บทที่ 2: สารประกอบที่กำหนดเป้าหมาย OSBPL7 เพิ่ม ABCA1- การไหลออกของคอเลสเตอรอลที่ขึ้นอยู่กับการรักษาการทำงานของไตในสองรูปแบบของโรคไต

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

การอภิปราย

การศึกษานี้อธิบายการระบุประเภทของสารประกอบโดยการค้นพบยาฟีโนไทป์ (PDD) ที่เพิ่มการควบคุมการไหลออกของคอเลสเตอรอลที่ขึ้นกับ ABCA1- deconvolution เป้าหมายเปิดเผยว่า OSBPL7 เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุล ในรูปแบบสัตว์ของโรคไต สารประกอบเหล่านี้ลดการสะสมของไขมันในไต ป้องกันการสูญเสีย podocyte โปรตีนในปัสสาวะปกติ และลดการทำงานของไตลดลง

การรักษาโรคเรื้อรังในปัจจุบันโรคไตถูกจำกัดไว้ที่ ACEi, ARBs และล่าสุดคือสารยับยั้งโซเดียม-กลูโคสโคทรานสพอร์ตเตอร์-ประเภท 2 (SLGT2i) แม้จะมีประสิทธิผลของยาเหล่านี้ในการชะลอการลุกลามของโรคไตเรื้อรัง โดยส่วนใหญ่ในผู้ป่วยโรคไตที่มีโปรตีนยูริก ความต้องการทางการแพทย์ที่ไม่ได้รับการตอบสนองใน CKD ยังคงมีจำนวนมหาศาล3,3940 ในการทดลองแบบสุ่มกับผู้ป่วย 4300 ราย พบว่า SGLT2i มีประสิทธิภาพโดยไม่คาดคิดโดยไม่คำนึงถึง การปรากฏตัวของโรคเบาหวาน4 ซึ่งบ่งชี้ว่ากลไกของ renoprotection อื่นนอกเหนือจากการลดน้ำตาลกลูโคสมีส่วนเกี่ยวข้อง อันที่จริง การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่า SGLT2i สามารถเพิ่ม HDL ในพลาสมาและอาจลดการสะสมของไขมันในหัวใจ42 การเกิดขึ้นล่าสุดของ SGLT2i ได้เน้นย้ำถึงประโยชน์ของการกำหนดเป้าหมายกลไกการขับ CKD หลายแบบเพื่อพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น

เราและคนอื่นๆ ได้อธิบายการสะสมคอเลสเตอรอลในไตในโรคไตที่เกิดจากทั้งต้นกำเนิดเมตาบอลิซึมและไม่ใช่เมตาบอลิซึม การสะสมของไขมันในไต ร่วมกับการไหลออกของโคเลสเตอรอลที่มี ABCAl ลดลง เกิดขึ้นใน DKD7-11, FSGS12-14 และ AS13 ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการฟื้นฟูการทำงานของ ABCAl อาจมีประสิทธิภาพในการรักษาโรคไตประเภทนี้ เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการลดคอเลสเตอรอลในไตด้วย cyclodextrin หรือการแสดงออกของ ABCAl ทางพันธุกรรมมากเกินไปจะช่วยป้องกันการทำงานของไตบกพร่องในรุ่นของ DKD9, FSGS13,14 และ ASl3 นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่าการขาด ABCAl จำเพาะของ podocyte ทำให้ฟีโนไทป์ของไตแย่ลงใน DKD7 การศึกษากับตัวเร่งปฏิกิริยา LXR เช่น T1317 ยังให้การสนับสนุนอย่างมากสำหรับบทบาทสำคัญของ ABC Al ซึ่งยังคงเป็นเป้าหมายการรักษาที่น่าสนใจแม้ว่าจะมีข้อจำกัดของสารเหล่านี้

เราค้นหาตัวแทนโดยการค้นพบยาฟีโนไทป์และการเพิ่มประสิทธิภาพของร้านขายยาโมเลกุลขนาดเล็กของผู้สมัคร เราระบุชุดของ 5-arylnicotinamides ซึ่งมีตัวแทนหลายรายที่เพิ่มระดับโปรตีน ABCAl และการไหลออกของคอเลสเตอรอลจากเซลล์ที่มีคอเลสเตอรอล การไม่มีกิจกรรมการไหลออกในไฟโบรบลาสต์จากผู้ป่วยที่เป็นโรคแทนเจียร์ และการขาด ABCAl mRNA ที่เพิ่มขึ้นเผยให้เห็นกลไกการออกฤทธิ์ใหม่

ความพยายามในการทำลายล้างเป้าหมายระบุว่า OSBPL7 เป็นเป้าหมายที่มีความสนใจสูง หัววัดระดับโมเลกุล (³H-Cpd K) จับ OSBPL7 ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้อย่างมีประสิทธิภาพ และสามารถแข่งขันกับสารประกอบที่ไม่ได้ติดฉลากได้อย่างมีประสิทธิภาพ ที่สำคัญกว่านั้น เราได้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ "กิจกรรม-กิจกรรม" ที่สัมพันธ์กันสำหรับชุดสารประกอบที่ใหญ่ขึ้นระหว่างความสามารถในการเพิ่มการไหลออกของคอเลสเตอรอล ABCAl และความสามารถในการแข่งขันเพื่อจับโพรบกับ OSBPL7 การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ ร่วมกับการศึกษาแบบจำลองโมเลกุลและการเทียบท่า บ่งชี้ถึงปฏิกิริยาโดยตรงของสารประกอบกับกระเป๋าที่มีผลผูกพัน sterol OSBPL7 ที่คาดการณ์ไว้ สุดท้าย การศึกษา siRNA ยืนยันการมีส่วนร่วมของ OSBPL7 ในฟังก์ชัน ABC Al

