CD73 การแสดงออกมากเกินไปใน Podocytes: เครื่องหมายใหม่ของการบาดเจ็บ Podocyte ในโรคไตของมนุษย์
Feb 26, 2022
นามธรรม:เส้นทาง CD73 เป็นกลไกต้านการอักเสบที่สําคัญในการตั้งค่าโรคต่างๆ การสังเกตในแบบจําลองเมาส์แนะนําว่า CD73 อาจมีบทบาทในการป้องกันในความเสียหายของไต; อย่างไรก็ตาม ไม่มีหลักฐานโดยตรงเกี่ยวกับบทบาทในมนุษย์โรคไตได้รับการอธิบายจนถึงปัจจุบัน ที่นี่เราตั้งสมมติฐานว่าการบาดเจ็บของโพโพไซต์ในมนุษย์โรคไตเปลี่ยนแปลงนิพจน์ CD73 ที่อาจอํานวยความสะดวกในการวินิจฉัยโรคโพโพไซโตพาธี เราประเมินการแสดงออกของ CD73 และหนึ่งในเป้าหมายที่สําคัญในการทํางานคือตัวรับ chemokine C-C ประเภท 2 (CCR2) ในโพโดไซต์จากไตการตรวจชิ้นเนื้อของผู้ป่วย 39 รายที่มี podocytopathy (รวมถึง glomerulosclerosis โฟกัสเซ็กเมนต์ (FSGS), โรคการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด (MCD), glomerulonephritis เยื่อหุ้มสมองอักเสบ (MGN) และ amyloidosis) และกลุ่มควบคุม การแสดงออกของ Podocyte CD73 ในแต่ละกลุ่มโรคเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (p< 0.001–p="">< 0.0001).="" moreover,="" there="" was="" a="" marked="" negative="" correlation="" between="" cd73="" and="" ccr2="" expression,="" as="" confirmed="" by="" immunohistochemistry="" and="" immunofluores-="" cence="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," respectively),="" thus="" suggesting="" a="" protective="" role="" of="" cd73="">อาการบาดเจ็บที่ไต.ในที่สุดเราระบุว่า CD73 เป็นเครื่องหมายการวินิจฉัยที่มีศักยภาพใหม่ของ podocytopathies ของมนุษย์โดยเฉพาะอย่างยิ่งของ MCD ที่ขึ้นชื่อในเรื่องการขาดคุณสมบัติทางพยาธิวิทยาที่เป็นที่รู้จักโดยกล้องจุลทรรศน์แสงและอิมมูโนฮิสโตเคมี
คำ:โพโพไซต์; โรคการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด ซีดี73; ซีซีอาร์2;การบาดเจ็บที่ไต;ภาวะไตวาย
แนะ นำ
บทบาทสําคัญทางวิวัฒนาการของ adenosine triphosphate (ATP) ในฐานะแหล่งพลังงานภายในเซลล์ที่แพร่หลายได้รับการปรับปรุงมานานกว่าสามทศวรรษที่ผ่านมาด้วยแนวคิดปฏิวัติว่าสมาชิกของระบบพิวรีน (ATP, adenosine di- และ triphosphate (ADP และ AMP ตามลําดับ) อาจส่งสัญญาณนอกเซลล์เพื่อไกล่เกลี่ยปฏิสัมพันธ์ของเซลล์ [ 1 , 2 ] แนวคิดนี้นําไปสู่ความเข้าใจว่าระบบพิวรีนร์จิกมีส่วนร่วมในการสร้างการตอบสนองของภูมิคุ้มกันผ่านการปรับโปรไฟล์การแสดงออกของตัวรับการหลั่งไซโตไคน์การผลิตสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทําปฏิกิริยา (ROS) และการย่อยเชื้อโรคภายในเซลล์ [3–7] ATP นอกเซลล์ผ่านการแปลง/dephosphorylation เป็น ADP และ AMP ผ่าน CD39 (ecto-nucleosidtriphosphate diphosphohydrolase 1) และสุดท้าย AMP จะถูกย่อยสลายเป็นอะดีโนซีนโดย CD73 (ecto-5 0 nucleotidase) [ 8 ] CD73 อาจมีอยู่ในรูปแบบที่ผูกกับเมมเบรนหรือละลายน้ําได้ รูปแบบเมมเบรนมีโครงสร้างที่หรี่ลงซึ่งประกอบด้วยหน่วยย่อย 70 kD ที่เหมือนกันสองหน่วยซึ่งจับกับเมมเบรนพลาสมาผ่านการเชื่อมโยงระหว่างซีรีน C-terminal และ glycosylphosphatidyl inositol (GPI) [ 9 ] น่าสังเกต, CD39 พื้นผิว ATP และ ADP ดูเหมือนจะเป็นตัวยับยั้งการแข่งขันของ CD73 [ 9 – 11 ] การแสดงออกของ CD73 แสดงถึงเส้นทางที่สําคัญของการปรับระดับอะดีโนซีนในพื้นที่นอกเซลล์ CD73 ไม่ใช่โมเลกุลเฉพาะของเซลล์หรืออวัยวะ การแสดงออกของมันในเม็ดเลือดขาว, endothelium, เซลล์เยื่อบุผิวหรือ mesenchymal ของอวัยวะต่าง ๆ (ไตปอด ตับ ลําไส้ใหญ่ สมองและหัวใจ) และสเต็มเซลล์ได้รับการบันทึกไว้อย่างดี [ 12 – 14 ] บทบาทการป้องกันของอะดีโนซีนผ่านทางไนตริกออกไซด์ (NO) - ทางเดินการสังเคราะห์ในการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดเลือดในตับถูกรายงานครั้งแรกโดย Peralta et al. [ 15 ] สอดคล้องกับข้อมูลเหล่านี้การกระทําของมันได้รับการแสดงเพื่อ ameliorate ความเสียหายของปอดเฉียบพลันการปฏิเสธทางเดินหายใจ allograft โรคการปลูกถ่ายอวัยวะเฉียบพลันกับโฮสต์และการติดเชื้อ [4,16–19]
CISTANCHE จะช่วยปรับปรุงไต/ไตวาย
ดังที่แสดงให้เห็นอย่างน่าเชื่อถือในเมาส์หลายรุ่น CD73 อาจมีส่วนร่วมในปฏิสัมพันธ์ระหว่าง tubulo กับไตในไต. CD73-mediated รุ่นของ adenosine ที่ได้มาจาก CD73 จาก ATP ของแหล่งกําเนิดท่อในระหว่างความเสียหายขาดเลือด reperfusion ได้รับการแสดงเพื่อลดการอักเสบผ่านการยับยั้งการทํางานของ effector ของนิวโทรฟิล [ 20 ] นอกจากนี้หนูที่ขาด CD73 ยังแสดงการอักเสบภูมิต้านทานผิดปกติที่มาพร้อมกับจํานวนโพโพไซต์และ fenestrations บุผนังหลอดเลือดที่ลดลง [ 21 ] ปรากฏการณ์นี้มีความสัมพันธ์กับระดับซีรั่มที่เพิ่มขึ้นของไซโตไคน์โปรอักเสบเช่นปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอก (TNF) -alpha หรือ chemokine C-X-C motif ligand 2 (CXCL-2) ในการตั้งค่าของมนุษย์โรคไตมีการตั้งสมมติฐานว่าความเสียหายของ podocyte น่าจะเป็นส่วนผสมของกลไกการปรับตัวและการทําลายล้างของการตอบสนองของเซลล์ต่อสิ่งเร้าทางพยาธิวิทยาไม่จําเป็นต้องสะท้อนถึงการสังเกตที่ตีพิมพ์จากแบบจําลองในหลอดทดลองหรือสัตว์ สาเหตุของการบาดเจ็บ podocyte แตกต่างกันไปจากความเครียดเชิงกล (การกรองไต) ความเครียดออกซิเดชัน (เช่นในความดันโลหิตสูงหรือโรคไตโรคเบาหวานการบาดเจ็บที่เป็นพิษการแทรกซึมของเซลล์อักเสบหรือแบบจําลองสัตว์ของโรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด) ไปจนถึงความเครียดทางภูมิคุ้มกันวิทยา (เช่นภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนและเสริมความเสียหายที่เป็นสื่อกลางในช่วงภาวะไตอักเสบ) [ 22 ] การตั้งค่าการอักเสบของ glomerulonephritis สามารถกระตุ้น podocytes เพื่อสังเคราะห์ไซโตไคน์ต่างๆ, อาจผ่านทาง CC chemokine รับ 2 (CCR2) การส่งสัญญาณไกล่เกลี่ย. ถึงกระนั้นยังไม่ค่อยมีใครรู้จักในบทบาทของ CD73 ในมนุษย์โรคไตโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการตั้งค่าของการอักเสบเรื้อรังและการบาดเจ็บ podocyte
ในการศึกษาปัจจุบันเราตั้งสมมติฐานว่า CD73 มีบทบาทในการเกิดโรคของโรคไตของมนุษย์และวิเคราะห์การแสดงออกของ podocyte CD73 ในมนุษย์ไตการตรวจชิ้นเนื้อจากผู้ป่วยที่มีโรคที่เกี่ยวข้องกับ podocytopathy เราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของพื้นผิว podocyte ของCD73 เป็นเครื่องหมายที่เชื่อถือได้ของpodocytedamage ดังนั้นอนุภาคจึงสนับสนุนค่าการวินิจฉัยของ CD73 ในโรคการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด (MCD) นอกจากนี้เรายังรายงานความสัมพันธ์เชิงลบระหว่างการแสดงออกของ podocyte CCR2 และ CD73 ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกมากเกินไปของ CD73 แสดงถึงการตอบสนองแบบปรับตัวต่อรอยโรคของไต
ผลลัพธ์
