Cistanche Deserticola Polysaccharide ยับยั้งการสูญเสียกระดูกที่เกิดจาก OVX ในหนูเมาส์และ Osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

บทคัดย่อ

โรคกระดูกพรุนเป็นโรคกระดูกร้ายแรงที่ส่งผลต่อประชากรสูงอายุ Cistanche deserticola (CD) ยาชูกำลังและอาหารทางการแพทย์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในประเทศจีน ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถรักษาโรคกระดูกพรุนได้อย่างมีประสิทธิภาพ Cistanche deserticola polysaccharide (CDP) ที่สกัดจาก CD มีคุณสมบัติทางเภสัชวิทยาต่างๆ แต่มีบทบาทในกระดูกการก่อตัวและการทำงานรวมถึงโรคกระดูกพรุนยังไม่ทราบ วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือเพื่อสกัดและทำให้ CDP บริสุทธิ์เพื่อสำรวจกลไกการออกฤทธิ์ต่อโรคกระดูกพรุนที่อาจเกิดขึ้นเพิ่มเติม ผลการวิจัยพบว่าการรักษาด้วย CDP ช่วยป้องกันโรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX และทำให้การสูญเสียกระดูกดีขึ้นโดยการยับยั้งกิจกรรมและการทำงานของกระดูกพรุน นอกจากนี้ การรักษาด้วย CDP ยังยับยั้งการสร้างกระดูกที่เหนี่ยวนำโดย RANKL การสลายของกระดูก และการแสดงออกของยีนที่จำเพาะต่อกระดูก ในทางกลไก CDP ยับยั้งการเปิดใช้งานเส้นทางส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPKs ที่เกิดจาก RANKL และส่งผลต่อการเปิดใช้งาน NFATc1 ที่ปลายน้ำ ข้อค้นพบในการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่า CDP เป็นยาที่อาจปลอดภัยสำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุน (10 ประโยชน์ที่ Cistanche สามารถให้ได้ )

