิจของการระบาดของโควิด-19: ความจำเป็นในการเตรียมพร้อมรับมือกับโรคระบาด สาธารณสุขแนวหน้า. 2020;8:241. เที่ยงคืน:325743072. ศูนย์วิทยาศาสตร์ระบบและวิศวกรรมศาสตร์ (CSSE) [อินเทอร์เน็ต] แดชบอร์ดโควิด-19 มหาวิทยาลัยจอห์น ฮอปกินส์. [อ้างถึง 11 กุมภาพันธ์ 2021] มีจำหน่ายจาก:
2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, และคณะ การมีส่วนร่วมของโปรตีนโครงสร้างของโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงต่อภูมิคุ้มกันในการป้องกัน Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. เที่ยงคืน:15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K และอื่นๆ วัคซีน DNA กระตุ้นให้เกิดการวางตัวเป็นกลางของไวรัสโคโรนาจากโรคซาร์สและภูมิคุ้มกันในการป้องกันในหนู ธรรมชาติ. 2004;428(6982):561–4. เที่ยงคืน:15024391
4. 5. มูธูมานี่ เค, ฟัลซาราโน ดี, รอยเชล เอล, ทิงเจย์ ซี, ฟลิงไก เอส, บียาร์เรอัล ดีโอ และอื่นๆ วัคซีน DNA โปรตีนต่อต้านขัดขวางที่เป็นเอกฉันท์สังเคราะห์กระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันในการป้องกันโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจในตะวันออกกลางในไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ วิทย์แปลเมด 2015;7(301):301ra132. เที่ยงคืน:26290414
5. 6. วัคซีน Krammer F. SARS-CoV-2 อยู่ระหว่างการพัฒนา ธรรมชาติ. 2020;586(7830):516–27. ช่วงเที่ยง:32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. ภูมิคุ้มกันป้องกันต่อผู้สมัครวัคซีนหน่วยย่อย SARS ที่อิงตามโปรตีน Spike: บทเรียนสำหรับการพัฒนาวัคซีนโคโรนาไวรัส เจ อิมมูนอล เรส 2020;2020:7201752. เที่ยงคืน:32695833
7. 8.Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, และคณะ การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายและเซลล์ที่เกิดจากวัคซีน DNA 3a ต่อโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS) หรือโคโรน่าไวรัสที่คล้ายโรคซาร์สในหนู คลินิกวัคซีนอิมมูนอล 2009;16(1):73–7. เที่ยงคืน:18987164
8. 9.โบเวอร์ เจเอฟ, หยาง เอ๊กซ์, โซโดรสกี้ เจ, รอสส์ ทีเอ็ม การกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางด้วยวัคซีน DNA ซึ่งแสดงการละลายของไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ที่มีความเสถียรชนิดที่ 1 ไตรเมอร์ไกลโคโปรตีนในซองจดหมายที่คอนจูเกตเป็น C3d เจ วิโรล. 2004;78(9):4710–9. เที่ยงคืน:15078953
9. 10. ซาคาร์ตชุก เอเอ็น, วิสวานาธาน เอส, โมชายินสกี ไอ, เพตริก เอ็ม, บาบิอุค แอลเอ การเพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีน DNA เพื่อต่อต้านโรคซาร์ส ดีเอ็นเอเซลล์ไบโอล 2007;26(10):721–6. เที่ยงคืน:17665998
10. 11.แกรี่ อีเอ็น,ไวเนอร์ ดีบี วัคซีน DNA: ช่วงเวลาไพรม์ไทม์มาถึงแล้ว Curr Opin อิมมูนอล 2020;65:21–7. เที่ยงคืน:32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J และคณะ ภูมิคุ้มกันของผู้สมัครรับวัคซีน DNA สำหรับโรคโควิด-19 แนทคอม. 2020;11(1):2601. เที่ยงคืน:32433465
12. 13.ยู เจ ทอสตาโนสกี้ LH ปีเตอร์ แอล เมอร์คาโด เอ็นบี แมคมาฮาน เค มาห์โรเคียน เอสเอช และคณะ การป้องกันวัคซีน DNA ต่อ SARS-CoV-2 ในลิงแสม ศาสตร์. 2020;369(6505):806–11. เที่ยงคืน:32434945
13. 14.ยอร์ริตสมา เอสเอชที, โกวานส์ อีเจ, กรูบอร์-เบาก์ บี, วิเจซุนดารา ดีเค. วิธีการจัดส่งเพื่อเพิ่มการดูดซึมของเซลล์และการสร้างภูมิคุ้มกันของวัคซีน DNA วัคซีน. 2016;34(46):5488–94. เที่ยงคืน:27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, และคณะ การตอบสนองอย่างรวดเร็วต่อโรคติดเชื้ออุบัติใหม่—บทเรียนที่เรียนรู้จากการพัฒนาวัคซีน DNA สังเคราะห์ที่มุ่งเป้าไปที่ไวรัสซิกา จุลินทรีย์ติดเชื้อ 2018;20(11–12):676–84. เที่ยงคืน:2955534516.อดัม แอล, ชิตเชค เอ็น, โทโดโรวา บี, โรเซนบัม พี, โจลี ซี, ปูซ์ ซี และอื่นๆ ลายเซ็นโมเลกุลและเซลล์โดยธรรมชาติในผิวหนังก่อนการตอบสนองของทีเซลล์ที่ยาวนานหลังการฉีดวัคซีน DNA ด้วยไฟฟ้า เจ อิมมูนอล. 2020;204(12):3375–88. เที่ยงคืน:32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV และอื่นๆ อุปกรณ์ต้นแบบใหม่สำหรับการนำส่งวัคซีน DNA ที่เสริมด้วยไฟฟ้าด้วยไฟฟ้าพร้อมกันไปยังผิวหนังและกล้ามเนื้อ วัคซีน. 2011;29(39):6771–80. เที่ยงคืน:21199706
16. 18. วิลเลียมส์ เอ็ม, อีวิง ดี, เบลวินส์ เอ็ม, ซัน พี, ซันดาราม AK, ราวิปรากาช KS และคณะ ภูมิคุ้มกันที่เพิ่มขึ้นและประสิทธิภาพในการป้องกันของวัคซีน DNA ไข้เลือดออกชนิดเตตระวาเลนต์โดยใช้กระแสไฟฟ้าและการนำส่งเข้าในผิวหนัง วัคซีน. 2019;37(32):4444–53. เที่ยงคืน:31279565
17. 19. รามกฤษณะ ม. การหาค่าไทเทอร์จุดสิ้นสุด 50% โดยใช้สูตรง่ายๆ เวิลด์ เจ วิโรล 2016;5(2):85–6. เที่ยงคืน:27175354
18. 20.คอร์มาน VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, และคณะ การตรวจหาไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019 (2019-nCoV) โดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ ยูโรเซอร์เวลล์ 2020. เวลาเที่ยง:31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q และอื่นๆ ลำดับสัญญาณของเนื้อเยื่อ plasminogen activator (tPA) ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันของวัคซีนที่ใช้ MVA เพื่อต่อต้านวัณโรค อิมมูนอล เลตต์. 2017;190:51–7. เที่ยงคืน:28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y และคณะ กลไกการหลอมรวมของ 2019-nCoV และตัวยับยั้งฟิวชันที่กำหนดเป้าหมายโดเมน HR1 ในโปรตีนสไปค์ เซลล์โมลอิมมูนอล 2020;17(7):765–7. เที่ยงคืน:32047258