Dendrimer–tesaglitazar Conjugate ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ของ Microglia และช่วยเพิ่ม -amyloid Phagocytosis† ตอนที่ 1

การเปลี่ยน microglia จากสถานะ 'โปรการอักเสบ' ที่ทำให้รุนแรงขึ้นของโรคไปสู่ฟีโนไทป์ 'ต้านการอักเสบ' ที่ป้องกันระบบประสาทเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มในการจัดการกับโรคทางระบบประสาทหลายชนิด

Microglia เป็นเซลล์ชนิดหนึ่งในระบบประสาทส่วนกลางที่มีหน้าที่หลักในการรักษาสุขภาพและการทำงานของเซลล์ประสาท พวกมันสามารถหลั่งปัจจัยการเจริญเติบโตและปัจจัยทางระบบประสาทที่หลากหลาย และสามารถรักษากิจกรรมการเผาผลาญปกติของเซลล์ประสาทได้โดยการล้างของเสียที่อยู่รอบ ๆ เซลล์ประสาท การศึกษาในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่า microglia มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความทรงจำ เรามาดูพร้อมๆ กันเลยครับ

ประการแรก ไมโครเกลียสามารถกระตุ้นเซลล์ประสาทและส่งเสริมการกระตุ้นการทำงานของเซลล์ประสาท ซึ่งจะเป็นการเพิ่มความจำ ด้วยการปล่อยชุดสารสื่อประสาท เช่น กลูตาเมตและอะลานีน microglia สามารถส่งเสริมการส่งสัญญาณระหว่างเซลล์ประสาท และสามารถเพิ่มการสั่นพ้องของสัญญาณ glial-neuron ระหว่างเยื่อหุ้มพรีไซแนปติก ส่งเสริมความตื่นตัวของเส้นประสาทและการสร้างความจำเพิ่มเติม

ประการที่สอง ไมโครเกลียยังสามารถกำจัดของเสียรอบๆ เซลล์ประสาท รักษากิจกรรมการเผาผลาญตามปกติของเซลล์ประสาท และลดการตายของเส้นประสาท ซึ่งจะช่วยส่งเสริมการปรับปรุงความจำ เมื่อขยะสะสมรอบๆ เซลล์ประสาทมากเกินไป จะส่งผลต่อกิจกรรมการเผาผลาญปกติของเซลล์ประสาท นำไปสู่การตายของเซลล์ประสาทและการทำงานลดลง ส่งผลให้ประสิทธิภาพของหน่วยความจำลดลง Microglia สามารถรักษาสภาพแวดล้อมการเผาผลาญตามปกติของเซลล์ประสาท และลดการตายของเส้นประสาทโดยการกลืนและสลายของเสียที่อยู่รอบข้าง ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความจำ

โดยสรุป microglia มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับหน่วยความจำ ด้วยการส่งเสริมการกระตุ้นของเซลล์ประสาทและกำจัดของเสียที่อยู่รอบข้าง ไมโครเกลียสามารถพัฒนาความจำให้ดียิ่งขึ้น และช่วยให้สมองของเราแข็งแรงและกระฉับกระเฉง เราควรใส่ใจในการปกป้องสุขภาพของไมโครเกลียเพื่อให้ความจำดีขึ้น จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมาก เนื่องจาก Cistanche เป็นสมุนไพรจีนโบราณที่มีลักษณะพิเศษมากมาย หนึ่งในนั้นคือการปรับปรุงความจำ ประสิทธิภาพของ Cistanche มาจากส่วนผสมออกฤทธิ์หลายชนิดใน Cistanche รวมถึงกรดแทนนิค โพลีแซ็กคาไรด์ ฟลาโวนอยด์ไกลโคไซด์ ฯลฯ ส่วนผสมเหล่านี้สามารถส่งเสริมสุขภาพสมองได้หลายวิธี

คลิกรู้ 10 วิธีปรับปรุงความจำ

Microglia ที่ทำให้เกิดการอักเสบมีส่วนทำให้เกิดการลุกลามของโรคโดยการปล่อยสารพิษต่อระบบประสาทและเร่งการสะสมโปรตีนที่ทำให้เกิดโรค ตัวเร่งปฏิกิริยา PPAR และ PPAR ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเปลี่ยน microglia จากฟีโนไทป์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ ('M 1- ชอบ') ไปเป็นฟีโนไทป์ที่กระตุ้นอีกทางหนึ่ง (' M 2- ชอบ') กลยุทธ์ดังกล่าวได้รับการสำรวจในการทดลองทางคลินิกสำหรับโรคทางระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์และพาร์กินสัน แต่มีแนวโน้มว่าจะล้มเหลวเนื่องจากการทะลุผ่านของอุปสรรคในเลือดและสมอง (BBB) ​​ที่ไม่ดี

