โรคไตเรื้อรังเพิ่ม Microbleeds ในสมองในหนูและมนุษย์
Mar 15, 2022
ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7
ได้รับ: 25 สิงหาคม 2018 /แก้ไข: 28 มกราคม 2019 /ยอมรับ: 22 กุมภาพันธ์ 2019 /เผยแพร่ออนไลน์: 4 พฤษภาคม 2019
# The Author(s) 2019
เชิงนามธรรม
microbleeds สมองเพิ่มขึ้นในเรื้อรังไตโรค(CKD) และการปรากฏตัวของพวกเขาเพิ่มความเสี่ยงของการลดลงของความรู้ความเข้าใจและโรคหลอดเลือดสมอง เราตรวจสอบการทำงานร่วมกันระหว่าง CKD และ microhemorrhage ในสมอง (สารตั้งต้นทางระบบประสาทของ microbleeds) ในแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเมาส์และเซลล์ และศึกษาความก้าวหน้าของภาระ microbleed ในการถ่ายภาพสมองแบบอนุกรมจากมนุษย์ การศึกษาด้วยเมาส์: ได้ทำการศึกษาแบบจำลอง CKD สองแบบ: โรคไตอักเสบจากท่อนำไข่ที่เหนี่ยวนำโดยอะดีนีนและการตัดไตด้วยไตเทียมแบบผ่าตัด 5/6 การศึกษาการเพาะเลี้ยงเซลล์: bEnd.3 เซลล์บุผนังหลอดเลือดในสมองของหนูเมาส์ถูกปลูกเพื่อบรรจบกัน และวัดความสมบูรณ์ของชั้นเดียวหลังจากการสัมผัสกับซีรัมยูเรียของมนุษย์ 5–15 เปอร์เซ็นต์หรือความเข้มข้นของยูเรียที่เพิ่มขึ้น การศึกษาในมนุษย์: ประเมินความก้าวหน้าของ microbleeds ของสมองใน MRI แบบอนุกรมจากกลุ่มควบคุม, CKD ก่อนการฟอกไต และผู้ป่วยที่ฟอกไต การตกเลือดในเส้นเลือดเพิ่มขึ้น 2–2 5-เท่าในหนูที่มี CKD ที่ไม่ขึ้นกับความดันโลหิตสูงในแบบจำลองการตัดไตแบบ 5/6 การย้อมสี IgG เพิ่มขึ้นในสัตว์ CKD ซึ่งสอดคล้องกับการซึมผ่านของสิ่งกีดขวางเลือดและสมองที่เพิ่มขึ้น การฟักตัวของเซลล์ bEnd.3 ด้วยยูเรียซีรัมหรือยูเรียที่เพิ่มขึ้นทำให้ความต้านทานไฟฟ้าทรานส์บุผนังหลอดเลือดลดลงตามขนาดยา ยูเรียที่เพิ่มขึ้นทำให้เกิดความผิดปกติของโครงกระดูกของแอคติน และลดการแสดงออกของคลอดิน-5 ในมนุษย์ความชุกของ microbleeds อยู่ที่ 50 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม CKD ทั้งสองเทียบกับ 10 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มควบคุมที่จับคู่อายุ ผู้ป่วยจำนวนมากขึ้นในกลุ่มการฟอกไตได้เพิ่ม microbleeds ใน MRI ติดตามผลหลังจาก 1.5 ปี CKD ขัดขวางการกั้นเลือดและสมองและเพิ่มการตกเลือดในสมองในหนูและจุลินทรีย์ในมนุษย์ ยูเรียที่สูงจะเปลี่ยนแปลงโครงร่างโครงร่างโครงร่างของแอกตินและโปรตีนรอยต่อที่แน่นในเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่เพาะเลี้ยง ซึ่งบ่งชี้ว่ากลไกนี้อธิบาย (อย่างน้อยก็ในบางส่วน) ภาวะตกเลือดขนาดเล็กและไมโครเบลดที่พบในการศึกษาในสัตว์และมนุษย์
คำสำคัญ โรคไตเรื้อรัง. จุลินทรีย์ เมาส์รุ่น. การเพาะเลี้ยงเซลล์บุผนังหลอดเลือด สมองMRI
เพื่อบรรเทาเรื้อรังไตโรคกับcistanche
บทนำ
หนึ่งในการค้นพบทางประสาทวิทยาโรคหลอดเลือดสมองที่สำคัญที่สุดในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาคือการเกิดขึ้นของเรื้อรังไตโรคให้มีผลกระทบที่เหนือกว่าปัจจัยเสี่ยงแบบเดิมๆ เช่น ความดันโลหิตสูงและเบาหวาน [10, 11] เนื่องจากมีความชุกสูง (ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์) ของ microbleeds ในสมองและความบกพร่องทางสติปัญญาในผู้ป่วยที่มี CKD ขั้นสูง [2–4, 6, 7] ความสัมพันธ์นี้สมควรได้รับการศึกษาเพิ่มเติม
