การตรวจหาและการกำหนดลักษณะของอนุภาคนาโนอินทรีย์ที่มีแร่ธาตุในไตของมนุษย์

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

การกลายเป็นปูนนอกมดลูกเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ ของมนุษย์ เช่น หลอดเลือด มะเร็งเรื้อรังไตโรค, และโรคเบาหวานเมลลิตุส แม้ว่าอนุภาคนาโนแร่จะถูกตรวจพบในหลอดเลือดที่แข็งตัว แต่ธรรมชาติและบทบาทของอนุภาคเหล่านี้ในร่างกายมนุษย์ยังคงไม่ชัดเจน ที่นี่เราแสดงเป็นครั้งแรกที่มนุษย์ไตเนื้อเยื่อที่ได้จากระยะสุดท้ายเรื้อรังไตโรคหรือผู้ป่วยมะเร็งไตมีอนุภาคแร่ทรงกลมหลายชั้นที่มีขนาด 50 ถึง 1,500 นาโนเมตร โดยที่ไม่พบอนุภาคใดๆ ในกลุ่มควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ อนุภาคแร่ส่วนใหญ่จะพบในเมทริกซ์นอกเซลล์ที่อยู่รอบๆ ท่อที่บิดเบี้ยว รวบรวมท่อและลูปของ Henle รวมทั้งภายในไซโตพลาสซึมของเซลล์ที่แยกเส้นท่อ และประกอบด้วยแคลเซียมฟอสเฟตโพลีคริสตัลลีนที่คล้ายกับแร่ธาตุที่พบในกระดูกและการกลายเป็นปูนนอกมดลูก ดิไตอนุภาคนาโนแร่ประกอบด้วยโปรตีนในซีรัมหลายชนิดที่ยับยั้งการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในของเหลวในร่างกาย รวมทั้งอัลบูมิน ทารกในครรภ์-A และอะโพลิโปโปรตีน A1 เนื่องจากแร่ธาตุ-อนุภาคนาโนอินทรีย์ไม่เพียงแต่พบในตะกอนที่ตกตะกอน แต่ยังพบในบริเวณที่ปราศจากการกลายเป็นปูนด้วยกล้องจุลทรรศน์ การสังเกตของเราบ่งชี้ว่าอนุภาคนาโนอาจเป็นตัวแทนของสารตั้งต้นของการกลายเป็นปูนและนิ่วในไตในมนุษย์

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

การกลายเป็นปูนนอกมดลูกเกี่ยวข้องกับหลอดเลือด, มะเร็ง,เรื้อรังไตโรคและเบาหวาน1–3. การศึกษาล่าสุดระบุว่าหลอดเลือดและเรื้อรังไตโรคผู้ป่วยที่มีสัญญาณของการกลายเป็นปูนในหลอดเลือดมีความเสี่ยงที่จะเจ็บป่วยและเสียชีวิตเพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าการกลายเป็นปูนนอกมดลูกเป็นอันตรายต่อสุขภาพของมนุษย์1,3 นอกจากนี้ยังพบการกลายเป็นปูนที่ไม่ต้องการในบุคคลที่มีอายุมากขึ้น และคนส่วนใหญ่ที่อายุเกิน 60 ปีจะแสดงสัญญาณของการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด4 ด้วยเหตุผลเหล่านี้ การถอดรหัสปัจจัยที่ก่อให้เกิดการกลายเป็นปูนนอกมดลูกและการพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพจึงเป็นเป้าหมายที่สำคัญ

การกลายเป็นปูนนอกมดลูกสามารถกำหนดได้ว่าเป็นความไม่สมดุลระหว่างตัวยับยั้งและตัวกระตุ้นการกลายเป็นปูนในร่างกาย สารยับยั้งการกลายเป็นปูน ได้แก่ โปรตีนในซีรัม เช่น อัลบูมิน เฟทูอิน-เอ ออสทีโอพอนติน และโปรตีน GLA ของเมทริกซ์ ตลอดจนสารประกอบขนาดเล็ก เช่น ไพโรฟอสเฟต ในขณะที่ภาวะโซเดียมในเลือดสูงและการอักเสบเป็นตัวกระตุ้นที่สำคัญของการกลายเป็นปูน5–7 การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ระบุว่าตัวกระตุ้นการกลายเป็นปูนจะกระตุ้นกระบวนการของเซลล์ที่คล้ายกับการสร้างกระดูกระหว่างการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด7,8 ถุงเมทริกซ์ที่คล้ายกับที่กระตุ้นการสร้างแร่ธาตุในกระดูกที่กำลังพัฒนายังถูกตรวจพบในเนื้อเยื่ออ่อนที่กลายเป็นหินปูน7–9 ถุงเมทริกซ์เหล่านี้น่าจะปล่อยออกมาจากเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด ซึ่งแยกออกเป็นเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์สร้างกระดูก ซึ่งทำให้เกิดการกลายเป็นปูน7

ตรวจพบอนุภาคนาโนแร่ (NPs) ในเนื้อเยื่ออ่อนซึ่งแสดงสัญญาณของการกลายเป็นปูนนอกมดลูก ราคาและอื่น ๆ พบว่าซีรั่มของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย bisphosphonate etidronate หรือวิตามิน D ที่มีแร่ธาตุ-โปรตีนเชิงซ้อนที่มีสารยับยั้งการกลายเป็นปูนของ fetuin-A และ matrix GLA protein10,11 ในทำนองเดียวกัน Jahnen-Dechent และคณะ สังเกตว่าคอมเพล็กซ์แร่ธาตุที่ประกอบด้วย fetuin-A ซึ่งเรียกว่าอนุภาคแคลซิโปรตีน (CPPs) สามารถตรวจพบได้ในน้ำในช่องท้องของผู้ป่วยที่มีภาวะเยื่อบุช่องท้องอักเสบ12 การศึกษาล่าสุดโดย Bertazzo et al. แสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของแร่ธาตุ NPs ในวาล์วเอออร์ตาและหลอดเลือดหัวใจของผู้ป่วยทั้งโรคหลอดเลือดแดงแข็งและรูมาติก ในขณะที่การศึกษาเกี่ยวกับการก่อตัวของอนุภาคแร่มักจะมุ่งเน้นไปที่ระบบหัวใจและหลอดเลือดของมนุษย์ แต่ก็ยังไม่ชัดเจนว่าอนุภาคนั้นอาจพบในเนื้อเยื่ออื่นหรือไม่ และหน่วยงานเหล่านี้มีบทบาทต่อสุขภาพหรือโรคหรือไม่