เดนไดรเมอร์โพลีอะมิโดเอมีนที่สิ้นสุดด้วยไฮดรอกซิล (โดยไม่มีการเกาะติดของลิแกนด์กำหนดเป้าหมายใดๆ) แสดงให้เห็นว่าข้าม BBB ที่บกพร่องที่บริเวณที่เกิดการอักเสบของระบบประสาท และสะสมในไมโครเกลียที่ถูกกระตุ้น

ดังนั้นการผัน dendrimer ของ PPAR / dual agonist อาจเปิดใช้งานการสลับฟีโนไทป์เป้าหมายของ microglia ที่เปิดใช้งาน ที่นี่เรานำเสนอการสังเคราะห์และการแสดงคุณลักษณะของคอนจูเกต dendrimer-PPAR / dual agonist (D-tesaglitazar) ใหม่

ในหลอดทดลอง D-tesaglitazar ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ 'M1 ถึง M2' ลดการหลั่งของสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา เพิ่มการแสดงออกของยีนสำหรับการทำลายเซลล์และการย่อยสลายของเอนไซม์ของโปรตีนที่ทำให้เกิดโรค (เช่น -amyloid, -synuclein) และเพิ่ม -amyloid phagocytosis

ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนการพัฒนาเพิ่มเติมของ D-tesaglitazar ไปสู่การแปลโรคทางระบบประสาทหลายอย่าง โดยเฉพาะโรคอัลไซเมอร์และพาร์กินสัน

การแนะนำ

ในสหรัฐอเมริกาเพียงแห่งเดียว ปัจจุบันมีผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์ (AD) มากกว่า 5.3 ล้านคน และผู้ป่วยโรคพาร์กินสัน (PD) กว่า 1 ล้านคน1 เนื่องจากอายุที่เพิ่มขึ้นเป็นปัจจัยเสี่ยงที่ใหญ่ที่สุดสำหรับโรคความเสื่อมของระบบประสาทหลายชนิด ความชุกและค่าใช้จ่ายในการรักษาโรคเหล่านี้ จะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ตามจำนวนประชากรที่เพิ่มมากขึ้น

นอกจากนี้ การขาดความสำเร็จเมื่อเร็วๆ นี้ในการพัฒนายาใหม่เพื่อรักษาโรคเหล่านี้ได้เน้นย้ำถึงความจำเป็นในการพัฒนาวิธีการรักษาที่เป็นนวัตกรรมใหม่2,3 ความล้มเหลวทางคลินิกเหล่านี้เน้นย้ำถึงความยากลำบากในการพัฒนายา รวมถึงการส่งยาที่มีความเข้มข้นในระดับสูงเพียงพอไปยังสมองเพื่อประสิทธิภาพโดยไม่ต้อง ทำให้เกิดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์

โรคที่เกิดจากความเสื่อมของระบบประสาท เช่น AD และ PD มีองค์ประกอบหลักสามอย่างร่วมกัน ได้แก่ การอักเสบของระบบประสาท การสะสมโปรตีนที่ทำให้เกิดโรค และการตายของเส้นประสาท4–7 คนที่มีสุขภาพดี ได้แก่ เซลล์ภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของสมอง (เดอะไมโครเกลีย) ฟาโกไซโตสของโปรตีนที่พับผิดอยู่ตลอดเวลา (เช่น -อะไมลอยด์ -ซินนิวคลิน) ) ที่ทำให้เส้นประสาทตายในขณะที่พวกมันถูกสร้างขึ้น ซึ่งป้องกันไม่ให้การรวมตัวของตราสัญลักษณ์เกิดขึ้น

อย่างไรก็ตาม ในผู้ที่พัฒนาโรคเกี่ยวกับระบบประสาทเสื่อมในที่สุด microglia ไม่สามารถกำจัดโปรตีนเหล่านี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกต่อไป และเปลี่ยนไปสู่ฟีโนไทป์ที่ทำให้เกิดการอักเสบที่กำเริบของโรค (โดยทั่วไปเรียกว่า M1)

