ภาพที่ชัดเจนและการหาปริมาณของไตในแบบ 3 มิติ

edmund.chen@wecistanche.com

เป็นเวลาหลายทศวรรษ การวัดของไตmicroanatomy โดยใช้2-ส่วนมิติทำให้เรามีความรู้โดยละเอียดเกี่ยวกับ ไต สัณฐานวิทยาภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยา อย่างไรก็ตาม การพัฒนาอย่างรวดเร็วของวิธีการล้างเนื้อเยื่อในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ร่วมกับการพัฒนารูปแบบการถ่ายภาพเชิงมิติแบบใหม่ 3-ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับไตโครงสร้างและหน้าที่ บทความทบทวนนี้อธิบายข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับไตการพัฒนาและโรคที่ได้รับเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยใช้วิธีการใหม่เหล่านี้ ตัวอย่างเช่น ในการพัฒนาไตวิธีการเหล่านี้ได้ให้ความเข้าใจใหม่เกี่ยวกับ morphogenesis ที่แตกแขนงของท่อไต การเพิ่มจำนวนและความมุ่งมั่นของเซลล์ต้นกำเนิด nephron ปฏิกิริยาระหว่างเซลล์ปลายท่อไตและเซลล์ต้นกำเนิดของ nephron และการสร้างการแบ่งส่วน nephron ในหนูตัวเต็มวัยไตการล้างเนื้อเยื่อร่วมกับกล้องจุลทรรศน์แบบแผ่นแสงสามารถสร้างภาพและหาจำนวนรวมของโกลเมอรูไล ซึ่งเป็นความก้าวหน้าครั้งสำคัญในสาขานี้ แนวทางที่คล้ายคลึงกันนี้ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับโครงสร้างของหลอดเลือดในไตและการปกคลุมด้วยเส้น การเปลี่ยนแปลงของเนื้อเยื่อตับ การสูญเสียเซลล์พอดไซต์และการเจริญเติบโตมากเกินไป การสร้างซีสต์ วิวัฒนาการของเสี้ยวเซลล์ และโครงสร้างของสิ่งกีดขวางการกรองไต ความก้าวหน้าอีกมากมายในความเข้าใจของไตชีววิทยาและพยาธิวิทยาสามารถคาดหวังได้เนื่องจากมีการพัฒนาและนำเทคนิคการล้างและการถ่ายภาพเพิ่มเติมมาใช้โดยผู้ตรวจสอบมากขึ้น

คำสำคัญ:ภาพ 3 มิติ; โกลเมอรูลัส; การพัฒนาไต โรคไต; การล้างเนื้อเยื่อ หลอด; ไต

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

จำนวนเนฟรอนทั้งหมดในมนุษย์ปกติแต่ละคนไตมีตั้งแต่ประมาณ 200000 ถึงมากกว่า 2 ล้าน โดย 1 โดยเฉลี่ยประมาณ 1 ล้าน เนฟรอนเหล่านี้รวมถึงส่วนประกอบอื่นๆ ของไตรวมถึงการรวบรวมท่อ หลอดเลือด คั่นระหว่าง และเส้นใยประสาท ถูกจัดเรียงด้วยความแม่นยำระดับจุลกายวิภาคที่สวยงาม 2 รูปแบบที่แม่นยำนี้เป็นรากฐานของปกติการทำงานของไตและสุขภาพ ซึ่งสามารถถูกรบกวนอย่างรุนแรงเมื่อโครงสร้างเนื้อเยื่อมีการเปลี่ยนแปลงเนื่องจากการเจริญมากเกินไปหรือการหดตัวของไตหรือท่อ การสูญเสียของไต ความผิดปกติ แต่กำเนิด การหายากของหลอดเลือด และการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้า แนวทางการถ่ายภาพที่หลากหลายมีส่วนทำให้เราเข้าใจถึงไตmicroanatomy ระหว่างการพัฒนาและในผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดีและเป็นโรคไต. โดยส่วนใหญ่ ความเข้าใจนี้มาจากการวิเคราะห์ส่วน2-มิติ (2D) ไม่ว่าจะเป็นส่วนทางกายภาพของแสงหรืออิเล็กตรอนด้วยกล้องจุลทรรศน์หรือส่วนแสงแบบคอนโฟคอล การหาปริมาณของจุลกายวิภาคศาสตร์นี้ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ทางสเตอริโอวิทยาของส่วนที่ให้ค่าประมาณของตัวเลข ความยาว พื้นที่ผิว และปริมาตรของโกลเมอรูลี ท่อทูบูล หลอดเลือด คั่นระหว่างหน้า และส่วนประกอบของเซลล์ 3,4 จนกระทั่งเมื่อไม่นานมานี้ การสร้างภาพ 3 มิติของไตโครงสร้างจุลภาคส่วนใหญ่จำกัดอยู่ที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ซึ่งช่วยให้สามารถแบ่งส่วนแสงและการสร้างใหม่ 3 มิติได้ลึกถึง 50 ถึง 80 ม. ม. น่าเสียดายที่คุณสมบัติการหักเหของแสงของส่วนประกอบโปรตีนและไขมันภายในเนื้อเยื่อกระจายแสง และทำให้คุณภาพของภาพลดลงอย่างมากเมื่อความลึกเพิ่มขึ้น ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการพัฒนาวิธีการล้างที่หลากหลายเพื่อขจัดปริมาณไขมันและเม็ดสีของเนื้อเยื่อ และจับคู่คุณสมบัติการหักเหของแสงของเนื้อเยื่อและสื่อยึดติดเพื่อทำให้เนื้อเยื่อโปร่งใส 5 วิธีการหักบัญชีมีความซับซ้อนตั้งแต่การบ่มเนื้อเยื่อในสารละลายต่างๆ ในช่วงเวลาหลายชั่วโมง ไปจนถึงขั้นตอนเพิ่มเติมที่เกี่ยวข้องกับอุปกรณ์ไฟฟ้าเคมีแบบกำหนดเอง เรานำผู้อ่านไปยังบทวิจารณ์ล่าสุด 5,6 สำหรับภาพรวมโดยละเอียดของวิธีการในปัจจุบัน และเอกสารที่อ้างถึงในที่นี้สำหรับวิธีการเฉพาะและกรณีการใช้งาน