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

โรคกระดูกพรุน—โรคที่มีลักษณะเฉพาะโดยมวลกระดูกลดลง โครงสร้างจุลภาคของเนื้อเยื่อกระดูกผิดปกติ ความเปราะบางของกระดูกที่เพิ่มขึ้น และการแตกหัก (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli และ Ginaldi, 2006)— ปัจจุบันส่งผลกระทบต่อผู้คนมากกว่า 200 ล้านคนทั่วโลกและนำเสนอการแพทย์ที่สำคัญและ ภาระทางเศรษฐกิจและสังคมในสังคมสมัยใหม่ (Strom et al., 2011). การรักษาทางคลินิกของโรคกระดูกพรุนส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนฮอร์โมนบิสฟอสโฟเนตหรือการบำบัดด้วยดีโนซูแมบ วิธีการเหล่านี้มีประสิทธิภาพแต่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงในระยะยาว เช่น ความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นจากมะเร็งเต้านมและกระดูกโคนขาหักผิดปกติ (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011) ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนในการสำรวจยาที่ไม่เพียงแต่ยับยั้งโรคกระดูกพรุนแต่ยังมีผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์น้อยลงอีกด้วย Cistanche deserticola (CD) ยาชูกำลังและอาหารทางการแพทย์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในประเทศจีน เรียกว่า "โสมทะเลทราย" เป็นลำต้นฉ่ำแห้งที่มีเกล็ดของ C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) และมีความหลากหลาย และกิจกรรมทางเภสัชวิทยาที่มีประสิทธิภาพ เช่น การควบคุมภูมิคุ้มกันต่อต้านอนุมูลอิสระและคุณสมบัติต้านโรคกระดูกพรุน (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014) การศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการแสดงท่าทางของซีดีในการรักษาโรคกระดูกพรุนส่วนใหญ่เน้นที่ phenylethanoid glycosides (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017) อย่างไรก็ตาม ซีดียังมีส่วนประกอบที่มีประสิทธิภาพอื่นๆ เช่น อิริดอยด์ ลิกแนน โพลีแซคคาไรด์ (Wang, Zhang, & Xie, 2012) การประยุกต์ใช้ทางคลินิกของการแพทย์แผนจีน (TCM) ส่วนใหญ่เป็นการต้มน้ำ โพลีแซ็กคาไรด์เป็นส่วนประกอบที่ละลายน้ำได้และมักเป็นส่วนประกอบทางเภสัชพลศาสตร์หลักของ TCM โพลีแซ็กคาไรด์ที่สกัดจาก TCM มีรายงานว่ามีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนและมีผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์บางประการ ซึ่งมักใช้ในคลินิก (เช่น พอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดจากEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) และ Morinda officinalis (Yan et al., 2019)) ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าCistanche Deserticola พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) ที่สกัดจากซีดีอาจเป็นยาที่อาจปลอดภัยสำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุน โดยปกติ การสลายของกระดูกและการสร้างกระดูกจะรักษาสมดุลแบบไดนามิกระหว่างการสร้างกระดูกใหม่โดยประสานกับเซลล์หลายประเภท รวมถึงเซลล์สร้างกระดูกเซลล์สร้างกระดูก, เซลล์เยื่อบุกระดูก และเซลล์สร้างกระดูก (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012) การเสียสมดุลนี้อาจส่งผลให้เกิดโรคเกี่ยวกับการเผาผลาญของกระดูกได้หลายอย่าง เช่น โรคกระดูกพรุน (Zhu et al., 2018) และโรคกระดูกพรุน (Ihde et al., 2011) Osteoclasts ในฐานะเซลล์ที่แยกความแตกต่างสุดท้ายที่ได้มาจากเชื้อสายโมโนนิวเคลียร์/มาโครฟาจ เป็นเซลล์เดียวที่มีฟังก์ชันการสลายของกระดูก (Teitelbaum, 20{{106}}0) มีไซโตไคน์ที่สำคัญสองชนิดที่มีส่วนร่วมในการสร้างความแตกต่างและการเจริญเติบโตของ osteoclast (Koga et al., 2004): ปัจจัยกระตุ้นอาณานิคมของมาโครฟาจ (M-CSF) และตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์ κB (NF-κB) ลิแกนด์ (RANKL) M-CSF ไกล่เกลี่ยการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดไปเป็นต้นกำเนิดของ osteoclast และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกด้วยการควบคุมการแสดงออกของตัวรับ RANK (Takayanagi, 2007) การจับกันของ RANKL และ RANK บนพื้นผิวเซลล์ osteoclast ส่งผลให้เกิดสิ่งต่อไปนี้: (1) การจัดหาโมเลกุลตัวปรับสัญญาณเช่น TNF รีเซพเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับแฟคเตอร์ 6 (TRAF6); (2) การกระตุ้นเป้าหมายดาวน์สตรีมหลายรายการ รวมถึง NF- κB และโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPKs); และ (3) การควบคุมระดับการแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น, ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007) การกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณเหล่านี้จะควบคุมการแสดงออกของยีน osteoclast โดยตรง รวมถึงกรดฟอสฟาเตส 5 (Acp5) [การเข้ารหัสกรดฟอสฟาเตสที่ดื้อต่อทาร์เทรต (TRAcP)] เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน 9 (MMP9) และคาเทปซินเค (CTSK) (บอยล์, ซิโมเนต์) , & เลซีย์, 2003). ดังนั้น การยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวกับการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL จึงเป็นวิธีการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับโรคกระดูกพรุน ในการศึกษานี้ เรามุ่งที่จะพิจารณาผลของการรักษา CDP ต่อแบบจำลองเมาส์โรคกระดูกพรุนที่เกิดจากรังไข่ (OVX) ที่เหนี่ยวนำให้เกิดรังไข่ในร่างกาย และต่อกิจกรรมของกระดูกพรุนที่เกิดจาก RANKL ในหลอดทดลอง โดยเน้นที่การแสดงออกของยีนที่จำเพาะต่อกระดูกพรุนและการกระตุ้น ของ NFATc1 และเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPK การค้นพบของเราอาจให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับศักยภาพของ CDP ในฐานะยาที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพในการรักษาโรคกระดูกพรุน 2. วัสดุและวิธีการ 2.1. ซีดีเก็บตัวอย่างสารเคมีและตัวอย่าง (หมายเลข 180801) ซื้อมาจาก Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) และระบุโดย Professor Haibo Huang จาก School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, China . ยาเม็ด Estradiol valerate ถูกซื้อจากไบเออร์ (เลเวอร์คูเซ่น, นอร์ธไรน์เวสต์ฟาเลีย, เยอรมนี) สื่อจำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลงโดยอัลฟ่า ( -MEM) และซีรัมของทารกในครรภ์ (FBS) ได้จาก Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ยาเพนนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซินและชุดย้อมสี TRAcP ได้มาจาก Solarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) M-CSF ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมและ RANKL ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมถูกจัดหาจากระบบ R&D (มินนิอาโปลิส รัฐมินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) แผ่นเคลือบไฮดรอกซีอะพาไทต์ซื้อมาจาก Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA) แอนติบอดีเบื้องต้นสำหรับ NFATc1 และ CTSK (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา); IκB- , p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK และ P-JNK (เทคโนโลยีสัญญาณมือถือ, Dan vers, MA, USA); และ -actin (CWBIO, ปักกิ่ง, จีน) ก็ได้รับเช่นกัน รีเอเจนต์อื่นๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นระดับการวิเคราะห์ และน้ำถูกทำให้บริสุทธิ์โดยระบบทำน้ำให้บริสุทธิ์ Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) 2.2. การสกัด CDP ซีดีถูกบดให้เป็นผงละเอียดและผสมกับปิโตรเลียมอีเทอร์สามครั้งเพื่อกำจัดมัน เรซิดิวที่เป็นของแข็งถูกรวบรวมโดยการกรองแล้วทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง พอลิแซ็กคาไรด์ถูกสกัดจากตัวอย่างที่บำบัดไว้ล่วงหน้าสามครั้งด้วยน้ำเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ทำให้เข้มข้น ตกตะกอนโดยการเติมแอนไฮดรัสเอทานอลจนถึงความเข้มข้นสุดท้าย 80 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) และเก็บไว้ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บตกตะกอนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาที ละลายในน้ำกลั่น และทำให้บริสุทธิ์ (การกำจัดโปรตีนอิสระ) โดยใช้วิธี Sevag (Zhao et al., 2019) พอลิแซ็กคาไรด์ที่นำกลับคืนมาถูกฟอก, ทำให้แห้งและเก็บไว้จนกว่าจะใช้ต่อไป นอกจากนี้ ผลองค์ประกอบทางเคมีพบว่า ปริมาณน้ำตาล กรดยูริก ซัลเฟต และโปรตีนของ CDP เท่ากับ 67.63 ± 0.98 เปอร์เซ็นต์ 21.05 ± 0.49 เปอร์เซ็นต์ 1.90 ± 0.24 เปอร์เซ็นต์ และ 8.81 ± 0.36 เปอร์เซ็นต์ องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์และการวิเคราะห์ฟูเรียร์ทรานส์ฟอร์มอินฟราเรดของ CDP แสดงในรูปที่ 1 และ 2 เพิ่มเติม 2.3 โมเดลเมาส์โรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX การทดลองในสัตว์ทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว (อนุมัติ SYXK 2019-0202) หนู C57BL/6 เพศเมียอายุสามสิบ 6-สัปดาห์ จัดหาให้โดยศูนย์สัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว หลังจากการเคยชินกับสภาพเป็นเวลา 1 สัปดาห์ หนูกลุ่มหนึ่งได้รับการผ่าตัดหลอก (กลุ่มหลอกลวง) ในขณะที่หนูที่เหลือได้รับการผ่าตัดรังไข่ออก (กลุ่ม OVX) หลังการผ่าตัด หนูได้รับอนุญาตให้พักฟื้นเป็นเวลา 1-สัปดาห์ จากนั้น สุ่มตัวอย่างหนูที่สร้างแบบจำลองสำเร็จออกเป็น 5 กลุ่ม โดยมีหนู 6 ตัวต่อกลุ่ม: (1) กลุ่มหลอก: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (2) กลุ่ม OVX: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (3) กลุ่ม OVX บวก E2 (E2) : รักษาด้วยยาเม็ด estradiol valerate 0.13 มก./กก., (4) OVX ร่วมกับกลุ่มยา CDP ต่ำ (CDP-L): รักษาด้วย CDP 300 มก./กก., (5) OVX ร่วมกับกลุ่มที่มีขนาดสูง CDP (CDP H): ได้รับการรักษา ด้วย CDP 600 มก./กก. น้ำกลั่น, E2 หรือ CDP ถูกบริหารให้โดยทางสายยางวันละครั้ง หนูทุกตัวถูกสังเวยหลังช่วงการรักษา 12- สัปดาห์ (รูปที่ 1A) มดลูกถูกรวบรวมและชั่งน้ำหนักและรวบรวมกระดูกหน้าแข้งซ้ายเพื่อการตรวจครั้งต่อไป ตัวอย่างเลือดครบส่วนถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ◦C ส่วนลอยเหนือตะกอนในซีรัมถูกสำลักและเก็บไว้ที่ − 80 ◦C จนกระทั่งทำการวิเคราะห์เพิ่มเติม 2.4. การวิเคราะห์ด้วยการตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ด้วยไมโครคอมพิวเตอร์ (micro-CT) และการตรวจ histomorphometry ของกระดูก กระดูกหน้าแข้งด้านซ้ายถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 48 ชั่วโมง และต่อมานำไปใส่ในหลอดสำหรับการปั่นแยกที่มีน้ำเกลือปกติ ตัวอย่างคงที่ถูกสแกนด้วยเครื่องมือ Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, เบลเยียม) โดยใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: แรงดันไฟฟ้า 80 kV; แหล่งกระแส 100 μA; อัล, ตัวกรอง 0.5 มม.; ขนาดพิกเซล 9.76 µm; และขั้นตอนการหมุน 0.6◦ พารามิเตอร์ต่างๆ ของกระดูก trabecular รวมถึงความหนาแน่นของแร่ธาตุกระดูก (BMD), ส่วนของปริมาตรกระดูก (BV/TV), ผิวกระดูกต่อปริมาตรทั้งหมด (BS/TV), จำนวน trabecular (Tb. N) และระยะห่าง trabecular (Tb.Sp ) ถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan) ภาพสามมิติถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan) ตามการวิเคราะห์ด้วย micro-CT กระดูกหน้าแข้งด้านซ้ายถูก decalcified ในสารละลาย EDTA 14 เปอร์เซ็นต์และฝังลงในพาราฟินสำหรับการแบ่งส่วน ตัวอย่างถูกหั่นเป็นส่วนๆ 5 ไมโครเมตรโดยใช้ไมโครโทมก่อนการทดลองย้อมฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) และ TRAcP ส่วนที่เปื้อนได้รับการตรวจสอบและบันทึกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan) 2.5. การวิเคราะห์เซรั่ม ความเข้มข้นของแคลเซียม (Ca) และฟอสฟอรัส (P) ถูกกำหนดตามคำแนะนำในชุดอุปกรณ์ที่ออกแบบโดยสถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Nanjing Jiancheng (หนานจิง ประเทศจีน) ระดับ TRAcP-5b และ RANKL ในซีรัมถูกวิเคราะห์โดยใช้ TRAcP-5b ELISA kit (CUSABIO, หวู่ฮั่น, จีน) และ RANKL ELISA kit (Cloud-CloneCorp., หวู่ฮั่น, จีน) ตามลำดับ