ในขณะที่การจำแนกประเภทการกระตุ้นการอักเสบ/ต้านการอักเสบ (M1/M2) ส่วนใหญ่ของการกระตุ้น microglial นั้นเป็นการทำให้สเปกตรัมของโพลาไรเซชันของแมคโครฟาจมากเกินไป แต่ยังคงใช้เป็นระบบการตั้งชื่อแบบกว้างๆ เพื่ออธิบายฟีโนไทป์ที่โดดเด่นของ microglia ในการอักเสบของระบบประสาทและการตอบสนองต่อการบำบัด

M1-เช่น microglia ปล่อยออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาและสารไกล่เกลี่ยการอักเสบอื่นๆ ที่ทำให้เกิดการตายของเซลล์ประสาทและทำให้พยาธิวิทยาของโรครุนแรงขึ้นโดยการเพิ่มการผลิตโปรตีนที่ทำให้เกิดโรค (เช่น -อะไมลอยด์, -ซินนิวคลิน)

นอกจากนี้ ปัจจัยเสี่ยงทางพันธุกรรมที่สำคัญสำหรับการพัฒนา AD (TREM2 และ APOE) แสดงออกในระดับสูงใน microglia และวิถีทางของ TREM2/APOE ได้รับการแสดงให้เห็นว่าทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ของอะไมโครเกลียใน AD, เส้นโลหิตตีบด้านข้างอะไมโอโทรฟิค (ALS) และโรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง (multiple sclerosis) โมเดลสัตว์8

การค้นพบเหล่านี้ยังแสดงให้เห็นถึงบทบาทของไมโครเกลียในพยาธิสภาพของโรคทางระบบประสาทของมนุษย์หลายชนิด วิธีการควบคุมฟีโนไทป์ของไมโครเกลียจะช่วยให้นักวิจัยเข้าใจบทบาทของพวกเขาในโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท นอกเหนือจากที่อาจเป็นวิธีการรักษาที่มีประสิทธิผลแล้ว

การเปลี่ยน microglia จาก M1 ไปเป็นฟีโนไทป์ที่ต้านการอักเสบและป้องกันระบบประสาท (M2) ได้รับการเสนอเป็นกลยุทธ์การรักษาเพื่อรักษาโรคทางระบบประสาทหลายอย่าง 5,6 ปัจจุบันมีการแสดงตัวดำเนินการ PPAR สองรายที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA ได้แก่ ยาเบาหวานประเภท rosiglitazone และ pioglitazone เพื่อกระตุ้นให้เกิด การเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ M1 ถึง M2 ในแมคโครฟาจและไมโครเกลีย ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย

มีการแสดงตัวดำเนินการ PPAR 9,10 ตัวเพื่อลดการหลั่งของออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาที่เกิดจาก LPS โดยการลดกิจกรรมของ NF-κBโดยการกระตุ้นการย่อยสลาย NF-κBและการส่งออกจากนิวเคลียส เช่นเดียวกับการกดทับที่ขึ้นกับลิแกนด์

นอกจากนี้ การศึกษาทางระบาดวิทยายังแสดงให้เห็นว่าผู้ป่วยโรคเบาหวานที่รับประทานยาโรซิกลิตาโซนหรือยาไพโอกลิตาโซนมีความเสี่ยงลดลงในการพัฒนา AD และ PD12 ต่อมา มีการตรวจสอบยาโรซิกลิตาโซนและยาไพโอกลิตาโซนผ่านการทดลองทางคลินิกระยะที่ 3 สำหรับโรค AD แต่ล้มเหลว13

คำอธิบายที่เป็นไปได้ประการหนึ่งสำหรับความล้มเหลวของการทดลองทางคลินิกที่กล่าวมาข้างต้นคือการขนส่งยาเหล่านี้ข้ามอุปสรรคในเลือดและสมอง (BBB) ​​ได้ไม่ดีนัก จึงเป็นการจำกัดจำนวนยาที่เข้าถึงสมองของผู้ป่วยที่ลงทะเบียนในการทดลองทางคลินิกเหล่านี้14

แท้จริงแล้ว มีการประมาณกันว่า BBB ป้องกันประมาณ 98% ของยาที่มีโมเลกุลขนาดเล็กทั้งหมดไม่ให้เข้าถึงสมอง และมีเพียงเศษเสี้ยวของยาที่เข้าสู่สมองเท่านั้นที่ไปถึงไมโครเกลีย15

นอกจากนี้ PPAR ยังเป็นตัวรับนิวเคลียร์อีกตัวหนึ่งในตระกูล PPAR16 โดยมีบทบาทในการสร้างสภาวะสมดุลของไขมันและควบคุมการอักเสบ และตัวเร่งปฏิกิริยา PPAR ก็แสดงให้เห็นว่ามีฤทธิ์ต้านการอักเสบใน microglia