โครงสร้างเซลล์ย่อยและประชากรทั้งหมดของเซลล์สามารถแก้ไขได้ภายในอวัยวะที่เคลียร์ทั้งหมดหรือส่วนที่หนา คุณสมบัติการถ่ายภาพอย่างแม่นยำภายในเนื้อเยื่อที่เคลียร์ต้องใช้กล้องจุลทรรศน์เฉพาะทางและการประมวลผลภาพเพื่อจับภาพและสร้างข้อมูลเชิงปริมาตรขึ้นใหม่จากตัวอย่างที่มีขนาดตั้งแต่หลายร้อยไมครอนจนถึงเซนติเมตร การสแกนจุดและกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลดิสก์แบบหมุนได้ถูกนำมาใช้อย่างมีประสิทธิภาพกับคุณสมบัติภาพภายในเคลียร์ไตเนื้อเยื่อแต่ต้องทนทุกข์ทรมานจากความละเอียดที่ลดลงในแกน Z และการลดความเข้มของการเรืองแสงที่ความลึกลงเรื่อยๆ เนื่องจากการส่องสว่างและการถ่ายภาพในแกนเดียว เทคนิคกล้องจุลทรรศน์แบบไลท์ชีตเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการถ่ายภาพเนื้อเยื่อที่เคลียร์แล้ว เนื่องจากช่วยให้ได้ปริมาตร 3 มิติขนาดใหญ่อย่างรวดเร็ว และอาจรวมถึงการให้แสงแบบหลายมุมและการถ่ายภาพด้วย เอกซเรย์ฉายภาพด้วยแสงเป็นอีกแนวทางหนึ่งที่รวมเอาการถ่ายภาพหลายมุมและการสร้างใหม่ด้วยระบบดิจิตอลเพื่อสร้างข้อมูลที่แกน X, Y และ Z ของแต่ละ voxel มีความละเอียดเท่ากัน โดยไม่คำนึงถึงวิธีการเฉพาะ การล้างเนื้อเยื่อและการถ่ายภาพทั้งส่วนทำให้เกิดโอกาสใหม่ในการสำรวจสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคของเซลล์ที่ไม่คุ้นเคยและโครงสร้างเนื้อเยื่อระดับสูง ในการตรวจสอบนี้ เราเน้นข้อมูลเชิงลึกใหม่ ๆ เกี่ยวกับไตพัฒนาการ ผู้ใหญ่ไตโครงสร้างและพยาธิสภาพที่เกิดจากการล้างเนื้อเยื่อ ตามด้วยการวิเคราะห์เชิงปริมาณ 3 มิติ

ข้อมูลเชิงลึกใหม่ในการพัฒนาไตทศวรรษของการทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนและการศึกษาที่น่าพิศวงได้นำไปสู่ความเข้าใจโดยละเอียดเกี่ยวกับประเภทเซลล์ เครือข่ายการควบคุมยีน และเส้นทางการส่งสัญญาณที่ควบคุมสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไตการพัฒนา. ความรู้นี้แจ้งการวินิจฉัยโรคที่มีมาแต่กำเนิดและช่วยให้สามารถผลิตไตชนิดเซลล์จากสเต็มเซลล์ pluripotent 7 อย่างไรก็ตาม ขนาด ความทึบ และความซับซ้อนของการพัฒนาไตเป็นอุปสรรคสำคัญในการวัดรูปร่างของอวัยวะนี้อย่างแม่นยำและการกระจายเซลล์และโปรตีนภายใน 3 มิติ การประยุกต์ใช้การล้างเนื้อเยื่อและการถ่ายภาพหลายขนาดในไตได้เปิดใช้งานการแสดงภาพและการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ morphogenesis ที่แตกแขนงของท่อไต, จำนวนเซลล์ต้นกำเนิด, และการบริจาคไตภายในอวัยวะที่ไม่บุบสลาย (รูปที่ 1) 8 วิธีการเหล่านี้สนับสนุนความสามารถใหม่สำหรับการสร้างฟีโนไทป์ที่แม่นยำและช่องทางเปิดเพื่อวิเคราะห์ตัวขับเคลื่อนระดับเซลล์และโมเลกุลของไตการพัฒนาและโรคประจำตัว