คลิกเพื่อทราบ cistanche ที่จะซื้อ และ cistanche ใช้สำหรับอะไร  

นอกจากนี้เรายังระบุ CBIR เป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้ รายงานหลายฉบับชี้ให้เห็นถึงบทบาทในการส่งสัญญาณ endocannabinoid ในการควบคุมคอเลสเตอรอลในระดับเซลล์ Rimonabant แสดงให้เห็นว่าปรับแต่งตัวรับขยะมูลฝอย B1 (SR-B1) และ ABCGl อย่างพอประมาณ แต่ไม่ใช่ ABC Al ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลของเรา45 cannabinoid สังเคราะห์ WIN55,212-2 ถูกแสดงเพื่อลดการแสดงออกของ ABC Al ในขณะที่เพิ่ม CD36 รีเซพเตอร์ของตัวรับขยะแขยงใน RAW264.7 macrophages46 ที่โหลดด้วย oxLDL ข้อมูลเหล่านี้ร่วมกันไม่สนับสนุนบทบาทที่แข็งแกร่งของ CBIR ในกฎระเบียบของ ABCA1 ในการศึกษาของเรา rimonabant และ CBIR agonists/antagonists รวมถึง AM251, WIN55-212-2 และ arachidonic choloroethylamine (ACEA) ไม่ได้ใช้งานเพื่อกระตุ้น ABCA1 การไหลออกของคอเลสเตอรอล (รูปที่ 3a, 4a)

โปรตีนซึ่งจับกับออกซีสเตอรอลของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (OSBPs) ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเดิมมีส่วนเกี่ยวข้องในการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของโคเลสเตอรอลและสฟิงโกไมเอลิน47-49 การศึกษาหลายชิ้นได้เชื่อมโยง OSBPs เฉพาะกับการควบคุมความคงตัวของโปรตีน ABC Al และคอเลสเตอรอลที่ไหลออกโดย ABCAl 50,51 ไม่มีข้อมูลใดก่อนหน้ารายงานปัจจุบันที่เกี่ยวข้องกับ OSBPL7 ว่าเป็นหน่วยงานกำกับดูแลของ ABCA1 ข้อมูลของเราแนะนำว่า OSBPL7 อาจจัดเตรียมฟังก์ชันการถ่ายโอนข้อมูลหรือสารตั้งต้นที่ส่งผลต่อ ABC Al การทดลองกระตุ้นภูมิคุ้มกันร่วมเบื้องต้นในเซลล์ที่ถ่ายไม่ได้ระบุปฏิสัมพันธ์โดยตรงระหว่างโปรตีนทั้งสอง อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์อภิมานของการศึกษาความสัมพันธ์ของจีโนมทั่วทั้งกลุ่ม (GWAS) ระบุว่า OSBPL7 อยู่ในตำแหน่งทางพันธุกรรม 60 ตำแหน่งที่มีอิทธิพลต่อระดับคอเลสเตอรอลในพลาสมาในมนุษย์

ความสนใจระยะยาวของเราในบทบาทของ ABC Al ในโรคไตทำให้เราประเมิน 5-arylnicotinimides ในหลอดทดลอง และแบบจำลองของโรคไตในร่างกาย เราพบว่า OSBPL7 แสดงออกในไต รวมทั้งในโกลเมอรูไลและพอดไซต์ และ Cpd A และ Cpd G ควบคุมการไหลออกของคอเลสเตอรอลที่เกิดจาก apo Al จากพอโดไซต์ที่บรรจุคอเลสเตอรอล Cpd A และ Cpd G ส่งเสริมการเพิ่มขึ้นของ ABCAl ที่พลาสมาเมมเบรนโดยไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของ mRNA กลไกนี้แตกต่างกับตัวเร่งปฏิกิริยา LXR ซึ่งควบคุม ABCAl mRNA ซึ่งทำให้ ABC Al เพิ่มขึ้นทั้งในพลาสมาและเยื่อหุ้มเซลล์ภายในเซลล์ เราประเมินประสิทธิภาพการรักษาของ Cpd A และ Cpd G ในร่างกาย ในรูปแบบเมาส์ของ FSGS (โรคไตที่เกิดจาก ADR) พบว่าสารทั้งสองชนิดช่วยลดปริมาณคอเลสเตอรอลในไต ซึ่งสัมพันธ์กับปริมาณโปรตีนในปัสสาวะที่ลดลง การลดน้ำหนัก และการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพของไต Cpd G มีประสิทธิภาพสูงในการป้องกันการสูญเสีย podocyte ที่เกิดจาก ADR และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของไต การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ ABCAl ในไตพร้อมกับการเพิ่มขึ้นในอักเสบโปรตีน ถูกป้องกันโดย Cpd G ซึ่งสนับสนุนบทบาทสำคัญของ ABCA1 Cpd G ลดระดับ albuminuria, BUN และ serum creatinine ในหนู AS ที่สำคัญกว่านั้น Cpd G ยืดอายุขัยในสัตว์ Col4a3 รุ่นเก่าที่มีภาวะไตวายขั้นสูง

ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนศักยภาพในการรักษาของสารประกอบที่กำหนดเป้าหมายไปที่ ABCAl และแนะนำอย่างยิ่งว่ารูปแบบใหม่ของการดำเนินการนี้จะให้ประสิทธิภาพเพิ่มเติมหรือเสริมสำหรับยาที่กำหนดเป้าหมาย RAAS, SGLT2, NRF2 และการสังเคราะห์หรือการดูดซึมคอเลสเตอรอล ตรงกันข้ามกับผลของ Cpd G การปิดล้อม RAAS ไม่ได้ยืดอายุขัยในหนู Col4a3 ที่มีอายุมากกว่า แม้ว่าจะเป็นวิธีบำบัดที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับการแทรกแซงในระยะเริ่มต้นในแบบจำลองนี้53,54 ฤทธิ์ต้านโปรตีนในปัสสาวะของ Cpd G นั้นเหนือกว่าผลของรามิพริลที่เรารายงานไว้ก่อนหน้านี้ในรูปแบบซินเจนีกของ AS38 ดังนั้น Cpd G จึงอาจกำหนดเป้าหมายประชากรของผู้ป่วยที่มี AS และโปรตีนในปัสสาวะได้ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ bardoxolone ซึ่งเป็นตัวเอก NRF-2 ที่ได้รับการแสดงว่าเพิ่ม GFR แต่ไม่มีผลต่อโปรตีนในปัสสาวะ ซึ่งเป็นตัวทำนายที่ทรงพลังที่สุดของ 10- ปี ความเสี่ยง ESRD ในประชากรทั่วไป55,56 พบว่าสแตตินสามารถป้องกันในการทดลอง AS57 และแนะนำในผู้ป่วย CKD ทุกรายเพื่อลดความเสี่ยงของโรคหัวใจและหลอดเลือด แต่ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าไม่มีประสิทธิภาพในการชะลอการลุกลามของโรคไต 8 สุดท้ายนี้ เราเพิ่งรายงานถึงประโยชน์ที่เป็นไปได้ของ ezetimibe ใน AS โดยการลด กรดไขมันและการดูดซึมไตรกลีเซอไรด์ อย่างไรก็ตาม ezetimibe ไม่ส่งผลต่อปริมาณคอเลสเตอรอลในไต และประสิทธิภาพในการปรับปรุง GFR และลดปริมาณโปรตีนในปัสสาวะนั้นด้อยกว่าผลที่เรารายงานที่นี่สำหรับ Cpd G