การศึกษาทางคลินิกโดยใช้การสร้างภาพระบบประสาท การวิเคราะห์เนื้อเยื่อหลังชันสูตร และตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF ได้ให้หลักฐานว่า BBB มีความบกพร่องใน AD และ PD เช่นเดียวกับโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาทอื่นๆ

เดนไดเมอร์ที่สิ้นสุดด้วยไฮดรอกซิล (G4-PAMAM-OH) รุ่น-4 รุ่นที่ 17 แสดงให้เห็นว่าสามารถเลี่ยง BBB ที่บกพร่องโดยภายใน และสะสมในแอคติเวตไมโครเกลียโดยไม่จำเป็นต้องกำหนดเป้าหมายลิแกนด์ หลังจากการบริหารระบบในแบบจำลองโรคการอักเสบของระบบประสาทที่แตกต่างกันหลายแบบ รวมถึงในสัตว์ฟันแทะ กระต่าย สุนัข และไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์18–28 ที่สำคัญ G4-PAMAM-OH สามารถจัดการลูกปัดอย่างเป็นระบบและข้าม BBB ในแบบจำลองโรคที่มีการหยุดชะงักของ BBB เล็กน้อย เช่น Rett Syndrome29

นอกจากนี้ ขอบเขตของการดูดซึม G4-PAMAM-OH เข้าสู่สมองเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความรุนแรงของโรคในรูปแบบกระต่ายของสมองพิการ30 เดนดริมเมอร์ที่สิ้นสุดด้วยไฮดรอกซิลมีข้อได้เปรียบในการส่งมอบแบบไม่รุกล้ำเมื่อเปรียบเทียบกับการคลอดในพื้นที่ที่มีการแพร่กระจายสูงผ่านทาง กะโหลกศีรษะที่ต้องการในการศึกษาก่อนหน้านี้กับอนุภาคนาโนอื่น ๆ เช่น poly-εcaprolactone และ PEG, dendrimers PAMAM ที่มีประจุลบ, จุดควอนตัมและสูตรนาโนที่ประกอบด้วย polyethyleneimine (PEI) และ dextran sulfate

นอกจากนี้ เดนไดรเมอร์ไฮดรอกซิล PAMAM เหล่านี้อยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการแปลเนื่องจากความสามารถในการปรับขนาดและโปรไฟล์ความปลอดภัยของร่างกายที่ยอมรับได้ดี36–38 เนื่องจากข้อมูลประสิทธิภาพเชิงบวกก่อนการทดลองทางคลินิก a (G4-PAMAM-OH)-N- ปัจจุบันคอนจูเกตอะซิติล-ซิสเทอีนกำลังได้รับการประเมินในการทดลองทางคลินิกระยะต้นสำหรับภาวะต่อมหมวกไตในสมองในวัยเด็ก (NCT03500627) และโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ที่รุนแรง (โควิด-19) ที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบ (NCT04458298)

เราศึกษาคอนจูเกตของเดนดริเมอร์–ยาของเทซากลิตาซาร์ (Tesa) ที่ติดอยู่กับ PAMAMdendrimer ที่สิ้นสุดด้วยไฮดรอกซิลรุ่น-4 Tesaglitazar เป็น PPAR / ตัวเอกคู่ที่มีศักยภาพซึ่งรวมเอาผลประโยชน์ของตัวดำเนินการ PPAR และ PPAR เข้าด้วยกัน ประกอบด้วยหมู่ฟังก์ชันของกรดคาร์บอกซิลิกสำหรับการคอนจูเกตโควาเลนต์กับเดนไดเมอร์และเพื่อการปลดปล่อยในภายหลัง

กีต้าร์เพิ่มเติมได้รับการพัฒนาและทดสอบทางคลินิก แต่ Tesa ไม่ได้รับเลือกเนื่องจากมีอัตราส่วนกิจกรรม PPAR ต่อ PPAR ที่ใหญ่กว่า โครงสร้างทางเคมีที่ค่อนข้างเรียบง่าย และโปรไฟล์ด้านความปลอดภัย39–43