การสร้างภาพและการวิเคราะห์การแตกแขนงของการสร้างรูปร่างในแบบ 3 มิติการสร้างต้นไม้ท่อไตเป็นคุณสมบัติที่กำหนดของไตการพัฒนาและได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางโดยใช้พันธุศาสตร์ของเมาส์และแบนไตวัฒนธรรมที่อธิบาย อย่างไรก็ตาม การทำความเข้าใจว่ายีนแต่ละตัวมีส่วนทำให้เกิดการเจริญเติบโต รูปแบบ และรูปแบบของโครงสร้างท่อเยื่อบุผิวที่แตกแขนงนี้อย่างไรในร่างกาย จำเป็นต้องมีความสามารถในการสร้างภาพและวิเคราะห์เครือข่ายที่ซับซ้อนนี้ในขนาดตัวอย่างที่หลากหลาย สั้นและคณะ 8 แก้ไขปัญหาเหล่านี้โดยใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ทั้งตัว การล้างด้วยตัวทำละลาย (เบนซิล แอลกอฮอล์ เบนซิล เบนโซเอต) และการถ่ายภาพอวัยวะทั้งหมดด้วยเอกซเรย์ฉายภาพด้วยแสง การใช้วิธีนี้ในการถ่ายภาพสแนปชอต 3 มิติตั้งแต่ต้นถึงกลางไตทีมพัฒนาได้พัฒนาซอฟต์แวร์การวิเคราะห์แบบกำหนดเองเพื่อให้ได้รายละเอียดที่ไม่เคยมีมาก่อนเกี่ยวกับต้นไม้ท่อไต ซึ่งรวมถึงจำนวนส่วนปลาย มุมและความยาวของกิ่ง ปริมาณกิ่ง และจำนวนรุ่นของการแตกแขนงจากต้นยูเทอริกที่ไม่บุบสลาย (รูปที่ 1c และ d) 8 เริ่มแรกใช้เพื่อกำหนดลักษณะและระบุลักษณะใหม่ของการแตกแขนงของไต 9,10 ความพยายามอย่างต่อเนื่องพยายามที่จะกำหนดหลักการและหน่วยงานกำกับดูแลหลักที่ควบคุมรูปแบบสาขาในร่างกาย 1

การเชื่อมโยงพลวัตของต้นกำเนิดกับการสร้างรูปร่างของอวัยวะด้วยการถ่ายภาพหลายสเกลปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลระหว่างเซลล์ท่อไตและเซลล์ต้นกำเนิด nephron มีบทบาทสำคัญในการสร้างส่วนประกอบของ nephrons ที่อำนวยความสะดวกการทำงานของไตในชีวิตผู้ใหญ่ ต้นกำเนิดของ nephron ที่ไม่ถูกชักนำทำให้เกิดปัจจัยที่ส่งเสริมไตการเจริญเติบโตผ่านการแตกแขนงของท่อไต ในขณะที่การจำกัดเชิงพื้นที่ภายในปลายท่อไต ทั้งสองรักษาสถานะต้นกำเนิดของ nephron และชักนำให้ส่วนย่อยของต้นกำเนิดเหล่านี้แยกความแตกต่างเป็น nephron ระยะแรก ปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ขับเคลื่อนวงจรของการแตกแขนงและการเหนี่ยวนำของเนฟรอนที่หยุดรอบการเกิด เมื่อต้นกำเนิดของเนฟรอนที่เหลืออยู่มีความแตกต่างกัน ก่อนวิธีการล้างเนื้อเยื่อ ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับพลวัตของไตmorphogenesis และความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของประชากรเซลล์ต้นกำเนิดตลอดเวลาถูกจำกัดอย่างรุนแรง สิ่งนี้เปลี่ยนไปด้วยการพัฒนาวิธีการถ่ายภาพหลายขนาดโดยใช้โปรโตคอลอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์แบบขยาย การล้างเนื้อเยื่อ และวิธีการถ่ายภาพเพื่อหาปริมาณไตการพัฒนาในระดับเซลล์ (คอนโฟคอล) และระดับอวัยวะทั้งหมด (เอกซเรย์ฉายภาพด้วยแสง, แผ่นแสง) 9,10 เห็นได้ชัดว่าอัตราของไตการเจริญเติบโตแตกต่างกันไปอย่างมากโดยอัตราการแตกแขนงอย่างรวดเร็วในขั้นต้นและอัตราการงอกลดลงในระยะที่สัมพันธ์กับการลดจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดภายในช่องที่เกี่ยวกับไต 10 การถ่ายภาพสามมิติแบบคอนโฟคอลของทารกในครรภ์ทั้งตัวที่เคลียร์แล้วไต(สัปดาห์ที่ 11) หรือตัวอย่างจากไตเปลือกนอก (สัปดาห์ที่ 11–23) ยืนยันว่าขนาดของช่องที่ลดลงนี้ได้รับการอนุรักษ์ไว้ข้ามสายพันธุ์ 12 การวิเคราะห์เปรียบเทียบเพิ่มเติมของช่อง nephrogenic ของมนุษย์และหนูเมาส์ในเนื้อเยื่อที่ปลอดโปร่งทำให้เกิดรูปแบบการจัดหาใหม่ตามเวลาของการก่อตัวของเนฟรอน โดยที่เซลล์ต้นกำเนิดจะถูกเพิ่มเข้าไปในเนฟรอนในระยะแรกอย่างค่อยเป็นค่อยไป และใช้เอกลักษณ์เซกเมนต์ตามลำดับที่พวกมันมาถึง . ในการศึกษาอื่นที่เน้นไปที่ความมุ่งมั่นของ nephron progenitor ได้ใช้วิธีการล้างเนื้อเยื่อโดยใช้ไฮโดรเจล (Passive Clear Lipid-exchangeed Acryl-amide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14 ) สำหรับ ความสามารถในการคงการเรืองแสงของนักข่าว tdTomato ภายนอก การวิเคราะห์การติดฉลาก tdTomato ภายในเนื้อเยื่อที่ล้างแล้วพบว่าเซลล์ภายในเนฟรอนที่ก่อมะเร็งในระยะแรกสามารถกลับคืนสู่สถานะต้นกำเนิดได้ ซึ่งผลลัพธ์ก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าความมุ่งมั่นเป็นแบบทางเดียว 15 ดังนั้น การล้างเนื้อเยื่อได้ปรับปรุงความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกระบวนการพัฒนาแบบไดนามิกในทุกระดับและสปีชีส์