ข้อมูลทางคลินิกและการถ่ายภาพโครงสร้างพิเศษของความเสียหายของ Podocyteตารางที่ 1 สรุปการนําเสนอทางคลินิกของกรณีที่รวมอยู่ในการศึกษาเกี่ยวกับอายุเพศ creatinine และค่าโปรตีนทั้งหมด ผู้ป่วย FSGS ทั้งหมดมีแบบฟอร์ม NOS หลัก (ไม่ได้ระบุไว้เป็นอย่างอื่น) ในบรรดาผู้ป่วย MGN 12 ราย 5 รายเป็นตัวรับฟอสโฟไลเปส A2 (PLA2R) เป็นบวก (42%) ในกลุ่ม amyloidosis ผู้ป่วย 2 รายมี AA-amyloidosis (16.7%) และ 10 AL-amyloidosis (83.3%); ในผู้ป่วย 2 รายที่มีสายโซ่แสง AL-amyloidosis เห็นได้ชัด (20%) และ 8 รายเป็นบวกสําหรับแลมบ์ดา (80% ของกลุ่ม AL-amyloidosis) ในผู้ป่วยทุกรายที่มี MCD, FSGS, MGN และ amyloidosis ความเสียหายของโพโพไซต์ถูกตรวจพบอย่างชัดเจนโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (รูปที่ 1)
รูปที่ 1 ภาพโครงสร้างพิเศษของความเสียหาย podocyte หลักและรอง ( ก ) การแพร่กระจายของร่างกาย podocyte บนเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต (ลูกศร) ด้วยการหดกลับของกระบวนการเท้าในกรณีของ MCD ( b ) กระบวนการเท้า podocyte ที่กว้างขวาง effacement (ลูกศร) และ cytoplasmic vacuolization (ดาว) ในผู้ป่วยที่มี FSGS หลัก ( c ) effacement กระบวนการเท้า (ลูกศร), vacuolization และ organelles ที่โดดเด่น (ลูกศรคู่) กับวัสดุที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่น epimembranous พื้นฐาน (ดาวฤกษ์) ในเยื่อหุ้มสมองอักเสบเยื่อหุ้มสมองปฐมภูมิ ( d ) การสะสม subepithelial ของ amyloid-fibrils (ลูกศรสองหัว) ที่มีการปลดโพโดไซต์ติดต่อกัน (เป็นสัญญาณของความเสียหายของโพโพไซต์กลับไม่ได้) ในผู้ป่วยที่มี AL-amyloidosis (แลมบ์ดา) ไมโครกราฟอิเล็กตรอนทั้งหมดจะถูกนําเสนอที่กําลังขยาย 4000 × เม็ดมีด—โฟโตมิคกราฟด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบแสงที่สอดคล้องกัน (40 × /0.65 NA; ขนาดแถบสเกล: 50 μm in (a,c,d) และ 100 μm นิ้ว (b); PAS-ย้อมสี)
การแสดงออกของพื้นผิวของ CD73 เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของ Podocyte ในโรคไตของมนุษย์
เพื่อสํารวจว่าโพโดไซต์แสดง CD73 ในสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาและเพื่อประเมิน thepatternofCD73indifferentdiseasesettingsrelatedtopodocytedamage,weperformedim- การวิเคราะห์ทางเคมีของการแสดงออกของ CD73 การวิเคราะห์โครงสร้างพิเศษยืนยันความเสียหายของ podocyte ว่าเป็นความผิดปกติของโครงกระดูกด้วยอย่างน้อยที่สุด (รูปที่ 1) ในกลุ่มควบคุมเชิงลบของเราที่ไม่มีรอยโรค podocyte ไม่สามารถตรวจพบการแสดงออกของ podocyte อย่างมีนัยสําคัญของ CD73 ได้แม้จะมีแง่บวกของการควบคุมภายใน (เส้นเลือดฝอย peritubular) ที่มักจะคราบเป็นบวก (รูปที่ 2) ในทางกลับกันกลุ่มความเสียหายของโพโพไซต์ (MCD, FSGS, MGN และ amyloidosis) แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของ podocyte CD73 อย่างมีนัยสําคัญทางสถิติ (p< 0.0001);="" the="" significant="" increase="" was="" consistent="" also="" when="" comparing="" single="" entities="" with="" negative="" controls="" (p="" at="" least="">< 0.001).="" interestingly,="" the="" extent="" of="" cd73="" upregulation="" tended="" to="" be="" lower="" in="" the="" mcd="" group,="" albeit="" significantly="" lower="" only="" in="" comparison="" with="" mgn="" samples="" (p="0.0043)" (figure="" 2).="" in="" podocyte="" damage="" groups,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" semiquantitative="" cd73="" score="" and="" proteinuria="" on="" binary="" (nephrotic/non-nephrotic)="" or="" quantitative="" (g/24="" h)="" level="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0.6302" and="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," respectively;="" figure="" 3a).