ก่อนหน้านี้ Tesa ได้บรรลุการทดลองทางคลินิกระยะที่ 3 สำหรับโรคเบาหวานประเภท 2 ในสหรัฐอเมริกา แต่ล้มเหลวเนื่องจากความเป็นพิษที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งอาจป้องกันได้โดยการลดขนาดยาที่จำเป็นในการบริหารโดยการนำส่งเดนไดเมอร์แบบควบคุม39,40,44เนื่องจาก Tesa เป็น PPAR / dual agonist การนำส่งแบบกำหนดเป้าหมายไปยัง microglia ที่กระตุ้น ณ ตำแหน่งที่เกิดการอักเสบของระบบประสาทอาจเป็นประโยชน์อย่างมาก

ในที่นี้ เราสาธิตการสังเคราะห์และการแสดงคุณลักษณะของคอนจูเกตเดนดริเมอร์–เตซากลิตาซาร์ (D-Tesa) และแสดงให้เห็นถึงความสามารถของสารประกอบนี้ในการกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ 'M1 toM2' ในไมโครเกลีย และปรับปรุงฟาโกไซโตซิสของอะไมลอยด์ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

1-[3-(ไดเมทิลอะมิโน)โพรพิล]-3-เอทิล คาร์โบไดอิไมด์ เมไทโอไดด์(EDC), 4(ไดเมทิลอะมิโน)ไพริดีน (DMAP), CuSO4·5H2O,โซเดียม แอสคอร์เบต, กรดเฮกซีโนอิก และอัลบูมินในซีรั่มของวัว (BSA) ถูกซื้อจาก Sigma Aldrich US และใช้ตามที่ได้รับ (เซนต์หลุยส์ มิสซูรี)

Tesaglitazar ได้มาจาก AstaTech Inc. (Bristol, PA) Ethylenediamine-core PAMAM dendrimer (รุ่นที่ 4 ที่มีกลุ่มปลายไฮดรอกซิล 64 กลุ่ม) ได้รับจาก Dendritech Inc. (มิดแลนด์, มิชิแกน) เป็นสารละลายในเมทานอล

เดนไดเมอร์ถูกเก็บไว้ในเมทานอลที่อุณหภูมิ 4 องศา และเมทานอลถูกระเหยก่อนใช้งาน ซื้อเมมเบรนฟอกไตที่มีค่าตัดน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) ที่ 1 kDa จาก Spectrum Laboratories Inc. (นิวบรันสวิก นิวเจอร์ซีย์)

ตัวทำละลายอื่นๆ ทั้งหมดถูกใช้ตามที่ได้รับในรูปแบบแอนไฮดรัส ปฏิกิริยาทั้งหมด ยกเว้นทองแดง (I) ปฏิกิริยาการคลิกแบบเร่งปฏิกิริยาอัลไคน์–อะไซด์ไซโคลแอดดิชัน (CuAAC) ดำเนินการภายใต้สภาวะปราศจากน้ำในตัวกลางอินทรีย์ที่มีเครื่องแก้วอบแห้งในเตาอบภายใต้ไนโตรเจนเฉื่อย บรรยากาศ.

สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์: Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovineserum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), 0.05% trypsin-EDTA และ MTT reagent ของ Dulbecco ได้รับจาก Invitrogen (Carlsbad, CA , สหรัฐอเมริกา)

รีเอเจนต์ Griess ได้มาจาก Promega (Madison, WI) และ TNF- ELISA ได้มาจาก R&D Systems (Minneapolis, MN) เมทานอลเกรดเชิงวิเคราะห์ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich ได้รับ Trypan blue จาก Corning (Manassas, VA, USA)

ขั้นตอนการสังเคราะห์สำหรับคอนจูเกต D-Tesa
เทตระเอทิลีนไกลคอลโมโนเอไซด์ (2) ถูกสังเคราะห์โดยใช้เกณฑ์วิธีที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้45

การสังเคราะห์และการทำให้บริสุทธิ์ของ Tesa-TEG-azide (3)
เทซา (950 มก., 2.32 มิลลิโมล) ถูกละลายใน 10 มิลลิลิตร ไดเมทิลฟอร์มาไมด์ (DMF) ไปยังสารละลายที่ถูกกวนนี้ เทตราเมทิลีนไกลคอล โมโน-เอไซด์ (2, 662.1 มก., 3.02 มิลลิโมล) ใน DMF (1 มล.) ถูกเติมแบบหยด จากนั้น DMAP (255.4 มก., 2.09 มิลลิโมล) และ EDC (577.5 มก.,3.02 มิลลิโมล) ถูกเติมไปยังของผสมปฏิกิริยา และปฏิกิริยาถูกกวนภายใต้การไล่ไนโตรเจนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