โดยสรุป รายงานนี้อธิบายการระบุโดยการค้นพบยาฟีโนไทป์ของโมเลกุลขนาดเล็กที่เหมือนยาชั้นหนึ่งซึ่งก่อให้เกิดการไหลออกของคอเลสเตอรอลที่เป็นสื่อกลางด้วย ABCAl ชีววิทยาเคมีระบุ OSBPL7 เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลและแสดงให้เห็นว่าโมเลกุลมีปฏิสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดภายในโดเมนการจับตัวของออกซีสเตอรอลที่คาดการณ์ไว้ ตามความรู้ของเรา นี่เป็นหนึ่งในตัวอย่างเพียงไม่กี่ตัวอย่างของสารประกอบคล้ายยาที่ค้นพบครั้งแรกโดยวิธีฟีโนไทป์ ซึ่งระบุเป้าหมายได้สำเร็จในเวลาต่อมา44 สารประกอบ G และ A มีประสิทธิภาพสูงในการปรับปรุงการทำงานของไตในแบบจำลองหนูเมาส์ซึ่งสะท้อนถึงสาเหตุที่หลากหลายสองอย่างของโรคไตที่ลุกลาม ดูเหมือนว่าพวกมันปลอดภัยและทนได้ดี ดังสะท้อนจากความสามารถในการลดระดับ AST ในหนูที่มีปัญหา ADR และที่น่าสนใจกว่านั้นคือเพื่อยืดอายุการใช้งานของหนู Col4A3 KO สารประกอบเหล่านี้อาจเสนอวิธีบำบัดโรคไตรูปแบบใหม่ โดยกำหนดเป้าหมายเมแทบอลิซึมของโคเลสเตอรอลในระดับเซลล์ผ่านรูปแบบการทำงานใหม่ ยาเหล่านี้ควบคู่ไปกับยาที่ใช้อยู่ในปัจจุบันซึ่งมุ่งเป้าไปที่ความดันโลหิตหรือการควบคุมระดับน้ำตาลกลูโคส อาจระบุถึงความต้องการที่ไม่ได้รับการตอบสนองอย่างมีนัยสำคัญใน CKD

วิธีการ

สารประกอบ. สารประกอบที่ใช้ในการศึกษานี้สรุปไว้ในตารางเสริมที่ 5 และถูกสังเคราะห์ขึ้นที่ F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น สำหรับการทดลองในหลอดทดลอง สารประกอบที่ถูกทำแห้งแบบเยือกแข็งถูกสร้างขึ้นใหม่ใน DMSO (Sigma) และส่วนย่อยถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา สำหรับการทดลองภายในร่างกาย สารประกอบที่ถูกทำแห้งแบบเยือกแข็งถูกแขวนลอยใหม่ในกระสายยาที่มีไฮดรอกซีโพรพิล เมทิลเซลลูโลส 1.25 เปอร์เซ็นต์,0.10 เปอร์เซ็นต์ของเกลือโซเดียมโดคูเสต0.18 เปอร์เซ็นต์โพรพิลพาราเบนโซเดียมและ 0.02 เปอร์เซ็นต์ของกรดซิตริก โมโนไฮเดรต ที่ pH 6 อนุภาคแขวนลอยละเอียดถูกสร้างขึ้นโดยโซนิเคชันแบบพัลส์สั้นๆ สามครั้งที่ทำบนน้ำแข็ง

ขั้นตอนทางเคมีสังเคราะห์และข้อมูลวิเคราะห์. โปรดดูไฟล์ข้อมูลเสริม 1

การคัดกรองเป้าหมายทางชีววิทยาเคมี/ผู้สมัคร โดยสรุป พลาสมิดซึ่งแสดงเป้าหมายของผู้สมัครที่สนใจซึ่งหลอมรวมกับแท็ก FLAG ถูกทรานส์เฟกไปในเซลล์ HEK293 หลังจาก 24 ชม. สารประกอบ K ที่ถูกทริทิเอต K ที่ความเข้มข้นที่สามารถเหนี่ยวนำ ABCA1-โคเลสเตอรอลที่หลั่งออกมา (1.0 ไมโครโมลาร์) ถูกเติมเป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ที่มีชีวิตถูกสัมผัสกับแสงยูวี (K{{ 7}} นาโนเมตร) เพื่อสืบค้นการเชื่อมโยงข้ามแบบผสม/เป้าหมายที่เป็นไปได้ในแหล่งกำเนิด เซลล์ไลเซตถูกเตรียม โปรตีนที่แสดงออกจากนั้นถูกกระตุ้นภูมิคุ้มกันแบบเลือกเฟ้นโดยใช้แอนติบอดีต้าน FLAG ควบคู่ไปกับเม็ดบีดเซฟาโรส โปรตีนที่จับถูกแยกออกโดย SDS-PAGE และเตรียมและตรวจสอบรอยเปื้อนที่เหมือนกันสองจุดโดย western blot และโดยการถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติเพื่อตรวจหาการแสดงออกของโปรตีน และการมีอยู่หรือไม่มีการเชื่อมขวางแบบผสมตามลำดับ แผนผังลำดับงานของหน้าจอนี้แสดงไว้ในรูปที่ 2 รูปที่ 2d แสดงความสามารถของ Cpd A และ Cpd G เพื่อแทนที่ Cpd K ที่ไตร่ตรองจาก OSBPL7 ที่แสดงออกมากเกินไปและตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน รูปที่ 3b แสดงตัวอย่างการใช้ของการสอบวิเคราะห์นี้เพื่อตรวจจับการจับของ Cpd K ที่ถูกทริทิเอตกับแวเรียนต์ที่แสดงออกมากเกินไปและกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ OSBPL7 ที่มีการกลายพันธุ์แบบจุดในกระเป๋าการจับอ็อกซิสเตอรอลที่คาดการณ์ไว้ของ OSBPL7 ข้อดีของวิธีนี้คือ i. การใช้พลาสมิดทรานส์เฟกชันทำให้เกิดการแสดงออกในระดับสูงของผู้สมัครแต่ละคน ซึ่งจะช่วยลดโอกาสที่พลาดเป้าหมายที่แท้จริงสำหรับผู้ที่อาจแสดงออกในระดับภายนอกต่ำ iii ปฏิกิริยาระหว่างโพรบเคมีกับเป้าหมายเกิดขึ้นในบริบททางชีวภาพที่เกี่ยวข้อง (เซลล์ที่มีชีวิต) ที่ความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา และ iii การตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันยอมให้โปรตีนที่แสดงออกมาที่สนใจถูกทำให้บริสุทธิ์จากโปรตีนพื้นหลัง ซึ่งปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณ/สัญญาณรบกวนอย่างมาก