microbleeds ในสมองเป็นจุดโฟกัสเล็กๆ ของ hemosiderin–iron ที่แสดงให้เห็นในการถ่ายภาพด้วยคลื่นสนามแม่เหล็ก (MRI) ซึ่งเชื่อกันว่าสะท้อนถึงภาวะเลือดออกในสมองน้อย [12, 13] และบ่งบอกถึงความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นสำหรับโรคหลอดเลือดสมอง ทั้งเลือดออกและขาดเลือด [9, 14] ลำดับ MRI เฉพาะ (ภาพสะท้อนแบบไล่ระดับสีและการถ่ายภาพที่เน้นความไวต่อความไว) แสดงให้เห็นถึงพื้นที่โฟกัสเหล่านี้ของการสูญเสียสัญญาณในเนื้อเยื่อสมองที่วัดได้น้อยกว่าหรือเท่ากับ 10 มม. [12, 15] จุลินทรีย์ในสมองขึ้นอยู่กับอายุ โดยความชุกจะเข้าใกล้ 20 เปอร์เซ็นต์เมื่ออายุ 65 [16] นอกจากอายุแล้ว ความดันโลหิตสูงและโรคหลอดเลือดหัวใจตีบเป็นปัจจัยเสี่ยงที่อธิบายได้ดีที่สุดสำหรับการพัฒนาของจุลินทรีย์ในเลือด [13, 17] ใน CKD ระยะสุดท้าย microbleeds มีมากถึง 50 เปอร์เซ็นต์ของประชากร [2–4]
พร้อมกันนั้น ความบกพร่องทางสติปัญญามีทั้งที่แพร่หลายและรุนแรงกว่าในระดับที่ต่ำกว่าของไตการทำงาน[18] ถึงความชุก 30–70 เปอร์เซ็นต์ในผู้ป่วยไตวายเรื้อรัง [6, 7] ในการวิเคราะห์แบบภาคตัดขวางของผู้ป่วยไตเทียม 338 รายที่มีอายุ 55 ปีขึ้นไปที่มีกลุ่มควบคุมที่ตรงกับอายุ 34 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยฟอกไตมีความบกพร่องทางสติปัญญาอย่างรุนแรงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม 12 เปอร์เซ็นต์ [6] อีก 35 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มการฟอกไตมีความบกพร่องทางสติปัญญาในระดับปานกลาง [6]
การศึกษาหลายชิ้นในกลุ่มประชากรที่ไม่ใช่ CKD ได้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นระหว่าง microbleeds ในสมองกับการทำงานของความรู้ความเข้าใจที่ลดลง [19–22] ข้อมูลทางระบาดวิทยาสนับสนุนการมีอยู่ร่วมกันของภาระ MRI microbleed และความผิดปกติของความรู้ความเข้าใจในผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้าย (ESRD) [8, 23] นอกจากนี้ รายงานล่าสุดของผู้ป่วยไตวายเรื้อรัง 28 รายที่มี MRI ในสมองแบบอนุกรมแสดงให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่าง microbleeds ใหม่และคะแนนการตรวจสภาพจิตใจขนาดเล็ก (MMSE) ที่ลดลง [4] นอกจากนี้ ผู้ป่วย ESRD มีอัตราอุบัติการณ์สูงขึ้น 3- ถึง 4- เท่าที่สูงขึ้นของทั้งโรคหลอดเลือดสมองตีบและโรคหลอดเลือดสมองตีบเมื่อเทียบกับประชากรทั่วไป [5] ในกลุ่มผู้ป่วยไตเทียมชาวญี่ปุ่นที่ปราศจากโรคหลอดเลือดสมองที่การตรวจวัดพื้นฐาน การปรากฏตัวของเลือดในสมองเป็นตัวทำนายที่เป็นอิสระของการตกเลือดในสมองในช่วงระยะเวลาติดตามผล 5- ปี [9]
เรารายงานผลการศึกษาในหนูทดลองและผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรัง เราพบการตกเลือดในสมองเพิ่มขึ้นในหนูที่เป็นโรค CKD และอธิบายถึงรอยต่อที่แน่นของบุผนังหลอดเลือดบกพร่องและการหยุดชะงักของโครงร่างโครงร่างของแอกตินเป็นกลไกที่อาจก่อให้เกิดการตกเลือดขนาดเล็กในสภาพแวดล้อม CKD การวิเคราะห์ย้อนหลังของ MRI สมองต่อเนื่องจากกลุ่มที่ไม่ใช่ CKD ก่อนการฟอกไต และการฟอกไตเรื้อรังยืนยันว่า ESRD เป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับความก้าวหน้าของภาระ microbleed
วิธีการ
หนูทดลอง
สัตว์ทดลองและกลุ่มบำบัด
แบบจำลองหนูเมาส์ CKD สองตัวถูกตรวจสอบ (1) Adenine tubulointerstitial nephritis model: หนู C57BL/6J เพศผู้จาก Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) อายุ 10– 12 สัปดาห์ได้รับอาหารที่มีอะดีนีน 0.2 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 18 วันเพื่อทำให้เกิดโรคไตเรื้อรังคั่นระหว่างหน้า กลับไปรับประทานอาหารปกติเป็นเวลา 2 สัปดาห์ จากนั้นจึงให้อาหารอะดีนีนอีกครั้งเป็นเวลา 1 สัปดาห์เพื่อรักษา CKD (รูปที่ 1a) หนูควบคุมได้รับการบำรุงรักษาตามปกติ (2) 5/6 แบบจำลองการตัดไต: หนู C57BL/6J เพศผู้อายุ 10 สัปดาห์ได้รับการผ่าตัดสองขั้นตอนที่ห้องปฏิบัติการแจ็คสันซึ่งเกี่ยวข้องกับการตัดไตบางส่วนด้านซ้าย ตามด้วยการตัดไตทั้งหมดด้านขวา 1 สัปดาห์ต่อมา สัตว์ถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการ 1 สัปดาห์หลังจาก
การผ่าตัดครั้งที่สอง แบบจำลองทั้งสองนี้ใช้เพื่อกำหนดผลของความดันโลหิตสูง ความดันโลหิตสูงเป็นจุดเด่นของแบบจำลองการตัดไต 5/6 ในขณะที่ adenine- CKD ไม่ใช่ความดันโลหิตสูง [24]
สัตว์ CKD ถูกสุ่มให้ไม่มีการฉีดไลโปโพลีแซคคาไรด์ (LPS) หรือ LPS (ในการศึกษานำร่อง เราพบว่าต้องใช้ระยะเวลานานของปัสสาวะเพื่อตรวจหาภาวะเลือดออกตามไรฟันที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติในสัตว์ CKD ที่ไม่ได้รับการรักษา หนูที่ได้รับอาหารอะดีนีนเพียง 10 วันนับจาก 18 วันแรก การสัมผัสมี 3.0 ± 0.4 microhemorrhage ต่อ cm2)
ห้าสัปดาห์หลังจากการเหนี่ยวนำ CKD เริ่มต้นและที่อายุเท่ากันในกลุ่มควบคุม หนูได้รับการฉีด LPS ในช่องท้อง (ip) (Salmonella enterica serotype Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) เพื่อกระตุ้น microbleeds ในสมอง LPS ถูกบริหารให้ในขนาดยาสามขนาด, 1 มก./กก. ที่ 0, 6 และ 24 ชั่วโมง [25] หนูที่ได้รับการรักษาด้วย LPS ได้รับความชุ่มชื้นด้วยการฉีดน้ำเกลือใต้ผิวหนัง 2-3 ครั้งต่อวันเป็นเวลา 3 วันหลังจากการรักษาด้วย LPS ความดันโลหิต (BP) ถูกวัด 2 วันก่อนการฉีด LPS ผ่านทาง plethysmography ที่ปลายแขน (CODA-S2 multi-channel, Kent Scientific) การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจาก University of California, Irvine Institutional Animal Care และ Use Committee
การเก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อและเคมีในเลือด
หนูเมาส์ถูกทำการุณยฆาต 1 สัปดาห์หลังการฉีด LPS หรือเมื่ออายุเท่ากันในสัตว์ที่ไม่ได้รับการรักษาโดยการกำจัดเลือดออกโดยใช้การเจาะหัวใจภายใต้การดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรนที่สูดดม ใช้ 26-เข็มวัดเป็น cannula และสอดเข้าไปในช่องซ้าย และใช้สารละลาย PBS ที่เย็นจัดที่อัตราการไหล 7-8 มล./นาที หลังจาก