ซีดีเก็บตัวอย่างสารเคมีและตัวอย่าง (หมายเลข 180801) ถูกซื้อจาก Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) และระบุโดยศาสตราจารย์ Haibo Huang จาก School of เภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว กวางโจว ประเทศจีน ยาเม็ด Estradiol valerate ถูกซื้อจากไบเออร์ (เลเวอร์คูเซ่น, นอร์ธไรน์เวสต์ฟาเลีย, เยอรมนี) สื่อจำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลงโดยอัลฟ่า ( -MEM) และซีรัมของทารกในครรภ์ (FBS) ได้จาก Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ยาเพนนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซินและชุดย้อมสี TRAcP ได้มาจาก Solarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) M-CSF ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมและ RANKL ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมถูกจัดหาจากระบบ R&D (มินนิอาโปลิส รัฐมินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) แผ่นเคลือบไฮดรอกซีอะพาไทต์ซื้อมาจาก Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA) แอนติบอดีเบื้องต้นสำหรับ NFATc1 และ CTSK (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา); IκB- , p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK และ P-JNK (เทคโนโลยีสัญญาณมือถือ, Dan vers, MA, USA); และ -actin (CWBIO, ปักกิ่ง, จีน) ก็ได้รับเช่นกัน รีเอเจนต์อื่นๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นระดับการวิเคราะห์ และน้ำถูกทำให้บริสุทธิ์โดยระบบทำน้ำให้บริสุทธิ์ Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) 2.2. การสกัด CDP ซีดีถูกบดให้เป็นผงละเอียดและผสมกับปิโตรเลียมอีเทอร์สามครั้งเพื่อกำจัดมัน เรซิดิวที่เป็นของแข็งถูกรวบรวมโดยการกรองแล้วทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง พอลิแซ็กคาไรด์ถูกสกัดจากตัวอย่างที่บำบัดไว้ล่วงหน้าสามครั้งด้วยน้ำเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ทำให้เข้มข้น ตกตะกอนโดยการเติมแอนไฮดรัสเอทานอลจนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 80 เปอร์เซ็นต์ (v/ v) และเก็บไว้ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 24 ชม. ตะกอนถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาที ละลายในน้ำกลั่น และทำให้บริสุทธิ์ (การกำจัดโปรตีนอิสระ) โดยใช้วิธี Sevag (Zhao et al., 2019). พอลิแซ็กคาไรด์ที่นำกลับคืนมาถูกฟอก, ทำให้แห้งและเก็บไว้จนกว่าจะใช้ต่อไป นอกจากนี้ ผลองค์ประกอบทางเคมีพบว่า ปริมาณน้ำตาล กรดยูริก ซัลเฟต และโปรตีนของ CDP เท่ากับ 67.63 ± 0.98 เปอร์เซ็นต์ 21.05 ± 0.49 เปอร์เซ็นต์ 1.90 ± 0.24 เปอร์เซ็นต์ และ 8.81 ± 0.36 เปอร์เซ็นต์ องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์และการวิเคราะห์ฟูเรียร์ทรานส์ฟอร์มอินฟราเรดของ CDP แสดงในรูปที่ 1 และ 2 เพิ่มเติม 2.3 โมเดลเมาส์โรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX การทดลองในสัตว์ทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว (อนุมัติ SYXK 2019-0202) หนู C57BL/6 เพศเมียอายุสามสิบ 6-สัปดาห์ถูกจัดหาโดยศูนย์สัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว หลังจากการเคยชินกับสภาพเป็นเวลา 1 สัปดาห์ หนูกลุ่มหนึ่งได้รับการผ่าตัดหลอก (กลุ่มหลอกลวง) ในขณะที่หนูที่เหลือได้รับการผ่าตัดรังไข่ออก (กลุ่ม OVX) หลังการผ่าตัด หนูได้รับอนุญาตให้ฟื้นตัวเป็นเวลา 1-สัปดาห์ จากนั้น สุ่มตัวอย่างหนูที่สร้างแบบจำลองสำเร็จออกเป็น 5 กลุ่ม โดยมีหนู 6 ตัวต่อกลุ่ม: (1) กลุ่มหลอก: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (2) กลุ่ม OVX: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (3) กลุ่ม OVX บวก E2 (E2) : รักษาด้วยยาเม็ด estradiol valerate 0.13 มก./กก., (4) OVX ร่วมกับกลุ่มยา CDP ต่ำ (CDP-L): รักษาด้วย CDP 300 มก./กก., (5) OVX ร่วมกับกลุ่มที่มีขนาดสูง CDP (CDP H): ได้รับการรักษา ด้วย CDP 600 มก./กก. น้ำกลั่น, E2 หรือ CDP ถูกบริหารให้โดยทางสายยางวันละครั้ง หนูทุกตัวถูกสังเวยหลังช่วงการรักษา 12- สัปดาห์ (รูปที่ 1A) มดลูกถูกรวบรวมและชั่งน้ำหนักและรวบรวมกระดูกหน้าแข้งซ้ายเพื่อการตรวจครั้งต่อไป ตัวอย่างเลือดครบส่วนถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ◦C ส่วนลอยเหนือตะกอนในซีรัมถูกสำลักและเก็บไว้ที่ − 80 ◦C จนกระทั่งทำการวิเคราะห์เพิ่มเติม 2.4. การวิเคราะห์ด้วยการตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ด้วยไมโครคอมพิวเตอร์ (micro-CT) และการตรวจ histomorphometry ของกระดูก กระดูกหน้าแข้งด้านซ้ายถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 48 ชั่วโมง และต่อมานำไปใส่ในหลอดสำหรับการปั่นแยกที่มีน้ำเกลือปกติ ตัวอย่างคงที่ถูกสแกนด้วยเครื่องมือ Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, เบลเยียม) โดยใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: แรงดันไฟฟ้า 80 kV; แหล่งกระแส 100 μA; อัล, ตัวกรอง 0.5 มม.; ขนาดพิกเซล 9.76 µm; และขั้นตอนการหมุน 0.6◦ พารามิเตอร์หลายอย่างของกระดูก trabecular รวมถึงความหนาแน่นของแร่ธาตุกระดูก (BMD), ส่วนของปริมาตรกระดูก (BV/TV), ผิวกระดูกต่อปริมาตรทั้งหมด (BS/TV), trabecular number (Tb. N) และระยะห่าง trabecular (Tb. Sp ) ถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan) ภาพสามมิติถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan) ตามการวิเคราะห์ด้วย micro-CT กระดูกหน้าแข้งด้านซ้ายถูก decalcified ในสารละลาย EDTA 14 เปอร์เซ็นต์และฝังลงในพาราฟินสำหรับการแบ่งส่วน ตัวอย่างถูกหั่นเป็นส่วนๆ 5 ไมโครเมตรโดยใช้ไมโครโทมก่อนการทดลองย้อมฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) และ TRAcP ส่วนที่เปื้อนได้รับการตรวจสอบและบันทึกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan) 2.5. การวิเคราะห์ซีรัม ความเข้มข้นของแคลเซียม (Ca) และฟอสฟอรัส (P) ถูกกำหนดตามคำแนะนำชุดอุปกรณ์ที่ออกแบบโดยหนานจิง

สถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Jiancheng (หนานจิง ประเทศจีน) วิเคราะห์ระดับ TRAcP{{0}}b และ RANKL ในซีรัมโดยใช้ TRAcP-5b ELISA kit (CUSABIO, หวู่ฮั่น, จีน) และชุด RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., หวู่ฮั่น, จีน) ตามลำดับ 2.6. BMM การสอบวิเคราะห์การเสื่อมสลายกระดูกในหลอดทดลองถูกแยกออกจากกระดูกหน้าแข้งและกระดูกโคนขาของหนูเมาส์ C57BL/6 เพศเมียอายุ 6-สัปดาห์ เซลล์ที่ถูกแยกเดี่ยวถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง -MEM ที่มี M-CSF 25 ng/mL, 10 เปอร์เซ็นต์ของ FBS และ 1 เปอร์เซ็นต์ของเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน เมื่อไปถึงการบรรจบกัน BMM (1 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมและบำบัดด้วย CDP ในการมีอยู่ของ RANKL 50 ng/mL สื่อและ CDP ถูกแทนที่ทุก 2 วัน หลังจากผ่านไป 7 วัน เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และย้อมเพื่อให้มีร่องรอย จำนวนเซลล์สร้างกระดูกซึ่งกำหนดเป็นเซลล์บวก TRAcP ที่มีนิวเคลียสตั้งแต่สามนิวเคลียสขึ้นไป ถูกนับและจัดทำเป็นเอกสารโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง 2.7. การสอบวิเคราะห์การงอกขยายของเซลล์ BMM (1 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจาน 96- หลุมและบ่มข้ามคืน ต่อจากนี้ เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 และ 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง การบรรจบกันของเซลล์ถูกตรวจพบและวิเคราะห์โดยใช้ IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) ซึ่งเป็นระบบสร้างภาพเซลล์มีชีวิตแบบไดนามิกแบบเรียลไทม์ในระยะยาว 2.8. การสอบวิเคราะห์การสลายของไฮดรอกซีพาไทต์ BMM (1 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจานที่เคลือบด้วยไฮดรอกซีอะพาไทต์ บำบัดด้วย CDP ที่ความเข้มข้นที่ระบุ (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเพาะเลี้ยงใน -MEM ที่สมบูรณ์ที่มี 25 นาโนกรัม/ มิลลิลิตร M-CSF และ 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร RANKL หลังจากผ่านไป 7 วัน เซลล์จะถูกล้างด้วยสารละลายฟอกขาว 10 เปอร์เซ็นต์เพื่อเอาส่วนประกอบของเซลล์ออก ภาพของพื้นที่การดูดกลืนไฮดรอกซีอะพาไทต์ถูกจับโดยใช้ IncuCyte ZOOM® และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003) 2.9. การแยก RNA และการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณย้อนกลับแบบเรียลไทม์ (RT-qPCR) แบบเรียลไทม์ BMM (1 × 105 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในเพลต 6- หลุมและกระตุ้นด้วย RANKL และ M-CSF ต่อหน้า CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 5 วัน RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อกระดูกของหนูเมาส์โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Sigma Aldrich) DNA เสริมถูกสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมด 2 ไมโครกรัมโดยใช้ชุด reverse transcriptase (TransGen Biotech, Beijing, China) ปฏิกิริยา RT-qPCR ถูกเตรียมโดยใช้ PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) และตรวจพบโดยระบบ ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) พารามิเตอร์การปั่นจักรยานสำหรับ PCR ถูกกำหนดไว้ดังนี้: 95 ◦C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 40 รอบที่ 95 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที และ 60 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที ไพรเมอร์จำเพาะที่ใช้แสดงไว้ในตารางที่ 1 และปริมาณของยีนเป้าหมายแต่ละยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH (กลุ่มควบคุมภายใน)