="" overall,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" cd73="" score="" and="" creatinine="" level="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figure="" 3b).="" additionally,="" we="" could="" not="" detectsignificant="" correlation="" between="" cd73="" expression="" and="" hypertension="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" or="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="">
การเพิ่มกฎระเบียบของ CD73 ที่ได้จาก Podocyte ในโรคไตของมนุษย์มีความสัมพันธ์เชิงลบกับการแสดงออกของตัวรับ CCR2 และไม่สัมพันธ์กับการแสดงออกของเนฟรินและโพโดซินชื่นชมข้อมูลที่เผยแพร่เกี่ยวกับการลดลงของการลดลงของการแสดงออกของ macrophage CCR2 หลังจาก CD73 overexpression ในแบบจําลองเซลล์ต้นกําเนิดเราตั้งสมมติฐานว่าการเพิ่มขึ้นของ CD73 ระหว่างการบาดเจ็บ podocyte ผกผันมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ CCR2 โปรอักเสบและทําการวิเคราะห์ CCR2 ภูมิคุ้มกันวิทยา ในกลุ่มควบคุมไม่สามารถตรวจพบการแสดงออกเล็กน้อยของ CCR2 หรือเฉพาะเท่านั้นโดยไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเปรียบเทียบกับลายเซ็น CD73 ในตัวอย่างเดียวกัน ในทางตรงกันข้ามการเพิ่มขึ้นของพื้นผิว CCR2 อย่างมีนัยสําคัญส่วนใหญ่ (แต่มีความเข้มต่าง ๆ ) สามารถเห็นได้ในตัวอย่างส่วนใหญ่จากการตรวจชิ้นเนื้อความเสียหายของ podocyte และโดยทั่วไปจะถูกควบคุมเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p = 0.0206; p รูปเสริม S1) กลุ่มโรคไม่ได้แตกต่างกันอย่างมีนัยสําคัญในเรื่องนี้
เราวิเคราะห์เพิ่มเติมถึงความสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ระหว่างความเข้มของการแสดงออกของ CD73 และ CCR2 อันที่จริงการเปรียบเทียบคะแนน CD73 และ CCR2 จากกลุ่มการตรวจชิ้นเนื้อที่ได้รับบาดเจ็บจาก podocyte สามารถสังเกตความสัมพันธ์เชิงลบที่ทําเครื่องหมายไว้ได้ (Spearman r = − 0.4821, p = 0.0052), (รูปที่ 4) โปรดทราบว่า glomeruli ที่มี podocytes CD73 บวกมีแนวโน้มที่จะแสดงการแสดงออกของ CCR2 ที่ลดลงไม่เพียง แต่ใน podocytes เท่านั้น แต่ยังอยู่ในเซลล์โดยรอบเช่นเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม (รูปที่ 4) ความสัมพันธ์ผกผันได้รับการยืนยันโดยการประเมินการย้อมสีร่วมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สําหรับ CD73/CCR2 ในโพโดไซต์ที่เสียหายโดยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (Spearman r = − 0.4478, p = 0.0282), (รูปที่ 5) เพื่อจัดการกับความสัมพันธ์ในที่สุดระหว่าง CD73 positivity และ (การสูญเสีย) การแสดงออกของโปรตีนเฉพาะ podocyte เราได้ทําการย้อมสีอิมมูโนฟลูโอเพิ่มเติมสําหรับเนฟรินและโพโดซินและประเมินรูปแบบการแสดงออกของพวกเขาในการควบคุมกลุ่ม MCD และ FSGS (รูปที่ 6a) รวมถึงการย้อมสีร่วมกับ CD73 ในตัวอย่างที่มีแผลโพโพไซต์ (รูปที่ 6b–e) เราไม่สามารถตรวจพบความสัมพันธ์ที่สําคัญระหว่างความเข้มของการเรืองแสงเฉลี่ยของการแสดงออกของโพโดซินหรือเนฟรินที่ด้านหนึ่งและการแสดงออกเฉลี่ยของ CD73 ในอีกด้านหนึ่ง (n = 39, Spearman r = 0.212, p = 0.1948 สําหรับ podocin และ n = 60, Spearman r = 0.01906, p = 0.8851 สําหรับเนฟริน)
การอภิปราย
เราอธิบายที่นี่เป็นครั้งแรกในการแสดงออกของ CD73 บนพื้นผิวของ podocytes ที่ได้รับบาดเจ็บในมนุษย์โรคไต. วิเคราะห์เกี่ยวกับไตการตรวจชิ้นเนื้อจากผู้ป่วยที่มีความเสียหาย podocyte ที่โดดเด่นเช่นใน MCD, FSGS, MGN และ amyloidosis เรารายงานการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ podocyte CD73 อย่างมีนัยสําคัญในแต่ละกลุ่มเหล่านี้เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมไตเป็นอิสระจากสาเหตุของความเสียหาย podocyte นอกจากนี้เรายังรายงานความสัมพันธ์ผกผันระหว่างการแสดงออกของ CD73 และ CCR2 โดยโพโดไซต์ของกลุ่มความเสียหายโพโพไซต์ CCR2 เฉพาะ podocyte ที่เพิ่มขึ้นได้รับการแสดงเพื่อไกล่เกลี่ยโรคเบาหวานการบาดเจ็บที่ไตในหนู [ 23 ] นอกจากนี้ยังมีรายงานว่าการปิดล้อมของ CCR2 ในแบบจําลอง murine ที่เกิดจาก Adriamycin ของ FSGS เพื่อลดโปรตีนและการบาดเจ็บของไต [ 24 ] การศึกษาล่าสุดจาก Lee et al. - ยังใช้แบบจําลองเมาส์ - บ่งชี้ว่าการสูญเสีย CCR2 อาจ ameliorate albuminuria ที่เกิดจากโรคอ้วนผ่านการปิดกั้นความเครียดออกซิเดชันและการสะสมของไขมัน [ 25 ] อันที่จริงในระบบในหลอดทดลองที่ใช้เซลล์ต้นกําเนิด mesenchymal (MSC) จากเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มหัวใจ murine ได้แสดงให้เห็นว่า MSC ที่แสดงออกมากเกินไปของ CD73 กําหนดกระบวนการซ่อมแซมผ่านกิจกรรมต้านการอักเสบรวมถึงปัจจัยอื่น ๆ เนื่องจากการยับยั้งการแทรกซึมของแมคโครฟาจที่เป็นบวกCCR2 [ 13 ] ดังนั้นในแง่ของผลลัพธ์และข้อมูลที่เผยแพร่ของเราจึงเป็นที่ดึงดูดใจที่จะตั้งสมมติฐานว่าการแสดงออกของ CD73 โดย podocytes อาจทําหน้าที่ป้องกันในอาการบาดเจ็บที่ไตซึ่งอาจผ่านทางเดินที่ลดทอน CCR2 การส่งสัญญาณ CCR2 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการยึดเกาะและการเปิดใช้งานแมคโครฟาจ [ 26 , 27 ] ในฐานะที่เป็นแมคโครฟาจอาจมีอิทธิพลต่อการเกิดโรคของ podocytopathy ที่เกี่ยวข้องกับโรคไต(เช่น MGN หลักที่การแทรกซึมของ CD68 + , CCR2 + แมคโครฟาจได้รับการยอมรับว่าเป็นตัวบ่งชี้ที่สําคัญของระยะสุดท้ายภาวะไตวาย[ 28 ]), การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างเนื้อหา monocyte /macrophage, ต้นกําเนิด (การแทรกซึมเทียบกับถิ่นที่อยู่), โปรไฟล์การเปิดใช้งาน (M1—proinflammatory vs. M2—เปิดใช้งานหรืออื่น) และการแสดงออก CD73 ในมนุษย์โรคไตมีความจําเป็นต้องตรวจสอบตามผลลัพธ์ของเราด้วยข้อมูลก่อนหน้านี้จากแบบจําลอง murine
ใน micromilieu อักเสบที่สามารถเห็นได้ในการขาดออกซิเจน, ขาดเลือด reperfusion หรือเนื้อเยื่อภูมิต้านทานผิดปกติทําลายหลายเซลล์ปล่อยสมาชิกของระบบส่งสัญญาณพิวรีน, ส่วนใหญ่อยู่ในรูปแบบของการอักเสบโปร ATP หรือ ADP [ 29 , 30 ] ในการตั้งค่าเหล่านี้ ecto-nucleotidaseCD73anditsproductadenosineareimportantfactorsinimmune การตอบสนองกฎระเบียบและการปิดเสียง ในแบบจําลองสัตว์ CD73 ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีการป้องกันในไตการบาดเจ็บจากการขาดเลือด reperfusion และการขาดของมันทําให้เกิดความผิดปกติของ podocyte, นําไปสู่การอักเสบแพ้ภูมิตัวเองและโรคไต[ 21 , 31 ]. การทดลองอื่น ๆ ของเมาส์ในร่างกายโดยใช้การบาดเจ็บจากการขาดเลือดได้เปิดเผยอิทธิพลต้านการอักเสบที่สําคัญของ CD73 ที่แสดงโดยเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงและการกระทําที่สําคัญในไตการป้องกันระหว่างโรคไตโรคเบาหวานผ่านทาง adenosine–endothelial Adora2b รับสัญญาณ [20,32] Podocytopathies เป็นกลุ่มที่พบบ่อยที่สุดของแผลในไตที่นําไปสู่โปรตีน- uria MCD ซึ่งเป็นต้นแบบ podocytopathy 'ปฐมภูมิ' เป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของโปรตีนไตในเด็กอายุ > 1 ปี [ 33 , 34 ] สมมติฐานปัจจุบันเกี่ยวกับการเกิดโรคของ MCD ชี้ให้เห็นถึงบทบาทสําคัญของไซโตไคน์และผู้ไกล่เกลี่ยภูมิคุ้มกันอื่น ๆ ในการหยุดชะงักของความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดิน podocyte-glomerular [ 35 - 38 ] ความแตกต่างระหว่างการไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มองเห็นได้ในกล้องจุลทรรศน์แสงและโปรตีนที่รุนแรงเป็นจุดเด่นของ MCD หลักฐานโครงสร้างพิเศษของความเสียหาย podocyte โดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจึงเป็น conditio sine qua non สําหรับการวินิจฉัยของ MCD จนถึงปัจจุบัน. อัลกอริทึมการวินิจฉัยนี้เน้นถึงความสําคัญของเครื่องมือวินิจฉัยบรรทัดแรกเพิ่มเติมในเรื่องนี้ การตรวจสอบการแสดงออกของ CD73 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการตั้งค่าความพร้อมใช้งานที่ จํากัด ของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจึงอาจช่วยแยกความแตกต่างระหว่างแหล่งที่มาของไต (เช่น podocytopathic) และ extraglomerular (เช่นท่อหรือ paraproteinemic) แหล่งที่มาของโปรตีน การเปรียบเทียบระหว่างอิมมูโนวิทยาและอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ในการศึกษาของเราจะพูดถึงเรื่องหลัง
CISTANCHE จะช่วยปรับปรุงโรคไต/ไต
สิ่งพิมพ์หลายฉบับได้บันทึกการกระจายตัวของ aberrant และการสูญเสียโปรตีนเฉพาะ podocyte อย่างน่าเชื่อถือในหลาย ๆโรคไตการตั้งค่าที่มีการบาดเจ็บของ podocyte และ proteinuria ตามที่ตรวจสอบเมื่อเร็ว ๆ นี้ [ 39 ] ในการศึกษาของเราภายในกลุ่มความเสียหาย podocyte เราไม่สามารถตรวจพบความสัมพันธ์ที่สําคัญระหว่างความรุนแรงของการเรืองแสง podocin / nephrin และความเข้มของการแสดงออกของ CD73 อย่างไรก็ตาม ข้อจํากัดเฉพาะขัดขวางการตีความพยาธิสรีรวิทยาของข้อมูลสถิติ podocin/nephrin เทียบกับ CD73 ประการแรกสําหรับการประเมินความเข้มของการเรืองแสงเราเลือก podocytes โดยใช้การขยายทางเทคนิคและความจุความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล แม้ว่าเงื่อนไขเหล่านี้ช่วยให้สามารถตรวจจับร่างกายของ podocyte ได้อย่างง่ายดาย แต่กระบวนการที่สําคัญและโดยเฉพาะอย่างยิ่งกระบวนการเท้ายังคงไม่ชัดเจนดังนั้นจึงอาจไม่ได้ทําเครื่องหมาย / วิเคราะห์ ประการที่สองความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ CD73 และโปรตีนเฉพาะ podocyte ใน glomeruli ทั้งหมดไม่สามารถพิสูจน์ได้: แม้ว่าการประเมิน podocin และ nephrin ในระดับนี้จะถูกต้องตามกฎหมาย (เนื่องจากมีเหตุอันควรที่จะสมมติว่าไม่มีเซลล์ไตอื่น ๆ ที่แสดงโปรตีนเหล่านี้) ซึ่งไม่สามารถอ้างสิทธิ์สําหรับ CD73 ซึ่งแสดงบางส่วนอย่างน้อยโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือด ประการที่สามการประเมินความเข้มของการเรืองแสงเฉลี่ยเพียงอย่างเดียวในฐานะเครื่องหมายอิสระของการบาดเจ็บของโพโพไซต์เป็นที่น่าสงสัยเนื่องจากไม่ครอบคลุมรูปแบบการกระจายทางพยาธิวิทยาและละเอียดของ podocin และ nephrin ภายใน glomerulus ซึ่งเราสามารถสังเกตได้อย่างชัดเจนในรูปที่ 6 ดังนั้นเราจึงลังเลที่จะระบุว่าไม่มีความสัมพันธ์ของ CD73-podocin และ CD73-nephrin ในการวิเคราะห์ของเรากับเส้นทางโมเลกุลที่แตกต่างกันของเครื่องหมายเหล่านี้ จําเป็นต้องมีการศึกษาโพโพไซต์เพิ่มเติมในหลอดทดลองและในสัตว์เพื่อสํารวจการรบกวนในที่สุดระหว่างน้ําตกที่ส่งสัญญาณเหล่านี้
เมื่อนํามารวมกันโดยตระหนักถึงขนาดตัวอย่างที่เล็กเป็นข้อ จํากัด หลักของการศึกษาของเราเราแสดงให้เห็นถึงการแสดงออกมากเกินไปของ CD73 ที่ไม่สอดคล้องกันโดย podocytes ที่ได้รับบาดเจ็บและแนะนําCD73 เป็นเครื่องหมายการวินิจฉัยใหม่ของ podocytopathy ในโรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุดผลลัพธ์ของเราอาจช่วยในการระบุ podocytes ที่เสียหายและส่งผลให้กระบวนการวินิจฉัยใช้เวลาและค่าใช้จ่ายน้อยลง นอกจากนี้ผลลัพธ์ของเรายังสอดคล้องกับข้อมูลที่เผยแพร่จากวิธีการทดลอง murine และแนะนําปฏิสัมพันธ์เชิงป้องกันระหว่าง CD73 และ CCR2 ในมนุษย์โรคไต. จําเป็นต้องมีการศึกษาแบบหลายศูนย์เพิ่มเติมที่มีกลุ่มผู้ป่วยที่ใหญ่ขึ้นเพื่อจัดการกับกลไกของการส่งสัญญาณ CD73 ในมนุษย์ไตโรคและคุณค่าการพยากรณ์โรค ในทํานองเดียวกันจําเป็นต้องมีจํานวนกลุ่มประชากรที่มากขึ้นเพื่อสร้างความสัมพันธ์ที่อาจเกิดขึ้นระหว่างความรุนแรงของโรคและการแสดงออกของ CD73
วัสดุและวิธีการ
กลุ่มการศึกษาการตรวจชิ้นเนื้อทั้งหมด 49 ชิ้นที่รวมอยู่ในการศึกษานี้จากผู้ป่วย 49 รายได้รับการวินิจฉัยระหว่างวันที่ 1 มกราคม 2018 ถึง 31 ธันวาคม 2019 ที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัย Mannheim มหาวิทยาลัยไฮเดลเบิร์ก เกณฑ์การคัดเลือกเพิ่มเติมคือการตรวจชิ้นเนื้อที่เป็นตัวแทนที่มีความเป็นไปได้ที่จะทําการวินิจฉัยสามครั้งด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีและ EM ข้อมูลทางคลินิกที่เพียงพอการวินิจฉัยที่ชัดเจนและวัสดุที่เพียงพอสําหรับการศึกษานี้ ผู้ป่วยทุกรายเป็นผู้ใหญ่และคนผิวขาว การสืบสวนได้รวบรวมการตรวจชิ้นเนื้อ 39 ชิ้นจากผู้ป่วยที่มีอาการบาดเจ็บ podocyte ของสาเหตุที่แตกต่างกัน (การตรวจชิ้นเนื้อ 7 ชิ้นจากผู้ป่วยที่มีภาวะเกล็ดเลือดในสมองส่วนโฟกัสหลัก—FSGS; 8 จากโรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด—MCD; 12 จากผู้ป่วยที่มีภาวะเยื่อบุโพรงมดลูกอักเสบเยื่อหุ้มสมองอักเสบเยื่อหุ้มสมองอักเสบ—MGN; 12 จากผู้ป่วยที่มีภาวะอะไมลอยด์ซิส) การควบคุมเชิงลบคือไตการตรวจชิ้นเนื้อจากผู้ป่วย 10 รายที่ไม่มีแผล podocyte และไม่มีโปรตีน (ผู้ป่วย 6 รายที่เป็นโรคไตอักเสบเล็กน้อยผู้ป่วย 2 รายที่เป็นโรคไตอักเสบคั่นระหว่างหน้าและผู้ป่วย 2 รายที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา) การตรวจชิ้นเนื้อทั้งหมดที่กล่าวมาข้างต้นรวมอยู่ในการวิเคราะห์การแสดงออกของ podocyte CD73 สําหรับ CCR2 หลังจากยกเว้นส่วนพาราฟินที่มีจํานวน glomeruli ที่ไม่ใช่ sclerotic ไม่เพียงพอ (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
นรีเวชวิทยา, อิมมูโนฮิสโตเคมี, อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนส่วนอนุกรม 1 μ m ได้ทําบนพาราฟินฝังไตการตรวจชิ้นเนื้อและย้อมด้วยฮีมาทอกซีลิน/eosin (H/E), กรดธาตุ-ชิฟฟ์ (PAS), การย้อมสีไตรโครมของ Masson รวมถึงอิมมูโนฮิสโตเคมีตามปกติมาตรฐานเพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัย อิมมูโนฮิสโต- การย้อมสีทางเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของพาราฟินแบบฟอร์มาลินคงที่สําหรับการตรวจชิ้นเนื้อแบบฝังอยู่สําหรับดําเนินการด้วยตนเองโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้านมนุษย์ CD73 (โคลน D7F9A, การส่งสัญญาณเซลล์, แฟรงก์เฟิร์ต, เยอรมนี) และโมโนโคลนอลโมโนโคลนอลแอนติบอดี CCR2 ต่อต้านมนุษย์ (โคลน 7A7; 7A7) Abcam, Cambridge, UK), กระต่ายโพลีโคลนอลต่อต้านแอนติบอดีต่อมนุษย์ต่อเนฟริน (Abcam, Cambridge, UK) และแอนติบอดี podocin ต่อต้านมนุษย์ของกระต่าย (Sigma, Saint Louis, MO, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การตรวจชิ้นเนื้อทั้งหมดรวมอยู่ในการวิเคราะห์การแสดงออกของ podocyte CD73 โดยอิมมูโนฮิสโตเคมี สําหรับ CCR2 ส่วนพาราฟินที่มีจํานวน glomeruli ที่ไม่ใช่ sclerotic ไม่เพียงพอ (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE จะปรับปรุงการไหลเวียนของไต/ไต
กล้องจุลทรรศน์แสงและการวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาการได้มาซึ่งภาพและการวิเคราะห์ทําได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์สแกน PreciPoint M8 กับ Olympus PlanCN 40 ×วัตถุประสงค์ /0.65 และซอฟต์แวร์ MicroPoint (v.5 พฤษภาคม 2016; 1.5 พฤษภาคม 2016) PreciPoint, ไฟรซิง, เยอรมนี). การประเมินกึ่งเชิงปริมาณของการแสดงออกของพื้นผิว podocyte CD73 ในการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีได้รับการประเมินโดยใช้มาตราส่วนการให้คะแนน 0-3 (0—ไม่มีการแสดงออก; 1—การบวกเซ็กเมนต์โฟกัส (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">โพโพไซต์ 50% เป็นบวกใน<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50% โกลเมรูลี) CD73 โพโพไซต์เชิงบวกและเชิงลบได้รับการวิเคราะห์สําหรับการแสดงออกร่วมกันของ CCR2 โดยใช้ระบบการให้คะแนนแบบ semiquantitative ตามความเข้ม (0—ไม่มีการแสดงออก, 1—การแสดงออกที่อ่อนแอ, 2—การแสดงออกในระดับปานกลางและ 3—การแสดงออกที่แข็งแกร่ง ตามการควบคุมเชิงบวก CCR2 ภายในการตรวจชิ้นเนื้อ—เอนโดเธเลียมและการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน) การประเมินดําเนินการอย่างอิสระโดยนักพยาธิวิทยาสองคน (SP และ ZP) ในลักษณะที่ตาบอด
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลรูปภาพของ CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) และนิวเคลียส (DAPI) ของโพโดไซต์ได้มาตามลําดับด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบใช้มอเตอร์ Olympus FV1000 ที่ติดตั้ง HeNe 594 นาโนเมตร อาร์กอน 488 นาโนเมตร และไดโอด UV 405 นาโนเมตรและหลอดโฟโตมัลทิพลิเออร์ (PMT) ที่ควบคุมโดยซอฟต์แวร์ FluoView โดยใช้วัตถุประสงค์ 60 × /1.35 UPlanSApo ภาพ 12 บิตที่มีเฟรม 512 × 512 พิกเซลและขนาดพิกเซล 0.41 μ ม. สําหรับภาพรวมและ 0.10 μ ม. สําหรับความละเอียดสูงได้มาโดยการรักษาการตั้งค่าทั้งหมดบนกล้องจุลทรรศน์ให้คงที่ ภาพเหล่านี้ได้รับการประมวลผลและวิเคราะห์แบบกึ่งอัตโนมัติเพิ่มเติมโดยใช้มาโคร ImageJ ที่พัฒนาขึ้นเอง (วันที่เข้าถึง: 15 ธันวาคม 2020) ในไม่ช้าภาพถูกแบ่งส่วนสําหรับแต่ละ podocytes เกณฑ์ถูกนําไปใช้และความเข้มเฉลี่ยที่วัดวิเคราะห์ทางสถิติและพล็อต ภาพทั้งหมดได้รับการประมวลผลด้วยการตั้งค่าคงที่และแสดงด้วยสีหลอกเดียวกันที่ปรับเชิงเส้นอย่างเท่าเทียมกันสําหรับแต่ละช่องบนภาพที่ผสาน
การวิเคราะห์ทางสถิติStatisticanalyseswereperformedusingGraphPadPrismv. 8.4.3ซอฟต์แวร์ (ซอฟต์แวร์ GraphPad, Inc., La Jolla, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ข้อมูลทั้งหมดถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ความแตกต่างทางสถิติคํานวณโดยใช้ t-test ที่จับคู่หรือไม่จับคู่รวมถึงการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของ Pearson ตามที่ระบุไว้
