การเปลี่ยนผ่านอย่างแข็งขันของระยะหน่วยความจำความกลัวจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์ผ่านการป้องกันการรวมตัวของ ERK-Mediated

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

ดิดึงความทรงจำแห่งความกลัวทำให้เกิดกระบวนการหน่วยความจำที่ตรงกันข้ามสองกระบวนการ กล่าวคือ การรวมใหม่และการสูญพันธุ์ การดึงข้อมูลโดยสังเขปทำให้เกิดการรวมบัญชีใหม่เพื่อรักษาหรือเพิ่มความจำความกลัวในขณะที่การดึงข้อมูลเป็นเวลานานทำให้ความทรงจำนี้ดับลง ถึงแม้ว่ากลไกของการรวมบัญชีและการสูญพันธุ์จะได้รับการตรวจสอบแล้ว แต่ก็ยังไม่ทราบว่าขั้นตอนของความทรงจำที่น่ากลัวนั้นเปลี่ยนจากการรวมบัญชีอีกครั้งเป็นการสูญพันธุ์ในระหว่างการดึงหน่วยความจำได้อย่างไร ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่ากระบวนการเปลี่ยนหน่วยความจำที่ขึ้นกับไคเนสที่ควบคุมสัญญาณ (ERK) นอกเซลล์หลังจากการดึงข้อมูลจะควบคุมการสลับเฟสของหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์โดยป้องกันการเหนี่ยวนำการรวมใหม่ในงานหลีกเลี่ยงการยับยั้ง (IA) ในหนูเพศผู้ ประการแรก ระยะหน่วยความจำการเปลี่ยนแปลง ซึ่งยกเลิกการเหนี่ยวนำการรวมใหม่ แต่ไม่เพียงพอสำหรับการได้มาซึ่งการสูญพันธุ์ ถูกระบุหลังจากการรวมบัญชีใหม่ แต่ก่อนระยะการสูญพันธุ์ ประการที่สอง ระยะการรวมตัว การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์หลังจากการดึงหน่วยความจำแสดงให้เห็นลายเซ็นระดับโมเลกุลและเซลล์ที่แตกต่างกันผ่านโปรตีนซึ่งจับองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อแคมป์ (CREB) และ ERK ฟอสโฟรีเลชันในอะมิกดาลา ฮิปโปแคมปัส และเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าที่อยู่ตรงกลาง (mPFC) ระยะการรวมตัวใหม่แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของ CREB phosphorylation ในขณะที่ระยะการสูญพันธุ์แสดงประชากรประสาทหลายกลุ่มด้วยการผสมผสานของ CREB และ/หรือ ERK ฟอสโฟรีเลชัน ในบริเวณสมองเหล่านี้ ที่น่าสนใจ ระยะหน่วยความจำสามเฟส รวมถึงระยะการเปลี่ยนภาพ แสดงการเปิดใช้งาน ERK ชั่วคราวทันทีหลังจากการดึงข้อมูล สิ่งที่สำคัญที่สุด การปิดล้อมของ ERK ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส หรือ mPFC ที่เฟสหน่วยความจำทรานสิชั่น ยับยั้งการเพิ่มประสิทธิภาพหน่วยความจำ IA ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการรวมใหม่ การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเส้นทางการส่งสัญญาณ ERK ควบคุมการเปลี่ยนแปลงของเฟสหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์และกระบวนการนี้ทำหน้าที่เป็นสวิตช์ที่ยกเลิกการรวมความกลัวอีกครั้งหน่วยความจำ.

คำสำคัญ: ERK; การสูญพันธุ์;กลัวความทรงจำ; การรวมตัวใหม่; การเปลี่ยนแปลง

1ภาควิชาชีววิทยาศาสตร์ คณะชีววิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรแห่งโตเกียว โตเกียว 156-8502 ประเทศญี่ปุ่น และ

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

แถลงการณ์สำคัญ

ดึงความทรงจำแห่งความกลัวทำให้เกิดกระบวนการหน่วยความจำที่ตรงกันข้ามสองกระบวนการ การรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ การควบรวมกิจการจะคงไว้ซึ่ง/เสริมความจำความกลัวในขณะที่การสูญพันธุ์ทำให้ความจำความกลัวอ่อนแอลง ยังไม่ทราบวิธีการเปลี่ยนเฟสหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์ในระหว่างการดึงข้อมูล ที่นี่ เราระบุกระบวนการเปลี่ยนหน่วยความจำที่ใช้งานอยู่ซึ่งทำหน้าที่เป็นสวิตช์ที่ยับยั้งการรวมใหม่ ระยะการเปลี่ยนภาพหน่วยความจำนี้แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของฟอสโฟรีเลชันไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ (ERK) ชั่วคราวในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าตรงกลาง (mPFC) ที่น่าสนใจ การยับยั้ง ERK ในบริเวณเหล่านี้ในช่วงการเปลี่ยนภาพไม่ยับยั้งการเพิ่มประสิทธิภาพหน่วยความจำการหลีกเลี่ยงแบบหลีกเลี่ยง (IA) ที่อาศัยการรวมบัญชีใหม่ การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ากระบวนการหน่วยความจำทรานซิชันควบคุมการเปลี่ยนเฟสของหน่วยความจำความกลัวของหน่วยความจำความกลัวอย่างแข็งขันโดยป้องกันการเหนี่ยวนำการรวมใหม่ผ่านการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ ERK