2.10. การวิเคราะห์ Western blot BMM (5 × 105 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจาน6-หลุม สำหรับการทดลองในระยะเวลาสั้นๆ เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วย 5{{ 58}} ng/mL RANKL เป็นเวลา 30 นาที เป็นเวลานาน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย RANKL 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตรในวันที่ 3, 5 และ 7 ในการมีอยู่ของ CDP (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) โปรตีนทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RIPA lysis buffer (CWBIO) โปรตีนถูกแยกโดย 10 เปอร์เซ็นต์ SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF เยื่อหุ้มถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง บ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ◦C และจากนั้นด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง เมมเบรนได้รับการพัฒนาโดยใช้รีเอเจนต์ ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) และถ่ายภาพโดยใช้ Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China) 2.11. การตรวจหาการเคลื่อนย้าย NFATc1 โดยใช้การทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ BMM ถูกเพาะบนแผ่นปิด 12-หลุม กระตุ้นด้วย RANKL และ M-CSF และบำบัดด้วย CDP 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 5 วัน เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาที ล้างสามครั้งด้วย PBS และซึมผ่านด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกผสมกับซีรัมแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ (CWBIO) และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ◦C และจากนั้นด้วยแอนติบอดีรองต้านเมาส์ของแพะ Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) ในความมืดเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แผ่นปิดถูกล้างด้วย PBS, ติดตั้งใน Prolong Gold Antifade Reagent ด้วย 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) และตรวจสอบโดยใช้ Zeiss LSM 800 ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, เยอรมนี) 2.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลการทดลองทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) ข้อมูลสำหรับการศึกษาในสัตว์และเซลล์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และค่าเฉลี่ย ± SD ตามลำดับ ผลลัพธ์ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวหรือการทดสอบ t ของนักเรียน ค่าของ p < 0.05="" ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ="" 3.="" ผลลัพธ์="" 3.1.="" cdp="" ป้องกันการสูญเสียกระดูกที่เกิดจาก="" ovx="" ในร่างกาย="" เราใช้แบบจำลองเมาส์โรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก="" ovx="" เพื่อตรวจสอบผลของการรักษา="" cdp="" ต่อโรคกระดูกพรุนในร่างกาย="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม="" sham="" น้ำหนักตัวของหนูเมาส์="" ovx="" เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่ดัชนีมดลูกลดลง="" ซึ่งบ่งชี้ว่าแบบจำลองโรคกระดูกพรุนนั้นสร้างได้สำเร็จ="" (รูปที่="" 1b="" และ="" d)="" การวิเคราะห์="" micro-ct="" ของกระดูกหน้าแข้งในกลุ่ม="" ovx="" พบว่ามีการสูญเสียมวลกระดูกอย่างมาก="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม="" ovx="" จำนวนกระดูก="" trabeculae="" เพิ่มขึ้นในกลุ่ม="" cdp-l="" ในขณะที่การเพิ่มขึ้นของกลุ่ม="" cdp-h="" และ="" e2="" นั้นสำคัญกว่า="" และ="" trabeculae="" ในสองกลุ่มหลังนั้นหยาบกว่าและช่องว่างก็เล็กลง="" (="" มะเดื่อ="" 1c)="" การวิเคราะห์เชิงปริมาณยืนยันว่าพารามิเตอร์ฮิสโตมอร์โฟเมตริกของกระดูกหลายตัว="" รวมถึง="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" และ="" tb="" n="" มีค่าเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่="" tb="" sp="" แสดงค่าที่ลดลงในกลุ่ม="" cdp-h="" (รูปที่="" 1e="" และ="" f)="" การตรวจทางพยาธิวิทยาโดยใช้การย้อมสี="" h&e="" พบว่าจำนวนกระดูก="" trabeculae="" ในกลุ่ม="" cdp-h="" และ="" e2="" สูงกว่าในกลุ่ม="" ovx="" อย่างมีนัยสำคัญ="" ในขณะที่ไม่มีการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม="" cdp-l="" (รูปที่="" 1g)="" นอกจากนี้="" การย้อมสี="" tracp="" แสดงให้เห็นว่าจำนวนเซลล์สร้างกระดูกเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในกลุ่ม="" ovx="" แต่ลดลงในกลุ่ม="" cdp-h="" และ="" e2="" (รูปที่="" 1h)="" กลุ่ม="" cdp-l,="" cdp-h="" และ="" e2="" แสดงให้เห็นว่ายับยั้งการเพิ่มขึ้นของเนื้อหา="" p="" ที่เกิดจาก="" ovx="" แต่เพิ่มปริมาณ="" ca="" ในซีรัมในเลือด="" เครื่องหมายการดูดซึมกระดูก="" rankl="" และ="" tracp-5b="" มีแนวโน้มลดลงใน="">