การเพาะเลี้ยงเซลล์. สายพันธุ์ของเซลล์ถูกซื้อจาก ATCC และเพาะเลี้ยงย่อยไม่เกินข้อ 15 ยกเว้นเซลล์พอดไซต์ของมนุษย์ซึ่งมีพื้นเพมาจากดร. Jochen Reiser พอดไซต์ของมนุษย์ที่ทำให้ไม่ตายแบบมีเงื่อนไขถูกเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะอนุญาตที่ 33 องศา ในตัวกลาง RPMI (คอร์นิง) ที่มี FBS (GIBCO) 10 เปอร์เซ็นต์), เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์0.01 มก./มล. อินซูลินของมนุษย์ชนิดรีคอมบิแนนท์, 0.0055 มก./มล. มนุษย์ทรานเฟอร์ริน (ปราศจากธาตุเหล็กอย่างมาก) และโซเดียม ซีลีไนต์ 0.005 ไมโครกรัม/มล. (ITS, Corning) เพื่อกระตุ้นการสร้างความแตกต่าง โพโดไซต์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาเป็นเวลา 14 วันในตัวกลาง RPMI ที่มี 10 เปอร์เซ็นต์ของ FBS (GIBCO) และ 1 เปอร์เซ็นต์ของเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน โพโดไซต์ที่แยกความแตกต่างถูกอดอาหารใน RPMI-0.2 เปอร์เซ็นต์ FBS เป็นเวลา 18 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วยสารประกอบ 1 ไมโครโมลาร์ 5 ไมโครโมลาร์ และ 10 ไมโครโมลาร์ที่เตรียมใหม่ใน DMSO เป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่ 37 องศาตามที่ระบุไว้

คอเลสเตอรอลที่ไหลออกมาในมาโครฟาจและไฟโบรบลาสต์. ความสามารถของสารประกอบในการเหนี่ยวนำการไหลออกของโคเลสเตอรอลที่เป็นสื่อกลาง ABCAl ถูกกำหนดหาในการเพาะเลี้ยงแบบทำซ้ำของเซลล์ THP1 หรือไฟโบรบลาสต์ในไมโครเพลท 96-หลุม เซลล์ถูกเคลือบที่ความหนาแน่น 150,000 เซลล์/หลุม โมโนไซต์ THP1 ถูกทำให้แตกต่างกับมาโครฟาจโดยการเติม PMA (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 72 ชั่วโมงในตัวกลาง RPMI ที่มี 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมวัวในครรภ์และ 3 pl ของ 2-เมอร์แคปโตเอทานอล เซลล์ถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย RPMI-1640 และจากนั้นบรรจุด้วย 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของอะซิติเลต LDL และ 10μCi/มิลลิลิตร 【' H】-โคเลสเตอรอลในตัวกลาง RPMI-1640 ที่มี FCS 2 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37 องศา . หลังจากการโหลด เซลล์ถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย RPMI-1640 และบ่มด้วยสารประกอบทดสอบเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติมในตัวกลาง RPMI-1640 ที่มี l mg/ml ที่เป็นกรดไขมันอิสระในซีรัมอัลบูมิน (BSA) จากนั้นล้างเซลล์หนึ่งครั้ง และการไหลออกของโคเลสเตอรอลถูกเหนี่ยวนำโดยการเติม apoAI ของมนุษย์ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร หรือ HDL2, HDL3 หรือ LDL 30 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน RPMI-1640 ที่มี I มก./มล. BSA สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม 6 ชม. กัมมันตภาพรังสีในสารเหนือตะกอนของวัฒนธรรมถูกกำหนดโดยการนับแบบเรืองแสงวาบ การไหลออกของคอเลสเตอรอลแสดงเป็นค่าสัมพัทธ์เทียบกับกลุ่มควบคุมที่ถูกบ่มในกรณีที่ไม่มีตัวรับคอเลสเตอรอล เส้นกราฟการตอบสนองปริมาณรังสีคำนวณโดยใช้ XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK)

คอเลสเตอรอลที่ไหลออกใน podocytes. พอดไซต์ของมนุษย์ที่แยกความแตกต่างเป็นเวลา 13 วันถูกติดฉลากเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 องศาในตัวกลาง RPMI ที่มี FBS 2 เปอร์เซ็นต์และ [PH]-โคเลสเตอรอล (1 uCi/มล., American Radiolabeled Chemicals) จากนั้นเซลล์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS และบ่มด้วย RPMI ที่เสริมด้วย 0.2 เปอร์เซ็นต์ fat-free-BSA (Sigma) ที่มีหรือไม่มีสารประกอบเป็นเวลา 18-h ที่ 37 องศา สารประกอบถูกใช้ที่ความเข้มข้นต่อไปนี้∶ Cpd C（1 μM）, Cpd A （1 μM, 5 uM） และ Cpd G（l uM, 5 uM,10 μM） หลังจากการฟักตัว 18-ชั่วโมง apoAI ของมนุษย์（Calbiochem） ถูกเติมลงในสื่อ (20 ไมโครกรัม/มล. ความเข้มข้นสุดท้าย) และเซลล์ถูกบ่มอีก 18 ชั่วโมงที่ 37 องศา อะลิควอตของตัวกลางที่เก็บรวบรวมก่อน (T =0h) และหลัง (T=18h) การเติม apoAI ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1200×g เป็นเวลา 5 นาที และกัมมันตภาพรังสีในส่วนเหนือตะกอน ถูกนับด้วยการเรืองแสงวาบของเหลว จากนั้นเซลล์ถูกล้างด้วย PBS, สลาย SDS 0.1 เปอร์เซ็นต์, NaOH 0.1 โมลาร์ และกัมมันตภาพรังสีในไลเสตถูกหาปริมาณโดยการเรืองแสงวาบของของเหลว การไหลออกของโคเลสเตอรอล apo Al-mediated แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ คำนวณจากปริมาณฉลากที่ปล่อยสู่ตัวกลางหลังจากเติม apo Al (ความแตกต่างของกัมมันตภาพรังสีในตัวกลางก่อนและหลังเติม ApoA1) หารด้วยจำนวนฉลากทั้งหมดในแต่ละหลุม (กัมมันตภาพรังสีที่ปล่อยสู่สื่อบวกกับกัมมันตภาพรังสีในเซลล์ที่ถูกสลาย)