เลือดไปเลี้ยงเป็นเวลา 5 นาที ซีกสมองซีกซ้ายถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วสำหรับ Western blot ซีกสมองซีกขวาและไตทั้งสองข้างได้รับการแก้ไขในชั่วข้ามคืนในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% จากนั้นจึงเก็บไว้ใน PBS ที่เย็นจัดก่อนการแบ่งส่วน เซรั่มถูกแบ่งส่วนสำหรับเคมีในเลือด ยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ถูกวัดโดยใช้ชุดสีจาก BioAssay Systems (Hayward, CA) creatinine ในซีรัมวัดโดยใช้ capillary electrophoresis ที่ O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX)
การตรวจหา microhemorrhages
สมองถูกติดตั้งใน agarose 1.5 เปอร์เซ็นต์และแบ่งส่วนด้วย vibratome เพื่อสร้างส่วนโคโรนา (40 μm) ทุกส่วนที่ 5 ถูกรวบรวมสำหรับการย้อมสีน้ำเงินปรัสเซียนเพื่อตรวจหา microhemorrhages [26] ทำการย้อมสีน้ำเงินปรัสเซียนโดยใช้โพแทสเซียม hexacyanoferrate-tri hydrate 5 เปอร์เซ็นต์ที่เตรียมไว้ใหม่และกรดไฮโดรคลอริก 10 เปอร์เซ็นต์ ยี่สิบนาทีต่อมา ล้างส่วนต่างๆ ในน้ำและย้อมทับด้วยสีแดงแบบเร็วนิวเคลียร์ อบแห้ง และปิดฝาไว้ ภาวะเลือดออกในกระแสเลือดถูกระบุด้วยกำลังขยาย × 20 เนื่องจากการสะสมของสีม่วง-น้ำเงินนับโดยการฉีดสามครั้งได้รับที่ 0,6 และ 24 ชม. ให้น้ำเกลือใต้ผิวหนังเป็นเวลา 3 วันหลังจากฉีด LPS ความดันโลหิตส่วนหาง (BP) ถูกวัดก่อนการฉีด LPS หนูถูกสังเวย 1 สัปดาห์หลังจากการฉีด LPS b ตัวแทนของ H&E ย้อมสีไตซึ่งแสดงให้เห็นหนูที่บาดเจ็บที่คั่นด้วยท่อนำไข่ที่เหนี่ยวนำโดยอะดีนีน (แผงด้านขวา) เทียบกับไตปกติจากสัตว์ CTL (แผงด้านซ้าย) × กำลังขยาย 20 แถบมาตราส่วน=100 μm
ผู้สังเกตการณ์อิสระแล้วคำนวณค่าเฉลี่ย ภาพของส่วนที่ย้อมเป็นบวกที่สังเกตพบถูกจับโดยใช้โฟโตไมโครสโคป (Nikon Eclipse, Japan) สำหรับสัตว์สามตัวต่อกลุ่มเพื่อคำนวณพื้นที่ microhemorrhage ภาพสไลด์ทั้งหมดถูกสแกนและใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ฟรี (เวอร์ชัน 10.2) จาก National Institutes of Health (www.imagej.nih.gov/ij/) เพื่อ
คำนวณพื้นที่ผิวสมองทั้งหมด จำนวน microhemorrhages ถูกทำให้เป็นมาตรฐานไปยังพื้นที่ผิวสมองทั้งหมดต่อสัตว์หนึ่งตัว
ซับตะวันตก
สมองซีกโลกสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในขณะที่เก็บเนื้อเยื่อและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในรีเอเจนต์การสกัดเนื้อเยื่อเย็น I (Thermo Fisher Scientific) เสริมด้วยค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอส (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) วัดความเข้มข้นของโปรตีนด้วยชุดทดสอบโปรตีน BCA (Thermo Fisher Scientific) SDS-PAGE เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสถูกทำให้เสร็จด้วยโปรตีน 100 ไมโครกรัมต่อตัวอย่าง โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้ม PVDF แล้วปิดกั้นสำหรับ
1 ชั่วโมงในนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ที่เตรียมในบัฟเฟอร์ TBS-T (10 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween-20) และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่มีเป้าหมายเป็น claudin -5 (เจือจาง 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (เจือจาง 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) และทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุมภายใน GAPDH (เจือจาง 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) ในนมที่ไม่มีไขมัน 5% TBS-T ค้างคืนที่ 4 องศา จากนั้นบลตถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต้านกระต่ายหรือแอนตี้เมาส์ตามลำดับเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย TBS-T ตรวจพบแถบโดยใช้ Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT)
อิมมูโนฮิสโตเคมี
เพื่อตรวจหาการรั่วไหลของสิ่งกีดขวางในเลือดและสมอง (BBB) ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีรอง IgG รองแอนติบอดีต่อหนูที่ biotinylated ที่ 1:100 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว ส่วนต่างๆ ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีด้วยสารเชิงซ้อนของ avidin-biotin-peroxidase (Vector Laboratories) ที่การเจือจาง 1:200 การย้อมสีได้รับการพัฒนาโดยใช้ 3′,3′- diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories) เป็นโครโมเจน เปอร์เซ็นต์พื้นที่ที่ย้อมด้วย IgG ถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ในสมองที่ไม่ใช่ LPS CTL และ CKD เกณฑ์ขั้นต่ำสำหรับการย้อมสี IgG เชิงบวกถูกเลือกโดยการประเมินสัตว์ควบคุมสำหรับการย้อมสี IgG ด้วยตนเอง และจากนั้นเกณฑ์นี้จึงเท่ากันสำหรับสัตว์ที่รวมทั้งหมด [27]
Cistanche Deserticola ป้องกันโรคไต
การทดลองเพาะเลี้ยงเซลล์
การเพาะเลี้ยงเซลล์บุผนังหลอดเลือดสมองและการรักษาเซรั่ม
เซลล์ bEnd.3 ของเมาส์ที่ถูกทำให้เป็นอมตะถูกซื้อจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ฟีโนไทป์ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้รับการยืนยันผ่านการย้อมสีภูมิคุ้มกันสำหรับปัจจัย von Willebrand
การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกบ่มในตัวกลางของ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco ที่มีกลูโคสสูง (DMEM, ATCC 30-2002) ที่มีกลูโคส 25 มิลลิโมลาร์ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS) และเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ใน ตู้อบความชื้น 37 องศาในบรรยากาศของ CO2 5 เปอร์เซ็นต์และอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกใช้ที่ข้อ 5 สำหรับการทดลองทั้งหมด เซลล์ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 5× 106 บนแผ่นแทรก Transwell โพลีเอสเตอร์ 12-หลุม (รูพรุน 0.4 ไมโครเมตร, Costar) และเกิดการบรรจบกันที่ 24-48 ชั่วโมง จากนั้นจึงเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อให้เซลล์มีความเข้มข้นต่างกันของ FBS, เซรั่มปกติของมนุษย์ (HNS) หรือซีรัมยูรีมิก (CKD) จากผู้ป่วยฟอกไต การอ่าน TEER ถูกวัดโดยใช้ EVOM2 โวลต์/โอห์มมิเตอร์ (World Precision Instruments, Sarasota, FL) ที่ตำแหน่งสามตำแหน่งต่อหลุมเพื่อให้ได้ค่าเฉลี่ย การทดลองดำเนินไปเป็นเวลา 21 วัน และมีการรีเฟรชอาหารทุกๆ 3-4 วัน NHS และ uremic serum มาจากตัวอย่างที่ฝากไว้ก่อนหน้านี้ที่ได้รับหลังจากได้รับการอนุมัติจาก IRB และได้รับความยินยอม