เราสังเกตก่อนหน้านี้ว่า NPS แร่ธาตุ-อินทรีย์ก่อตัวขึ้นเองตามธรรมชาติในของเหลวในร่างกายของมนุษย์และสัตว์ 14–28 NPs แร่ธาตุเหล่านี้เริ่มแรกอธิบายว่าเป็นนาโนแบคทีเรีย (NB) และเชื่อกันว่าไม่เพียงแต่เป็นเซลล์ที่เล็กที่สุดในโลก 29 แต่ยังเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของการแพร่ของโรคมากมาย รวมถึงโรคอัลไซเมอร์ หลอดเลือด มะเร็งไตหินการก่อตัว polycysticไตโรคและต่อมลูกหมากอักเสบ30–32 อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราได้แสดงให้เห็นว่า NB เป็น NP แร่ธาตุที่ไม่มีชีวิตซึ่งเลียนแบบแบคทีเรียทั่วไปในแง่ของสัณฐานวิทยา การเจริญเติบโต การงอกขยาย และวัฒนธรรมย่อย 15,18,22 ความเป็นไปได้ที่อนุภาคแร่ที่คล้ายกับ NB อาจพบได้ในเนื้อเยื่อของมนุษย์ และอนุภาคเหล่านี้มีบทบาทในโรคหรือไม่

ในการศึกษานี้ เราได้พัฒนาวิธีการนาโนวัสดุเพื่อตรวจหาและวิเคราะห์แร่ธาตุ-อินทรีย์ NP ในมนุษย์ที่เป็นโรคไตเนื้อเยื่อ. เราแสดงให้เห็นว่าเนื้อเยื่อไตจากโรคไตเรื้อรังระยะสุดท้ายและผู้ป่วยมะเร็งไตมี NPs ของแร่ธาตุหลายชั้นที่คล้ายกับอนุภาคแร่ biomimetic ที่ตกตะกอนตามธรรมชาติในของเหลวในร่างกายในหลอดทดลอง ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับองค์ประกอบทางชีวเคมี กลไกการก่อตัว และการทำงานทางชีวภาพของอนุภาคแร่ธาตุและอินทรีย์เหล่านี้ และได้ให้แสงสว่างแก่กลไกของการกลายเป็นปูนนอกมดลูกและการเริ่มต้นของโรคในร่างกายมนุษย์

ผลลัพธ์

เราตรวจดูเนื้อเยื่อไตที่ผ่าตัดเอาออกจากผู้ป่วยในมนุษย์ที่เป็นโรคไตเรื้อรังระยะสุดท้าย (n=2) หรือมะเร็งไต (n=18; ดูตารางที่ 1 สำหรับตัวอย่างมะเร็งไต เราเน้นไปที่การไม่ - ส่วนที่เป็นมะเร็งของเนื้อเยื่อ) เพื่อเป็นการควบคุมที่ดี เราได้ศึกษาการตรวจชิ้นเนื้อไตที่ได้จากผู้ป่วยที่มีอาการบาดเจ็บหรือเลือดคั่ง แต่ไม่มีการทำงานของไตผิดปกติมาก่อน (n=2; ตารางที่ 1)

เนื้อเยื่อไตจากบุคคลที่มีสุขภาพดีมีลักษณะทางจุลกายวิภาคปกติ และไม่พบการกลายเป็นปูนนอกมดลูกหลังจากการย้อมสี von Kossa (รูปที่ 1A, B) ในทางกลับกัน เนื้อเยื่อไตที่ได้จากบุคคลที่เป็นโรคและย้อมด้วย hematoxylin และ eosin (H&E) แสดงให้เห็นหลักฐานของความเสียหายของเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2A–C ระบุด้วยลูกศร) และร้อยละ 80 ของเนื้อเยื่อที่เป็นโรคที่ตรวจสอบพบว่ามีการสะสมของแร่ธาตุตามที่เปิดเผย โดยการย้อมสีฟอน Kossa (รูปที่ 1C–T, รูปที่ 2E,F, การกลายเป็นปูนสามารถมองเห็นได้เป็นวัสดุสีดำที่ระบุโดยลูกศรสีดำ; ดูตารางที่ 1) ด้วย พบตะกอนสะสมในคอร์เทกซ์และไขกระดูก ซึ่งรวมถึงช่องว่างนอกเซลล์รอบ ๆ ทูบูลที่ส่วนปลาย ทูบูลที่เรียงใกล้เคียงกัน รวบรวมท่อและลูปของเฮนเล เช่นเดียวกับไซโทพลาสซึมของเซลล์ที่วาดทิวบูลและท่อ (รูปที่ 1C–T และรูปที่ 1C–T และรูปที่ . 2E, F). ไม่พบการกลายเป็นปูนในเม็ดเลือดของไต (รูปที่ 2D)

เพื่อตรวจสอบธรรมชาติของการตกตะกอนของแร่ธาตุ เราได้เตรียมไตที่บางเฉียบสำหรับการสังเกตโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ในตัวอย่างที่มีแร่สะสมด้วยกล้องจุลทรรศน์ อนุภาคแร่หรือแกรนูลถูกตรวจพบในไซโตพลาสซึมของเซลล์เยื่อบุผิวของไต ในเมทริกซ์นอกเซลล์ใต้เยื่อหุ้มชั้นใต้ดิน และภายในลูเมนของท่อที่ซับซ้อนส่วนต้นและส่วนปลาย (รูปที่ 3A, B อนุภาคจะขยายใหญ่ขึ้น) ในแผง A1–A4 และ B1–B4) NP แร่ยังถูกสังเกตพบภายในเซลล์ที่บุในลูปของ Henle และรวบรวมท่อ (รูปที่ 3C, D, ขยายในแผง C1, C2 และ D1) พบอนุภาคบางตัวภายในถุงน้ำภายในเซลล์ในเซลล์ไต (รูปที่ 3A แผง A1 และ A2) วิธีการด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่ใช้ในที่นี้ช่วยให้เราเห็นภาพภายในของอนุภาคแร่ อนุภาคบางส่วนมีวงแหวนหนาแน่นอิเล็กตรอนสลับกับชั้นแสงอิเล็กตรอนที่สว่าง (รูปที่ 3A แผง A3 และ A4 รูปที่ 3C แผง C1) หลอดเลือดหลายเส้น เช่น vasa recta เช่า (หลอดเลือดแดงตรงของไต) เราล้อมรอบด้วยแร่ธาตุจำนวนมาก (รูปที่ 3D แผง D1) ดังนั้นจึงพบแร่ธาตุ NPs ที่ตำแหน่งต่าง ๆ ในเนื้อเยื่อไตของมนุษย์ทั้งหมดซึ่งแสดงสัญญาณของการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในขณะที่ไม่พบอนุภาคในการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ

อนุภาคแร่ที่พบในเนื้อเยื่อไตดูเหมือนจะคล้ายกันมากกับแร่ธาตุอินทรีย์ NPs ที่อธิบายไว้ก่อตัวขึ้นเองตามธรรมชาติในของเหลวในร่างกายในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา 15,17 (และที่เราเรียกว่า bions24) เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราได้เตรียมแร่ธาตุอินทรีย์ NP (หรือไบออน) โดยใช้วิธีการตกตะกอนตามที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้15 วิธีนี้ประกอบด้วยการเพิ่มไอออนที่ตกตะกอน เช่น แคลเซียมและฟอสเฟตลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ (ตัวกลางของ Eagle หรือ DMEM ที่ดัดแปลงของ Dulbecco) ที่มีของเหลวในร่างกาย เช่น เซรั่มของมนุษย์ (HS) ตามด้วยการฟักตัวในสภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ (ดูวิธีการ) อนุภาคที่ผลิตด้วยวิธีนี้ (HS-NPS) มีลักษณะเป็นทรงกลมหรือทรงรี และแสดงพื้นผิวแร่ที่เรียบหรือเป็นผลึก (รูปที่ 4A–E) คล้ายกับอนุภาคที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในของเหลวในร่างกาย 22,23 เช่นเดียวกับในน้ำในช่องท้องของมนุษย์12 และ หลอดเลือดแดงแข็งตัว13. อนุภาคแร่มีความคล้ายคลึงกันมากกับแร่ธาตุ NPs หรือแกรนูลที่พบในเนื้อเยื่อไตในแง่ของสัณฐานวิทยาโดยรวม โครงสร้างหลายชั้น และลักษณะพื้นผิว (รูปที่ 4F–J) ขนาดของอนุภาคที่ได้มาจาก HS และเม็ดไตยังเปรียบเทียบกันได้ โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลางตั้งแต่ 50 ถึง 1,500 นาโนเมตร (รูปที่ 4A–E,F–J) ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น เม็ดไตบางเม็ดถูกล้อมรอบด้วยเยื่อหุ้มไขมัน ซึ่งอาจเป็นตัวแทนของถุงบรรจุสินค้าภายในเซลล์หรือถุงน้ำเยื่อหุ้มเซลล์นอกเซลล์ (รูปที่ 4H,I เยื่อแสดงด้วยลูกศร) โครงสร้างเมมเบรนดังกล่าวไม่มีอยู่ในตัวอย่าง HS-NP ที่เตรียมในหลอดทดลอง (รูปที่ 4A–E) ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเม็ดไตมีความคล้ายคลึงกับแร่ธาตุอินทรีย์ NPs ที่ประกอบในซีรัม

จากการใช้การวิเคราะห์การเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนในพื้นที่ที่เลือก เราสังเกตว่าเฟสแร่ของ HS-NPs ที่เตรียมล่วงหน้าในหลอดทดลองประกอบด้วยวัสดุนาโนคริสตัลไลน์ (รูปที่ 4E, สิ่งที่ใส่เข้าไป; ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันสำหรับเม็ดไต (รูปที่ 4J สิ่งที่ใส่เข้าไป) และสำหรับกระดูกและการกลายเป็นปูนนอกมดลูกตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้33,35

เราศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของ HS-NP และเม็ดไตโดยใช้เอ็กซ์เรย์สเปกโทรสโกปีแบบกระจายพลังงาน (EDX) HS-NPs แสดงยอดที่สำคัญของคาร์บอน (C), แคลเซียม (Ca), ออกซิเจน (O) และฟอสฟอรัส (P) (รูปที่ 4K) ซึ่งสอดคล้องกับการปรากฏตัวของแร่แคลเซียมฟอสเฟต จุดสูงสุดของซิลิกอน (Si) ต่ำยังถูกบันทึกไว้ใน HS-NPs (รูปที่ 4K) ซึ่งอาจเป็นส่วนประกอบของอนุภาคขนาดเล็ก เม็ดไตยังแสดงพีคของคาร์บอน แคลเซียม ออกซิเจน และฟอสฟอรัส ซึ่งบ่งชี้ถึงแร่ธาตุแคลเซียมฟอสเฟต พร้อมกับยอดเพิ่มเติมของซิลิคอนและเหล็ก (Fe) (รูปที่ 4L) พีคของยูเรเนียม (U) มาจากยูเรนิลอะซิเตตที่ใช้เป็นรีเอเจนต์ที่ตัดกันระหว่างการเตรียมตัวอย่าง (การมีอยู่ของยูเรเนียมในตัวอย่างของอนุภาคแร่บางชนิด เช่น เม็ดไต และไม่มีอยู่ในเนื้อเยื่อควบคุมในรูปที่ 4M อาจมีสาเหตุมาจากค่าสูง ความสัมพันธ์ของยูเรเนียมต่อฟอสเฟต ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้35) สเปกตรัมควบคุม EDX ของเนื้อเยื่อไตที่อยู่รอบๆ อนุภาคแสดงให้เห็นยอดของคาร์บอนและออกซิเจน (รูปที่ 4M) ซึ่งบ่งชี้ว่าแคลเซียมและฟอสฟอรัสส่วนใหญ่พบในอนุภาคแร่

อัตราส่วนแคลเซียม: ฟอสฟอรัส (Ca:P) ของ HS-NP และเม็ดไตแปรผันจาก 0.65 ถึง 1.18 อัตราส่วนเหล่านี้แตกต่างจากค่าทางทฤษฎีที่ 1.67 ที่สังเกตพบสำหรับไฮดรอกซีอะพาไทต์ปริมาณสารสัมพันธ์ แต่ยังอยู่ในช่วงที่เห็นก่อนหน้านี้สำหรับผลึกแคลเซียมฟอสเฟตและอะพาไทต์ที่สังเกตพบที่ระดับการตกผลึกต่างๆ การค้นพบนี้ร่วมกันยืนยันว่าเม็ดไตประกอบด้วยแคลเซียมฟอสเฟต NPs

พบว่าโปรตีนหลายชนิดยับยั้งการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในลักษณะที่เป็นระบบในร่างกาย36,37 นอกจากนี้ เชื่อว่าโปรตีนโคโรนาที่พบบนพื้นผิวของ NPs สังเคราะห์นั้นเชื่อว่าเป็นตัวกำหนดการกระจายทางชีวภาพและผลกระทบของอนุภาคต่อเซลล์ใน vivo38,39 ในทางกลับกัน องค์ประกอบโปรตีนของแร่ธาตุอินทรีย์ NPs ที่พบในเนื้อเยื่อไตของมนุษย์ยังคงไม่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ ก่อนหน้านี้เราพบว่าอัลบูมิน, fetuin-A และ apolipoprotein-A1 (apo-A1) เป็นตัวแทนของโปรตีนหลักที่ทำปฏิกิริยากับแร่ธาตุอินทรีย์ NPs ที่เกิดขึ้นในของเหลวในร่างกาย17,20 ที่นี่เราใช้การติดฉลาก immunogold เพื่อตรวจสอบการมีอยู่และตำแหน่งของโปรตีนเหล่านี้ภายในเม็ดไต

เราใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อต้านซีรัมอัลบูมินของมนุษย์ (HSA), ซีรัม fetuin-A (HSF), apo-1A ของมนุษย์ และ HS ทั้งหมดเพื่อตรวจสอบการมีอยู่ของโปรตีนในซีรัมใน HS-NP และเม็ดไต ความจำเพาะของโพลีโคลนอลแอนติบอดี (เตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้25) ถูกตรวจสอบโดยใช้ Western blotting (รูปที่ 5) โพลีโคลนอลแอนติบอดีแต่ละตัวมีปฏิกิริยาเชิงบวกกับ HS-NPs ที่เตรียมในหลอดทดลอง เช่นเดียวกับเม็ดแร่ที่พบในเนื้อเยื่อไตของมนุษย์ (รูปที่ 6A,B, แผง A1–A3 และ B1–B3; จุดสีดำ) แอนติบอดีทำปฏิกิริยากับชั้นที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นเป็นหลักหรือแกนมืดของ HS-NP และเม็ดไต (รูปที่ 6A, B) ซึ่งบ่งชี้ว่าบริเวณที่มืดเหล่านี้อาจมีโปรตีนในระดับที่สูงกว่าเมื่อเทียบกับบริเวณที่มีแสงอิเล็กตรอน กลุ่มควบคุมเชิงลบที่ดำเนินการโดยไม่มีแอนติบอดีปฐมภูมิไม่ก่อให้เกิดปฏิกิริยา (รูปที่ 6A, B, แผง A4 และ B4, กลุ่มควบคุม) เราสรุปได้ว่าเม็ดไตเป็นตัวแทนของแร่ธาตุอินทรีย์ NP ที่คล้ายกับ HS-NP ที่ไม่เพียงแต่อาศัยสัณฐานวิทยาและองค์ประกอบของแร่ธาตุเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการจับกับสารยับยั้งการกลายเป็นปูนที่สำคัญที่มีอยู่ในซีรัมด้วย

ใช้กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์เพื่อยืนยันการมีอยู่ของเม็ดแร่ที่มี HSA และ HSF ในไตของมนุษย์ที่เป็นโรค โดยใช้เทคนิคนี้ เนื้อเยื่อไตของมนุษย์แสดงให้เห็น

การย้อมสีในเชิงบวกสำหรับโปรตีนทั้งสองในพื้นที่ต่างๆ รวมถึง interstitium รอบ ๆ ท่อไตเช่นเดียวกับไซโตพลาสซึมของเซลล์ที่แยกเส้นท่อ (รูปที่ 7A แผง A1 และ A2) การรวมตัวของโปรตีนที่มีทั้งอัลบูมินและเฟทูอิน-เอยังสังเกตเห็นได้ในบริเวณเหล่านี้ แม้ว่าจะมีปริมาณที่ต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการย้อมสีของโปรตีนเดี่ยว (รูปที่ 7A และแผง A3 การย้อมแบบรวมเป็นสีเหลือง) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราสังเกตเห็นว่าการย้อมโปรตีนที่ตรวจพบโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ซ้อนทับอย่างใกล้ชิดกับรูปแบบของการกลายเป็นปูนนอกมดลูกที่สังเกตได้โดยใช้การย้อมแบบฟอน คอสซ่า (รูปที่ 7A,B การกลายเป็นปูนจะมองเห็นเป็นวัสดุสีดำที่ระบุโดยลูกศรใน B) ผลลัพธ์เหล่านี้ให้การสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับการปรากฏตัวของอนุภาคแร่อินทรีย์ในเนื้อเยื่อไตของมนุษย์ที่ตรวจสอบ

การอภิปราย

ในขณะที่ความเข้าใจของเรามีความก้าวหน้าเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ระหว่าง NP สังเคราะห์และเซลล์ของมนุษย์ เรารู้น้อยกว่ามากเกี่ยวกับผลกระทบของ NP แร่อินทรีย์ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติในของเหลวในร่างกาย การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่าอนุภาคเหล่านี้ก่อตัวในของเหลวชีวภาพเมื่อความเข้มข้นของแคลเซียมและฟอสเฟตเกินความอิ่มตัว15,16 เรายังสังเกตด้วยว่าอนุภาคเหล่านี้ถูกทำให้อยู่ภายในโดยเซลล์ภูมิคุ้มกัน แต่มีเพียงอนุภาคขนาดใหญ่เท่านั้นที่กระตุ้นปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่ก่อให้เกิดการอักเสบ23 อย่างไรก็ตาม การกระจายของอนุภาคเหล่านี้ในเนื้อเยื่อของมนุษย์และไม่ว่าพวกมันจะมีบทบาททางสรีรวิทยาหรือพยาธิวิทยาในร่างกายหรือไม่นั้นยังไม่ได้รับการตรวจสอบ

ในการศึกษานี้ เราตรวจพบ NPs ของแร่ธาตุอินทรีย์ในไตของผู้ป่วยมนุษย์ที่ทุกข์ทรมานจากโรคไตระยะสุดท้ายหรือมะเร็งไตเป็นครั้งแรก Mineralo-organic NPs ที่ตรวจพบมีแคลเซียมฟอสเฟตที่ตกผลึกได้ไม่ดีพอๆ กับแร่ธาตุในกระดูก เช่นเดียวกับ albumin, fetuin-A และ apo-A1 ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งการกลายเป็นปูนในของเหลวในร่างกาย ผลลัพธ์ของเราสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ที่อธิบายการมีอยู่ของคอมเพล็กซ์แร่โปรตีนในเนื้อเยื่อหลอดเลือดและของเหลวในร่างกาย12,13,34,40 เนื่องจากพบอนุภาคที่เราสังเกตพบในบริเวณที่ไม่มีการตกตะกอนด้วยกล้องจุลทรรศน์ การสังเกตของเราแนะนำว่าอนุภาคอาจเป็นตัวแทนของสารตั้งต้นของการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในเนื้อเยื่อของมนุษย์ เนื่องจากมีความเป็นไปได้ที่ NP ของแร่ธาตุ-อินทรีย์อาจค่อยๆ เติบโตในขนาดและได้รับการแปลงอนุภาคเป็นฟิล์มภายใต้สภาวะที่เอื้ออำนวยดังที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา 15,18 การสังเกตที่นำเสนอในที่นี้ชี้ให้เห็นว่าสารตั้งต้นของแร่ธาตุอาจนำไปสู่การก่อตัวของขนาดใหญ่ขึ้น แร่ธาตุที่สะสมในร่างกาย เช่น คราบพลัคของแรนดัลล์ และนิ่วในไต

การสังเกตของเราว่าการกลายเป็นปูนนอกมดลูกของแร่ธาตุและ NPs ของแร่ธาตุอินทรีย์นั้นพบได้ในโครงสร้างทางกายวิภาคต่างๆ ของไต ซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบครั้งก่อนของการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในอวัยวะนี้41 การสังเกตของ Evan et al. ระบุว่าการทำให้เป็นแร่ในไตของผู้ป่วยไตอักเสบอาจเริ่มต้นและเกิดขึ้นอย่างเด่นชัดในเนื้อเยื่อคั่นระหว่างหน้าของลูปของ Henle40,42 ผู้เขียนเหล่านี้ตั้งข้อสังเกตว่าการสะสมของแร่ในบริเวณนี้อาจยื่นออกมาจากด้านฐานของ urothelium และนำไปสู่การก่อตัวของนิ่วในไต การสังเกตของเราแนะนำว่า นอกเหนือจากลูปของ Henle แล้ว บริเวณไตอื่นๆ อาจมีแร่ธาตุ NPs ซึ่งในที่สุดอาจมีวิวัฒนาการเพื่อก่อให้เกิดการสะสมของแร่ธาตุขนาดใหญ่ในไตของมนุษย์ เรากำลังตรวจสอบความเป็นไปได้ที่ NP ของแร่ธาตุที่ก่อตัวในการไหลเวียนโลหิตอาจย้ายไปยังเนื้อเยื่อของไตและทำให้เกิดการกลายเป็นปูนนอกมดลูกและการก่อตัวของนิ่วในไต