บทนำ

การดึงหน่วยความจำไม่ใช่กระบวนการแบบพาสซีฟ แต่เป็นกระบวนการที่มีพลวัตมากกว่าที่ช่วยให้สามารถบำรุงรักษา เสริมกำลัง อ่อนตัว หรือเปลี่ยนแปลง/อัปเดตหน่วยความจำดั้งเดิม (Misanin et al., 1968; Schneider and Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. , 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader and Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima et al., 2014) ที่สำคัญ ความทรงจำของความกลัวแบบมีเงื่อนไขที่ดึงมาได้จากการเปิดรับสิ่งเร้าแบบมีเงื่อนไข (CS) อีกครั้งสั้น ๆ จะกลายเป็นสิ่งที่ไม่แน่นอนและจำเป็นต้องมีการรวมตัวใหม่ที่ขึ้นกับการแสดงออกของยีนเพื่อการบำรุงรักษาหรือเพิ่มประสิทธิภาพ (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel et al., 2005; Fukushima et al., 2014) ในทางกลับกัน การเปิดรับ CS ซ้ำ ๆ อย่างต่อเนื่องหรือซ้ำ ๆ ทำให้เกิดการสูญเสียความทรงจำซึ่งทำให้ความทรงจำที่น่ากลัวอ่อนแอลง (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers and Davis, 2002) ดังนั้นดึงความทรงจำแห่งความกลัวทำให้เกิดกระบวนการหน่วยความจำที่ตรงกันข้ามสองกระบวนการ กล่าวคือ การรวมใหม่และการสูญพันธุ์ แม้ว่ากระบวนการทั้งสองจะถูกเหนี่ยวนำโดยการเปิดรับ CS ที่เหมือนกันอีกครั้ง แต่จะแตกต่างกันตามระยะเวลาของการเปิดรับ CS อีกครั้ง

ลักษณะทางชีวเคมีทั่วไปและที่สำคัญของการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์คือข้อกำหนดสำหรับการแสดงออกของยีนที่มีสื่อกลางที่ตอบสนองต่อองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อแคมป์ (CREB) (Mamiya et al., 2009) ที่น่าสนใจ เราได้แสดงให้เห็นความแตกต่างของลายเซ็นระดับโมเลกุล กายวิภาค และพฤติกรรมระหว่างขั้นตอนการรวมบัญชีและการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำความกลัวตามบริบท (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009) การปิดกั้นการสังเคราะห์โปรตีนระหว่างระยะการรวมตัวใหม่จะขัดขวางความทรงจำของความกลัวดั้งเดิม ในขณะที่การปิดกั้นการสังเคราะห์โปรตีนระหว่างระยะการสูญพันธุ์จะไม่สามารถทำได้ แม้ว่าหน่วยความจำของความกลัวตามบริบทจะเปิดใช้งานอีกครั้ง ความต้องการของบริเวณสมองที่แสดงการกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่อาศัย CREB นั้นแตกต่างกันระหว่างการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ การรวมตัวใหม่ขึ้นอยู่กับ amygdala และ hippocampus ในขณะที่การสูญพันธุ์ขึ้นอยู่กับ amygdala และ medial prefrontal cortex (mPFC) อย่างไรก็ตาม ระยะเวลาของการเปิดใช้งาน amygdaloid CREB นั้นแตกต่างกันระหว่างขั้นตอนของการรวมบัญชีอีกครั้งและการสูญพันธุ์ ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าระยะการรวมตัวและการสูญพันธุ์ไม่ได้เป็นอิสระ แต่มีปฏิสัมพันธ์ซึ่งกันและกัน ที่น่าสนใจคือ การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ได้ระบุกรอบเวลา (ระยะการเปลี่ยนภาพ) ที่ไม่แสดงการกระตุ้นไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ (ERK) ในต่อมทอนซิลหลังการรวมกลุ่มอีกครั้ง แต่ก่อนระยะการสูญพันธุ์หลังจากการดึงหน่วยความจำความกลัวการได้ยิน (Merlo et al., 2018) ). เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นกลไกที่เป็นไปได้โดยการเปลี่ยนเฟสของหน่วยความจำจากการรวมบัญชีเป็นการสูญพันธุ์ระหว่างดึงความทรงจำแห่งความกลัว. กล่าวอีกนัยหนึ่ง อาจเป็นไปได้ว่ากระบวนการเปลี่ยนหน่วยความจำจะควบคุมสวิตช์นี้อย่างแข็งขัน