การศึกษา siRNA. พูล siRNA ที่จำเพาะสำหรับ OSBPL7 ของมนุษย์, CBIR ของมนุษย์ และกลุ่มควบคุมเชิงลบของ siRNA ที่ไม่ใช่เป้าหมายถูกสรุปไว้ในตารางเสริมที่ 6 โมโนไซต์ THPI ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 80,000 เซลล์/หลุมใน {{4} }แผ่นหลุมและแยกความแตกต่างด้วย PMA ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจาก 72 ชั่วโมง สื่อถูกแทนที่ด้วยอาหารสด 50 ul ต่อหลุม จากนั้นเซลล์ถูกทรานส์เฟกโดยใช้ Viromer Blue reagent (Origene) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสังเขป 10 ul ของ siRNA (5 ไมโครโมลาร์) ถูกผสมกับ 90 ul ของ Viromer Blue (เจือจาง 1 เปอร์เซ็นต์ในปริมาตร/ปริมาตรในบัฟเฟอร์ที่ให้มา) หลังจากการบ่ม 15 นาที สารเชิงซ้อนของรีเอเจนต์การทรานส์เฟกชัน siRNA ถูกเจือจางที่ 1:6.5 ในตัวกลางสดและเติมลงในปริมาตร 50 ul ต่อหลุม หลังจาก 24 ชม. จากนั้นเซลล์จะถูกบรรจุด้วยโคเลสเตอรอลโดยการบ่มด้วยแอซีทิเลต LDL(25 ไมโครกรัม/มล.) ในตัวกลาง RPMI, 1 เปอร์เซ็นต์ FBS, 100 นาโนโมลาร์ PMA,2 ไมโครซีi H-โคเลสเตอรอลเป็นเวลา 24 ชม. ชุดของหลุมที่มีเซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกกันไว้เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการทรานส์เฟกโดย RT-PCR จากนั้นมาโครฟาจที่บรรจุคอเลสเตอรอลถูกบ่มต่อหน้า Cpd G 5 uM หรือยานพาหนะ (0.1 เปอร์เซ็นต์ DMSO) ในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI ที่มีฟีนอลเรด 0.2 เปอร์เซ็นต์ BSA) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติม จากนั้นวัดการไหลออกของคอเลสเตอรอลตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

RT-PCR. แยก RNA โดยใช้ RNEasy Plus Mini kit (Qiagen) การถอดความแบบย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ qScript cDNA SuperMix(Quantabio) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ TaqMan Fast Universal PCR Master Mix และการสอบวิเคราะห์การแสดงออกของยีน Taqman (ตารางเสริม 7)

หยดตะวันตก. ไลเสตหรือเศษส่วนของเซลล์ถูกบ่มในบัฟเฟอร์แหลมลีที่ 55 องศา เป็นเวลา 10 นาทีภายใต้สภาวะรีดิวซ์ โปรตีนทั้งหมด 30 ไมโครกรัมจากเซลล์ไลเซตหรือหนึ่งในสามของปริมาตรที่รวบรวมในการเตรียมการแยกส่วนของเซลล์ถูกแยกออกโดย SDS-PAGE ในเจลเกรเดียนต์เจล (ไบโอแรด) 4-20 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นโปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF หลังจากการปิดกั้นด้วยนม TBS 5 เปอร์เซ็นต์ เยื่อหุ้มถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา แอนติบอดีปฐมภูมิต่อไปนี้ถูกใช้: แอนติ-ABCA1 ของหนูเมาส์(Abcam; 1:1000), แอนติบอดีต้าน GAPDH ของกระต่าย (มิลลิรูพรุน;1:10,000), แอนติ-แอกตินของหนู ( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 และ anti-Na plus /K plus ATPase(Cell Signaling; all 1:100) และ rabbit anti-OSBPL7(Sigma ; 1:1000). หลังการล้าง เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยแอนติบอดี IgG-HRP ที่ต้านกระต่ายหรือต้านหนูเมาส์ (Promega,1:10,00) ตรวจพบสัญญาณหลังจากการบ่มด้วยสารตั้งต้น Westernbright ECL HRP (Advansta) และสัญญาณการเรืองแสงถูกจับด้วยเวิร์กสเตชัน Azure C600 Gel Imaging (Azure Biosystems Inc, USA) หรือฟิล์มเอ็กซ์เรย์