ฟีโนไทป์ที่แม่นยำ. ความก้าวหน้าในการล้างเนื้อเยื่อและการวิเคราะห์เชิงปริมาณได้เปิดใช้งานความสามารถใหม่สำหรับฟีโนไทป์ที่แม่นยำ การเปลี่ยนแปลงที่แข็งแกร่งทางสถิติในการแตกแขนงและจำนวน nephron ได้รับการระบุในแบบจำลองเมาส์ที่มีฟีโนไทป์ที่ละเอียดอ่อน เช่น Ret þ/? และ Six2 þ/? หนู (รูปที่ 2) ซึ่งก่อนหน้านี้จัดอยู่ในประเภท "ปกติ" 10,16 การถ่ายภาพคอนโฟคอลความละเอียดสูงของการล้าง Wnt11 ?/?ไตระบุฟีโนไทป์ของเซลล์ใหม่ที่ซึ่งต้นกำเนิดของ nephron ดูไม่เป็นระเบียบเนื่องจากไม่สามารถสร้างสิ่งที่แนบมากับเซลล์ที่เสถียรด้วยปลายท่อไตและแยกความแตกต่างก่อนเวลาอันควร 17 วิธีการเหล่านี้ยังถูกใช้เพื่อหาปริมาณว่าตัวควบคุมใหม่ของสถานะเซลล์ต้นกำเนิด nephron เช่น DNA methyltransferase 1, microRNAs Lin28 และ Let7 และอิทธิพลของ TSC1ไตพัฒนาการและจำนวนเนฟรอน ฟีโนไทป์ที่แม่นยำ 18–20 มีแนวโน้มที่จะกลายเป็นเครื่องมือสำคัญในความพยายามของเราในการทำความเข้าใจผลกระทบเพิ่มเติมของปัจจัยทางพันธุกรรมและสิ่งแวดล้อมที่มีส่วนทำให้จำนวน nephron ต่ำและความโน้มเอียงที่จะเรื้อรังโรคไต

แบบจำลองทางคณิตศาสตร์ของไตสัณฐานวิทยา ข้อมูลที่ได้มาจากการพัฒนาที่ชัดเจนไตกำลังกระตุ้นคลื่นของการสร้างแบบจำลองทางคณิตศาสตร์จากภาพที่พยายามจะแยกแยะว่ารูปแบบและหน้าที่ของเนื้อเยื่อขนาดมหภาคเกิดขึ้นได้อย่างไรจากปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลระหว่างประชากรเซลล์ต้นกำเนิด 11,21–23 การประยุกต์ใช้การถ่ายภาพอวัยวะทั้งหมดเพิ่มเติมในเนื้อเยื่อใสจะมีความสำคัญอย่างยิ่งในการทำความเข้าใจตัวขับเคลื่อนระดับโมเลกุลและเซลล์ของรูปแบบเนื้อเยื่อ 3 มิติ และอาจถือเป็นกุญแจสำคัญในการปรับปรุงโครงสร้างและความถูกต้องของแบบจำลองเซลล์ต้นกำเนิดของไต.

สัณฐานวิทยา 3 มิติและพยาธิสภาพของไตผู้ใหญ่สัณฐานวิทยาที่ซับซ้อนของผู้ใหญ่ไตจำกัดการใช้เครื่องมือทางสัณฐานวิทยา 2 มิติ เนื่องจากอาจสื่อถึงการรับรู้ที่ไม่สมบูรณ์หรือทำให้เข้าใจผิดเกี่ยวกับโครงสร้าง 3 มิติ ในที่นี้ เราจะหารือเกี่ยวกับความก้าวหน้าของระเบียบวิธีที่สำคัญบางประการในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ซึ่งขณะนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์โครงสร้าง 3 มิติในผู้ใหญ่ได้อย่างมีประสิทธิภาพไต, ตั้งแต่เหมือนเดิมไตไปจนถึงส่วนประกอบของแผ่นกั้นการกรองไต (รูปที่ 3) 2

CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต

จำนวนและขนาดของเนฟรอนมนุษย์ไตแสดงให้เห็นความแปรปรวนภายในและระหว่างหัวเรื่องในจำนวนและปริมาตรของเนฟรอนในระดับสูง ซึ่งได้อธิบายไว้ในการศึกษาชันสูตรพลิกศพของอาสาสมัครโดยไม่เปิดเผยโรคไต1,30,31 และเชื่อมโยงกับการรบกวนพัฒนาการ เป็นเวลาหลายทศวรรษแล้วที่เครื่องมือมาตรฐานทองคำในการหาปริมาณจำนวนเนฟรอนในตัวอย่างทดลองและตัวอย่างของมนุษย์คือวิธีดิสเซกเตอร์/ตัวแยกส่วน ซึ่งเป็นวิธีสเตอริโอลอจิคัลที่มีการออกแบบเป็นหลัก 3,4 แม้ว่าวิธีการนี้จะแม่นยำและแม่นยำ แต่ก็ยังเป็นการลงมือปฏิบัติ ใช้เวลานาน และต้องมีการฝึกอบรมที่สำคัญ ด้วยเหตุผลนี้ แนวทางทางเลือกจึงถูกเสนอให้คิดค้นวิธีการที่มีประสิทธิภาพที่สามารถให้จุดยุติคุณภาพสูง: 32 ตัวอย่างเช่น การรวมกันของวิธีการหักบัญชีด้วยแสง ซึ่งรวมถึงไม่ชอบน้ำ (ก่อนหน้านี้เรียกว่าเป็นตัวทำละลาย) แบบที่ชอบน้ำหรือแบบไฮโดรเจล ด้วยขั้นสูง กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (เช่น confocal, multiphoton หรือ light sheet)