ในงานการหลีกเลี่ยงสารยับยั้ง (IA) หนูจะได้รับช็อตไฟฟ้าหลังจากที่พวกมันเข้าไปในช่องมืดจากช่องแสงและรูปแบบหน่วยความจำเพื่อหลีกเลี่ยงช่องมืด ก่อนหน้านี้ โดยงานนี้ เราแสดงให้เห็นว่าระยะการรวมตัวและการสูญพันธุ์สามารถแยกแยะได้ ณ จุดเวลาที่เมาส์เข้าไปในช่องมืดจากช่องแสงระหว่างช่วงการรับแสงซ้ำ (Fukushima et al., 2014) ดังนั้นงานนี้ช่วยให้เราสามารถอธิบายลักษณะเฉพาะของเปอร์สเปคทีฟลายเซ็นระดับโมเลกุลของเฟสการรวมบัญชีและการสูญพันธุ์ ตรงกันข้ามกับกระบวนทัศน์การปรับสภาพความกลัวตามบริบทแบบคลาสสิกซึ่งการเปิดใช้งานหน่วยความจำความกลัวแบบมีเงื่อนไขอีกครั้งโดยการเปิดเผย CS อีกครั้งจะเริ่มต้นทั้งการรวมและการสูญพันธุ์ ระยะสั้น (3 นาที) การเปิดเผยซ้ำไปยังบริบทที่มีเงื่อนไขจะทำให้เกิดการรวมใหม่ ในขณะที่การเปิดรับบริบทนี้เป็นเวลานาน (30 นาที) หรือซ้ำหลายครั้งทำให้เกิดการสูญพันธุ์ (Eisenberg et al., 2003; Pedreira and Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee et al., 2008; Mamiya et al., 2009) นอกจากนี้ เราพบว่าหน่วยความจำ IA ที่ดึงมานั้นได้รับการปรับปรุงผ่านการรวมหน่วยความจำใหม่ในงานนี้ (Fukushima et al., 2014)

เพื่อให้เข้าใจกลไกการเปลี่ยนจากการควบรวมกิจการเป็นการสูญพันธุ์ในช่วงดึงความทรงจำแห่งความกลัวเรามุ่งหมายที่จะระบุและกำหนดลักษณะลายเซ็นระดับโมเลกุล ระดับเซลล์ และพฤติกรรมของระยะการรวมตัวใหม่ การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA เราวิเคราะห์การเปิดใช้งาน CREB และ ERK ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และ mPFC ในขั้นตอนการรวมบัญชี การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ และตรวจสอบบทบาทของการเปิดใช้งาน ERK ในกระบวนการหน่วยความจำเหล่านี้

วัสดุและวิธีการ

หนู การทดลองทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง (สมาคมประสาทวิทยาศาสตร์แห่งประเทศญี่ปุ่นและมหาวิทยาลัยเกษตรแห่งโตเกียว) การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดที่ดำเนินการในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยเกษตรแห่งโตเกียว (การอนุญาต #280037) ขั้นตอนการผ่าตัดทั้งหมดดำเนินการภายใต้การระงับความรู้สึก Nembutal และพยายามทุกวิถีทางเพื่อลดความทุกข์ทรมาน หนูเมาส์ C57BL/6N เพศผู้ได้รับมาจากแม่น้ำชาร์ลส์ หนูถูกเลี้ยงในกรงห้าหรือหกตัว รักษาวงจรแสง/มืด 12/12 ชม. และอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ตามต้องการ หนูอายุอย่างน้อยแปดสัปดาห์เมื่อทำการทดสอบ ทำการทดสอบในช่วงแสงของวัฏจักร การทดลองทั้งหมดดำเนินการแบบตาบอดต่อสภาพการรักษาของหนู

การทดสอบ IA อุปกรณ์ IA แบบทีละขั้นตอน (OHARA Pharmaceutical) ประกอบด้วยกล่องที่มีช่องแยกแสงและความมืด (ทั้ง 15.5 12.5 11.5 ซม.) ช่องไฟส่องสว่างด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016) ก่อนเริ่มการฝึก IA หนูจะได้รับการจัดการทีละ 2 นาทีในแต่ละวันเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ ในระหว่างการฝึกซ้อม หนูแต่ละตัวได้รับอนุญาตให้คุ้นเคยกับช่องแสงเป็นเวลา 30 วินาที และประตูกิโยตินถูกยกขึ้นเพื่อให้สามารถเข้าถึงช่องมืดได้ เวลาแฝงในการเข้าสู่ช่องมืดถือเป็นตัววัดการได้มา ทันทีที่หนูเข้าไปในห้องมืด ประตูกิโยตินก็ปิดลง หลังจากผ่านไป 5 วินาที จะมีการส่ง footshock (0.2 mA) เป็นระยะเวลารวม 2 วินาที (การฝึก) ที่ 24 ชั่วโมงหลังการฝึก วางเมาส์กลับเข้าไปในช่องแสงจนกระทั่งเข้าไปในช่องมืด (เฉลี่ย 459 6 15.49 วินาที) ทันทีหลังจากที่เมาส์เข้าไปในช่องมืด ประตูกิโยตินก็ปิด และเมาส์ก็อยู่ในช่องมืดเป็นเวลาที่แตกต่างกัน (0, 1 หรือ 10 นาที) โดยไม่มีการกระตุ้นด้วยเท้า (การเปิดใช้งานใหม่) หน่วยความจำได้รับการประเมิน 48 ชั่วโมงต่อมา [การทดสอบหน่วยความจำระยะยาวหลังการเปิดใช้งาน (PR-LTM)] เป็นเวลาแฝงแบบครอสโอเวอร์สำหรับเมาส์เพื่อเข้าสู่ช่องมืดเมื่อเปลี่ยนในช่องแสง เช่นเดียวกับการเปิดใช้งานอีกครั้ง