ปฏิกิริยาถูกติดตามโดยใช้โครมาโทกราฟีแบบชั้นบางและโครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) ของผสมของปฏิกิริยาถูกเจือจางด้วย 100 มิลลิลิตร ไดคลอโรมีเทน (DCM) และของผสมของปฏิกิริยาที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ ถูกเลื่อนไปในกรวยแยก และชั้นอินทรีย์ถูกล้างในเวลาต่อมาสามครั้งด้วยสารละลายโซเดียมไบคาร์บอเนตอิ่มตัว ตามด้วยสารละลายแอมโมเนียม คลอไรด์อิ่มตัว และสุดท้ายด้วยน้ำเกลือ

จากนั้นชั้นอินทรีย์ถูกทำให้แห้งด้วยแอนไฮดรัสโซเดียม ซัลเฟต จากนั้นตัวทำละลายในชั้นอินทรีย์ถูกกำจัดออกโดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน และสารละลายถูกละลายใหม่ใน 3 มล. DCM และดูดซึมไปบนซิลิกาเจลเพื่อทำให้บริสุทธิ์ด้วยระบบโครมาโตกราฟี CombiFlash® โดยใช้วิธีการไล่ระดับด้วยเอทิลอะซีเตต/เฮกเซนเป็นตัวทำละลายเพื่อให้ได้ 3 เท่าที่ชัดเจน -น้ำมันสีเหลือง

ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ที่ต้องการจะถูกชะออกมาด้วยเอทิลอะซิเตตประมาณ 30–40% (ผลผลิต: 70%) 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.15(d, J=1.9 Hz, 2H) 7.08 (ง, เจ=8.6 เฮิร์ตซ์, 2H), 6.73 (ง, เจ=8.6 เฮิร์ตซ์,2H), 4.25–4.14 (ม., 2H), 4.07 (t, เจ {{ 33}}.8 เฮิร์ตซ์ 2H), 3.94 (dd, J =7.8, 5.2 Hz, 1H), 3.67–3.47 (ม. 14H), 3.30 (dd, J=8.7 , 3.8 เฮิรตซ์,2H), 3.06 (วินาที, 3H), 3.02 (t, J=6.7 เฮิรตซ์, 2H), 2.91–2.84 (ม., 2H),1.08 (t, J=7 .0 Hz, 3H).ESI-MS: ตามทฤษฎี C28H39N3O10S: 609.24 ได้รับ (M + 1):610.13

การสังเคราะห์และการทำให้บริสุทธิ์ของ D-YNE (5)

(480 มก., 4.22 มิลลิโมล) ถูกเติมไปยังสารละลายที่ถูกกวนของ G4-PAMAM-OH (2.5 ก., 0.176 มิลลิโมล) ใน DMF แบบแอนไฮดรัส 20 มล. ของผสมนี้, DMAP (430 มก., 3.52 มิลลิโมล) และ EDC (1 ก.,5.28 มิลลิโมล) ถูกเติมลงไป

ของผสมของปฏิกิริยาถูกกวนภายใต้การไล่ไนโตรเจนเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์ ของผสมของปฏิกิริยาถูกถ่ายโอนไปยังหลอดไดอะไลซิส 1000 MWCO การไดอะไลซิสด้วย DMF ถูกดำเนินการเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และ DMF ถูกเปลี่ยนประมาณทุกๆ หกชั่วโมง

จากนั้นทำการฟอกไตด้วยน้ำปราศจากไอออน (DI) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โดยน้ำจะเปลี่ยนทุกๆ หกชั่วโมงโดยประมาณ สุดท้าย ปริมาณของหลอดไดอะไลซิสที่เป็นผลลัพธ์ถูกไลโอฟิไลซ์เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ทำให้ได้ผงฟูสีขาว (ผลผลิต: 61%) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.10–7.67 (m, เดนดริเมอร์ภายในเอไมด์ H), 4.72 (s, พื้นผิวเดนดริเมอร์ OH), 4.01 (t,เอสเทอร์ –CH2), 3.32 (m, เดนดริเมอร์ –CH2), 3.06 (m, เดนดริเมอร์และตัวเชื่อมต่อ –CH2), 2.85–2.58 (m, เดนดริเมอร์ –CH2), 2.56–1.89(m, เดนไดเมอร์และตัวเชื่อมต่อ –CH2), 1.78–1.61 (m, ตัวเชื่อมต่อ –CH2) การสังเคราะห์และการทำให้บริสุทธิ์ของ D-Tesa (6)