ตามความรู้ของเรา รายงานฉบับแรกที่รวมกล้องจุลทรรศน์การหักเหแสงและกล้องจุลทรรศน์แบบแผ่นแสงสำหรับการวิเคราะห์จำนวนและขนาดของเนฟรอนได้รับการตีพิมพ์โดย Klingberg et al 24 ในเอกสารสำคัญที่มีความก้าวหน้าที่สำคัญหลายประการ อย่างแรก รายงานนี้แนะนำเอทิล ซินนาเมต ซึ่งเป็นตัวทำละลายที่ไม่เป็นอันตรายซึ่งสามารถแทนที่สารเคมีที่เป็นพิษ เช่น เบนซิล แอลกอฮอล์–เบนซิล เบนโซเอต ซึ่งจนกระทั่งถึงตอนนั้นก็ถูกใช้เป็นประจำในโปรโตคอลการหักบัญชีที่ไม่ชอบน้ำ ประการที่สอง ผู้วิจัยทำการนับ nephron ในหนูที่ไม่เสียหายไตฉันn รูปแบบที่ก้าวร้าวและก้าวหน้าของภูมิคุ้มกัน-ไกล่เกลี่ยโรคไตการระบุการสูญเสียของ nephron ระหว่างโรค นอกจากนี้ ยังได้แนะนำขั้นตอนสำคัญสู่ระบบอัตโนมัติด้วยคอมพิวเตอร์ของอัลกอริธึมการแบ่งส่วนรูปภาพ ซึ่งเป็นเส้นทางสู่การปรับปรุงประสิทธิภาพที่สำคัญ ล่าสุด Østergaard et al. 25 นำเสนอวิธีการหักบัญชีที่ไม่ชอบน้ำที่คล้ายคลึงกันร่วมกับกล้องจุลทรรศน์แบบแผ่นแสงและการแบ่งส่วนภาพอัตโนมัติที่ให้ทั้งจำนวนไตทั้งหมดและปริมาตรของไตเดียวในแบบจำลองเมาส์ของโรคไตจากเบาหวาน นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังแสดงให้เห็นการติดฉลากการทำงานที่สวยงามของทูบูไลส่วนต้นผ่านทางการฉีดอัลบูมินในร่างกาย เพื่อให้เห็นภาพของรอยต่อของท่อไตและโครงร่างอย่างง่ายสำหรับจุลพยาธิวิทยาที่สัมพันธ์กันในตัวอย่างที่ล้างด้วยแสงเดียวกัน รายงานนี้แสดงให้เห็นถึงความยืดหยุ่นของโปรโตคอลเหล่านี้ ซึ่งกำลังกลายเป็นไปป์ไลน์แบบหลายชั้นสำหรับการทำโปรไฟล์เนื้อเยื่อที่ครอบคลุม

หลอดเลือดไตและการปกคลุมด้วยเส้นตามรอยเส้นเลือดแตกแขนงหรือเส้นใยประสาทในผู้ใหญ่ไตแทบจะเป็นไปไม่ได้เลยในจุลกายวิภาคศาสตร์แบบ 2 มิติ เนื่องจากขนาดของอวัยวะและความซับซ้อนของการกระจายโครงสร้างจำเป็นต้องมีการแบ่งส่วนแบบอนุกรมที่กว้างขวางและเชี่ยวชาญ ล่าสุด Huang et al. 33 รายงานว่ามีประจุบวกใกล้สีย้อมเรืองแสงอินฟราเรด (MHI148-PEI) เพื่อติดฉลากหลอดเลือดโดยเฉพาะ ซึ่งสามารถใช้ร่วมกับโปรโตคอลการหักล้างที่ปรับเปลี่ยนและเร่งความเร็วได้โดยใช้เอทิล ซินนาเมต เพื่อลดระยะเวลาในการประมวลผลเนื้อเยื่อ แนวทางนี้เปิดช่องทางใหม่สำหรับการวิจัยหลอดเลือดในไต,โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องการภาพความละเอียดสูงในแบบ 3 มิติ ในทำนองเดียวกัน Hasegawa และคณะ 26 ใช้ค็อกเทลล้างสมอง/ร่างกายที่ไม่มีสิ่งกีดขวางและการวิเคราะห์เชิงคำนวณ (CUBIC) ร่วมกับระบบกล้องจุลทรรศน์แบบแผ่นแสงที่สร้างขึ้นเองเพื่อระบุการกระจายของการปกคลุมด้วยเส้นความเห็นอกเห็นใจในไตของเมาส์ที่ไม่บุบสลาย เส้นประสาทที่เห็นอกเห็นใจกระจายไปทั่วหลอดเลือดแดงเป็นหลัก หลังจาก 10 วันของการขาดเลือดขาดเลือดหรืออาการบาดเจ็บที่การกลับเป็นซ้ำ ความหนาแน่นของเยื่อหุ้มเซลล์แบบเห็นอกเห็นใจก็ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสัมพันธ์กับระดับ norepinephrine ที่ลดลงในเนื้อเยื่อไต. การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ยังคงอยู่เพียงบางส่วนภายใน 28 วันหลังจากได้รับบาดเจ็บครั้งแรก ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจพบการเปลี่ยนแปลงที่เห็นอกเห็นใจอย่างต่อเนื่องในระหว่างการลุกลามของโรคเรื้อรังโรคไต.