การแยกเซลล์. โพโดไซต์ที่แยกความแตกต่างได้รับการบำบัดด้วยสารประกอบ Cpd C (l μM), Cpd A (5 μM) หรือ Cpd G (10 μM) เป็นเวลา 18 ชั่วโมง ล้าง และจากนั้นเก็บเกี่ยวใน PBS ที่เย็นจัด เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1000×g เป็นเวลา 5 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกลบออกอย่างระมัดระวัง และเม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ไฮโปโทนิก (15 mM KCl,1.5 mM MgClz,10mM HEPES และ I mM DTT) เสริมด้วยโปรตีเอส ค็อกเทลสารยับยั้ง (โรช) เซลล์ถูกรบกวนด้วยเครื่องฉีดแก้ว และซูโครสถูกเติมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 227 มิลลิโมลาร์ เซลล์ไลเซตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1000×g เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศา จากนั้นนำ supernatant ไปใส่ในหลอดใหม่และหมุนเหวี่ยงที่ 10,000×g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา เม็ดที่มีเศษเล็กเศษน้อยถูกรวบรวมและส่วนลอยถูกย้ายไปยังหลอดใหม่และหมุนเหวี่ยงที่ 100,000×g เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 องศา เศษเยื่อหุ้มพลาสมาอัดเม็ดถูกรวบรวมและส่วนลอยเหนือตะกอนที่มีเศษส่วนไซโตซอลที่ปราศจากออร์แกเนลล์ถูกทำให้เข้มข้นในคอลัมน์ตัวกรอง Vivaspin 500 Western blot ถูกดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีสำหรับ ABCAl และเครื่องหมายจำเพาะสำหรับเศษส่วนของเมมเบรนแต่ละส่วนตามที่บรรยายไว้ข้างต้น Nat/K plus ATPase ถูกใช้เพื่อระบุเศษส่วนของพลาสมาเมมเบรน ERp72 เป็นเครื่องหมายสำหรับเศษส่วนที่อุดมด้วยไมโครโซมอล และ MEK เป็นตัวควบคุมสำหรับเศษส่วนไซโตซอลที่ไม่ใช่เยื่อหุ้ม

ABC AT ร่วมสร้างภูมิคุ้มกัน. ABCA{{0}}สร้างธงโดย Dr.Michael Fitzgerald มหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ด OSBPL7-V5 โครงสร้าง (pcDNA3.1-V5-ORP7) ถูกซื้อจาก Addgene เวกเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม PCMV6-AN-GFP และ pCMV6-AC-3DDK จาก Origene ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ เซลล์ HEK293 ถูกทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดอย่างใดอย่างหนึ่งต่อไปนี้:(1)ABCA1-Flag plus OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag plus PCMV{{19 }}AN-GFP; หรือ(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK โดยใช้ Fugene 6 transfection reagent (Promega) โดยทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต 48 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกสลายด้วยบัฟเฟอร์การตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน 1 มล. (ไทรทัน X-100 เปอร์เซ็นต์ 1 เปอร์เซ็นต์,50 มิลลิโมลาร์ Tris-Cl pH 7.0,150mM NaCI)ที่เสริมด้วยค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส (โรช) ไลเซตถูกล้างโดยการหมุนเหวี่ยงและปริมาณโปรตีนทั้งหมดเท่ากันจากส่วนลอยเหนือตะกอนแต่ละตัวถูกบ่มในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยเจล Affinity ต้านธง M2 (ซิกมา อัลดริช) 30 ไมโครลิตร เม็ดบีดถูกอัดเป็นเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยงและล้าง 5 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์อิมมูโนพรีซิเดชั่น 1 มล. โปรตีนที่ถูกกระตุ้นภูมิคุ้มกันถูกชะโดยการบ่มเม็ดบีดด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 2x 50 ไมโครลิตร เป็นเวลา 15 นาทีที่ 56 องศา การมีอยู่ของ ABC A1 และ OSBPL7-V5 ในไลเสตและตัวชะถูกตรวจสอบโดย western blot ตามที่อธิบายข้างต้น

การศึกษาสัตว์. สัตว์ถูกเลี้ยงไว้บนวัฏจักรแสง/ความมืด 12 ชั่วโมง/12 ชั่วโมง และอยู่ภายใต้อุณหภูมิควบคุม (18-23 องศา ) และความชื้น (40-60 เปอร์เซ็นต์ ) ในสถานที่เลี้ยงสัตว์ปลอดเชื้อโรคของแผนกทรัพยากรสัตวแพทย์ของมหาวิทยาลัย ของไมอามี่ คณะแพทยศาสตร์มิลเลอร์ หนูได้รับโปรตีนมาตรฐาน 18 เปอร์เซ็นต์สำหรับอาหารสัตว์ฟันแทะหนูและน้ำเปล่า โปรโตคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ (IACUC) ของมหาวิทยาลัยไมอามี ซึ่งได้รับการรับรองโดยสมาคมเพื่อการประเมินและการรับรองห้องปฏิบัติการดูแลสัตว์นานาชาติ (AAALAC) ขั้นตอนทั้งหมดดำเนินการตามกฎระเบียบด้านจริยธรรมของรัฐบาลกลางและของรัฐ รวมถึงระเบียบพระราชบัญญัติสวัสดิภาพสัตว์ (AWA) ที่ดูแลโดยกระทรวงเกษตรของสหรัฐอเมริกา (USDA) และนโยบายบริการสาธารณสุขว่าด้วยการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองอย่างมีมนุษยธรรม (PHS) นโยบาย) บริหารงานโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH), สำนักงานสวัสดิภาพสัตว์ทดลอง (OLAW) หนู Balb/c เพศเมียถูกซื้อมาจากห้องปฏิบัติการ Jackson สำหรับการศึกษาเกี่ยวกับโรคไตที่เกิดจาก Adriamycin เมื่ออายุได้ 8 สัปดาห์ หนูได้รับ Adriamycin (Sigma-Aldrich, 12 มก./กก.) หรือยานพาหนะ (0 0.9 เปอร์เซ็นต์ NaCI) เพียงครั้งเดียวโดยการฉีดเข้าเส้นเลือดที่หาง หนูเมาส์ถูกสุ่มแยกออกเป็นหกกลุ่มการทดลองและ, ซึ่งเริ่มต้นที่ 24 ชั่วโมงหลังการฉีด ADR, บำบัดด้วยกระสายยาอย่างใดอย่างหนึ่งหรือขนาดยาที่ต่างกันทุกวันผ่านทางสายยางทางปากเป็นเวลา 28 วัน ใช้ปริมาณต่อไปนี้: Cpd C (ตัวเอก LXR) 10 มก. / กก.; Cpd A 30 มก./กก.; ซีพีดีจี 100 มก./กก. สัตว์ทั้งหมดถูกสังเวย 28 วันหลังการฉีด ADR หนูเมาส์ Col4a3 KO (Col4a3tmiDec สายพันธุ์ 129X1/SvJ) ถูกซื้อมาจาก Jackson Labs หนูถูกสุ่มแยกออกเป็น 2 กลุ่ม เริ่มที่อายุ 4 สัปดาห์ หนูเมาส์ถูกให้ยาโดยทางปากวันละครั้งด้วยกระสายยาอย่างใดอย่างหนึ่งหรือ Cpd G(100 มก./กก.) เป็นเวลา 4 สัปดาห์ตามด้วยการสังเวยที่อายุ 8 สัปดาห์ การศึกษาครั้งที่สองดำเนินการในหนูทดลอง Col4a3 KO โดยเริ่มการรักษาเมื่ออายุ 6 สัปดาห์ การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อประเมินว่าการรักษา Cpd G ของหนูเมาส์ที่มีภาวะไตวายที่ตรวจพบแล้วอาจชะลอการเกิดโรคไตวายระยะสุดท้าย และทำให้การอยู่รอดนานขึ้นหรือไม่ สำหรับการรักษาด้วยรามิพริล หนู Col4a3 KO เริ่มรับรามิพริลเมื่ออายุได้ 4 สัปดาห์ Ramipril ถูกเติมลงในน้ำดื่มที่ความเข้มข้นที่จะนำไปสู่ขนาด 10 มก./กก./วัน 8