สำหรับการทดลองแรก เราตรวจสอบผลของการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนหลังการเปิดใช้งานใหม่ (เปิดรับซ้ำไปยังส่วนมืดเป็นเวลา 0, 1 หรือ 10 นาที; รูปที่ 1) อะนิโซมัยซินซึ่งยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน (ANI; Wako) ถูกละลายในน้ำเกลือ (pH ที่ปรับเป็น 7.0–7.4 ด้วย NaOH) หนูได้รับการฝึกอบรมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และใน 24 ชั่วโมงต่อมา พวกเขาได้รับยานพาหนะ (VEH) หรือ ANI (150 มก./กก., ip) ทันทีหลังจากที่สัมผัสกับช่องมืดอีกครั้งเป็นเวลา 0, 1 หรือ 10 นาทีโดยไม่มีการกระแทก (เปิดใช้งานใหม่). ในปริมาณนี้ ANI ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนในสมองร้อยละ 0.90 ในช่วง 2 ชั่วโมงแรก (Flood et al., 1973) ที่ 48 ชั่วโมงหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่ หนูแต่ละตัวจะถูกวางอีกครั้งในช่องแสงและประเมินเวลาแฝงของครอสโอเวอร์

สำหรับการทดลองครั้งที่สอง [phosphorylated CREB (pCREB) และ phosphorylated ERK (pERK) immunohistochemistry; มะเดื่อ 2–5] เราตรวจสอบบริเวณสมองที่ถูกกระตุ้นหลังจากเปิดรับแสงอีกครั้ง (จนกว่าหนูจะเข้าไปในช่องมืด เปิดรับช่องมืดอีกครั้งเป็นเวลา 0 นาที) หรือช่องมืด (ซ้ำ) สัมผัสกับช่องมืดเป็นเวลา 1 หรือ 10 นาที) หนูถูกแบ่งออกเป็นสี่ฟุกุชิมะและคณะ · การเปลี่ยนแปลงของระยะความทรงจำแห่งความกลัวหลังการดึงข้อมูล J. Neurosci., 10 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2564, • 41(6):1288–1300 • 1289 กลุ่ม ที่ 24 ชั่วโมงหลังการฝึก หนูแต่ละตัวถูกเปิดโปงอีกครั้งไปยังช่องแสงและจากนั้นก็อยู่ในช่องมืดหลังจากพวกมันเข้ามาจากช่องมืด [การเปิดใช้งานใหม่: 0 นาทีในห้องมืด กลุ่มการรวมตัวใหม่ (Recon); 1 นาที กลุ่มเปลี่ยนผ่าน (ตรัง) 10 นาที กลุ่มการสูญพันธุ์ (Ext)] หนูอีกกลุ่มหนึ่งไม่ถูกส่งคืนไปยังส่วนสว่าง/มืด [กลุ่มที่ไม่เปิดใช้งานใหม่ (NR)] จากนั้น หนูเมาส์ถูกทำให้ชาด้วย Nembutal (750 มก./กก., ip) ที่ 5, 15 หรือ 30 นาทีหลังการเปิดใช้งานอีกครั้ง