การเปลี่ยนแปลงของ Tubulointerstitialระบบท่อไตวิเคราะห์ได้ยากเป็นพิเศษในรูปแบบ 3 มิติ ลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ซับซ้อนและซับซ้อนทำให้เกิดความท้าทายหลายประการสำหรับวิธีการทั่วไปโดยพิจารณาจากการแบ่งส่วนแบบอนุกรมและกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม การล้างด้วยแสงช่วยให้สามารถวิเคราะห์ tubuli ที่ไม่บุบสลายและสภาพแวดล้อมจุลภาคโดยรอบได้ ศริตาส et al. 34 ทำการผสมผสานระหว่างการล้างด้วยแสงแบบไฮโดรเจลและแบบไม่ชอบน้ำ ตามด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงขั้นสูงและการวิเคราะห์ 3 มิติแบบกึ่งอัตโนมัติเพื่อกำหนดลักษณะการเปลี่ยนแปลงของท่อส่วนปลายเนื่องจากการกีดกันโพแทสเซียมในอาหาร ผู้ตรวจสอบหาปริมาณ hyperplasia ของท่อและตรวจพบการเพิ่มขึ้นของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนภายใน tubulointerstitium การศึกษานี้ใช้ประโยชน์จากความเก่งกาจของทั้งการหักเหแสงและ

รูปที่ 3| สัณฐานวิทยาสามมิติ (3D) ในไตผู้ใหญ่ (ก) การนับไตในไตทั้งหมดโดยใช้การติดฉลาก CD31 ของเซลล์บุผนังหลอดเลือด แผงแสดงการสร้างใหม่ 3 มิติ (ซ้าย) ส่วนออปติคัลในมุมมองสองมิติ (2D) (ตรงกลาง) และพื้นที่พิเศษที่แสดงโกลเมอรูไลเดี่ยวในการเปรียบเทียบระหว่างกล้องจุลทรรศน์แผ่นเรียบ (LSFM) กับเลนส์คอนโฟคอลและ 2- โฟตอน (2P) กล้องจุลทรรศน์ ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก American Society of Nephrology จาก Journal of the American Society of Nephrology การประเมินจำนวนโกลเมอรูลาร์ทั้งหมดและขนาดกระจุกของเส้นเลือดฝอยในไตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ไลท์ชีตแบบอัตโนมัติ, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al ., เล่มที่ 28, ฉบับที่ 2, 2017; การอนุญาตที่ส่งผ่าน Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Sizing glomeruli with spatial registration—รหัสสีแสดงถึงขนาด glomerular โดยที่สีแดงคือวัตถุที่ใหญ่ที่สุดและสีชมพูเป็นวัตถุที่เล็กที่สุด ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก American Society of Nephrology จาก Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., volume 6, issue 6 , 2020; การอนุญาตที่ส่งผ่าน Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) การติดตามหลอดเลือดและการปกคลุมด้วยเส้น ซึ่งประกอบด้วยการสร้าง 3 มิติของไตที่ไม่บุบสลายด้วยการสร้างฉลากภูมิคุ้มกันของเส้นประสาทที่เห็นอกเห็นใจ (สีเขียว) ระบบหลอดเลือด (สีม่วงแดง) และการรวมเข้าด้วยกัน (ซ้าย) ดัดแปลงจาก Kidney International เล่มที่ 96 ฉบับที่ 1 Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) ที่แสดงให้เห็นภาพเส้นประสาทที่เห็นอกเห็นใจไตผิดปกติหลังการบาดเจ็บจากการขาดเลือด/การกลับเป็นเลือด หน้า 129–138 ลิขสิทธิ์ 2019 โดยได้รับอนุญาตจาก International Society of Nephrology 26 (d) สัณฐานวิทยาของโพโดไซต์ในโกลเมอรูไลแต่ละชนิดโดยใช้การติดฉลากอิมมูโนสำหรับมาร์กเกอร์จำเพาะของโพโดไซต์ p57 (สีเขียว) และเครื่องหมายดีเอ็นเอ 4 0 ,6-ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลลินโดล (DAPI) แผงแสดง (ซ้าย) การสร้าง 3D และ (ขวา) พื้นผิวที่แสดงผล ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก American Society of Nephrology จาก Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., เล่มที่ 27, ฉบับที่ 10, 2016; การอนุญาตที่ส่งผ่าน Copyright Clearance Center, Inc. 27 (จ) พลวัตของเซลลูลาร์โดยใช้การติดตามเชื้อสาย แสดง podocytes (ซ้ายสุด) เซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม (PECs) ก่อตัวเป็นเสี้ยวเซลล์ในรูปแบบ 3 มิติ (กลางซ้าย) มุมมอง 2 มิติของ PEC ที่บุกรุก ด้านไตที่มีอาการบาดเจ็บที่หลอดเลือด (กลาง-ขวา) และภาพ 2 มิติของท่อทางออก (ขวาสุด) ดัดแปลงจาก Kidney International เล่มที่ 96 ฉบับที่ 2 Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., การวิเคราะห์นวนิยาย 3 มิติโดยใช้เอกสารการล้างเนื้อเยื่อออปติคัลเอกสารการวิวัฒนาการของ glomerulonephritis ก้าวหน้าอย่างรวดเร็วของ murine หน้า 505–516 ลิขสิทธิ์ ª 2019 นานาชาติ Society of Nephrology ภายใต้ใบอนุญาต CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) 28 (f) การแสดงภาพไดอะแฟรมกรีดด้วยกำลังขยายที่เพิ่มขึ้นจากซ้ายไปขวา ดัดแปลงจาก Kidney International เล่มที่ 99 ฉบับที่ 4 Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., โปรโตคอลการล้างและบวมที่ง่ายและรวดเร็วสำหรับการถ่ายภาพ 3 มิติในแหล่งกำเนิดของไตข้ามตาชั่ง หน้า 1010–1020 , ลิขสิทธิ์ ª 2021, International Society of Nephrology, ภายใต้ใบอนุญาต CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) 29 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่www.ไต-อินเตอร์เนชั่นแนล.org