เทซา-TEG-อะไซด์ (3,177.8 มก., 0.3{{10}}3 มิลลิโมล) ถูกเติมไปยังของผสมที่กวนของ D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} มก., 0.023 มิลลิโมล) ใน 5 มล. ของส่วนผสมเตตระไฮโดรฟูแรน (THF) ในอัตราส่วน 1:1 และน้ำกับ DMF 0.5 มล. ในขวดขนาด 20 มล. ที่ปลอดภัยสำหรับเครื่องปฏิกรณ์ไมโครเวฟ สำหรับปฏิกิริยาคลิก CuAAC คอปเปอร์ซัลเฟต เพนทาไฮเดรต (11.6 มก., 0.0467 มิลลิโมล) และ (+)-โซเดียม-ลาสคอร์เบต (9.3 มก., 0.0467 มิลลิโมล) ถูกเติมไปยังของผสมปฏิกิริยา

ขวดถูกปิดผนึก จากนั้นจึงใส่ถังปฏิกิริยาลงในเครื่องปฏิกรณ์ไมโครเวฟ Biotage® Initiator และทำปฏิกิริยาภายใต้รังสีไมโครเวฟ 20 วัตต์ โดยคนเป็นเวลา 8 ชั่วโมงที่ 50 องศา ของผสมของปฏิกิริยาถูกถ่ายโอนไปยังหลอดไดอะไลซิส 1000 MWCO และการไดอะไลซิสของ DMF ถูกดำเนินการเป็นเวลา 24 ชั่วโมง โดยที่ DMF ถูกแทนที่ด้วยตัวทำละลายใหม่ประมาณทุก ๆ 4 ชั่วโมง

จากนั้น เนื้อหาของหลอดฟอกไตจะถูกถ่ายโอนไปยังหลอดแอฟัลคอน และเติมน้ำ DI ในปริมาณที่เท่ากัน นอกจากนี้ สารละลายเกลือไดโซเดียมของกรดเอทิลีนไดเอมีนเตตร้าอะซิติก 200 ไมโครลิตรยังถูกเติมลงในเนื้อหาของหลอดฟอลคอน

จากนั้นของผสมนี้ถูกใส่ไปในท่อไดอะไลซิส 1000 MWCO ใหม่ และทำการไดอะไลซิสเป็นเวลา 12 ชั่วโมงในน้ำ DI 1000 มิลลิลิตรพร้อมสารละลาย EDTA ที่เติมตามด้วยการฟอกไตด้วยน้ำเป็นเวลา 12 ชั่วโมง

จากนั้นของผสมถูกไลโอฟิไลซ์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงและได้ผลลัพธ์เป็นผงฟูสีขาว (ผลผลิต: 64%) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.2–7.6 (m, dendrimer Internalamide H), 7.36 (d, Tesa ArH), 7.21 (d, Tesa ArH), 7.03 (d, TesaArH), 6.76 (d, Tesa ArH), 4.37 (s, Tesa H), 4.18–4.04 (m, ตัวเชื่อมโยงH), 3.96 (dd, Tesa และตัวเชื่อมโยง H), 3.70 (m, Tesa และตัวเชื่อมโยง H) ,3.58–3.14 (m, เดนไดเมอร์ –CH2), 3.14–2.86 (m, เดนดริเมอร์ –CH2), 2.87–2.49 (m, เดนดริเมอร์และลิงเกอร์ –CH2), 2.25 (m, เดนดริเมอร์ –CH2) , 1.82–1.67 (m, ตัวเชื่อมโยง –CH2), 0.97 (t, Tesa –CH3)

เทคนิคการกำหนดลักษณะ

เรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR) สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกไว้บนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker 500 MHz ที่อุณหภูมิห้อง การเปลี่ยนแปลงทางเคมีของโปรตอน (δ) ได้รับการรายงานในหน่วย ppm

1H NMR ใช้เพื่อกำหนดจำนวนโมเลกุลของ Tesa ที่ติดอยู่กับแต่ละโมเลกุลของ D-Tesa โดยวิธีการรวมโปรตอน โดยการเปรียบเทียบพีคของโปรตอนเอไมด์ภายในของ dendrimer ที่δ 7.6–8.2 ppm กับโปรตอนอะโรมาติกของ Tesa ที่ δ 7.36–6.76 ppm และเมทิลโปรตอนของ Tesa ในภูมิภาคอะลิฟาติกโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