กลุ่มที่ไม่มีความแตกต่างทางสถิติ ในขณะที่กลุ่ม CDP-H ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1I) นอกจากนี้เรายังตรวจสอบผลของ CDP ต่อการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย osteoclast ในเนื้อเยื่อกระดูกโดย RT-qPCR ระดับ mRNA ของ NFATc1, Acp5, Mmp9 และ CTSK ในกลุ่ม OVX สูงกว่าระดับในกลุ่ม Sham อย่างมีนัยสำคัญ หมู่ CDP-H แสดงระดับ mRNA ที่ลดลงของ NFATc1, Acp5 และ CTSK โดย 1.74-, 1.70- และ 2.00-เท่าเมื่อเทียบกับกลุ่ม OVX (รูปที่ 1J). 3.2. CDP ยับยั้งการสร้าง osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL ในหลอดทดลอง เราตรวจสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ของ BMM ที่ได้รับการบำบัดด้วย CDP โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ภาพเซลล์มีชีวิตแบบไดนามิกแบบเรียลไทม์ในระยะยาว เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การบรรจบกันของเซลล์ในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDP จะไม่เปลี่ยนแปลงที่ขนาดยา<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1.25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CDP แสดงขนาดและจำนวนที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2B และ C) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CDP สามารถยับยั้งการสร้างกระดูกเชิงกรานที่เกิดจาก RANKL ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ 3.3. CDP ยับยั้งกิจกรรมการสลายของ osteoclastic ที่เกิดจาก RANKL และการแสดงออกของยีนที่จำเพาะต่อ osteoclast เรายังได้พิจารณาผลของการรักษา CDP ต่อกิจกรรมการสลายของกระดูกของ osteoclasts โดยใช้แผ่นเคลือบไฮดรอกซีอะพาไทต์ การสลายของกระดูกเป็นหน้าที่หลักและเป็นมาตรฐานสำหรับการวัดกิจกรรมและความสามารถของเซลล์สร้างกระดูก (Novack & Faccio, 2011) ผลการวิจัยพบว่า CDP สามารถลดพื้นที่การดูดซับกระดูกของ osteoclasts ได้อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งบ่งชี้ว่า CDP ยับยั้งกิจกรรมการสลายของกระดูกที่เกิดจาก RANKL (รูปที่ 3A และ B) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง พื้นที่ดูดซับกระดูก osteoclastic ลดลงเหลือประมาณ 6.3 เปอร์เซ็นต์หลังการรักษาด้วย CDP 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เพื่อให้เข้าใจถึงอุปสรรคของ CDP ต่อการสร้างกระดูกพรุนได้ดีขึ้น เราจึงวัดระดับการถอดรหัสของยีนที่เกี่ยวข้องกับเซลล์สร้างกระดูก หากไม่มีการรักษาด้วย CDP การเหนี่ยวนำด้วย RANKL ส่งเสริมการแสดงออกของยีน NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 และ Mmp9 ในทางตรงกันข้าม การใช้ CDP และ RANKL ร่วมกันทำให้ยีนทั้ง 5 ตัวนี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3C และ D)

3.4. CDP ยับยั้งการย้อมสี TRAcP ที่กระตุ้นด้วย NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL เปิดเผยว่าการรักษาด้วย CDP ช่วยลดจำนวนเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ที่คาดว่าจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการกระตุ้น RANKL เป็นเวลา 3-7 วัน (รูปที่ 4A และ B) นอกจากนี้ เราตรวจสอบว่าการบำบัดด้วย CDP สามารถบั่นทอนความแตกต่างของ osteoclast ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการยับยั้งการแสดงออกของ NFATc1 หรือไม่ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า NFATc1 แสดงออกอย่างมากหลังจากการกระตุ้น RANKL เป็นเวลา 5 วัน ซึ่งถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วย CDP (รูปที่ 4C และ D) นอกจากนี้ การรักษาด้วย CDP ยังยับยั้งระดับการแสดงออกของ CTSK ซึ่งเป็นโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการสร้างและการทำงานของเซลล์สร้างกระดูกปกติ (Bossard et al., 1996) (รูปที่ 4E และ F) เราเลือกการแสดงจุดในเวลาของการกระตุ้น RANKL เป็นเวลา 5 วันเพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลของการรักษา CDP 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรต่อการโยกย้าย NFATc1 ตามที่คาดไว้ การบำบัดด้วย CDP ยับยั้งการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4G และ H)