เม็ดไตหลายชนิดที่ตรวจพบในการศึกษานี้พบได้ในถุงน้ำภายในเซลล์หรือถุงนอกเซลล์ (รูปที่ 4H, I) และสิ่งเหล่านี้คล้ายกับถุงน้ำเมทริกซ์ที่แสดงเพื่อกระตุ้นการกลายเป็นปูนในกระดูกและฟัน7,8 เมื่อเร็ว ๆ นี้เราสังเกตว่าถุงน้ำที่แยกได้จากซีรัมของมนุษย์และสัตว์ทำให้เกิดการก่อตัวของแร่ธาตุ NPs และตกตะกอนด้วยกล้องจุลทรรศน์ในหลอดทดลอง 25 Schlieper et al.34 ยังตั้งข้อสังเกตว่าอนุภาคแร่ที่พบในหลอดเลือดแดงมีความเกี่ยวข้องกับโครงสร้างเมมเบรนและเสนอว่าถุงน้ำเมทริกซ์หรือวัตถุ apoptotic อาจเป็นตัวแทนของนิวคลีเอเตอร์ของอนุภาคแร่ในเนื้อเยื่อเหล่านี้ ในทำนองเดียวกัน Khan et al. รายงานว่าการสะสมของแคลเซียมฟอสเฟตที่พบในไตของผู้ป่วยที่เป็นนิ่วในไตของมนุษย์นั้นสัมพันธ์กับเส้นใยคอลลาเจนและถุงน้ำเมทริกซ์9 ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า NPs ของแร่อินทรีย์ที่ตรวจพบในเนื้อเยื่อไตอาจก่อตัวขึ้นผ่านกลไกที่เกี่ยวข้องกับถุงน้ำพังผืด ซึ่งเป็นสถานการณ์ที่คล้ายคลึงกับสิ่งที่พบในหลอดเลือดแดงหลอดเลือด7,8 ในทางกลับกัน การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่าการกลายเป็นปูนนอกมดลูกที่พบในหลอดเลือดแดงของเต้านมของผู้หญิงไม่เกี่ยวข้องกับเครื่องหมายของเซลล์สร้างกระดูกหรือเซลล์ apoptotic43 ซึ่งบ่งชี้ว่ากลไกของการกลายเป็นปูนอาจมีความเฉพาะเจาะจงกับอวัยวะหรือบริบททางชีววิทยาที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้ Mineralo-organic NPs เช่นที่อธิบายไว้ในที่นี้เนื้อเยื่อไตของมนุษย์อาจก่อตัวขึ้นเนื่องจากความล้มเหลวในการรักษาความเข้มข้นทางสรีรวิทยาของไอออน (เช่น แคลเซียมและฟอสเฟต) และสารยับยั้งการกลายเป็นปูน (เช่น อัลบูมิน ทารกในครรภ์-A และ apo -A1) ในของเหลวในร่างกายของมนุษย์

ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าชั้นที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นและแกนกลางของแร่ธาตุ-อินทรีย์ NPs อาจมีโปรตีนและโมเลกุลอินทรีย์ในระดับที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับบริเวณที่มีแสงอิเล็กตรอนของอนุภาค (รูปที่ 6A, B) ชั้นที่มีความหนาแน่นของอิเล็กตรอนเหล่านี้ดูเหมือนจะถูกทำให้เป็นแร่ตามลักษณะผลึกของวัสดุนี้ภายใต้ TEM (ดูรูปที่ 4A–J) ผู้เขียนคนอื่น ๆ รวมทั้ง Ryall41 และ Evan et al.44 ได้เสนอว่าชั้นอิเล็กตรอนที่เปล่งแสงอาจเป็นตัวแทนของแร่ธาตุในขณะที่ชั้นที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นอาจสอดคล้องกับโมเลกุลอินทรีย์ การตีความเหล่านี้อาจเนื่องมาจากอย่างน้อยส่วนหนึ่งก็เนื่องมาจากลักษณะที่ตัวอย่างได้รับการประมวลผลและตรวจสอบในการศึกษาแต่ละครั้ง ตลอดจนลักษณะของเนื้อเยื่อเริ่มต้นที่ใช้

นอกจากจะมีบทบาทในการกลายเป็นปูนนอกมดลูกแล้ว อนุภาคอินทรีย์ของแร่ธาตุยังอาจทำให้เกิดการอักเสบในเนื้อเยื่อไต เราได้แสดงให้เห็นเมื่อเร็วๆ นี้ว่าในขณะที่แร่ธาตุอินทรีย์ NPs ไม่สามารถกระตุ้นการหลั่งของอินเตอร์ลิวคินที่มีการอักเสบ-1 โดยมาโครฟาจของมนุษย์ แต่มวลรวมของแร่ธาตุที่มีขนาดใหญ่กว่า 1 ไมโครเมตรก็สามารถทำได้23 การปลดปล่อยอินเตอร์ลิวคิน-1ในการตอบสนองต่อวัสดุที่เป็นผลึกได้แสดงให้เห็นว่าอาศัยการกระตุ้นของสารเชิงซ้อนระดับโมเลกุลภายในเซลล์ที่เรียกว่าอินแฟลมมาโซม45–47 นอกจากนี้ ตรวจพบอนุภาคแร่ในไตซึ่งมีเนื้องอก และความสัมพันธ์ระหว่างมะเร็งกับการอักเสบเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้ว48 ความเป็นไปได้ที่อนุภาคแร่ที่รวมตัวกันอาจกระตุ้นสารอักเสบและมีส่วนทำให้เกิดการอักเสบและมะเร็งในไตหรือเนื้อเยื่ออื่น ๆ ยังคงต้องได้รับการตรวจสอบ

นอกเหนือจากการกลายเป็นปูนนอกมดลูก เม็ดแร่ที่อธิบายไว้ที่นี่อาจมีส่วนร่วมในกระบวนการของโรคอื่นๆ ตัวอย่างเช่น เราได้เสนอก่อนหน้านี้ว่าแร่ธาตุ NP อาจจับกับโปรตีนหลายชนิดในของเหลวในร่างกายและทำให้โมเลกุลอินทรีย์เหล่านี้หมดไปจากของเหลวในร่างกาย 20,26 ในทางกลับกัน ร่างกายมนุษย์อาจป้องกันการก่อตัวและการสะสมของแร่ธาตุ NPs ภายใต้สถานการณ์ปกติโดยอาศัยการมีอยู่ของสารยับยั้งการกลายเป็นปูนและระบบ reticuloendothelial (เช่น แมคโครฟาจ) ดังนั้น NP แร่จึงอาจสะสมได้ก็ต่อเมื่อสภาวะสมดุลของแคลเซียมในระบบหรือในท้องถิ่นถูกรบกวน และเมื่อกลไกการป้องกันล้มเหลวในร่างกายมนุษย์