สำหรับการทดลองครั้งที่สาม (microinfusion ของ U{{20}}126; รูปที่ 6,7) เราตรวจสอบผลกระทบของการยับยั้ง ERK ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส หรือ mPFC ต่อการรวมตัวใหม่/การปรับปรุงหน่วยความจำ การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ สารยับยั้ง MEK U0126 (Sigma-Aldrich) ละลายในน้ำไขสันหลังเทียมที่มี Tween 80 (Sigma) สามหยดในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 7.5 เปอร์เซ็นต์ (วาโก) 2.5 มล. และปรับเป็น pH 7.4 กับ NaOH หนูได้รับการฝึกอบรมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และ 24 ชั่วโมงต่อมา พวกมันถูกวางกลับเข้าไปในช่องแสง (การเปิดใช้งานอีกครั้ง) หนูเมาส์ถูกไมโครอินฟิวส์กับ U0126 (1 มก.) หรือ VEH เข้าไปในบริเวณสมองต่างๆ ทันทีหลังจาก (รูปที่ 6A, C, E–H, 7A–C) หรือ 30 นาทีหลังจาก (รูปที่ 6B, D) เปิดใช้งานอีกครั้ง ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปิดใช้งานใหม่ หนูแต่ละตัวถูกวางอีกครั้งในช่องแสงและค่าหน่วงเวลาของครอสโอเวอร์ถูกประเมิน (PR LTM) การฉีดไมโครอินฟิวชั่นในฮิบโปแคมปัสและ mPFC (0.5 มล.) เกิดขึ้นที่อัตรา 0.25 มล./นาที ไมโครอินฟิวชั่นในต่อมอมิกดาลา (0.2 มล.) ทำขึ้นที่อัตรา 0.1 มล./นาที cannula ที่ฉีดถูกทิ้งไว้เป็นเวลา 2 นาทีหลังจากการให้ microinfusion และหนูก็ถูกนำกลับไปยังกรงบ้านของพวกมัน สารยับยั้ง MEK SL327 (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ) ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์และเจือจางด้วยน้ำเกลือ หนูได้รับการฝึกอบรมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และ 24 ชั่วโมงต่อมา หนูแต่ละตัวถูกวางกลับเข้าไปในช่องแสง (การเปิดใช้งานอีกครั้ง) หนูเมาส์ถูกฉีดทั่วระบบด้วย SL327 (10 หรือ 20 มก./กก.) หรือ VEH ทันทีหลังจากการกระตุ้นอีกครั้ง (รูปที่ 7D–F) ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปิดใช้งานใหม่ หนูแต่ละตัวถูกวางอีกครั้งในช่องแสงและค่าหน่วงเวลาของครอสโอเวอร์ถูกประเมิน (PR-LTM)

อิมมูโนฮิสโตเคมีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019) หลังจากการดมยาสลบ หนูทุกตัวได้รับพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ สมองถูกเอาออก ตรึงค้างคืน ถ่ายโอนไปยังซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์ และเก็บไว้ที่ 4 องศา ส่วนโคโรนาล (30 มม.) ถูกตัดด้วยเครื่องแช่แข็ง

สำหรับการย้อมสี pCREB และ pERK ส่วนที่ลอยได้อิสระถูกบำบัดด้วย H2O2 1 เปอร์เซ็นต์ และบ่มข้ามคืนด้วยโพลีโคลนัลแอนติ-ฟอสโฟ-CREB (ซีรีน 133; S133) ของกระต่าย (1:1000; #{{10 }}, มิลลิพอร์) และ/หรือโมโนโคลนัลแอนติ-ฟอสโฟ-ERK1/2 (T202/Y204) ของกระต่าย (1:300; #4370; เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์) ในสารละลายบล็อกกิ้ง (น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตบวก 1 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มอัลบูมินจากแพะ 1 มก./มล. เซรั่มอัลบูมินจากวัว และ 0.05 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100) ส่วนต่างๆ ถูกล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตและฟักไข่ด้วย IgG ต้านกระต่ายเปอร์ออกซิเดสที่คอนจูเกต (1:500; Jackson ImmunoResearch) สำหรับ pCREB หรือ IgG ต่อต้านกระต่าย IgG ของแพะคอนจูเกตที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชสำหรับ pERK เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง สัญญาณ pCREB ถูกขยายโดยไบโอติน ไทราไมด์ และแสดงภาพโดยใช้ Alexa Fluor-conjugated streptavidin (Invitrogen) สัญญาณ peRK ถูกขยายด้วย TSA-FCM (Invitrogen) ส่วนต่าง ๆ ถูกติดตั้งบนสไลด์และปิดฝาโดยใช้สื่อการติดตั้ง (Millipore)

การหาปริมาณดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008) โครงสร้างถูกกำหนดทางกายวิภาคตามแผนที่ของ Franklin และ Paxinos (1997) เซลล์ประสาทอิมมูโนรีแอคทีฟทั้งหมดถูกนับโดยผู้ทดลองที่ตาบอดต่อเงื่อนไขการรักษา

ผลลัพธ์

การกำหนดลักษณะของเฟสหน่วยความจำหลังจากการดึงข้อมูลในงาน IA

งาน IA ช่วยให้เราสามารถแยกแยะขั้นตอนการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ ณ จุดเวลาที่เมาส์เข้าไปในช่องมืดจากช่องแสง (Fukushima et al., 2014) เพื่อให้เข้าใจกลไกที่เป็นพื้นฐานของการเปลี่ยนเฟสหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์ เราจึงระบุขั้นตอนหน่วยความจำ IA หลังจากการดึงหน่วยความจำโดยตรวจสอบผลของการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนที่จำเป็นสำหรับการรวมและการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA (Fukushima et al., 2557). หนูถูกวางไว้ในช่องไฟก่อน เมื่อผ่านไป 5 วินาทีหลังจากที่พวกเขาเข้าไปในห้องมืด โช้คไฟฟ้าแบบสั้นก็ถูกส่งออกมา (การฝึก) หนูทดลองถูกเปิดโปงอีกครั้งไปยังช่องแสง 24 ชั่วโมงหลังการฝึก (ช่วงการเปิดใช้งานใหม่; รูปที่ 1A) และเวลาแฝงของครอสโอเวอร์เพื่อเข้าสู่ช่องมืดถูกประเมิน (รูปที่ 1B) หนูถูกนำกลับเข้าไปในกรงบ้านทันทีหลังจากที่เข้าไปในช่องมืดจากช่องแสง (0-นาทีที่เปิดรับช่องมืดอีกครั้ง; ระยะการรวมตัว) หรืออยู่ในช่องมืดเป็นเวลา 1, 3 หรือ 10 นาทีโดยไม่เกิด footshock (ระยะการสูญพันธุ์; รูปที่ 1C–E) ทันทีหลังช่วงการเปิดใช้งานใหม่ หนูเมาส์ได้รับการฉีด VEH หรือ ANI ตัวยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนอย่างเป็นระบบ ที่ 48 ชั่วโมงต่อมา เวลาแฝงของครอสโอเวอร์ถูกประเมิน PR-LTM

สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา (Fukushima et al., 2014) การเปิดรับแสงซ้ำในช่องแสง (กลุ่ม 0 นาที) ทำให้เกิดการรวมใหม่และการเพิ่มประสิทธิภาพของหน่วยความจำ IA การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางเปิดเผยผลกระทบที่มีนัยสำคัญของเวลา (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036) ยา (F(1 ,24)=23.197, p , 0.0001) และเวลาที่ปฏิกิริยาระหว่างยา (F(1,24)=25.022, p , 0.0001; รูปที่ 1B) หลังการทดสอบเฉพาะกิจ Bonferroni และ t-test ที่จับคู่เปิดเผยว่ากลุ่ม VEH และ ANI เพิ่มขึ้นหรือลดลงอย่างมีนัยสำคัญตามลำดับเวลาแฝงของครอสโอเวอร์ที่ PR-LTM เมื่อเทียบกับเซสชันการเปิดใช้งานใหม่ (ps , 0.05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; รูปที่ 1B) การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่าการดึงหน่วยความจำ IA ในช่องแสงช่วยเพิ่มความจำ ในขณะที่การยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนรบกวนหน่วยความจำที่ดึงมา ซึ่งยืนยันข้อสังเกตก่อนหน้านี้ว่าการดึงหน่วยความจำ IA ช่วยเพิ่มความจำผ่านการรวมใหม่ในลักษณะที่ขึ้นกับกระบวนการสังเคราะห์โปรตีน

ในทางตรงกันข้าม การเปิดรับส่วนมืดอีกครั้งทำให้เกิดการสูญพันธุ์ในระยะยาว [ความแปรปรวนสองทาง เวลา (รูปที่ 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; รูปที่ 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), ยา (รูปที่ 1C, F (1,28)=4.674, p=0.039; รูปที่ 1D, F (1,36)=12.285, p {{29 }}.0012) เวลาปฏิกิริยาระหว่างยา (รูปที่ 1C, F (1,28)=7.916, p=0.009; รูปที่ 1D, F (1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)] ตามที่สังเกตก่อนหน้านี้ (Fukushima et al., 2014) กลุ่ม VEH ที่อยู่ในช่องมืดเป็นเวลา 3 หรือ 10 นาทีพบว่ามี cross over latency ที่ PR-LTM ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับช่วงการเปิดใช้งานใหม่ ในขณะที่กลุ่ม ANI แสดง crossover latency ที่เปรียบเทียบกันได้ที่ PR-LTM เมื่อเทียบกับช่วงการเปิดใช้งานใหม่และ กลุ่ม VEH (หลังการทดสอบของ Bonferroni, ps , 0.05; การทดสอบ t ที่จับคู่กัน, รูปที่ 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p . 0.05; รูปที่ 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0.0001, ANI, t(9)=1.02, p . 0.05 ). ความแปรปรวนของผู้สังเกตการณ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการสัมผัสซ้ำในช่องมืดเป็นเวลา 3 หรือ 10 นาทีดับหน่วยความจำ IA และการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนนั้นขัดขวางการสูญพันธุ์ในระยะยาว ดังนั้น การดึงหน่วยความจำ IA ในช่องที่มืดจะดับหน่วยความจำ IA ในลักษณะของการแสดงออกของยีน

ที่สำคัญ กลุ่ม VEH แสดงค่าเวลาแฝงข้ามที่เปรียบเทียบได้ที่ PR-LTM เมื่อเทียบกับเซสชันการเปิดใช้งานใหม่และกับกลุ่ม ANI เมื่อพวกเขาอยู่ในช่องมืดเป็นเวลา 1 นาที [ความแปรปรวนสองทาง เวลา (F(1,36)) {{ 5}}.03, p . 0.05), ยา (F(1,36)=0.019, p . 0.05), เวลาปฏิกิริยาระหว่างยา (F(1,36)=0.011, p . 0.05); โพสต์เฉพาะกิจของ Bonferroni ป.ล. 0.05; จับคู่ t-test, VEH, t(9)=0.091, p . 0.05, ANI, t(9)=0.328, p . 0.05; รูปที่ 1E]. การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่ากลุ่ม VEH ไม่มีการเพิ่มประสิทธิภาพหรือการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA และกลุ่ม ANI ไม่มีการหยุดชะงักของหน่วยความจำ IA ดังนั้น การเปิดรับแสงซ้ำในช่องมืดเป็นเวลา 1 นาทีจะบล็อกทั้งการเพิ่มประสิทธิภาพและการหยุดชะงักที่เกิดจาก ANI ของหน่วยความจำ IA ที่เปิดใช้งานใหม่ แต่ไม่ได้ทำให้หน่วยความจำ IA ดับลง ซึ่งบ่งชี้ว่าการรับแสงซ้ำ 1- นาทีนี้จะยกเลิกการเหนี่ยวนำการรวมใหม่ แต่ไม่เพียงพอต่อการดับหน่วยความจำ IA

โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเปิดรับแสงซ้ำไปยังช่องแสงทำให้เกิดระยะการรวมบัญชีใหม่ ในขณะที่การเปิดรับแสงอีกครั้งไปยังส่วนมืดนานขึ้น (3 หรือ 10 นาที) ทำให้เกิดระยะการสูญพันธุ์ ที่สำคัญกว่านั้น การอยู่ในช่องมืดเป็นเวลา 1 นาทีจะทำให้เกิดช่วงการเปลี่ยนผ่านจากการรวมเป็นการรวมตัวใหม่เป็นการสูญพันธุ์ ซึ่งยับยั้งความกลัวการรวมหน่วยความจำใหม่โดยไม่ทำให้เกิดการสูญพันธุ์

ลายเซ็นระดับโมเลกุลของระยะการรวมตัว การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และ mPFC หลังจากการดึงหน่วยความจำ IA

การรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำความกลัวตามบริบทแสดงการเพิ่มขึ้นของ CREB phosphorylation ที่ S133 ซึ่งเป็นเครื่องหมายของการกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่จำเป็นสำหรับการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ในระยะยาว แต่แสดงการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนของ CREB phosphorylation (Mamiya et al., 2009 ). ที่น่าสนใจคือ การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าไม่มีการเพิ่มขึ้นของฟอสโฟรีเลชั่นของ ERK ซึ่งเป็นตัวควบคุมต้นน้ำของ CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001) ในบริเวณฐานของต่อมทอนซิลเมื่อเปลี่ยนจากการรวมตัวใหม่ สู่การสูญพันธุ์ของความทรงจำแห่งความกลัวที่ชี้นำ แม้ว่าฟอสโฟรีเลชันนี้จะเพิ่มขึ้นในบริเวณข้างก้นเมื่อมีการรวมตัวและดับความทรงจำของความกลัวที่ชี้นำ (Merlo et al., 2014, 2018). การศึกษาอื่นระบุว่าฮิปโปแคมปัส ERK ถูกเปิดใช้งานก็ต่อเมื่อความทรงจำเกี่ยวกับความกลัวตามบริบทถูกระงับ แต่ไม่ได้รับการรวมใหม่ (Tronson et al., 2009) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าระยะการรวมตัว การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์แสดงให้เห็นลายเซ็นระดับโมเลกุลและระดับเซลล์ที่แตกต่างกัน ดังนั้นเราจึงวัดและเปรียบเทียบระดับของ pCREB และ pERK ในขั้นตอนการรวมบัญชี การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์โดยใช้อิมมูโนฮิสโตเคมี เราทำตารางการทดลองที่คล้ายกันดังในรูปที่ 1B, D, E โดยใช้กลุ่มทดลองสี่กลุ่ม หนูถูกเปิดโปงไปที่ช่องแสงอีกครั้งที่ 24 ชั่วโมงหลังการฝึก จากนั้นให้พักในห้องมืด [เปิดใช้งานใหม่: 0 นาทีในกลุ่มที่มืด 1 นาที กลุ่มเปลี่ยนผ่าน (ตรัง) 10 นาที กลุ่มการสูญพันธุ์ (Ext)] หนูอีกกลุ่มหนึ่งไม่ถูกส่งคืนไปยังส่วนสว่าง/มืด (กลุ่ม NR ที่ไม่ได้เปิดใช้งานใหม่) เรานับเซลล์ประสาท pCREB-positive (pCREB1), เซลล์ประสาท pERK-positive (pERK1) และเซลล์ประสาทแบบ double-positive (pCREB1/pERK1) ในอะมิกดาลา ฮิปโปแคมปัส และ mPFC ที่ 30 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่