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อทำการวิเคราะห์ท่อในไตที่ไม่บุบสลายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบฝังไฮโดรเจลและกล้องจุลทรรศน์แบบแผ่นแสง ตลอดจนการหาปริมาณเซลล์เดียวในชิ้นไตโดยใช้การล้างแบบไม่ชอบน้ำและกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล เนื่องจากแต่ละชุดจะเหมาะสมกว่าสำหรับคำถามการวิจัยเฉพาะ Tahaei et al ใช้การผสมผสานของการหักล้างด้วยแสงและกล้องจุลทรรศน์แสงขั้นสูง 35 ซึ่งมีลักษณะพหุสัณฐานทางเพศในความยาวของท่อปลายโค้ง ซึ่งอาจกำหนดความสามารถของมันในการปรับให้เข้ากับความเครียดทางสรีรวิทยา และ Schuh et al. 36 ผู้เปิดเผยความแตกต่างในแนวแกนในการดูดจับลิแกนด์ของท่อใกล้เคียงและการทำงานของเอนโดไลโซโซม โดยเน้นว่าเซ็กเมนต์ S1 มีความเชี่ยวชาญสูงในการดูดซับโปรตีนอีกครั้งผ่านทางเอนโดไซโทซิสที่อาศัยรีเซพเตอร์ ในการศึกษาล่าสุด Blanc et al. 2 วิเคราะห์แบบจำลองของการสร้างซีสต์ โดยแสดงให้เห็นว่าซีสต์พัฒนาเฉพาะในส่วนเนฟรอนที่จำเพาะ ซึ่งกำหนดรูปร่างของพวกมันและตั้งอยู่ติดกับท่อที่ไม่เจือปนปกติ โดยรวมแล้ว ตอนนี้เรามีตัวอย่างมากมายของการใช้ออปติคัลเคลียริ่งโดยตรงสำหรับการวิเคราะห์อย่างเป็นระบบของช่องคั่นระหว่างหน้าของท่อ

การสูญเสีย Podocyte และยั่วยวนโกลเมอรูลัสให้ตัวอย่างเฉพาะสำหรับการวิเคราะห์หน่วยการทำงานที่ไม่บุบสลายภายในอวัยวะ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การศึกษาการพร่องของ podocyte ได้รับประโยชน์โดยตรงจากความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีเหล่านี้ เนื่องจากวิธีการออกแบบที่ใช้มาตรฐานทองคำต้องใช้เวลาและทรัพยากรอย่างมาก 37 เครื่องมือแรกสำหรับการวิเคราะห์ 3D podocyte morphometric ของ glomeruli ของเมาส์ที่ไม่บุบสลายรวม immunolabeling ของไตชิ้นโดยใช้โปรโตคอลที่ปรับเปลี่ยนของอิมมูโนฟลูออเรสทางอ้อม การล้างด้วยแสงแบบไม่ชอบน้ำ และกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ซึ่งอำนวยความสะดวกในการหาปริมาณของจำนวนพอโดไซต์ทั้งหมดในโกลเมอรูไลแต่ละอันของปริมาตรที่ทราบ เราเชื่อว่าแนวทางนี้เหมาะสำหรับการศึกษากระบวนการที่ส่งผลต่อชุดย่อยของโครงสร้าง (เช่น การสูญเสีย podocyte ที่นำไปสู่ ​​glomerulosclerosis แบบโฟกัสและแบบปล้อง) เทคนิคเดียวกันนี้ถูกนำมาใช้ในภายหลังเพื่อกำหนดลักษณะของบทบาทของการเจริญเติบโตมากเกินไปของ podocyte เป็นการตอบสนองการชดเชยหลังจากการสูญเสีย podocyte ซึ่งเป็นกลไกที่เป็นสื่อกลางโดยเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของเส้นทางการส่งสัญญาณราพามัยซิน 38 ในขณะที่การศึกษาทั้ง 2 นี้เน้นไปที่การวิเคราะห์ของ glomerular podocytes ไปป์ไลน์นี้ที่อิงการติดฉลากอิมมูโนแบบธรรมดาสามารถใช้เพื่อกำหนดลักษณะการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ชนิดใดก็ได้ที่ความละเอียดเชิงพื้นที่สูง

วิวัฒนาการของเสี้ยวเซลล์เครื่องมือสำคัญอีกตัวที่จำเป็นต้องรวมเข้ากับกล่องเครื่องมือสำหรับ 3D . ให้สำเร็จไตmorphometry คือการติดตามเชื้อสายทางพันธุกรรม วิธีการหักล้างด้วยแสงส่วนใหญ่มักจะทำให้เกิดการดับแสงฟลูออเรสเซนต์ในระดับหนึ่ง (ซึ่งแตกต่างกันไปตั้งแต่เล็กน้อยถึงรุนแรง) 6 เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้นำเสนอโปรโตคอลที่รวมการติดตามสายเลือด การล้างด้วยแสง และกล้องจุลทรรศน์หลายโฟตอนสำหรับการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมของการสูญเสียเซลล์พอดไซต์และการกระตุ้นเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม 28 ในการศึกษานี้ การสูญเสีย podocyte ถูกระบุว่าเป็นคุณลักษณะของโรคไตอักเสบเสี้ยววงเดือนในการทดลองโดยใช้การติดฉลากเมแทบอลิซึมของ podocytes ด้วยโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่เพิ่มขึ้น วิวัฒนาการของเสี้ยวเซลล์ถูกมองเห็นและหาปริมาณโดยอิงจากการเพิ่มจำนวนและการย้ายถิ่นของเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม ซึ่งถูกทำเครื่องหมายด้วยโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่ได้รับการปรับปรุงและติดตามในระหว่างการทดลองแบบจำลองของโรคไตอักเสบจากเสี้ยวพระจันทร์ การวิเคราะห์โกลเมอรูไลที่ไม่บุบสลายทำให้สามารถระบุการสูญเสียโฟกัสของโพโดไซต์และการก่อตัวของรอยโรค ซึ่งพัฒนาไปสู่การอุดตันของหลอดอาหารโดยเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของโกลเมอรูไลที่ทูบ (atubular glomeruli) การศึกษานี้ปูทางสำหรับการศึกษาในอนาคตของปฏิสัมพันธ์ระหว่างภูมิคุ้มกันและเยื่อบุผิวที่ซับซ้อนภายในที่ไม่เสียหายไต