เราเสนอว่าแนวทางนาโนที่พัฒนาขึ้นที่นี่อาจใช้ในการศึกษาการก่อตัวของแร่ธาตุอินทรีย์ในเนื้อเยื่อของสัตว์และมนุษย์ ตัวอย่างเช่น แอนติบอดีที่ต่อต้านโปรตีนที่ยับยั้งการกลายเป็นปูน เช่น อัลบูมิน, fetuin-A และ apo-A1 อาจใช้ร่วมกับการวิเคราะห์แร่ธาตุเพื่อตรวจหาและกำหนดลักษณะการก่อตัวของแร่ธาตุอินทรีย์ NP ในเนื้อเยื่อของสัตว์จำลอง ผลลัพธ์ที่ได้โดยใช้วิธีการนี้อาจนำไปใช้กับการวัดทางคลินิกที่ทำกับของเหลวในร่างกายมนุษย์เพื่อระบุพารามิเตอร์ทางชีววิทยาที่สะท้อนถึงสถานะของการก่อตัวของอนุภาคแร่และการกลายเป็นปูนนอกมดลูกในร่างกาย เราคาดหวังว่าความรู้นี้อาจนำไปสู่การพัฒนากลยุทธ์การรักษาแบบใหม่เพื่อป้องกันและรักษาโรคของมนุษย์และเงื่อนไขที่เกี่ยวข้องกับการกลายเป็นปูนนอกมดลูก

วิธีการ

เนื้อเยื่อไตการใช้เนื้อเยื่อของมนุษย์และการทดลองที่ทำในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาสถาบันของโรงพยาบาลช้างกุงเมมโมเรียล วิธีการและการทดลองได้ดำเนินการตามแนวทางที่ได้รับอนุมัติ ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้ป่วย ควบคุมเนื้อเยื่อไตที่มีสุขภาพดีได้จากการตัดชิ้นเนื้อของการบาดเจ็บและผู้ป่วยที่เป็นเลือดคั่งที่ไม่มีประวัติโรคไต (n=2); เนื้อเยื่อไตยังได้รับจากผู้ป่วยมะเร็งไต (n=20) และจากผู้ป่วยโรคไตระยะสุดท้าย (n=2) ซึ่งไตถูกนำออกหรือตัดชิ้นเนื้อระหว่างการผ่าตัดปลูกถ่าย (ตารางที่ 1) สำหรับเนื้อเยื่อมะเร็งไต ส่วนที่ไม่เป็นมะเร็งของเนื้อเยื่อถูกผ่าและวิเคราะห์ในการศึกษานี้

การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาเนื้อเยื่อไตถูกติดตั้งบนบล็อกพาราฟิน บล็อกถูกแบ่งส่วนและชิ้นเนื้อเยื่อถูกให้ความร้อนบนจานร้อนที่ 70 องศาเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อเอาพาราฟินออก นำส่วนต่างๆ ไปแช่ในสารละลายใหม่ของไซลีน 3 ครั้งเป็นเวลา 15 นาที เพื่อขจัดพาราฟินที่เหลือออกให้หมด นำส่วนต่างๆ ไปคืนสภาพด้วยเอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์ 80 เปอร์เซ็นต์ และ 70 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้ง ตัวอย่างที่คืนสภาพถูกล้างด้วยน้ำกลั่นสองครั้ง (ddH2O) เป็นเวลา 5 นาที นิวเคลียสของเซลล์ถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินเป็นเวลา 8 นาที นำสีย้อมออกจากชิ้นงานทดสอบด้วยน้ำอุ่นเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างไตถูกล้างใน ddH2O และจุ่ม 10 ครั้งในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างที่บำบัดด้วยเอทานอลถูกย้อมทับด้วยอีโอซิน Y เป็นเวลา 1 นาที ตัวอย่างถูกทำให้แห้งด้วยเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์และ 100 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง ตามด้วยขั้นตอนการคายน้ำในไซลีนเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างไตที่ขาดน้ำขั้นสุดท้ายถูกติดตั้งบนสไลด์แก้วด้วยกลีเซอรอล 50 เปอร์เซ็นต์ และตรวจดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล

ตัวอย่างที่ถูกทำให้ปราศจากพาราฟินและคืนสภาพถูกเตรียมขึ้นตามที่อธิบายไว้สำหรับการย้อมสี H&E ส่วนที่คืนความชุ่มชื้นถูกย้อมด้วยซิลเวอร์ไนเตรต (5 เปอร์เซ็นต์ ) ตามด้วยการสัมผัสกับแสงยูวีเป็นเวลา 20 นาที สารละลายถูกล้างด้วย ddH2O เป็นเวลา 15 นาที ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยโซเดียม ไธโอซัลเฟต (5 เปอร์เซ็นต์ ) เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยการล้างด้วย ddH2O เป็นเวลา 15 นาที ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยสีแดงเร็วแบบนิวเคลียร์ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) เป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างที่ย้อมถูกทำให้แห้งอย่างต่อเนื่องด้วยเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์และ 100 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะทำการคายน้ำในไซลีนเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างไตถูกติดตั้งบนสไลด์แก้วและตรวจดูตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและการวิเคราะห์ EDXตัวอย่างไตถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ ที่มีความหนาน้อยกว่า 1 มม. โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบผ่า LGPS (Olympus, Tokyo, Japan) เนื้อเยื่อถูกตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์และพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 1 เปอร์เซ็นต์ใน 0.1 โมลาร์บัฟเฟอร์คาโคดิเลตที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน ตัวอย่างคงที่ถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์คาโคดิเลต 0.1 โมลาร์ในซูโครส 8 เปอร์เซ็นต์ (pH 7.2) บนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที เนื้อเยื่อที่ล้างแล้วถูกบ่มในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) ที่มีออสเมียมเตตรอกไซด์ 1 เปอร์เซ็นต์และโพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ 1.5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงบนน้ำแข็ง เนื้อเยื่อถูกล้างด้วย ddH2O บนน้ำแข็ง 10 นาทีสามครั้ง เนื้อเยื่อที่ล้างถูกย้อมบนน้ำแข็งด้วย 1 เปอร์เซ็นต์ของยูแรนิล อะซีเตตใน ddH2O เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ก่อนล้างสามครั้งด้วย ddH2O บนน้ำแข็ง เนื้อเยื่อไตถูกทำให้แห้งด้วยเอทานอล 30, 50, 70, 80 และ 90 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง ยกเว้นเมื่อเอทานอลถึง 70 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งในกรณีนี้ ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน เนื้อเยื่อถูกย้อมด้วยกรดฟอสโฟทังสติก 1 เปอร์เซ็นต์ในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาที ก่อนการคายน้ำด้วยเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างถูกแช่ในโพรพิลีนออกไซด์ที่ 40, 57, 67 และ 100 เปอร์เซ็นต์ในเอทานอลเป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง ตามด้วยแช่อีกครั้งในโพรพิลีนออกไซด์ 100 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 5 นาที เนื้อเยื่อไตแทรกซึมด้วย Eponate 812 50, 70 และ 100 เปอร์เซ็นต์ (Ted Pella, Redding, CA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในแต่ละครั้ง ตัวอย่างไตที่ฝังไว้ของ Eponate 812- ถูกเตรียมโดยการฟักสองครั้งใน 100 เปอร์เซ็นต์ของ Eponate ตัวอย่างที่ฝังตัวถูกบ่มในเตาอบที่ 60 องศาข้ามคืนเพื่อให้เรซินโพลีเมอไรเซชัน