รูปที่ 4 CDP ระงับการเปิดใช้งาน NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL (A) BMM ถูกเพาะในจาน 6-หลุมและกระตุ้นด้วย RANKL และ M-CSF ในการมีอยู่ของ CDP (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) สำหรับ วันที่ระบุไว้ รูปภาพที่แสดงแทนซึ่งแสดงเซลล์ที่มีหลายนิวเคลียสที่เป็นบวก TRAcP กำลังขยาย ×100 แท่งมาตราส่วน {{10}} μm (B) การหาปริมาณของเซลล์หลายนิวเคลียสที่เป็นบวก TRAcP (นิวเคลียสที่มากกว่าหรือเท่ากับ 3) (CF) การวิเคราะห์ Western blot ของการแสดงออกของโปรตีน NFATc1 และ CTSK ใน BMM กระตุ้นด้วย M CSF และ RANKL เป็นเวลา 3–7 วันต่อหน้า CDP (G) BMM ถูกบำบัดด้วย CDP 10 ug/mL และกระตุ้นโดย M-CSF และ RANKL เป็นเวลา 5 วัน จากนั้นทำภูมิคุ้มกันด้วย NFATc1 (สีเขียว) และ DAPI (สีน้ำเงิน) และสังเกตพบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล กำลังขยาย ×200. แท่งมาตราส่วน=20 μm. (H) วิเคราะห์ความเข้มของการเรืองแสงโดยใช้ Image-Pro Plus ค่าจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=3) *p < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่มควบคุม="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่ม="" rankl="" 3.5.="" cdp="" ยับยั้งการกระตุ้นด้วย="" rankl="" ของเส้นทางการส่งสัญญาณ="" nf-κb="" และ="" mapks="" เพื่อชี้แจงกลไกที่เกี่ยวข้องในการยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ="" osteoclast="" ที่เกิดจาก="" cdp="" เราได้ตรวจสอบผลกระทบของการรักษา="" cdp="" ในวิถี="" nf-κb="" และ="" mapks="" ผลการศึกษาพบว่าการรักษาด้วย="" cdp="" มีผลกดขี่ต่อการเสื่อมสลายของ="" iκb="" และฟอสโฟรีเลชัน="" p65="" ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา="" (รูปที่="" 5a="" และ="" b)="" ฟอสฟอริเลชันของสมาชิกในครอบครัว="" mapk="" สามคน="" โดยเฉพาะไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์="" (erk),="" c-jun="" n-terminal="" kinase="" (jnk)="" และ="" p38="">