การทดลองเพาะเลี้ยงเซลล์ยูเรีย
เพื่อตรวจสอบผลของยูเรีย (สารพิษที่ตกค้างมากที่สุดใน CKD) เซลล์ bEnd.3 ถูกบ่มใน DMEM ที่มีกลูโคสสูงโดยมี FBS 10 เปอร์เซ็นต์เพียงอย่างเดียวหรือในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วยยูเรีย 42 หรือ 72 มก./ดล. (70 หรือ 120 ไมโครเมตร) ( ซิกม่า- Aldrich) ความเข้มข้นของยูเรียเหล่านี้ใกล้เคียงกับค่าก่อนและหลังการฟอกไตโดยทั่วไปที่พบในผู้ป่วย ESRD และถือว่ามีความเกี่ยวข้องทางคลินิก [28] ที่ส่วนท้ายของระยะฟักตัว 24- ชั่วโมง TEER ถูกวัดและเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและประมวลผลสำหรับการวิเคราะห์ Western blot สำหรับการแสดงภาพโครงร่างโครงกระดูกของแอคตินนั้น เซลล์ bEnd.3 ถูกปลูกบนฝาครอบกระจกและสัมผัสกับความเข้มข้นของยูเรียข้างต้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตรึงไว้เป็นเวลา 10 นาทีในฟอร์มาลิน/PBS ที่แช่เย็น 4 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นจึงแปรรูปสำหรับการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยใช้แอคติสแตติน 488 ฟลูออเรสเซนต์ ลึงค์ที่มีคราบนิวเคลียร์ DAPI (catalog# PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO) ทำสไลด์สามเท่าต่อกลุ่ม และสามเฟรมถูกสร้างภาพต่อสไลด์บนซอฟต์แวร์ ImageJ เพื่อคำนวณพื้นที่ของการย้อมสีลลลอยด์ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานของพื้นที่ DAPI
ซับตะวันตก
bEnd.3 เซลล์จากการทดลองยูเรียถูกอัดเป็นก้อน จากนั้น lysed ใน Tissue Extraction Reagent I (Thermo Fisher Scientific) เสริมด้วยค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอส (Roche Applied Science) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกวัดด้วยชุดทดสอบโปรตีน BCA และเวสเทิร์นบล็อตถูกทำตามที่อธิบายข้างต้นด้วยคลาวดิน-5 (เจือจาง 1:500) และออกคลูดิน (เจือจาง 1:500) ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุมภายในของ GAPDH (เจือจาง 1:20 ,000). Western blots ถูกทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง
มนุษย์ศึกษา
ทบทวนแผนภูมิ MRI สมองย้อนหลัง
เวชระเบียนอิเล็กทรอนิกส์ระหว่างวันที่ 1 มกราคม 2008 ถึง 31 ธันวาคม 2014 ที่ศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย-เออร์ไวน์ ได้รับการตรวจคัดกรองโดยใช้ระบบ Honest Broker และ UCReX (University of California Research Exchange) หลังจากได้รับอนุมัติจาก IRB ก่อนการฟอกไต CKD (n =8) และผู้ป่วยไตเทียมเรื้อรัง (n =9) ที่มีการสแกน MRI ในสมองอย่างน้อย 2 ครั้ง ณ จุดเวลาที่แยกกัน (จากผู้ป่วยไตเทียม 10 รายที่ระบุครั้งแรก นำ 1 รายออกจาก การวิเคราะห์ขั้นสุดท้ายเนื่องจากภาพที่หายไปในระบบ PACS รังสีวิทยา) ส่วนควบคุมที่มีการทำงานของไตปกติ (n=10) ถูกจับคู่ด้วยตนเองกับผู้ป่วยโรคไตไตวายเรื้อรัง CKD ตามเพศและอายุ ± 5 ปี
การทบทวน MRI สำหรับไมโครเลือดในสมอง