CISTANCHE จะปรับปรุงการฟอกไต/ไต

แผ่นกั้นกรองไตเครื่องมือวินิจฉัยที่สำคัญสำหรับการประเมินโรคไตเป็นประจำคือการวิเคราะห์โครงสร้างพิเศษของการตรวจชิ้นเนื้อไตด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน อีกทางเลือกหนึ่งสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสามารถพบได้ในด้านของกล้องจุลทรรศน์ขยาย ซึ่งตามคำจำกัดความมีจุดมุ่งหมายเพื่อเพิ่มความละเอียดทางแสงโดยการเพิ่มขนาดเนื้อเยื่อ ในช่วงหลายปีที่ผ่านมา Unnersjo-Jess และคณะ 39,40 ได้จัดเตรียมโปรโตคอลหลายตัวสำหรับการแสดงภาพโครงสร้างระดับนาโนในไต.เมื่อเร็ว ๆ นี้ ผู้ตรวจสอบเหล่านี้รายงานขั้นตอนที่ง่ายและรวดเร็วสำหรับการสร้างภาพ 3 มิติของไตสัณฐานวิทยาที่รวมแนวคิดการหักล้างด้วยแสงและการขยายเนื้อเยื่อเพื่อแก้ไขโครงสร้างระดับนาโนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบธรรมดา 29 โปรโตคอลนี้ใช้เพื่อแสดงภาพและหาจำนวนคุณสมบัติทางพยาธิวิทยาหลายอย่างในหนูและมนุษย์ไตการตัดชิ้นเนื้อซึ่งรวมถึงกระบวนการที่เท้า การเปลี่ยนแปลงของเยื่อหุ้มไตชั้นใต้ดิน, ความยาวของช่องผ่า, การสะสมของ IgG และลักษณะทางพยาธิวิทยาแบบคลาสสิก (เช่น โกลเมอรูโล-เส้นโลหิตตีบ, พังผืดทับถมของทูบูโล, และการฝ่อของท่อ) โดยสรุป วิธีนี้ช่วยให้สามารถแสดงภาพหลายขนาดและหาปริมาณพยาธิสภาพของไตโดยใช้วิธีการง่ายๆ และเครื่องมือวิเคราะห์ภาพที่เข้าถึงได้ ความสามารถในการปรับขนาดและการนำแนวทางนี้ไปใช้ในทางปฏิบัติในการปฏิบัติทางคลินิกมีแนวโน้มว่าจะถูกกำหนดโดยความจำเป็นของอุปกรณ์ไมโครสโคปขั้นสูงและการพัฒนาเครื่องมือวิเคราะห์ภาพอัตโนมัติ

บทสรุป

วิธีการล้างเนื้อเยื่อในสเปกตรัมในปัจจุบันรวมถึงเทคนิคง่ายๆ ที่สามารถนำไปใช้ในห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ เพื่อปรับปรุงการถ่ายภาพ 3 มิติบนกล้องจุลทรรศน์ที่มีอยู่ทั่วไป เมื่อโอกาสที่ได้รับจากแนวทางใหม่เหล่านี้ชัดเจนขึ้น เราคาดว่าจะมีการนำระบบกล้องจุลทรรศน์แบบพิเศษมาใช้ในวงกว้างขึ้นเพื่อสร้างภาพเนื้อเยื่อที่เคลียร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพที่ความละเอียดสูง และการพัฒนาการวิจัยที่ปรับให้เหมาะสมและเวิร์กโฟลว์ทางคลินิกเพื่อตอบคำถามที่เฉพาะเจาะจง สาขาประสาทวิทยาได้ทำหน้าที่เป็นพื้นที่ทดสอบสำหรับวิธีการและการประยุกต์ใช้การถ่ายภาพเนื้อเยื่อที่ชัดเจน การวิเคราะห์ภาพอัตโนมัติ แนวทางใหม่ในการศึกษาการเชื่อมต่อของเซลล์ และโครงการ Atlas การแสดงออกของยีนและโปรตีนทั่วทั้งเนื้อเยื่อได้รับการพัฒนาในบริบทนี้ มีแนวโน้มว่าแนวทางที่คล้ายคลึงกันจะให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับกายวิภาคของเซลล์และการพึ่งพาอาศัยกันของประชากรเซลล์ในการพัฒนาและผู้ใหญ่ไต.

ข้อจำกัดในทางปฏิบัติสำหรับความก้าวหน้าเหล่านี้รวมถึงต้นทุนของฮาร์ดแวร์เกี่ยวกับภาพ และความยากลำบากในการจัดการ จัดเก็บ และวิเคราะห์ชุดข้อมูลขนาดใหญ่ ข้อจำกัดอื่นๆ เกิดจากการขาดความสามารถในการทำซ้ำของการย้อมสีด้วยเนื้อเยื่อที่ได้รับผลกระทบจากสภาวะการตรึงและการติดฉลากแอนติบอดี ด้วยเหตุนี้ การวิเคราะห์ 3 มิติแบบใหม่จึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องได้รับการประเมินอย่างมีวิจารณญาณและเปรียบเทียบกับวิธีการที่กำหนดไว้ แม้จะมีความก้าวหน้าที่น่าประทับใจในการประเมินไตพัฒนาการและผู้ใหญ่ไตโครงสร้างและโรคที่เน้นในการทบทวนนี้ เราเชื่อว่าการล้างเนื้อเยื่อที่ดีที่สุดและการถ่ายภาพ 3 มิติยังมาไม่ถึง และน่าจะเป็นพื้นที่ที่น่าตื่นเต้นสำหรับการเติบโตไตการวิจัยในทศวรรษหน้า