การวิเคราะห์ฟีโนไทป์ของหนู. เก็บตัวอย่างปัสสาวะเฉพาะจุดทุกสัปดาห์ อัลบูมินในปัสสาวะวัดโดย ELISA (ห้องปฏิบัติการ Bethy! Albuminuria แสดงเป็นอัตราส่วนอัลบูมิน / ครีเอตินิน หนูเมาส์ได้รับการดมยาสลบด้วยคีตามีน (90 มก./กก.)/ไซลาซีน(10 มก./กก.) เลือดถูกเก็บในหลอดเฮปาริไนซ์ และจากนั้นสัตว์ต่างๆ ถูกทำให้เป็นปุ๋ยผ่านทางช่องด้านซ้ายด้วยสารละลาย NaCl 0.9 เปอร์เซ็นต์ เยื่อหุ้มสมองของไตถูกตัดออกอย่างระมัดระวังและแยกออกเป็นตัวอย่างที่แช่แข็งแบบสแน็ปช็อต ฝังอยู่ใน OCT หรือแก้ไขในฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับการประเมินในภายหลัง

การหาปริมาณไขมันสะสมในส่วนเปลือกนอกของไต ตัวอย่างเยื่อหุ้มไตที่ฝังตัวของ OCT ถูกแช่แข็งที่ความหนา 4 ไมโครเมตรและย้อมด้วยน้ำมัน สารละลายโอ-ไอโซโพรพานอลสีแดง (Electron Microscopy Science, PA) เจือจาง 6:4 ในน้ำแล้วย้อมทับด้วย Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA) จากนั้นจึงประเมินส่วนต่างๆ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Olympus BX 41, Tokyo, Japan)

การกำหนดปริมาณคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอไรด์. ตัวอย่างเปลือกนอกไตที่แช่แข็งแบบสแน็ปถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์โพแทสเซียมฟอสเฟต 2 มิลลิโมลาร์, pH 7,(1{{10}} บัฟเฟอร์พัล/เนื้อเยื่อมก.) โดยใช้ตัวทำแก้วบนน้ำแข็ง 100 ul ของโฮโมจิเนตถูกผสมอย่างทั่วถึงด้วยเฮกเซน 1 มิลลิลิตร: ไอโซโพรพานอล (3:2;vv) ต่อปริมาตรของเนื้อเยื่อที่เป็นเนื้อเดียวกัน เฟสที่เป็นน้ำ (เม็ด) และอินทรีย์ (ซูเปอร์เน็ต) ถูกแยกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000× g เป็นเวลา 5 นาที เม็ด (เฟสที่เป็นน้ำ) ถูกทำให้แห้งและสร้างใหม่ในยูเรีย 8 โมลาร์, SDS 0.1 เปอร์เซ็นต์, 0.1 โมลาร์ของ NaOH และโปรตีนทั้งหมดถูกหาปริมาณโดยวิธี BCA (เทอร์โมฟิชเชอร์) วัฏภาคอินทรีย์ถูกทำให้แห้งโดยการสัมผัสกับไนโตรเจน จากนั้นสร้างไขมันใหม่ใน 100 ul isopropanol∶NP-40 (9:1;vv) ปริมาณไตรกลีเซอไรด์ถูกตรวจสอบโดยใช้ชุดสีตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Cayman Chemical USA) วิเคราะห์ปริมาณคอเลสเตอรอลและ CE ทั้งหมดโดยใช้ วิธีฟลูออโรเมตริกด้วยเอนไซม์59 สำหรับการวัดโคเลสเตอรอลรวม สารสกัดถูกเจือจาง 1:100 ในบัฟเฟอร์การทดสอบ (โพแทสเซียมฟอสฟอรัส 100 มิลลิโมลาร์ e,50mM NAC,5mM กรดโคลิค,0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-10,pH 7.4)ที่มีโคเลสเตอรอลออกซิเดส(1 U/ml), เอสเทอเรสคอเลสเตอรอล(1 U/ml),peroxidase มะรุม(1 U/ml), และAmplex Red (75 μM) ปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 30 นาทีในแผ่นหลุมทึบแสงสีดำ 96-หลุม (Greiner) และวัดการเรืองแสงในเครื่องอ่านไมโครเพลท (Spectramax i3X, Molecular Devices) ที่การกระตุ้น 530 นาโนเมตรและการปล่อยมลพิษ 580

สำหรับการวัดค่า CE นั้น 150 ul ของบัฟเฟอร์สำหรับการทดสอบที่อธิบายข้างต้น เสริมด้วย catalase ตับวัว(45 U/ml) และโคเลสเตอรอลออกซิเดส (1 U/ml) ถูกเติมลงในตัวอย่าง 25 ul และบ่มข้ามคืนที่ 37 องศาเพื่อให้ปราศจากสารตกค้าง โคเลสเตอรอลเหลือแต่เอสเทอร์ของโคเลสเตอรอล จากนั้นเติมรีเอเจนต์การตรวจหาคอเลสเตอรอลเอสเทอร์ 75 ul (โคเลสเตอรอลออกซิเดส 1 U/มล, เอสเทอเรสคอเลสเตอรอล 4 U/มล, เปอร์ออกซิเดสพืชชนิดหนึ่ง 24 U/มล., 300 ไมโครโมลาร์แอมเพล็กซ์สีแดง） ปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาทีและ วัดสัญญาณเรืองแสงตามที่อธิบายข้างต้นมาตรฐานภายในรวมถึงตัวอย่างที่มีคอเลสเตอรอล 1 mM และคอเลสเตอรอลโอลีเอต 5 uM เพื่อตรวจสอบความสมบูรณ์ของการสลายตัวของเอนไซม์ของคอเลสเตอรอลอิสระตลอดจนความไวและความจำเพาะในการทดสอบ