เม็ด HS-NP ที่ล้างแล้วที่ได้รับตามข้างต้นได้รับการแก้ไขด้วยกลูตาราลดีไฮด์ (2.5 เปอร์เซ็นต์) และพาราฟอร์มัลดีไฮด์ (1 เปอร์เซ็นต์) ใน ddH2O เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 4 องศา เม็ดแบบตายตัวถูกล้างด้วย ddH2O สามครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง เม็ดถูกทำให้แห้งด้วยการฟักตัวต่อเนื่องเป็นเอทานอล 30, 50, 70, 80, 90, 95 และ 100 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง ยกเว้นเมื่อเอทานอลถึงร้อยละ 70 ซึ่งเม็ดถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน สารละลายเอทานอลอื่นๆ สัมผัสกับเม็ดเป็นเวลา 10 นาทีเท่านั้น เม็ดที่คายน้ำถูกแทรกซึมด้วยตัวกลางสำหรับฝังสีขาว LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) โดยใช้อัตราส่วนที่แตกต่างกันของเอทานอลและตัวกลาง LR (3:1, 1:1 และ 1:3) เป็นเวลา 30 นาที เม็ดถูกแทรกซึมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ LR สด (100 เปอร์เซ็นต์) ข้ามคืนก่อนการเกิดโพลิเมอไรเซชัน เม็ดที่แทรกซึมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ LR ถูกบ่มในเตาอบที่ 60 องศาเป็นเวลา 2 วันเพื่อให้เรซินโพลีเมอไรเซชัน บล็อกของไตและ HS-NPs ถูกแบ่งส่วนเพื่อผลิตชิ้นที่มีความหนา 70-100 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครโทม Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Germany) ส่วนของเนื้อเยื่อถูกย้อมด้วย uranyl acetate 4% ก่อนการมองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Japan) ที่ทำงานที่ 100 kV รูปแบบการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนได้มาจากระบบเดียวกัน ใช้ตะแกรงนิกเกิลเป็นตัวรองรับ

สำหรับการวิเคราะห์ EDX ส่วนที่บางของเนื้อเยื่อไตถูกย้อมด้วยยูแรนิลอะซิเตตและล้างด้วย ddH2O ตามที่กล่าวข้างต้น ตามด้วยการทำให้แห้งในตู้ดูดความชื้นแบบอิเล็กทรอนิกส์ ตัวอย่างถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด JEM 2100 ความละเอียดสูงที่ทำงานที่ 120 kV สเปกตรัม EDX ได้รับสามเท่าโดยใช้ระบบ INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK) บางส่วนของ HS-NPs ถูกสังเกตโดยไม่มีการย้อมสี

การเตรียมแร่ธาตุอินทรีย์ NPsสารละลายตั้งต้นทั้งหมดถูกปรับเป็น pH 7.4 และฆ่าเชื้อโดยการกรองผ่านเยื่อแผ่น 0.2μm ก่อนใช้ HS ได้รับจากอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีของมนุษย์โดยใช้เทคนิคการเจาะเลือดแบบธรรมดา การใช้ของเหลวทางชีวภาพของมนุษย์ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาสถาบันของโรงพยาบาล Linko Chang Gung Memorial และได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากอาสาสมัคร HS-NPs ถูกเตรียมโดยการเติม 3 mM CaCl2 และ Na2HPO4 แต่ละตัวลงใน DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) ที่มี HS 10 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยการฟักตัวเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ในสภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ (37 องศา , 5 เปอร์เซ็นต์ CO2, อากาศที่มีความชื้น) อนุภาคถูกอัดเป็นเม็ดโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 16,000 ×g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศาและล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) โดยใช้ขั้นตอนการปั่นแยกเดียวกัน

SDS-PAGE และ Western blottingSDS-PAGE และการวิเคราะห์ Western blot ถูกดำเนินการอย่างสำคัญเหมือนเมื่อก่อน 15 โดยสังเขป 0.2 ไมโครกรัม (รูปที่ 5A,D) หรือ 1.2 ไมโครกรัม (รูปที่ 5B,C) ของโปรตีน HS, 47 ไมโครกรัม (รูปที่ 5A,B,D) หรือ 590กรัม ของโปรตีน HS-NP (รูปที่ 5C), 0.1ug ของ HSA (รูปที่ 5A–D) และ 0.6ug (รูปที่ 5A, C, D) หรือ {{23} }.15ug ของ HSF (รูปที่ 5B) ถูกละลายใน "บัฟเฟอร์การโหลด" 5 เท่า (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 เปอร์เซ็นต์ SDS, 0.05 เปอร์เซ็นต์ bromophenol blue, 50 เปอร์เซ็นต์ glycerol, 12.5 เปอร์เซ็นต์ - เมอร์แคปโตเอธานอล) จนถึงความเข้มข้นสุดท้าย 1 เท่า ก่อนให้ความร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที และแยกออกภายใต้สภาวะการทำให้เสียสภาพและการลดสภาพบน SDS-PAGE 10 เปอร์เซ็นต์ โดยใช้ระบบเจลขนาดเล็ก (Hoefer, Holliston, MA) ตัวควบคุม NP (ใช้ในเลนที่ 1 ของรูปที่ 5A–D) ประกอบด้วย NP แร่ธาตุที่เตรียมโดยการเพิ่ม CaCl2 และ Na2HPO4 3 mM ลงใน DMEM (ปริมาตรสุดท้าย 1 มล.) ตามด้วยการฟักตัวเป็นเวลาหนึ่งวันในสภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ อนุภาคถูกอัดเป็นก้อนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 16000 ×g เป็นเวลา 15 นาที ล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ HEPES และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ HEPES 50ul ส่วนย่อยของ 20ul ของอนุภาคที่ถูกแขวนลอยใหม่ถูกประมวลผลสำหรับ SDS-PAGE ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น เยื่อ PVDF ถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในนมที่สกัดน้ำมันออก 5 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนัก/ปริมาตร) ที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิที่สร้างขึ้นในบ้านตามที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้25 ถูกใช้ที่การเจือจาง 1:1,000 ( -apo-A1 และ -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) หรือ 1:6,000 ( -HSA) แอนติบอดีทุติยภูมิที่ต้านแรบบิทกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกตของแพะถูกใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Millipore, Billerica, MA) รอยเปื้อนถูกเปิดเผยโดยใช้เคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham Biosciences, Amersham, UK) และภาพยนตร์ autoradiographic