Microbleeds ถูกนับโดยนักประสาทวิทยาที่เข้าร่วม (DF) และวิเคราะห์การลุกลามเมื่อเวลาผ่านไป MRI ของสมองด้วยภาพ T2*-weighted และ susceptibility-weighted imaging (SWI) และภาพ FLAIR (fluid-attenuated inversion Recovery) ดำเนินการบนเครื่องสแกน MRI 1.5T และ 3T ความหนาของชั้นสำหรับลำดับ SWI ดำเนินการที่ 2 มม. โดยมีช่วงระหว่างชั้นเท่ากับ 0 microbleeds ถูกนับโดยอิงตาม SWI ตามแนวแกน 2-มม. FLAIR ถูกต่อ-
ก่อตัวขึ้นเพื่อตรวจหารอยโรคของสารสีขาวที่ความหนา 3 มม. และมีระยะห่างระหว่างชั้นเท่ากับ 0
การวิเคราะห์ทางสถิติ
ไม่มีข้อมูลผิดปกติเมื่อคัดกรองด้วยการทดสอบของ Grubbs (วิธีการเบี่ยงเบนแบบนักเรียนมาก http://graphpad.com/quick calls/grubbs1/) ความแตกต่างระหว่างกลุ่มในหนูและในคนถูกเปรียบเทียบโดยการทดสอบไคสแควร์ (ความแม่นยำของฟิชเชอร์) สำหรับตัวแปรหมวดหมู่และการทดสอบ t และ ANOVA สำหรับตัวแปรต่อเนื่อง ข้อมูลต่อเนื่องถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย± SEM สำหรับข้อมูลเมาส์ เราได้ดำเนินการทั้งแบบไม่มีพารามิเตอร์ของ Kruskal–Wallis และ ANOVA ทางเดียวด้วยการทดสอบ Tukey HSD การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (CKD-ใช่/ไม่ใช่ และ LPS- ใช่/ไม่ใช่) ถูกใช้เพื่อทดสอบอันตรกิริยาของ CKD ความแตกต่างระหว่างกลุ่มถือว่ามีนัยสำคัญหาก P < 0.05="" ตัวเลขถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์="" graphpad="" prism="" 4="" (ซอฟต์แวร์="" graphpad,="" san="" diego="">
ผลลัพธ์
เอาชีวิตรอดด้วย LPS Treatment
หนูเมาส์ CKD ที่บำบัดด้วย LPS มีอัตราการรอดชีวิต 80 เปอร์เซ็นต์ มีเพียงหนูที่รอดชีวิตถึง 1 สัปดาห์หลังการรักษาด้วย LPS เท่านั้น
รวมอยู่ในการวิเคราะห์ขั้นสุดท้าย หนูทั้งหมดในกลุ่มอื่นรอดชีวิตมาได้จนถึงสิ้นสุดการทดลอง
CKD เลือดออกในสมองเพิ่มขึ้นอย่างมาก
ภาระหลังการรักษา LPS
สัตว์ที่มีภาวะไตวายเรื้อรังที่เกิดจากอะดีนีนและ CKD 5/6 แสดงค่ายูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) และค่าครีเอตินีนในเลือดสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่เป็นโรค CTL (ตารางที่ 1) ความดันโลหิตหางสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสัตว์ nephrectomy-CKD เมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ CTL และ adenine-CKD (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตาม จำนวนจุลินทรีย์ในกลุ่ม CKD ทั้งสองมีความคล้ายคลึงกัน การย้อมสี H&E ยืนยันการบาดเจ็บที่ tubulointerstitial ที่เกิดจาก adenine ในไตจากหนู CKD (รูปที่ 1b)
ค่าเฉลี่ยภาระการตกเลือดในสมองเล็กน้อยเท่ากับ 2.0 ± 0.5 ต่อ cm2 ในหนูเมาส์ที่ไม่ใช่ LPS CTL และเพิ่มขึ้น 2–25-เท่าในสัตว์ CKD ที่ไม่ใช่ LPS (อะดีนีน- หนูเมาส์ CKD 4.5 ± 0.9 ต่อ cm2;
หนูเมาส์ nephrectomy-CKD 4.2 ± 1.1 ต่อ cm2) (ตารางที่ 1; รูปที่ 2a) สำหรับกลุ่มที่ไม่ใช่ LPS การเพิ่มขึ้นของ microhemorrhages มีความสำคัญสำหรับ adenine-CKD เมื่อเทียบกับ CTL แต่ไม่ใช่สำหรับ nephrectomy-CKD การรักษาด้วย LPS เพิ่มการเกิด microhemorrhage ในระดับเดียวกันในสัตว์ CTL และ CKD โดย