การประเมินทางเนื้อเยื่อ. คอร์เทกซ์ไตที่ฝังด้วยพาราฟินแบบตรึงฟอร์มาลินที่มีความหนา 4 ไมโครเมตรถูกย้อมด้วยกรด-Schiff(PAS) เป็นระยะ สไลด์นี้ได้รับการวิเคราะห์โดยนักพยาธิวิทยาของไตในการออกแบบตาสองชั้น Glomerular sclerosis, (global and segmental), podocyte hypertrophy และ podocyte hyperplasia แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของ glomeruli ที่พบในความผิดปกติเหล่านี้ ไมโครซิสต์แบบท่อและการอักเสบของคั่นระหว่างหน้าถูกให้คะแนนในระดับ 0-4 โดยที่ 0=0 เปอร์เซ็นต์ ,05=1-10 เปอร์เซ็นต์ ,1=11-25 เปอร์เซ็นต์ ,2:26-50 เปอร์เซ็นต์ ,3:{{ 12}} เปอร์เซ็นต์ และ 4=ความเสียหายมากกว่า 75 เปอร์เซ็นต์ การขยาย mesangial ได้คะแนนตามการวิเคราะห์กึ่งเชิงปริมาณ (มาตราส่วน 0-5) หรือเปอร์เซ็นต์ของโกลเมอรูไลที่แสดงการขยายตัวของ mesangial ( เปอร์เซ็นต์)

กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์. สำหรับการตรวจจับการแสดงออกของ ABC Al คอร์เทกซ์ไต 4 um ของพาราฟินถูกกำจัดพาราฟินและคืนสภาพ แอนติเจนถูกดึงออกมาโดยการต้มเป็นเวลา 30 นาทีในบัฟเฟอร์ซิเตรต pH 60(สารละลายสำหรับการดึงเป้าหมาย, ซิเตรต pH 6, ซิกมา, สหรัฐอเมริกา) ส่วนต่างๆ ถูกซึมผ่านเป็นเวลา 30 นาทีด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 ใน TBS ส่วนของเนื้อเยื่อถูกบ่มด้วยเซรั่มแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ (cat #G9023, Millipore Sigma) และ 1 เปอร์เซ็นต์ BSA (cat# SP-5050-500, Vector, USA) ใน TBS-T เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเพื่อสกัดกั้นที่ไม่เฉพาะเจาะจง ผูกพัน. จากนั้น ตัวอย่างถูกบ่มข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีต้าน ABCAl(Novus,1:200) ของ Rat และ Rabbit anti-WI1 (Abcam,1:200) ในห้องที่มีความชื้น หลังจากล้างอย่างทั่วถึง จากนั้นตัวอย่างถูกบ่มสำหรับ I ชั่วโมงที่ RT ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วยฟลูออโรโครม (Invitrogen,1:500) สื่อสำหรับยึดติด Antifade ที่มี DAPI (Vectashield Plus) ถูกเพิ่มไปยังส่วนต่างๆ ก่อนทำการวิเคราะห์

ภาพได้มาโดยใช้ FluoView FV1000 Confocal Microscope (Olympus) กับเลนส์ใกล้วัตถุ x63 ในระนาบต่างๆ โดยใช้รูปแบบ Z-series ที่มีขนาดขั้นเป็น 0.18 um ในระหว่างการวิเคราะห์ เครื่องบินแต่ละลำถูกแยกส่วนและซ้อนกันเพื่อสร้างภาพที่ฉายสูงสุดโดยใช้ซอฟต์แวร์ flu view เวอร์ชัน 4.3b (Olympus) จับภาพอย่างน้อย 5 ภาพจาก 5 ฟิลด์ที่แตกต่างกันต่อตัวอย่าง การหาปริมาณของความเข้มแสงเฉลี่ยของโกลเมอรูลาร์ของ ABCAl (MFI) ทำได้โดยใช้ซอฟต์แวร์ฟิจิ—ImageJ

สำหรับการตรวจหา OSBPL7,4 um เยื่อหุ้มไตแช่แข็งที่ฝังอยู่ใน OCT ได้รับการแก้ไขด้วย PFA-sucrose (2 เปอร์เซ็นต์, 4 เปอร์เซ็นต์) ใน PBS เป็นเวลา 20 นาทีที่ RT และซึมผ่านด้วย Triton-PBS 0.3 เปอร์เซ็นต์สำหรับ 15 นาทีและถูกบล็อกด้วยบัฟเฟอร์การบล็อก (5 เปอร์เซ็นต์ FBS ใน PBS) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงทำการบ่มเนื้อเยื่อส่วนต่างๆ ด้วยแอนติ-OSBPL7 ของกระต่าย (Sigma, 1:50) และแอนติ-ซินแนปโตโพดินของแพะ (Santa Cruz,1:800) ในห้องที่มีความชื้นในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา หลังจากล้างอย่างทั่วถึง จากนั้นตัวอย่างถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วยฟลูออโรโครม และเคลือบด้วยสื่อสำหรับยึดตามที่บรรยายไว้ข้างต้น รูปภาพถูกถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ Leica DMI 6000B

การวิเคราะห์ทางสถิติ. GraphPad Prism เวอร์ชัน 6 หรือ 7 ใช้เพื่อวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมด เปรียบเทียบกลุ่มโดยใช้ t-test แบบสองทางหรือแบบทางเดียวตามด้วยการทดสอบของ Dunnett หรือ Tukey F, Brown-Forsythe หรือการทดสอบของ Bartlett ใช้เพื่อกำหนดความแปรปรวนที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม ถ้า P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

สัตว์ทั้งหมดได้รับการสุ่มให้อยู่ในกลุ่มบำบัด