การติดฉลากอิมมูโนโกลด์ตัวอย่างถูกเตรียมสำหรับการสังเกต TEM บล็อก HS-NP ถูกแบ่งเป็นชิ้นที่มีความหนาน้อยกว่า 70 นาโนเมตร ส่วนตัวอย่างบนตะแกรงถูกบล็อกด้วยเจลาตินปลา 1 เปอร์เซ็นต์ (ซิกมา) ใน 0.1 M HEPES บัฟเฟอร์ (pH 8.0) เป็นเวลา 25 นาที กริดถูกฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต่อไปนี้: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. กลุ่มควบคุมเชิงลบไม่มีแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจลาตินปลา 1 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ HEPES) ส่วนที่ฟักตัวถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ HEPES เป็นเวลา 15 นาที ส่วนที่ล้างแล้วถูกบล็อกด้วยเจลาตินปลา 1 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ HEPES เป็นเวลา 20 นาที ตัวอย่างถูกบำบัดด้วย IgG ต้านกระต่าย IgG รอง 5-nm-ทอง-คอนจูเกตแพะเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ล้างตัวอย่างด้วยบัฟเฟอร์ HEPES เป็นเวลา 10 นาที ก่อนล้างด้วย ddH2O เป็นเวลา 10 นาที การสังเกต TEM ได้ดำเนินการตามข้างต้น

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสไลด์เนื้อเยื่อไตทางจุลกายวิภาคที่เตรียมตามข้างต้นถูกบล็อกด้วยอัลบูมินในซีรัมของวัว 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง สไลด์ถูกบ่มด้วยพอลิโคลนอลแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง 1:4,000 หลังจากล้างขั้นตอนการล้าง ตัวอย่างถูกบ่มด้วยแอนติบอดีรองแพะ anti-rabbit-FITC (492/520nm) และ goat anti-rabbit-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) ที่ 1:100 สำหรับ 1 ชม. สารเชิงซ้อนถูกล้างด้วย PBST เป็นเวลา 15 นาที คราบเรืองแสง 4′,6-ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลลินโดล (DAPI) ถูกใช้ที่ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 15 นาที ชิ้นงานที่ย้อมด้วย DAPI ถูกทำให้แห้งด้วยเอทานอล 95 และ 100 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยการทำให้แห้งในไซลีนอีก 10 นาที ตัวอย่างไตที่ขาดน้ำถูกติดตั้งด้วยสารยึดติด Vectashield fluorescence H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) และสังเกตดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany) ที่ติดตั้งกล้อง Spot Flex

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

อ้างอิง

1. Gachelli, CM Ectopic calcification: รวบรวมข้อเท็จจริงอย่างหนักเกี่ยวกับการทำให้เป็นแร่ของเนื้อเยื่ออ่อน แอม เจ ปทุม 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M. , Tintut, Y. & Demer, LL แคลเซียมในหลอดเลือด: กลไกและการขยายผลทางคลินิก หลอดเลือดแดง Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004)

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. การกลายเป็นปูนในหลอดเลือด Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Patterns และปัจจัยเสี่ยงสำหรับหลอดเลือดแข็งตัวที่เป็นระบบ หลอดเลือดแดง Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004)

5. Ketteler, M. et al. ข้อบกพร่องของโปรตีนควบคุมแคลเซียมในผู้ป่วยฟอกไต: แนวคิดใหม่ของการกลายเป็นปูนในระบบหัวใจและหลอดเลือดในปัสสาวะ ไต Int Suppl 84, S84–87 (2003)

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM การกำหนดเป้าหมายการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด: ทำให้เป้าหมายแข็งอ่อนลง Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM การควบคุมแคลเซียมของถุงน้ำเมทริกซ์ที่ได้มาจากเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012)

8. โดเฮอร์ตี้ TM และคณะ การกลายเป็นปูนในหลอดเลือด: ชีววิทยาของกระดูกและการอักเสบเรื้อรังที่ทางแยกของหลอดเลือด Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 100, 11201–11206 (2003)

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Association of Randall's plaques ด้วยเส้นใยคอลลาเจนและถุงน้ำเมมเบรน เจ Urol 187, 1094–1100 (2012)

10. ราคา, PA, เหงียน, TM & Williamson, MK ลักษณะทางชีวเคมีของซีรั่ม fetuin-mineral complex เจ ไบโอล เคม 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Serum ระดับของ fetuin-mineral complex สัมพันธ์กับการกลายเป็นปูนในหลอดเลือดแดงในหนูแรท เจ ไบโอล เคม 279, 1594–1600 (2004)

12. Heiss, A. et al. บทบาทลำดับชั้นของ fetuin-A และโปรตีนในซีรัมที่เป็นกรดในการก่อตัวและการรักษาเสถียรภาพของอนุภาคแคลเซียมฟอสเฟต เจ ไบโอล เคม 283, 14815–14825 (2551).

13. Bertazzo, S. et al. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบนาโนวิเคราะห์เผยให้เห็นข้อมูลเชิงลึกพื้นฐานเกี่ยวกับการกลายเป็นปูนเนื้อเยื่อหัวใจและหลอดเลือดของมนุษย์ แนท เมเตอร์ 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD อ้างว่า nanobacteria ในเลือดของมนุษย์เป็นอนุภาคนาโนแคลเซียมคาร์บอเนต Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 105, 5549–5554 (2551)

15. หนุ่ม JD และคณะ แบคทีเรียนาโนสมมุติฐานเป็นตัวแทนของสิ่งที่เหลืออยู่ทางสรีรวิทยาและผลพลอยได้จากการเพาะเลี้ยงของภาวะธำรงดุลแคลเซียมปกติ โปรวัน 4, e4417 (2009).

16. หนุ่ม JD และคณะ การแสดงคุณลักษณะของแกรนูลของแคลเซียมและอะพาไทต์ในซีรัมในฐานะสารเชิงซ้อนของแร่ธาตุ-โปรตีน pleomorphic และเป็นสารตั้งต้นของแบคทีเรียนาโนสมมุติฐาน โปรวัน 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J. , Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineral complexes ที่คล้ายกับเม็ดแคลเซียมในซีรัมและ nanobacteria สมมุติ: การสาธิตแนวคิดการยับยั้งการเพาะแบบคู่ โปรวัน 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. การขึ้นและลงของนาโนแบคทีเรีย วิทย์ Am 302, 52–59 (2010)

19. Martel, J. , Wu, CY & Young, JD การประเมินที่สำคัญของซีรั่มฉายรังสีแกมมาที่ใช้เป็นตัวป้อนในการเพาะเลี้ยงและการสาธิตของแบคทีเรียนาโนและอนุภาคนาโนที่กลายเป็นปูน Plos One 5, e10343 (2010)

20. Martel, J. et al. การวิเคราะห์โปรตีโอมิกแบบครอบคลุมของอนุภาคนาโนแร่ที่ได้จากของเหลวในร่างกายมนุษย์ และวิเคราะห์โดยโครมาโตกราฟีของเหลว-tandem mass spectrometry ทางทวารหนัก Biochem 418, 111–125 (2011)