HPLC(Waters Corporation, มิลฟอร์ด, แมสซาชูเซตส์) ที่ติดตั้งปั๊มไบนารี่ a1525, ดีแก๊สเซอร์ AF แบบอินไลน์, เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ 717 plus, เครื่องตรวจจับโฟโตไดโอดอาเรย์ 2998 และเครื่องตรวจจับมัลติ แลมฟลูออเรสเซนซ์ 2475 ที่เชื่อมต่อกับซอฟต์แวร์ Waters Empower ถูกนำมาใช้

ใช้คอลัมน์แบบย้อนกลับแบบสมมาตร C18 (โทโซห์ ประเทศญี่ปุ่น) ที่มีขนาดอนุภาค 5 ไมโครเมตร ความยาว 25 ซม. และเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 4.6 มม. สารประกอบถูกติดตามที่ 210 นาโนเมตร และ 254 นาโนเมตรโดยใช้ตัวตรวจวัด PDA

ตัวทำละลาย A คือน้ำเกรด HPLC ที่มี 0.1% กรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) และตัวทำละลาย B คือ อะซีโตไนไตรล์ (ACN) ที่มีน้ำ 5% และ 0.1% TFA วิธีการที่ใช้เริ่มต้นที่ 1{ {7}}0 : 0 (ACN: น้ำ) ลดลงเหลือ 10: 90 (น้ำ: ACN) ใน 5 นาที อยู่ที่ขั้วนั้นเป็นเวลา 15 นาที และกลับสู่ 100 : 0 (ACN: น้ำ) ใน 5 นาที อัตราการไหลคงอยู่ที่ 1 มิลลิลิตร นาที−1 แมสสเปกโทรสโกปี

ทำ ESI-MS บนแมสสเปกโตรมิเตอร์ BrukermicroTOF-II โดยใช้อะซีโตไนไตรล์/น้ำ (9: 1) เป็นระบบตัวทำละลาย ไอออนของโมเลกุลเป็นพีคโปรตอน[M + nH]n+ หรือ adducts [M + nX]n+ (X=Na, K หรือ NH4) ถูกนำมาใช้เพื่อยืนยันสูตรเชิงประจักษ์

การกระเจิงของแสงแบบไดนามิกและศักยภาพζ Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, UK) ที่ติดตั้งเลเซอร์ He – Ne ขนาด 5 0 mW (633 nm) ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดขนาดอนุภาคและการกระจายศักย์ของζ D-Tesa ถูกละลายในน้ำ DI จนถึงความเข้มข้น 0.2 mg ml−1 สำหรับ DLS และโซเดียมคลอไรด์ใน 10 mM จนถึงความเข้มข้น 0.1 mg ml−1 สำหรับศักยภาพζ

ทำการวัดที่ 25 องศา โดยใช้มุมกระจาย 173 องศาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า27,46การศึกษาการปล่อยยา D-Tesa ถูกละลายที่ความเข้มข้น 1 มก. ml−1 ในสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 7.4) สภาวะโทมิมิกพลาสมา หรือสารละลายโซเดียมซิเตรต (pH 5.5) เพื่อเลียนแบบสภาวะไลโซโซม

เอสเทเรสจากตับสุกร (จาก Sigma Aldrich) ถูกเติมลงในสารละลายโซเดียมซิเตรตเมื่อเริ่มต้นการศึกษาการปลดปล่อย และเติมประมาณทุกๆ 3 วันในระหว่างการศึกษา

ขวดแต่ละขวดบรรจุตัวอย่างขนาด 15 มล. และเขย่าอย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิ 37 องศาตลอดระยะเวลาของการทดลอง ที่จุดเวลาที่แตกต่างกัน มีการรวบรวมตัวอย่าง 200 ไมโครลิตรที่ซ้ำกันจากแต่ละ pH และกิจกรรมเอสเทอเรสในเวลาต่อมาถูกระงับโดยการเติมออฟเมทานอล 200 ไมโครลิตร ตัวอย่างจุดเวลาเป็นศูนย์ชั่วโมงทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม

ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ −80 องศา เพื่อหลีกเลี่ยงการไฮโดรไลซิสเพิ่มเติม ตัวอย่างถูกวิเคราะห์เพิ่มเติมโดย HPLC และพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (ที่ 210 นาโนเมตร) สำหรับพีคของยาอิสระถูกคำนวณ พื้นที่ใต้เส้นโค้งมีความสัมพันธ์กับปริมาณของยาที่ปล่อยออกมาโดยการใช้กราฟการปรับเทียบโดยที่ความเข้มข้นที่ทราบของ Tesa อิสระถูกรันบน HPLC ที่ 210 นาโนเมตร

For more information:1950477648nn@gmail.com