การอภิปราย

โรคกระดูกพรุนเป็นโรคกระดูกเสื่อมทั่วไป ปัจจุบันมียาสังเคราะห์ทางเคมีจำนวนมากที่ใช้ในการรักษาภาวะกระดูกพรุน เช่น เอสโตรเจนและบิสฟอสโฟเนต อย่างไรก็ตาม การใช้ยาเหล่านี้ในระยะยาวจะค่อยๆ บั่นทอนประสิทธิภาพทางคลินิกและทำให้เกิดผลข้างเคียงที่ร้ายแรงมากมาย รวมถึงความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของมะเร็งรังไข่ เต้านม และเยื่อบุโพรงมดลูก และภาวะกระดูกพรุนของขากรรไกร (Beral, 2003 ; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002) ในการศึกษานี้ เราเลือก CDP ซึ่งเป็นส่วนประกอบที่มีประสิทธิผลที่สกัดจาก CD เป็นตัวแทนในการรักษา และแสดงให้เห็นว่า CDP มีผลในการป้องกันการสูญเสียมวลกระดูกในหนูเมาส์ OVX และยับยั้งการก่อตัวและการทำงานของเซลล์สร้างกระดูกที่เกิดจาก RANKL ในขณะเดียวกัน ตามทฤษฎีการแพทย์แผนจีน "ไตที่ควบคุมกระดูก" การสูญเสียกระดูกเกิดจากภาวะไตบกพร่อง ในฐานะที่เป็นอาหารทางการแพทย์ที่ช่วยบำรุงไต ซีดีได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถรักษาโรคกระดูกพรุนได้อย่างมีประสิทธิภาพ (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li, & Zhang, 2016) ดังนั้น CDP ที่สกัดจากสมุนไพรธรรมชาตินี้จึงเป็นตัวเลือกยาที่ดีกว่าและปลอดภัยกว่า ในปัจจุบัน โมเดลเมาส์ OVX เป็นรูปแบบคลาสสิกของการสูญเสียกระดูกหลังหมดประจำเดือนในสตรี การตรวจสอบสาเหตุของการสูญเสียกระดูกและการแทรกแซง (Wehrle et al., 2015) ดังนั้น เราจึงทำการผ่าตัดรังไข่ออกทวิภาคีกับหนูเพศเมีย C57BL/6J เพื่อสร้างแบบจำลองโรคกระดูกพรุน ในการศึกษาก่อนหน้านี้ ปริมาณ CDP ที่ให้กับสัตว์คือ 50–200 มก./กก. (ขนาดต่ำ) และ 1800 มก./กก. (ขนาดสูง) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018) ในที่นี้ ปริมาณ CDP สูงในหนูทดลองคือ 600 มก./กก. ซึ่งอิงตามปริมาณทางคลินิกที่สูงของซีดี 30 กรัมในยาต้ม ดังนั้นจึงคล้ายกับการปฏิบัติทางคลินิกในปัจจุบัน ในการศึกษานี้ การรักษาด้วย CDP ยับยั้งการเพิ่มน้ำหนักตัวที่เกิดจาก OVX อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ทั่วไปที่พบในหนู OVX (Davis et al., 2019) ด้วยการใช้การสแกน micro-CT และการสร้าง 3D เราพบว่า OVX นำไปสู่การลดลงอย่างเห็นได้ชัดใน BMD, BV/TV, BS/TV และ Tb.N และการเพิ่มขึ้นของ Tb.Sp ในขณะที่การรักษาด้วย CDP กลับการเปลี่ยนแปลงทั้งหมดเหล่านี้ . โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อเทียบกับยาที่ให้ผลบวก CDP สามารถปรับปรุง BMD ของหนู OVX ได้อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเป็นเครื่องหมายสำคัญของคุณภาพกระดูกและใช้เพื่อสะท้อนระดับของโรคกระดูกพรุน (Fuggle et al., 2019) ซึ่งบ่งชี้ว่า CDP มีข้อได้เปรียบ มากกว่ายาที่เป็นบวกในการปรับปรุง BMD นอกจากนี้ ผลการตรวจชิ้นเนื้อบ่งชี้ว่าการรักษาด้วย CDP สามารถลดปริมาณที่เพิ่มขึ้นของ TRAcP-positive osteoclasts ที่เกิดจาก OVX ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการบริหาร CDP ช่วยลดการสูญเสียมวลกระดูกในโรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยอาจเกิดจากการยับยั้งการสร้างเซลล์สร้างกระดูก สอดคล้องกับผลลัพธ์ข้างต้น เราพบว่า CDP ยับยั้งการก่อตัวและการทำงานของ osteoclastic ที่เกิดจาก RANKL โดยขึ้นกับขนาดยา ในขณะที่ CDP มีผลเพียงเล็กน้อยต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ของสารตั้งต้นของ osteoclast ที่เกิดจาก M-CSF ในการทดลองในหลอดทดลองของเรา การผูกมัดของ RANKL และ RANK สามารถนำไปสู่การสรรหา TRAF6 และการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมต่างๆ ในภายหลัง เช่น NF-κB และ MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006) เส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κBมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสร้างความแตกต่างของ osteoclast และการปิดเสียงของยีนที่เข้ารหัสโปรตีนที่สำคัญในเส้นทางนี้สามารถนำไปสู่การพัฒนากระดูกที่ผิดปกติได้ (Leibbrandt & Penninger, 2008) เป็นที่ทราบกันดีว่า NF-κB มีอยู่ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นในคอมเพล็กซ์ที่มี IκB แต่จะเข้าสู่นิวเคลียสอย่างรวดเร็วหลังจากการกระตุ้น RANKL (Boyle et al., 2003) IκBที่ปล่อยออกมานั้นเสื่อมโทรมลงอย่างรวดเร็ว ในขณะที่ NF-κB กระตุ้นการถอดรหัสยีนที่เฉพาะเจาะจง ส่งผลให้เกิดการสร้างความแตกต่างของ osteoclast การเจริญเติบโตและการตายของเซลล์ (Abdelmagid et al., 2015) ในการศึกษานี้ ผลการศึกษาพบว่าการรักษาด้วย CDP ยับยั้งการกระตุ้น RANKL ที่เหนี่ยวนำให้เกิดเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB ซึ่งแสดงให้เห็นโดยการยับยั้งการเสื่อมสภาพของ IκB และฟอสโฟรีเลชันของ p65 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับผลการต่อต้านการเสื่อมของกระดูก . นอกจากนี้ เส้นทางการส่งสัญญาณของ MAPK รวมถึง ERK, JNK และ p38 มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการสร้างกระดูกที่เหนี่ยวนำโดย RANKL (Li et al., 2002) นอกจากนี้ สารยับยั้งที่เด่นชัดของ p38 และ JNK สามารถป้องกัน osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019) ในขณะที่ ERK มีบทบาทสำคัญในการอยู่รอดของ osteoclast (Miyazaki et al., 2000) เป็นที่ทราบกันดีว่า RANKL เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK โดยการเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของ ERK, JNK และ p38 (Mizukami et al., 2002) ในการศึกษาของเรา เราแสดงให้เห็นว่า CDP ยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นที่เกิดจาก RANKL ของโปรตีนหลักในเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการยับยั้งการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPK มีส่วนทำให้เกิดผลการยับยั้ง CDP ต่อการสร้างกระดูก การเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPK ส่งเสริมการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญหลายประการ เช่น เซลล์มะเร็งในเซลล์ โปรตีนกระตุ้น 1 และ NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003) NFATc1 ซึ่งเป็นสมาชิกสำคัญของตระกูล NFAT มีส่วนเกี่ยวข้องกับการสร้างความแตกต่างของเทอร์มินอล osteoclast ในฐานะผู้ควบคุมการถอดรหัสหลัก (Asagiri et al., 2005) มีรายงานว่าเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนที่ขาด NFATc1- ไม่สามารถแยกความแตกต่างออกเป็นเซลล์สร้างกระดูกภายใต้การกระตุ้นของ RANKL และการแสดงออกนอกมดลูกของ NFATc1 ทำให้เซลล์ต้นกำเนิดได้รับความแตกต่างผ่านการส่งสัญญาณ RANKL ซึ่งแสดงให้เห็นว่า NFATc1 มีบทบาทสำคัญใน ความแตกต่างของกระดูกพรุน (Takayanagi et al., 2002) ผลการศึกษาของเราแสดงผลการปราบปรามของ CDP ต่อการแสดงออกของ NFATc1 และโปรตีน CTSK ที่ตามมา น่าสนใจ เราสังเกตว่าระดับการแสดงออกของโปรตีนของ NFATc1 เพิ่มขึ้นก่อนแล้วจึงลดลง โดยไปถึงระดับสูงสุดในวันที่ 5 หลังจากการกระตุ้น RANKL ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของ Baek et al (2014) ซึ่งสังเกตพบ M-CSF ที่เหนี่ยวนำการเสื่อมของ NFATc1 ระหว่างการสร้างกระดูกเสื่อมระยะสุดท้ายผ่านการแพร่หลายที่เหนี่ยวนำโดย Cbl ของ NFATc1 ในลักษณะที่ขึ้นกับ Src ไคเนส ผลการทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์สนับสนุนผลการยับยั้งของ CDP ต่อการกระตุ้นการถอดรหัส NFATc1 อย่างสม่ำเสมอ นอกจากนี้ ยีนเฉพาะของ osteoclast รวมถึง CTSK, Acp5, Mmp9 และ Atp6v0d2 ทั้งหมดถูกควบคุมโดย NFATc1 โดยตรง (Y. Kim et al., 2005) ถูกระงับโดย CDP การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่า NFATc1 เป็นเป้าหมายของผลการยับยั้งของ CDP ต่อเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPKs

บทสรุป

โดยสรุป เราได้สกัดและทำให้บริสุทธิ์โพลิแซ็กคาไรด์ที่ออกฤทธิ์จากซีดี และแสดงให้เห็นว่า CDP แสดงผลในการป้องกันโรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX และการสูญเสียมวลกระดูกดีขึ้นโดยการยับยั้งกิจกรรมและการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก นอกจากนี้ CDP สามารถยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการทำงานของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL โดยรบกวนเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPK และส่งผลต่อการเปิดใช้งาน NFATc1 ที่ปลายน้ำ โดยสรุป การค้นพบของเราเป็นรากฐานสำหรับการขยายและการใช้ CDP ในการรักษาโรคกระดูกพรุน

บทความนี้มาจากรายการเนื้อหาที่มีอยู่ในหน้าแรกของวารสาร ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff