วัคซีนอะดีโนไวรัสที่ประกอบด้วยหน่วยย่อยของ Spike Protein S1 ที่ถูกตัดทอนของ SARS-CoV-2 นำไปสู่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยเฉพาะในหนู

อับสตรากะรัต:การพัฒนาวัคซีนโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) ที่มีประสิทธิภาพและปลอดภัยเป็นแนวทางที่สำคัญในการจัดการกับการแพร่ระบาดของโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงชนิดไวรัสโคโรนา 2 (SARS-CoV-2) ภายใต้สภาวะปัจจุบัน ในการศึกษานี้ เราได้ผลิตส่วนที่สั้นลงของยีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ที่ได้รับการปรับปรุงประสิทธิภาพแล้ว (2043 bp เรียกว่า S1) ซึ่งสามารถเข้ารหัสโปรตีน S1 ที่ถูกตัดทอนได้ โปรตีนได้รับการทดสอบเพื่อดูว่าสามารถกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพในหนูที่ต้าน SARS-CoV-2 ได้หรือไม่ การมีอยู่ของโปรตีน S1 ได้รับการยืนยันด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์และการซับแบบตะวันตก วัคซีนอะดีโนไวรัสที่มีส่วนของยีน S1 (Ad-S1) ได้รับการฉีดเข้ากล้ามเนื้อให้กับหนูสี่ครั้งใน 4 สัปดาห์ ภูมิคุ้มกันของร่างกายด้วยโปรตีน SARS-CoV-2 S1 แสดงให้เห็นในหนูที่ได้รับวัคซีนทุกตัว เซรั่มจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันแสดงให้เห็นฤทธิ์ต้านการติดเชื้อ ในหลอดทดลอง ได้อย่างดีเยี่ยม มีการตรวจพบการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายต่อโรค SARS-CoV-2 ที่แข็งแกร่งในหนูหลังการฉีดวัคซีนด้วย Ad-S1 ซึ่งบ่งชี้ว่าวัคซีนอะดีโนไวรัสอาจช่วยในการพัฒนาวัคซีนต้าน SARS-CoV-2 และความแตกต่างทางพันธุกรรมอื่นๆ ไวรัส

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ: โรคซาร์ส-โคฟ-2; วัคซีน; เวกเตอร์อะดีโนไวรัส ยีน S1; ภูมิคุ้มกัน

1. บทนำ

โรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) มักเกี่ยวข้องกับความล้มเหลวของอวัยวะหลายส่วนและอัตราการเสียชีวิตสูง [1] และเป็นภัยคุกคามหลักต่อความปลอดภัยของสาธารณะทั่วโลก ณ วันที่ 15 กรกฎาคม 2022 การแพร่ระบาดของโควิด-19 ยังคงดำเนินต่อไปทั่วโลก โดยมีรายงานผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันแล้ว 557,917,904 ราย รวมถึงผู้เสียชีวิต 6,358,899 รายไปยังองค์การอนามัยโลก (WHO) นอกจากนี้ ณ วันที่ 11 กรกฎาคม 2565 มีการจ่ายวัคซีนไปแล้วทั้งสิ้น 12,130,881,147 โดส ดังนั้น การออกแบบและพัฒนาวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (nCoV) จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งและเป็นหนึ่งในลำดับความสำคัญด้านสุขภาพระดับโลก เอสโปรตีนเป็นปัจจัยสำคัญในการนำเชื้อไวรัสโคโรนา 2 (SARS-CoV-2) ซึ่งเป็นโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงชนิด SARS-CoV-2 เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน [2,3] โปรตีนจับกับตัวรับโฮสต์และช่วยให้ไวรัสเข้าสู่เซลล์โฮสต์ได้อย่างราบรื่น [4] ไกลแคนที่เชื่อมโยงกับ N จะยื่นออกมาจากพื้นผิวของเล็มเมอร์และตกแต่ง S โปรตีนอย่างกว้างขวาง ซึ่งส่งผลต่อการพับของโปรตีน S ภูมิคุ้มกันของร่างกาย และการประมวลผลโปรตีเอสของเซลล์เจ้าบ้าน [5] โปรตีน S ของ SARS-CoV-2 มีความหนาแน่นของไกลแคนที่เชื่อมโยงกับ N ต่ำกว่าโปรตีน S ที่เกิดจากเชื้อไวรัสโคโรนาที่ทำให้เกิดโรคในมนุษย์อื่นๆ [6] ดังนั้น S โปรตีนอาจมีภูมิคุ้มกันสูงและเป็นเป้าหมายหลักของการทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง เอสโปรตีนมีโดเมนโครงสร้างสามโดเมน โดยโดเมน S1 เป็นแอนติเจนพื้นผิวโปรตีน S ที่สำคัญที่สุด [4] เนื่องจากความยากในการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ขนาดใหญ่ (โดเมนนอกเซลล์ของโปรตีน S คือกรดอะมิโนประมาณ 1,300 ตัว) และความเสี่ยงของการติดเชื้อที่ขึ้นกับแอนติบอดี (ADE) S1 (กรดอะมิโนประมาณ 700 ตัว) และโดเมนการจับตัวรับ (RBD หรือกรดอะมิโนประมาณ 200 ชนิด) ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่าเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจที่สุดสำหรับวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนา [7,8] Human adenovirus serotype 5 (HAdV-C5) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านไวรัสวิทยาขั้นพื้นฐานในฐานะการบำบัดด้วยยีนและการนำส่งวัคซีน [9] HAdV-C5 มีความหลากหลายตามธรรมชาติและสามารถเป็นปรสิตโฮสต์ส่วนใหญ่ได้ ซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนาการทดลองในสัตว์ เวกเตอร์ adenovirus ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มีความสามารถในการทำซ้ำและข้อบกพร่องในการจำลองแบบที่สร้างจาก HAdV-C5 ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการส่งวัคซีนและการบำบัดด้วยยีน [9,10] ปัจจุบัน อะดีโนไวรัสได้รับการอนุมัติให้เป็นวัคซีนป้องกันการติดเชื้อทางเดินหายใจเฉียบพลัน และมีการทดลองวัคซีนดังกล่าวหลายครั้ง เช่น สำหรับมาลาเรียและเอชไอวี-1 [9] ในบทความนี้ เราจะอธิบายวัคซีนเวกเตอร์อะดีโนไวรัสที่ขาดการจำลองแบบของมนุษย์ SARS-CoV-2 ตลอดจนการเตรียมและการใช้ ในการศึกษานี้ วัคซีน adenovirus ถูกสร้างขึ้นดังนี้: เวกเตอร์คือ adenovirus HAdV-C5 ที่มีข้อบกพร่องในการจำลองแบบของมนุษย์ซึ่งมีการลบ E1 และ E3, พลาสมิดโครงกระดูกคือ adenovirus ชนิดรีคอมบิแนนต์ที่มี pBHGlox∆E1,3Cre, สายเซลล์บรรจุภัณฑ์คือเซลล์ HEK293 และยีนเป้าหมายคือยีนโปรตีน S1 ที่ถูกตัดทอนของ SARS-CoV-2 การแสดงออกของโปรตีน S1 ในวัคซีนถูกระบุโดย Western blot และการตรวจอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ เพื่อตรวจสอบคุณภาพของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากตัวเลือกวัคซีนที่มีหนามแหลม จึงมีการตรวจสอบการตอบสนองของแอนติบอดีหลังการฉีดวัคซีนอย่างละเอียด ประโยชน์ทางภูมิคุ้มกันของวัคซีนได้รับการประเมินด้วยการทดสอบแอนติบอดีที่มีผลผูกพัน (การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA)) และการทดสอบแอนติบอดีที่เป็นกลาง การค้นพบของเราเป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนาและการประเมินวัคซีนและการรักษาโควิด-19 โดยใช้โปรตีน S1

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เซลล์และสัตว์

มีการใช้สายพันธุ์เซลล์ไตของลิง HEK293 และ Vero E6 ในการศึกษานี้ เซลล์ทั้งสองถูกปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's (DMEM) ที่ได้รับการดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วยซีรั่มของวัวในครรภ์ (FBS) 2% และเพนิซิลลิน 1% และสเตรปโตมัยซินที่ 37 ◦C พร้อม CO2 5% และความชื้นอิ่มตัว ซื้อหนู C57BL / 6 ตัวตัวเมียจำนวนยี่สิบตัว (6–8 สัปดาห์) จากศูนย์ทดลองสัตว์เจ้อเจียงจังหวัดเจ้อเจียง หนูถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม โดยมีหนู 10 ตัวในแต่ละกลุ่ม กลุ่มหนึ่งได้รับการก่อภูมิคุ้มกัน (การฉีดในช่องท้อง 100 µL) โดยมีเวกเตอร์ Ad5 ซึ่งแสดงออกโปรตีนสไปค์ SARS-CoV-2 (Ad5-S) และอีกกลุ่มที่มี PBS (การฉีดในช่องท้อง 100 µL) เป็นกลุ่มควบคุม จำนวนไวรัสทั้งหมดคือ 5 × 109 VP หนูทุกตัวได้รับการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยการฉีดเข้ากล้าม D0/D14 [11,12] ที่ D14 เลือดรอบข้าง 100 ไมโครลิตรถูกแยกออก และฉีดครั้งที่สองสองชั่วโมงหลังการเก็บเลือด ที่ D28 เลือดถูกเก็บโดยการเจาะแบบเรโทรออร์บิทัลและแยกซีรั่ม แอนติบอดีต่อการจับถูกตรวจพบ 3 วันหลังการเก็บเลือดแต่ละครั้ง, แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางถูกตรวจพบ 7 วันหลังการเก็บเลือดแต่ละครั้ง และตรวจพบไซโตไคน์ 7 วันหลังการเก็บเลือดครั้งที่สอง หนูทุกตัวถูกการุณยฆาต การทดสอบทั้งหมดดำเนินการอย่างเข้มงวดตาม "แนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของสาธารณรัฐประชาชนจีน" และได้รับอนุมัติจากสภาจริยธรรมมหาวิทยาลัยเจ้อเจียงชูเรน

2.2. วัคซีน

สายพันธุ์ SARS-CoV-2 ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้รวบรวมจากผู้ป่วยโควิด-19 โดยได้รับความยินยอม ห้องปฏิบัติการหลักของรัฐสำหรับการวินิจฉัยและการรักษาโรคติดเชื้อได้พัฒนาวัคซีนอะดีโนไวรัส (เซลล์เวโร สายพันธุ์หวู่ฮั่น หมายเลข GISAID: EPI_ISL_415711) ต่อต้านโรคซาร์ส-CoV-2 จากนั้น วัคซีนได้รับการผลิตตามมาตรฐานความปลอดภัยทางชีวภาพ (BSL) ข้อมูลจำเพาะของวัคซีนคือ 0.5 มล./โดส และประกอบด้วยทริส, NaCl, น้ำตาลอ้อย, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, เอทานอลสัมบูรณ์ และโปรตีน S1 ของ SARS-CoV-2

2.3. การสร้าง Adenovirus แบบรีคอมบิแนนท์

ลำดับโปรตีน SARS-CoV-2 S1 (หมายเลข QRU91950.1) ได้มาจาก PubMed ตามความเสื่อมของยีน ลำดับโคดอนนิวคลีโอไทด์ที่ได้รับการปรับปรุงให้เหมาะสมกับการแสดงออกของเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้รับการออกแบบบนสมมติฐานที่ว่าลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนของผลิตภัณฑ์ที่เข้ารหัสโดยโปรตีน SARS-CoV-2 S1 ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ความยาวรวม 2,043 bp ลำดับสารตั้งต้น 50 ลำดับถูกสังเคราะห์ด้วยเนื้อเยื่อ plasminogen activator (tPA) และลำดับการเข้ารหัส SARS-CoV-2 กรดอะมิโน S1 2–688 และลำดับสารตั้งต้นของ tPA ถูกผูกมัด มีการเพิ่มลำดับ Kozak และไซต์จำกัด SpeI ที่ด้านหน้าของ codon เริ่มต้น และไซต์ข้อจำกัด XbaI ถูกเพิ่มหลังจากการสิ้นสุด codon ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนข้างต้นถูกสังเคราะห์และโคลนเป็น pUC18 โดย Sangon Biotech เพื่อให้ได้พลาสมิดที่โคลนของยีนสังเคราะห์ ลำดับยีน S1 ที่สังเคราะห์และเวกเตอร์ pDC316 ถูกย่อยด้วยข้อ จำกัด ของ endonucleases SpeI และ XbaI ชิ้นส่วนเป้าหมายและเวกเตอร์ถูกดึงมาจากเจลและเชื่อมต่อกันเพื่อสร้างพลาสมิดของกระสวย พลาสมิดกระสวย SARS-CoV-2 ถูกบรรจุด้วยพลาสมิดโครงกระดูกระบบ AdMax adenovirus pBHGloxd∆E1 และ 3Cre โดยการทรานส์เฟกชันร่วมของเซลล์ HEK293 สารละลายไวรัสหลักได้มาหลังจากการละลายน้ำแข็งและการหมุนเหวี่ยงซ้ำๆ และไวรัสก็ถูกขยายและเพาะเลี้ยงหลังจากการทำให้คราบจุลินทรีย์บริสุทธิ์

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. ความมุ่งมั่นของ Adenovirus Titer

เซลล์ HEK293 ที่มีสุขภาพแข็งแรงถูกเลือกและแขวนลอยอีกครั้งเพื่อเตรียมสารแขวนลอยเซลล์ 5.0 × 105 เซลล์/มิลลิลิตร ซึ่งถูกเพาะในจานหลุม 24- (1 มิลลิลิตร/หลุม ) และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ◦C ในสภาพแวดล้อมที่มี CO2 5% ตัวอย่างถูกเจือจางเป็นสิบเท่า และตัวอย่างที่เจือจาง (0.1 มล.) ของ 10−5 ถึง 10−8 เซลล์ถูกฉีดวัคซีนลงบนจานหลุม 24- . จากนั้นเพลตได้รับการติดเชื้อที่อุณหภูมิ 37 —C โดยมี CO2 5% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ต่อจากนั้น อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเอาออก เติมเมทานอลที่ทำให้เย็นล่วงหน้า (0.5 มล.) และตัวอย่างถูกตรึงไว้ที่ −20 ◦C เป็นเวลา 20 นาที หลังจากการตรึง ตัวอย่างถูกล้างด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) และปิดกั้นด้วย 1% ซีรัมอัลบูมินของวัว (BSA, 0.2 มล.) ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ถัดไป แอนติบอดีปฐมภูมิ (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) และแอนติบอดีรอง (Goat pAb ถึง MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) แอนติบอดีถูกเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในระหว่างนั้น PBS ถูกนำมาใช้ในการซัก หลังจากการบ่ม สารละลายสำหรับการทำงานที่เตรียมไว้ใหม่ (0.2 มล.) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 5–10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น สารละลายสำหรับการทำงานถูกทิ้งไป ตัวอย่างถูกล้างด้วย PBS และ PBS (1 มล.) ถูกเติมอีกครั้ง จำนวนเฉลี่ยของเซลล์บวกในสนามกล้องจุลทรรศน์ (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) ถูกคำนวณ โดยเลือกการไล่ระดับสีที่มีเซลล์บวก 5-50 เซลล์ในมุมมอง และอย่างน้อยห้าพื้นที่ถูกสุ่มเลือกสำหรับการนับ . จำนวนช่องมองภาพในแต่ละหลุมของ 24- แผ่นหลุมได้รับการคำนวณ จากนั้น คำนวณระดับไทเตอร์ของไวรัสตามสูตรต่อไปนี้ (1):

2.5. PCR แบบเรียลไทม์

ในการตรวจจับการแสดงออกของ mRNA ของเซลล์ HEK293 หลังจากการติดเชื้อไวรัส เราได้แยก RNA ระดับกลางตามคำแนะนำในการใช้งาน TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA) RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ TRIzol และประมวลผลด้วย DNase I ที่ปราศจาก RQ1 RNase (Promega, Madison, WI, USA) เพื่อกำจัด DNA ที่ตกค้าง ได้รับ DNA เสริม (cDNA) โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับของ RNA ที่แยกออกมาโดยใช้ชุดรีเอเจนต์ PrimerScript ™ RT พร้อมชุดยางลบ gDNA (Takara, Kusatsu, ญี่ปุ่น) ชิ้นส่วน DNA ถูกสร้างขึ้นด้วยไพรเมอร์เฉพาะ P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) และ P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ) ของยีนเป้าหมาย (S1) ยีนถูกขยายด้วยไพรเมอร์ P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) และ P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ) เป็นระบบควบคุมภายใน (GAPHD)

2.6. เวสเทิร์นบล็อท

เซลล์ไลเซตและส่วนเหนือตะกอนถูกแยกด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต–โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (SDS-PAGE) จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลดีนฟลูออไรด์ (PVDF) มองเห็นรอยเปื้อนด้วยอุปกรณ์ถ่ายภาพ Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) โดยสรุป เมมเบรนถูกถ่ายโอนไปยัง TBST (50 มิลลิลิตร Tris-HCl, pH 7.5, 8 กรัม NaCl [0.5 มิลลิลิตร], 0.2 กรัม KCl, 0.5 มิลลิลิตร ทวีน -20) กับนมผงแห้งไร้ไขมัน 5% แล้วเขย่าบนเชคเกอร์ลดสีที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เมมเบรนของกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุมถูกนำออกจากสารละลายปิดผนึกและบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, ปักกิ่ง, จีน)] ที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิถูกเขย่าและบ่มข้ามคืนบนเชคเกอร์ลดสีที่ 4 ◦ซ ซับถูกล้างด้วยสารละลาย TBST และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงด้วยแอนติบอดีรอง [อิมมูโนโกลบูลินต่อต้านกระต่ายแพะ G (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)] หลังจากการล้าง บล็อตจะถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาทีด้วยชุดสารละลายพื้นผิว LumiBest ECL (cat. #4AW011-100, 4A Biotech) จากนั้นสังเกตดูในตัวสร้างภาพ

2.7. การทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

เซลล์ HEK293 (3 × 106/หลุม) ถูกเพาะลงในเพลตของหลุม 12- หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง เซลล์จะติดเชื้ออะดีโนไวรัสที่มียีน S1 (Ad-S1) หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง ตัวกลางจะถูกดูดเข้าไป และเซลล์จะถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย PBS ที่มี BSA 2% และตรึงไว้เป็นเวลา 15 นาทีด้วยเมทานอลที่ถูกแช่เย็นไว้ล่วงหน้าเป็นเวลา 15 นาทีที่ −20 ◦C หลังจากการล้างสามครั้งด้วย 2% BSA ใน PBS เซลล์ถูกซึมผ่านด้วย 0.5% ไทรทัน X{-100 เป็นเวลา 10 นาที จากนั้น เซลล์ถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วย 2 มิลลิลิตร 2% BSA สารละลายสำหรับปิดกั้นถูกละทิ้ง และเซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS ต่อจากนั้น แอนติบอดีปฐมภูมิ 2 มิลลิลิตร [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและ ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหรือ 4 ◦C ข้ามคืน จากนั้น ตัวอย่างถูกล้างสามครั้งด้วย 2% BSA เป็นเวลา 5 นาทีต่อการล้าง ต่อไป แอนติบอดีทุติยภูมิ 2 มิลลิลิตร [แพะต้าน IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. #550037, ZenBio)] ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ต่อจากนั้น ตัวอย่างถูกล้างสามครั้งด้วย 2% BSA เป็นเวลา 5 นาทีต่อการล้าง สารละลายฟีนิลินโดล (DAPI) 40,6-ไดอามิดิโน-2- (2 มล., 1 มก./มล.) (1:400, cat. #S0001, ไบโอส, โวเบิร์น, MA, สหรัฐอเมริกา) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม และทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 10 นาทีในความมืด การวิเคราะห์ถูกสังเกตด้วยระบบสร้างภาพ EVOS™ M7000 (cat. #AMF7000, Invitrogen)

2.8. เอลิซา

โปรตีน SARS-CoV-2 S (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเคลือบข้ามคืนในเพลตหลุม 96- (100 ไมโครลิตร/หลุม) ด้วย 0 0บัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนต 5 โมลาร์ หลังจากล้างด้วย PBST (0.2 กรัม KH2PO4, 2.9 กรัม Na2HPO4·12H2O, 8.0 กรัม NaCl, 0.2 กรัม KCl, 0.5 มล. Tween-20 เติมน้ำเป็น 1000 มล.) ห้า ครั้ง เติมสารละลายบล็อคและบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวอย่างซีรัมถูกเจือจางและเติมลงในแต่ละหลุม (100 ไมโครลิตร/หลุม) หลังจากการฟักตัว 1 ชั่วโมงที่ 37 ◦C ตัวอย่างถูกล้างด้วย PBST ห้าครั้ง แอนติบอดีปฐมภูมิ [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้น ตัวอย่างถูกล้างห้าครั้งด้วย PBST ตามด้วยการฟักตัว 1 ชั่วโมงที่ 37 —C ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบด้วยมะรุมเปอร์ออกซิเดส [แพะต่อต้านกระต่าย IgG H&L (HRP) (1:10,000, cat. #ab6721, abcam)] และห้าครั้ง ล้างด้วย PBST หลังจากเติม 3, 30, 5 และ 50-เตตระเมทิล ไบฟีนิล แอนไฮไดรด์ เป็นเวลา 5 นาที ปฏิกิริยาถูกหยุดด้วยกรดซัลฟิวริก 2 โมลาร์ ความหนาแน่นของแสงถูกวัดที่ 450 นาโนเมตรและ 630 นาโนเมตรโดยเครื่องมือติดฉลากเอนไซม์ (อุปกรณ์โมเลกุล, SpectraMax 190) จากนั้นจึงติดตั้งเข้ากับเส้นโค้งมาตรฐาน

ประโยชน์ของ Cistanche Tubulosa-เสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

2.9. การกำหนดไซโตไคน์ 

เพลต (cat. #T-k15048D-1, MSD) ถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 150 ไมโครลิตร/หลุม และตัวอย่างที่เตรียมไว้ 50 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม จากนั้น เพลตถูกผนึกด้วยเพลทแบบมีกาวและบ่มที่อุณหภูมิห้องโดยเขย่าเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อไป, จานถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 150 ไมโครลิตร/หลุมและสารละลายแอนติบอดีสำหรับการตรวจจับ 25 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม จานถูกปิดผนึกอีกครั้งและบ่มที่อุณหภูมิห้องด้วยการเขย่าเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อไป, จานถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ล้างอย่างน้อย 150 ไมโครลิตร/หลุม; 150 ไมโครลิตร 2× บัฟเฟอร์การอ่าน T (MSD) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม และเพลตถูกวิเคราะห์บนเครื่องมือ MSD

2.10. การทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง

2.10.1. การทดสอบการทำให้เป็นกลางด้วยไวรัสหลอก

กิจกรรมการทำให้เป็นกลางในซีรัมของเมาส์ได้รับการทดสอบโดยใช้ระบบเทียมไวรัสปากอักเสบตุ่ม (VSV) ซีรั่มถูกทำให้ไม่ทำงานในอ่างน้ำเป็นเวลา {{0}}.5 ชั่วโมงที่ 56 ◦C จากนั้นจึงเจือจางตามลำดับจนถึงช่วงที่ต้องการ เซลล์ HEK293 ถูกชุบในจานหลุม 96- ซีรั่มเจือจางผสมกับ 200 CCID50 (ปริมาณไวรัสที่สามารถแพร่เชื้อได้ 50% ของการเพาะเลี้ยงเซลล์)/100 µL ของสารแขวนลอยไวรัสในอัตราส่วน 1:1 และใส่ในตู้อบ CO2 (37 ± 1 ◦C) สำหรับ 2 ชม. ถัดไป สารละลายบำรุงรักษาไวรัส 100 ไมโครลิตรที่มีดับเบิลแอนติบอดี 0.5% เพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซินถูกเติมลงในแต่ละหลุม และของผสมที่ทำให้เป็นกลางถูกปลูกเชื้อลงในแผ่นหลุม 96- ที่ประกอบด้วยเซลล์ที่ 100 ไมโครลิตรต่อหลุม โดยมีหลุมซ้ำสองหลุมสำหรับ การเจือจางแต่ละครั้ง ในเวลาเดียวกัน มีการตั้งค่าการควบคุมเซลล์ตามปกติ และเซลล์ถูกบ่มในตู้อบ CO2 (37 ± 1 ◦C) เป็นเวลา 96 ชั่วโมง จากนั้น สารละลายไวรัส 200 CCID50/100 µL ถูกเจือจางเป็น 10-1~10-3 อาหารเลี้ยงเซลล์ในจาน 96- ถูกทิ้งไป เติมสารละลายบำรุงรักษาไวรัส 150 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และการเจือจางสารละลายไวรัสถูกปลูกเชื้อที่ความเข้มข้น 10-1~{{33} } ลงในหลุมของจานหลุม 96- (50 ไมโครลิตรต่อหลุม) การเจือจางแต่ละครั้งทำซ้ำใน 8 หลุม; การควบคุมเซลล์ปกติถูกตั้งค่าในเวลาเดียวกัน ตามด้วยการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 96 ชั่วโมง การเปลี่ยนแปลงของเซลล์ CPE ถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว การควบคุมเซลล์ปกติไม่ควรมีการเปลี่ยนแปลงทางไซโตพาติก และการควบคุมเชิงบวกควรมีการเปลี่ยนแปลง CPE จุดสิ้นสุดการทำให้เป็นกลาง (การเจือจางของซีรั่มที่แปลงเป็นลอการิทึม) คำนวณโดยการสังเกต CPE เกณฑ์ซีโรเนกาทีฟ/บวกคือ 1:12 เป็นเกณฑ์บวก/ลบ<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. การทดสอบการวางตัวเป็นกลางแบบสด

กิจกรรมการวางตัวเป็นกลางของซีรั่มของเมาส์ได้รับการประเมินโดยการทดสอบการวางตัวเป็นกลางแบบสด ซีรั่มเจือจางผสมกับ SARS-CoV-2 และบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ของผสมถูกเติมลงในจานหลุม 96- เพื่อแพร่เชื้อไปยังเซลล์ Vero E6 หลังจากการฟักตัว 72- ชม. ที่ 37 — C จะตรวจพบผลกระทบของไวรัสไซโตพาทิก (CPE) ภายใต้กำลังขยาย × 40 และไตเตอร์การทำให้เป็นกลาง (ส่วนกลับของการเจือจางในซีรั่ม 50% ที่จำเป็นในการต่อต้านการติดเชื้อไวรัส) ขั้นตอนข้างต้นทั้งหมดดำเนินการในสภาพแวดล้อมความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3

2.11. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยการทดสอบทีสองตัวอย่างโดยใช้ SPSS 26 ค่า p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ แนวโน้มส่วนกลางวัดด้วยไทเทอร์ค่าเฉลี่ยเรขาคณิต (GMT)

3. ผลลัพธ์

3.1. การสร้าง Adenovirus แบบรีคอมบิแนนท์

ได้รับพลาสมิด pAdeno-CMV-S1 ของกระสวย adenovirus recombinant ที่มีการแทรกที่ถูกต้อง แผนภาพโครงสร้างของมันแสดงในรูปที่ 1 adenovirus recombinant มีจีโนม HAdV-C5 ที่ขาดภูมิภาค E1 / E3 แผนผังของเวกเตอร์ adenovirus recombinant ที่ได้รับจากพลาสมิดของกระสวยและการเปลี่ยนพลาสมิดของโครงร่างโครงร่างในเซลล์ HEK293 แสดงในรูปที่ 1

3.2. การศึกษาลักษณะเฉพาะของ Recombinant Adenovirus

พลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนเป้าหมายถูกระบุโดย PCR (ดูรูปที่ 2A สำหรับผลลัพธ์ของเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส) นี่เป็นการทดลองซ้ำแล้วซ้ำอีก ลำดับไพรเมอร์คือ MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag และ S1-R acaataagtagggactgggtc และการหาลำดับยืนยันว่าลำดับนั้นสอดคล้องกับการออกแบบ ตรวจพบการแสดงออกของ SARS-CoV-2 S1 ในเซลล์ด้วยการซับแบบตะวันตก (รูปที่ 2B) และอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทางอ้อม (รูปที่ 2C) ตรวจพบสีของวงดนตรี (~ 75 kDa) โดย Western blotting และสอดคล้องกับตำแหน่งของวงดนตรีที่คาดหวัง ในระดับการถอดเสียง PT-PCR ตรวจพบการแสดงออก ในหลอดทดลอง ของ S1 ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ S1 mRNA ในเซลล์ HEK-293 สูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ

รูปที่ 1 การสร้างวัคซีน adenovirus ชนิดรีคอมบิแนนท์และกลยุทธ์การทดลอง ( A ) pAdeno-CMV-S1 เป็นพลาสมิดกระสวย adenovirus recombinant ที่มียีนเป้าหมาย S1 pBHGlox∆E1,3Cre คือพลาสมิดโครงกระดูกของ adenovirus pBHGlox∆E1,3Cre และ pAdeno-CMV-S1 ถูกสกัดด้วยชุดสกัดพลาสมิดของ QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, China) หนึ่งวันก่อนการทรานส์เฟกชัน เซลล์ HEK293 ถูกส่งผ่านในขวดเพาะเลี้ยงเซลล์ขนาด 25 ซม.2 อาหารเลี้ยงเชื้อคือ DMEM ที่มี FBS 5% โดยไม่มียาปฏิชีวนะ ในวันที่สอง มีการเลือกเซลล์ 60–80% และสารละลายการทรานส์เฟกชันถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ หลังจากการทรานส์เฟกชันเป็นเวลา 7 วัน เซลล์ถูกขูดออก, ปั่นเหวี่ยง, ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้ง และเซลล์ถูกทำให้ฟื้นคืนชีพด้วย PBS เซลล์ถูกแช่แข็งละลายซ้ำๆ ที่ −80 ◦C และ 37 ◦C หลังจากการปั่นแยก ส่วนเหนือตะกอนบรรจุสารละลายไวรัสหลักไว้ สายพันธุ์อะดีโนไวรัสชนิดรีคอมบิแนนท์ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ ขยาย และได้รับหลังจากการประมวลผลเพิ่มเติมและกำหนด Ad-S1 วัคซีนถูกฉีดเข้ากล้ามเข้าไปในหนูเพื่อทำการศึกษาติดตามผล (B) สเกลเวลาที่แสดงการสร้างภูมิคุ้มกันและการถอนเลือด

3.3. อะดีโนไวรัสไทเตอร์

ในการทดลองนี้ มีการคำนวณเซลล์บวกโดยเฉลี่ย 6 เซลล์ในสนามกล้องจุลทรรศน์ 5 แห่ง และไวรัสในบ่อน้ำถูกเจือจาง 108 ครั้ง ตามสูตรที่อธิบายไว้ในส่วนวัสดุและวิธีการ ค่าไทเตอร์ของอะดีโนไวรัสคือ 4.74 × 1,011 หน่วยที่สร้างคราบจุลินทรีย์ (pfu)/มล. (รูปที่ 2D)

3.4. ภูมิคุ้มกันระดับเซลล์หลังการฉีดวัคซีน

ในระหว่างช่วงการทดสอบ มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติในไซโตไคน์ในซีรัม (p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05) ซึ่งส่วนใหญ่แสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของคีโมแอตแทรคแตนท์ Keratinocyte/ยีนที่ควบคุมการเจริญเติบโตของมนุษย์ (KC/GRO) ลดลง และความเข้มข้นของ IFN- , IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } และ TNF- เพิ่มขึ้น ในขณะที่ความเข้มข้นของ IL-6 ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3)

รูปที่ 2 การจำแนกโปรตีน S1 ชนิดรีคอมบิแนนท์ HAdV-C5–SARS-CoV-2 และการหาค่าไทเตอร์ของอะดีโนไวรัส ( A ) การตรวจหา PCR ของพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ด้วยยีนเป้าหมาย S1 (B) การตรวจหา Western blot ของ SARS-CoV-2 เซลล์ HEK293 ที่มีการเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลติดเชื้อ SARS-CoV-2 เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นโปรตีนของเซลล์จะถูกสกัดและแยกโดย SDS-PAGE การแสดงออกของ SARS-CoV-2 ได้รับการยืนยันโดยการซับแบบตะวันตกด้วย IgG ต่อต้านกระต่ายของแพะ (C) กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของเซลล์ HEK -293 ที่ติดเชื้อ Ad-S1 (สีเขียว) เซลล์ถูกขัดขวางด้วย 40, 6-ไดอะมิดิโน- 2-ฟีนิลินโดล (DAPI) เพื่อทำให้นิวเคลียสเปื้อน สเกลบาร์ 1000 µm. (D) การทดสอบคราบจุลินทรีย์ใช้สำหรับการวัด ภาพไมโครกราฟแสดงการเจือจาง 10-5, 10-6, 10-7 และ 10-8 (จากซ้ายไปขวา)

รูปที่ 3 Ad-S1 ชักนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงระดับพลาสมาของไซโตไคน์ชนิด 1/2, อินเตอร์เฟอรอนชนิด 1 และไซโตไคน์อื่นๆ ตรวจพบผลลัพธ์โดยการเจาะเลือดจากหนู 7 วันหลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ข้อมูลจะถูกนำเสนอในรูปแบบกล่องและแผนภูมิกระจายแบบมัสสุ แต่ละวงกลมแสดงถึงบุคคลเดียว ค่า p คำนวณโดยใช้การทดสอบทีสองตัวอย่าง

3.5. การตรวจหาแอนติบอดีต้าน SARS-CoV-2 S1 หลังการสร้างภูมิคุ้มกัน

ELISA เปิดเผยว่าแอนติบอดีที่จำเพาะต่อ SARS-CoV-2- มีอยู่ในหนูที่ถูกฉีดด้วย Ad-S1 ตัวแรกและตัวที่สอง แต่ไม่ใช่หนูที่ถูกฉีดด้วย adenovirus capsid กลุ่มควบคุมหรือสารละลาย PBS (Ad/PBS) (รูปที่ 4A) ตรวจพบระดับ IgG ที่ 1:210 และ 1:212 ในหนูที่ได้รับวัคซีน Ad-S1- สองสัปดาห์หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรกและครั้งที่สอง ตามลำดับ ค่าไทเทอร์เจือจางที่ 28 วันหลังการฉีดวัคซีน (D28, GMT 2297.4) สูงกว่านั้นที่ D14 (GMT 378.9) ถึง 61- เท่า

รูปที่ 4 Ad-S1 กระตุ้นให้เกิดแอนติบอดี (A) และกิจกรรมการทำให้เป็นกลาง (B, C) ในระดับสูงในหนู (A) ELISA ของ SARS-CoV-2-IgG ในซีรัมเฉพาะจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน Ad-S1- (B) การวิเคราะห์ฤทธิ์ของไวรัสหลอกในซีรั่มจากหนูที่ได้รับวัคซีน Ad-S{8}} (C) การวิเคราะห์กิจกรรมการทำให้เป็นกลางของซีรั่มจากหนูที่ได้รับวัคซีน Ad-S{10}}

3.6. การสอบวิเคราะห์แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง

ความท้าทายของ SARS-CoV-2 ของเซลล์ Vero E6 ทำให้สามารถตรวจจับกิจกรรมการทำให้เป็นกลางในซีรั่มของเมาส์ที่ได้รับภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 4B, C) ไทเทอร์การทำให้เป็นกลางของ D14 และ D28 ของเซลล์ Vero E6 ที่ได้รับภูมิคุ้มกันของ Ad-S1- เพื่อต่อต้านการท้าทายไวรัสที่มีชีวิตในหลอดทดลองของ SARS-CoV{{10} อยู่ที่ 1:24.3 และ 1:26.3 ตามลำดับ การทดสอบไวรัสหลอกให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันกับการทดสอบไวรัสที่มีชีวิต โดยมีไทเทอร์การทำให้เป็นกลางสูงถึง 1:28.1 และ 1:29.6 ที่ D14 และ D28 ตามลำดับ ไทเทอร์การทำให้เป็นกลางของไวรัสหลอกเทียม D28 (GMT 769.0) สูงกว่าของ D14 (GMT 283.7) ถึง 2.7- เท่า

4. การอภิปราย

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1,000 ถึง<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

ในการศึกษานี้ เราได้สร้างวัคซีน recombinant adenovirus SARS-CoV-2 ซึ่งมีหน่วยย่อย S1 ของ SARS-CoV-2 และกำหนดให้เป็น Ad-S1 เช่นเดียวกับ CanSinoBIO ซึ่งได้รับการอนุมัติสำหรับการตลาด [28] เราใช้ HAdV-C5 ในวัคซีนนี้ Adenovirus ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการบำบัดด้วยยีนรีคอมบิแนนท์และเป็นพาหะของวัคซีน อย่างไรก็ตาม อัตราบวกของ HAdV-C5 สูงถึง 75–80% ในประชากรปกติ [29] นี่หมายความว่าภูมิคุ้มกันก่อนการเก็บรักษาต่อเวกเตอร์ HAdV-C5 จะลดภูมิคุ้มกันที่เกิดจากวัคซีนได้อย่างมีนัยสำคัญ ChAdOx1 nCoV-19 ได้รับการพัฒนาที่มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ดในสหราชอาณาจักร โดยใช้เวกเตอร์อะดีโนไวรัสของชิมแปนซี ในทางตรงกันข้าม มีอัตราซีโรบวกในมนุษย์ต่ำกว่า และเมื่อเป็นบวก มักจะแสดงระดับแอนติบอดีในซีรั่มที่ต่ำกว่า [30] . ดังนั้นจึงสามารถสำรวจเวกเตอร์ของอะดีโนไวรัสที่สามารถหลบเลี่ยงภูมิคุ้มกันที่มีอยู่ก่อนได้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการป้องกันของวัคซีนอะดีโนไวรัส ในการศึกษานี้ สถานะในซีรั่มของหนูก่อนและหลังการสร้างภูมิคุ้มกันถูกกำหนดโดยการทดสอบ ELISA และการทำให้เป็นกลาง และให้ผลหลักฐานของภูมิคุ้มกันของร่างกายสำหรับผู้สมัครรับวัคซีน ซีรั่มที่ผลิตหลังการฉีดวัคซีนเข้ากล้ามในหนูสามารถป้องกันเซลล์ Vero E6 จากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในหลอดทดลอง ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 4) นอกจากนี้เรายังตรวจพบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งขึ้นและการป้องกันที่ดีขึ้นในหนูหลังการฉีดวัคซีนครั้งที่สอง (รูปที่ 4) ผลการทดลองของเราคล้ายคลึงกับผลการทดลองทั่วไป

ในขณะที่การวิจัย SARS-CoV-2 ยังคงดำเนินต่อไป การศึกษาหลายชิ้นได้แสดงให้เห็นว่าพายุไซโตไคน์รองจากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 อาจส่งผลกระทบต่อการผลิตทีเซลล์ ทำให้ผู้ป่วยยากต่อการรักษาภูมิคุ้มกันในระยะยาว โรคซาร์ส-โคฟ-2 [31] ดังนั้นจึงจำเป็นต้องพิจารณาว่า Ad-S1 สามารถกระตุ้นภูมิคุ้มกันแบบ T-cell-mediated ในหนูได้หรือไม่ ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของ IFN- และ IL{-12 เพิ่มขึ้น และความเข้มข้นของ IL-4 ลดลงในกลุ่ม Ad-S1 ซึ่งบ่งชี้ว่าการอยู่รอดและการเติบโตของเซลล์ Th1 ที่เกิดจากวัคซีนในหนู IL -12, IL -10 และการหลั่ง TNF โดยเซลล์ Th1 เพิ่มขึ้นเล็กน้อยในกลุ่มทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า Ad-S1 กระตุ้นการตอบสนองของทีเซลล์ที่มีอคติ Th1- ในหนูได้อย่างมีประสิทธิภาพ [32] IL ที่เพิ่มขึ้น-5 บ่งชี้ว่าเซลล์ Th2 ยังมีส่วนร่วมในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันและก่อให้เกิดผลบางอย่าง ความเข้มข้นของ KC/GRO ในกลุ่มทดลองลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม PBS ซึ่งอาจเกิดจากการที่ยาเคมีบำบัดนิวโทรฟิลลดลง ซึ่งระงับการตอบสนองต่อการอักเสบ และอนุญาตให้ควบคุมผลข้างเคียงของวัคซีนได้เล็กน้อย ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อผู้ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง เช่น ผู้สูงอายุ หรือผู้ป่วยที่ได้รับเคมีบำบัดมากกว่า หลี่ เอ็ม., และคณะ. [29] พัฒนาวัคซีนอะดีโนไวรัสโดยใช้ Ad68 เป็นเวกเตอร์ ผลการวิจัยพบว่ากิจกรรมการทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV-2 ภายในร่างกายสามารถตรวจพบได้ภายในสองสัปดาห์หลังการฉีดวัคซีนเข้ากล้ามของหนู BALB/c จากนั้นเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง และไทเทอร์ของแอนติบอดีการทำให้เป็นกลาง (PRNT ID50) สูงถึง 957.3 ที่แปด สัปดาห์ ในขณะเดียวกัน ในการศึกษาของ Liu J. และคณะ [33] วัคซีนที่ใช้ AdC6 และ AdC68 เป็นพาหะได้รับการพัฒนา; การตอบสนองของแอนติบอดีทั้งการจับและการทำให้เป็นกลางหลังการสร้างภูมิคุ้มกันถูกสร้างขึ้น 14 วันหลังการให้ยา โดยมีไทเทอร์ IgG ที่ 7108 (ไทเทอร์เฉลี่ยเรขาคณิต, GMT; AdC6) และ 5489 (GMT, AdC68) ค่าไทเทอร์การทำให้เป็นกลาง 50 (NT50) ของการทดสอบการทำให้เป็นกลางของไวรัสเทียมคือ 125 (GMT, AdC6) และ 67 (GMT, AdC68)

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

ในการศึกษานี้ หนูที่ได้รับวัคซีน Ad-S1 มีระดับ IgG ที่ 1:1010 และ 1:122 ที่ตรวจพบโดย ELISA สองสัปดาห์หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรกและครั้งที่สอง ตามลำดับ ไทเทอร์เจือจางของ ad-s1 คือ 378.9 (GMT) ที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีน และ 2297.4 (GMT) ที่ 28 วันหลังการฉีดวัคซีน ในการทดสอบแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง เซลล์ Vero E6 ที่สร้างภูมิคุ้มกันด้วย Ad-S1 แสดงการทำให้เป็นกลางที่ 1:24.3 และ 1:26.3 ที่ D14 และ D28 ต่อการท้าทายของไวรัส SARS-CoV-2 ที่มีชีวิต ในหลอดทดลอง ตามลำดับ ระดับการทำให้เป็นกลางของ pseudovirus ที่ D14 และ D28 คือ 283.7 (GMT) และ 769.0 (GMT) ตามลำดับ ดังนั้นวัคซีนในการศึกษานี้จึงมีประสิทธิภาพมากกว่าในแง่ของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในแบบจำลองเมาส์

เนื่องจากข้อจำกัดของเงื่อนไขการทดลอง เราจึงไม่ได้ทำการวิเคราะห์จุดอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISpot) ของเซลล์ภูมิคุ้มกันของม้ามของหนูทดลอง นอกจากนี้ การทดลองการป้องกันการโจมตีของ SARS-CoV-2 กับหนูไม่สามารถทำได้เนื่องจากข้อจำกัดของห้องปฏิบัติการการป้องกันทางกายภาพ อย่างไรก็ตาม เราพบว่าวัคซีนมีประสิทธิภาพสูงในแบบจำลองเมาส์ และสามารถใช้เป็นสายพันธุ์วัคซีนสำรองในอุดมคติได้ นอกจากนี้ ควรตรวจสอบภูมิคุ้มกัน ความปลอดภัย และประสิทธิผลของผู้มีโอกาสเป็นวัคซีน SARS-CoV-2 ในสัตว์ทดลองเพิ่มเติม (เช่น กระต่าย ไพรเมต แรคคูน สุนัข) เนื่องจากแบบจำลองเมาส์อาจไม่ได้จำลองภูมิคุ้มกันของมนุษย์อย่างสมบูรณ์ คุณสมบัติ.

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

5. สรุปผลการวิจัย

ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาพรีคลินิกเกี่ยวกับวัคซีนอะดีโนไวรัสแสดงให้เห็นว่าวัคซีนมีความปลอดภัยและประสิทธิผลเพียงพอ ดังนั้นจึงอาจเป็นวัคซีนป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ที่มีแนวโน้มและเป็นไปได้

อ้างอิง

1. โตรกาโกส, IP; สตามาเทโลปูลอส, เค.; เทอร์โพส อี.; ซิตซิโลนิส, OE; ไอวาลิโอติ อี.; ปารัสเกวิส ด.; คาสทริติส, อี.; ปาฟลาคิส, GN; Dimopoulos, MA เจาะลึกวงจรชีวิต SARS-CoV-2 พยาธิสรีรวิทยา และการรักษาที่มีเหตุผลซึ่งกำหนดเป้าหมายไปที่ภาวะแทรกซ้อนทางคลินิกของ COVID-19 เจ. ไบโอเมด. วิทยาศาสตร์ 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gene ประจำเดือน: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 โปรตีนขัดขวางใหม่ของไวรัสโคโรนา เจ.คลิน. ปทุม. 2020, 73, 366–369. [ครอสอ้างอิง]

3. เชนิน ม.; จองบี.; ไปดี อาร์เคด; Pahan, K. การถดถอยของมะเร็งปอดในหนูโดยการบริหารทางจมูกของ SARS-CoV-2 Spike S1 มะเร็ง 2022, 14, 5648 [CrossRef]

4. คาดัม, เอสบี; สุขรามาณี, GS; บิชนอย ป.; ปาเบิล, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, ไวรัสโคโรนาที่แพร่ระบาด: ข้อมูลเชิงลึกระดับโมเลกุลและโครงสร้าง เจ. ไมโครไบโอลพื้นฐาน. 2021, 61, 180–202. [ครอสอ้างอิง]

5. สเติร์นเบิร์ก, อ.; Naujokat, C. ลักษณะโครงสร้างของโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ของไวรัสโคโรนา: เป้าหมายสำหรับการฉีดวัคซีน วิทยาศาสตร์ชีวิต 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. กำแพง เครื่องปรับอากาศ; ทอร์โตรีชี, แมสซาชูเซตส์; เฟรนซ์ บ.; สไนจ์เดอร์ เจ.; หลี่วว.; เรย์ เอฟเอ; ดิไมโอ ฟ.; บอช บีเจ; Veesler, D. Glycan โล่และการมาสก์อีพิโทปของโปรตีนสไปค์โคโรนาไวรัสที่สังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอน แนท. โครงสร้าง โมล ไบโอล 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. วัง ย.; วัง, ล.; เฉา, เอช.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 เหนือกว่า RBD ในฐานะแอนติเจนของวัคซีนหน่วยย่อยของ COVID-19 เจ.เมด. วิโรล. 2021, 93, 892–898. [ครอสอ้างอิง]

8. ธีโอฮาไรด์ TC; Conti, P. ระวัง SARS-CoV-2 Spike Protein: มีมากกว่าที่เห็น เจ. ไบโอล. ระเบียบ. โฮมอสท์. ตัวแทน 2021, 35, 833–838 [CrossRef] [PubMed]

9. กัว เอ็กซ์.; เติ้ง ย.; เฉิน เอช.; แลน เจ.; วังว.; โซว เอ็กซ์.; ฮุง ต.; ลู ซ.; Tan, W. ภูมิคุ้มกันทั้งระบบและเยื่อเมือกในหนูที่เกิดจากการสร้างภูมิคุ้มกันเพียงครั้งเดียวด้วยวัคซีนที่ใช้เวกเตอร์ adenovirus ประเภท 5 หรือ 41 ของมนุษย์ซึ่งมีโปรตีนขัดขวางของไวรัสโคโรนาในกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจในตะวันออกกลาง วิทยาภูมิคุ้มกัน 2015, 145, 476–484 [CrossRef] [PubMed]

10. เกา เจ.; เมส, เค.; บันซ์ โอ.; Ehrhardt, A. vectorology ของ adenovirus ของมนุษย์ที่ล้ำสมัยสำหรับแนวทางการรักษา กุมภาพันธ์ เลตต์. 2019, 593, 3609–3622. [ครอสอ้างอิง]

11. ซิง,เค.; ตู่ XY; หลิว ม.; เหลียง ZW; เฉิน เจเอ็น; หลี่เจเจ; เจียง แอลจี; ซิง เอฟคิว; Jiang, Y. ประสิทธิภาพและความปลอดภัยของวัคซีนป้องกันโควิด-19: การทบทวนอย่างเป็นระบบ จงกัว ดัง ไต้ เอ้อ เค่อ ซา จี้ 2021, 23, 221–228 [ครอสอ้างอิง]

12. วอยซีย์ ม.; คลีเมนส์, SAC; มาธี รัฐเซาท์แคโรไลนา; เว็คซ์, LY; โฟเลกัตติ PM; อลีย์ พีเค; แองกัส บ.; เบลลี่, VL; บาร์นาบัส SL; โบรัต, คิวอี; และคณะ ความปลอดภัยและประสิทธิภาพของวัคซีน ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) ต้าน SARS-CoV-2: การวิเคราะห์ชั่วคราวของการทดลองแบบสุ่มที่มีกลุ่มควบคุมสี่รายการในบราซิล แอฟริกาใต้ และสหราชอาณาจักร มีดหมอ 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. หลี่ ค.; กัว ย.; ฝาง ซ.; จาง เอช.; จาง ย.; Chen, K. การวิเคราะห์ประสิทธิภาพในการป้องกันของวัคซีนป้องกันโควิด-19 ที่ได้รับอนุมัติเพื่อต่อต้านสายพันธุ์กลายต่างๆ ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. แทนริโอเวอร์ นพ.; ทำ ˘ganay, HL; อโควา ม.; กูเนอร์, ทรัพยากรบุคคล; อาซัป, อ.; อคาน ส.; โคเซ, ธส.; แอร์ดินช์, F.; อคาลิน, เอ๊ะ; ตาบัก, Ö.F.; และคณะ ประสิทธิภาพและความปลอดภัยของวัคซีน SARS-CoV-2 แบบไวรัสชนิดเชื้อตาย (CoronaVac): ผลลัพธ์ชั่วคราวของการทดลองระยะที่ 3 แบบปกปิดทั้งสองด้าน แบบสุ่ม มีกลุ่มควบคุมด้วยยาหลอก ในตุรกี มีดหมอ 2021, 398, 213–222. [ครอสอ้างอิง]

15. เซี่ย ส.; จาง ย.; วังย.; วัง, เอช.; หยางย.; เกา แฟน; ตาล ว.; วู ก.; ซู ม.; Lou, Z. ความปลอดภัยและภูมิคุ้มกันของวัคซีน SARS-CoV-2 เชื้อตาย, BBIBP-CorV: การทดลองแบบสุ่ม ปกปิดสองด้าน ควบคุมด้วยยาหลอก ระยะที่ 1/2 มีดหมอติดเชื้อ โรค 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. หยาง ส.; หลี่ย.; ได, ล.; วังเจ.; เขาป.; หลี่ ค.; ฝาง เอ็กซ์.; วังค.; จ้าวเอ็กซ์.; หวางอี.; และคณะ ความปลอดภัยและภูมิคุ้มกันของวัคซีนหน่วยย่อยโปรตีนที่มี RBD ที่ใช้ไดเมอร์ริกแบบรีคอมบิแนนท์ซ้ำ (ZF2001) ต้านโควิด-19 ในผู้ใหญ่: การทดลองแบบสุ่ม ปกปิดสองด้าน ควบคุมด้วยยาหลอก ระยะที่ 1 และ 2 จำนวน 2 รายการ มีดหมอติดเชื้อ โรค 2021, 21, 1107–1119. [ครอสอ้างอิง]

17. Mallapaty ซึ่งเป็นวัคซีน DNA COVID ของอินเดีย ถือเป็นรายแรกของโลก และกำลังจะมาเพิ่มอีก ธรรมชาติ 2021, 597, 161–162. [ครอสอ้างอิง]

18. กรีโฟนี อ.; ไวสคอฟ ดี.; รามิเรซ ศรี; มาเตอุส เจ.; แดน เจเอ็ม; โมเดอบาเชอร์, CR; รอว์ลิงส์, เซาท์แคโรไลนา; ซูเธอร์แลนด์, อ.; เปรมกุมาร์ ล.; จาดี อาร์เอส; และคณะ เป้าหมายของการตอบสนองของทีเซลล์ต่อ SARS-CoV-2 โคโรนาไวรัสในมนุษย์ที่เป็นโรคโควิด-19 และบุคคลที่ไม่ได้รับเชื้อ เซลล์ 2020, 181, 1489–1501.e1415 [ครอสอ้างอิง]

19. เฉา ย.; ซู บ.; กัว เอ็กซ์.; ซัน, ว.; เติ้ง ย.; เบ้า, ล.; จู้คิว.; จางเอ็กซ์.; เจิ้ง ย.; เกิง, ซี.; และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่มีศักยภาพต่อโรค SARS-CoV-2 ระบุได้โดยการจัดลำดับเซลล์เดียวที่มีปริมาณงานสูงของเซลล์ B ของผู้ป่วยพักฟื้น เซลล์ 2020, 182, 73–84.e16 [ครอสอ้างอิง]

20. อมนัส ฟ.; วัคซีน Krammer, F. SARS-CoV-2: รายงานสถานะ ภูมิคุ้มกัน 2020, 52, 583–589 [ครอสอ้างอิง]

21. หลี่ย.; บี, ย.; เซียว เอช.; ยาว, ย.; หลิวเอ็กซ์.; หูซ.; ด้วน เจ.; หยางย.; หลี่ ซ.; หลี่ย.; และคณะ สูตรวัคซีนรวม DNA และโปรตีนแบบใหม่สำหรับโรคโควิด-19 ให้การป้องกันเต็มรูปแบบต่อโรค SARS-CoV-2 ในลิงแสม โผล่ออกมา จุลินทรีย์ติดเชื้อ 2021, 10, 342–355. [ครอสอ้างอิง]

22. ดู่ ล.; เฮ้.; โจว ย.; หลิว ส.; เจิ้ง บีเจ; Jiang, S. โปรตีนขัดขวางของ SARS-CoV ซึ่งเป็นเป้าหมายสำหรับการพัฒนาวัคซีนและการรักษา แนท. รายได้ไมโครไบโอล. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. ยู่ ล.; เฉา, เอช.; เสีย ต.; ลองร.; หลี่ฮ.; หยาง ต.; ยัน ม.; Xie, Z. โปรตีนนิวคลีโอแคปซิดที่ถูกตัดปลายด้วย N ของ SARS-CoV-2 เป็นเครื่องหมายทางซีรั่มวิทยาที่ดีกว่าโปรตีนนิวคลีโอแคปซิดทั้งหมดในการประเมินภูมิคุ้มกันของ SARS-CoV ที่ไม่ทำงาน-2 เจ.เมด. วิโรล. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. กรีนีย์, เอเจ; โลส์, แอน; อ่อนโยน LE; ครอว์ฟอร์ด, KHD; สตาร์, เทนเนสซี; มาโลน, KD; ชู, HY; Bloom, JD วัคซีน SARS-CoV-2 mRNA-1273 กระตุ้นการวางตัวเป็นกลางโดยเน้นที่ RBD มากขึ้น แต่มีการจับแอนติบอดีในวงกว้างมากขึ้นภายใน RBD bioRxiv 2021 [CrossRef]

25. แมนทัส ก.; นีฮอฟฟ์, เลอ; คอฟฟ์แมน RC; เอดารา, วีวี; ลาย, ล.; ฟลอยด์, เค.; ชิ, PY; การคุกคาม, VD; เอดูปูกันติ ส.; เชเรอร์, อีเอ็ม; และคณะ การประเมินการตอบสนองทางเซลล์และเซรุ่มวิทยาต่อการติดเชื้อ SARS-CoV แบบเฉียบพลัน-2 แสดงให้เห็นถึงความสำคัญเชิงหน้าที่ของโดเมนที่มีผลผูกพันกับตัวรับ เจ. อิมมูนอล. 2021, 206, 2605–2613. [ครอสอ้างอิง]

26. เขาย.; โจว ย.; หลิว ส.; คูซ.; หลี่วว.; ฟาร์ซาน ม.; Jiang, S. โดเมนที่มีผลผูกพันกับตัวรับของโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV ทำให้เกิดแอนติบอดีที่เป็นกลางที่มีศักยภาพสูง: นัยสำหรับการพัฒนาวัคซีนหน่วยย่อย ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 2004, 324, 773–781. [ครอสอ้างอิง]

27. เติ้ง ส.; เหลียง เอช.; เฉินพี.; หลี่ย.; หลี่ ซ.; แฟน ส.; วู, เค.; หลี่เอ็กซ์.; เฉิน ว.; ฉินย.; และคณะ การพัฒนาและการประยุกต์ใช้วัคซีนป้องกันเชื้อไวรัสพาหะในช่วงการแพร่ระบาดของโควิด-19 จุลินทรีย์ 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. จู้ เอฟซี; กวน XH; หลี่ ยงฮวา; หวง เจวาย; เจียง ต.; ฮู LH; หลี่ เจเอ็กซ์; หยาง เพื่อนรัก; วัง, ล.; วัง, ดับบลิวเจ; และคณะ ภูมิคุ้มกันและความปลอดภัยของวัคซีนชนิดรีคอมบิแนนท์อะดีโนไวรัส-5-เวกเตอร์โควิด-19 ในผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพแข็งแรงอายุ 18 ปีขึ้นไป: การทดลองระยะที่ 2 แบบสุ่ม ปกปิดสองด้าน ควบคุมด้วยยาหลอก มีดหมอ 2020, 396, 479–488 [ครอสอ้างอิง]

29. หลี่ ม.; กัว เจ.; ลู ส.; โจวร.; ชิ, เอช.; ชิ เอ็กซ์.; เฉิง ล.; เหลียงคิว.; หลิวเอช.; วัง ป.; และคณะ การฉีดวัคซีนครั้งเดียวด้วยวัคซีนจากชิมแปนซีอะดีโนไวรัสจะกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันอย่างยั่งยืนและป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. กัว เจ.; มอนดาล ม.; Zhou, D. การพัฒนาเวกเตอร์วัคซีนชนิดใหม่: เวกเตอร์ adenoviral ของชิมแปนซี ฮัม วัคซีนภูมิคุ้มกัน. 2018, 14, 1679–1685. [ครอสอ้างอิง]

31. น. คาเนโกะ.; คูโอ เอชเอช; บูเคา เจ.; ชาวนา เจอาร์; อัลลาร์ด-ชามาร์ด, เอช.; มหาจัน VS; Piechocka-Trocha, A.; เลเวรี, ก.; ออสบอร์น ม.; บาลส์, เจ.; และคณะ การสูญเสีย Bcl-6-การแสดงออกของเซลล์ตัวช่วยฟอลลิคูลาร์และศูนย์เชื้อโรคในโรคโควิด-19 เซลล์ 2020, 183, 143–157.e113 [CrossRef] [PubMed]

32. เล็กซ์เบิร์ก เอ็มเอช; ทอบเนอร์, อ.; อัลเบรชท์ ฉัน.; เลพีนีส ฉัน.; ริกเตอร์, อ.; คัมราดต์ ต.; แรดบรูช, อ.; Chang, HD IFN- และ IL-12 ประสานกันเพื่อแปลง ในสิ่งมีชีวิต สร้าง Th17 ให้เป็นเซลล์ Th1/Th17 ยูโร เจ. อิมมูนอล. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. หลิว เจ.; ซู, เค.; ซิง ม.; โจว ย.; กัว เจ.; ดู่ ม.; วังคิว.; ใดๆ.; หลี่ เจ.; เกา ป.; และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันแบบไพรม์บูสต์แบบเฮเทอโรโลจีสด้วยเวกเตอร์อะดีโนไวรัสของชิมแปนซีทำให้เกิดภูมิคุ้มกันที่ทรงพลังและป้องกันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 เซลล์ดิสคอฟ 7 กันยายน 2021 123 [CrossRef] [PubMed]