Amygdala (บริเวณด้านข้าง) CREB ถูกเปิดใช้งานในขั้นตอนการสูญพันธุ์และการรวมตัวใหม่ ในขณะที่ ERK ถูกเปิดใช้งานในระยะการสูญพันธุ์เท่านั้น (รูปที่ 2A–C) ANOVA ทางเดียวเผยให้เห็นผลกระทบที่มีนัยสำคัญของกลุ่ม (รูปที่ 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001) คล้ายกับการค้นพบก่อนหน้านี้ (Mamiya et al., 2009) การทดสอบ post hoc Newman–Keuls เปิดเผยว่ากลุ่ม Recon และ Ext แสดงเซลล์ประสาท pCREB1 มากกว่ากลุ่มอื่นอย่างมีนัยสำคัญ (p, 0.05) การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่าคล้ายกับการสังเกตที่ระดับพฤติกรรม (รูปที่ 1) การสัมผัสกับช่องมืดเป็นเวลา 1 นาที (ช่วงการเปลี่ยนภาพ) จะยกเลิกการ "เปิด" ของ CREB phosphorylation ที่จะเพิ่มขึ้นในระยะการรวมตัวใหม่ ในทางตรงกันข้าม พบเซลล์ประสาท pERK1 ในกลุ่ม Ext มากกว่ากลุ่มอื่นอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าจะมีเซลล์ประสาท pERK1 น้อยกว่าเซลล์ประสาท pCREB1 ในกลุ่ม Ext (F(3,29)=3}.793, p { {23}}.0207; รูปที่ 2C)

อย่างต่อเนื่อง สังเกตพบเซลล์ประสาทบวกสองเท่าอย่างมีนัยสำคัญมากขึ้น (pCREB1/pERK1) ในกลุ่ม Ext (F(3,29)=6.698, p=000 14; รูปที่ 2D) ในขณะที่พบเซลล์ประสาท pCREB1/ pERK– (pCREB single positive) มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม Recon และ Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; รูปที่ 2E) ดังนั้น ระยะการรวมกลุ่มอีกครั้งจึงพบเพียงประชากรเซลล์ประสาท pCREB1/pERK– เพียงกลุ่มเดียว ในทางตรงกันข้าม ระยะการสูญพันธุ์แสดงให้เห็นประชากรสองกลุ่มของเซลล์ประสาท pCREB1/pERK– และ pCREB1/ pERK1 ซึ่งบ่งชี้ว่า ERK ถูกกระตุ้นเฉพาะในเซตย่อยของเซลล์ประสาท pCREB1 ที่สำคัญ สังเกตผลลัพธ์ที่คล้ายกันในบริเวณ basolateral ของต่อมทอนซิล (รูปที่ 2G, F(3,29)=13.042, p , 0.0001; รูปที่ 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; รูปที่ 2I, F(3,29)=12.633, p , 0.0001; รูปที่ 2J, F(3,29)=12 .505, หน้า , 0.0001).

การเปิดใช้งาน ERK แบบสองเฟสในระยะการสูญพันธุ์ ERK เป็นตัวกระตุ้นต้นน้ำของ CREB และด้วยเหตุนี้จึงจำเป็นต้องมีการเปิดใช้งาน ERK สำหรับการรวมและการรวมหน่วยความจำความกลัวอีกครั้ง (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005) อย่างไรก็ตาม อย่างไม่สอดคล้องกัน ไม่พบการกระตุ้น ERK ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส หรือ mPFC ในระยะการรวมบัญชีอีกครั้งเมื่อวัด pERK ที่ 30 นาทีหลังช่วงการเปิดใช้งานใหม่ (รูปที่ 2-4) ดังนั้นเราจึงตรวจสอบหลักสูตรเวลาของ ERK และ CREB phosphorylation เราทำการทดลองที่คล้ายคลึงกันดังในรูปที่ 2-4 ยกเว้นว่าระดับ pCREB และ pERK ถูกวัดที่ 5, 15 และ 30 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่ (เปิดรับช่องมืดอีกครั้งเป็นเวลา {{ 66}}, 1 หรือ 10 นาที; รูปที่ 5A) สอดคล้องกับข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 2-4 พบว่ามีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ประสาท pCREB1 ที่ 30 นาที แต่ไม่ใช่ที่ 5 นาทีหลังจากเซสชันการเปิดใช้งานใหม่ใน Recon (amygdala,mPFC และ hippocampus) และ Ext (amygdala และ mPFC ) เป็นกลุ่ม แต่ไม่ใช่กลุ่ม Tran (รูปที่ 5E, one-way ANOVA, amygdala, 5 min, F(3,23)=0.346, p . 0.05, 30 min, F(3,23)=15.272, p , 0.0001; mPFC, 5 นาที, F(3,23)=1.169, p . 0.05, 30 นาที, F(3,23)=32 346, p , 0.0001; hippocampus, 5 นาที, F(3,23)=0.154, p . 0.05, 30 นาที, F(3,23)=16.197, p , 0.0001; unpaired t test, amygdala, reconsolidation, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0.0001, การสูญพันธุ์, 5 vs 30 นาที, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, reconsolidation, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0.0001, extinction, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; hippocampal CA1 region, reconsolidation, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374)

ที่น่าสนใจคือมีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ประสาท pERK1 ในกลุ่ม amygdala, mPFC และ hippocampus ของกลุ่ม Recon, Tran และ Ext ที่ 5 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่เมื่อเทียบกับกลุ่ม NR (รูปที่ 5F, amygdala, F(3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017) การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่า ERK ถูกเปิดใช้งานทันทีหลังจากเซสชันการเปิดใช้งานใหม่ในทุกเฟสของหน่วยความจำ อย่างไรก็ตาม จำนวนเซลล์ประสาท pERK1 ที่เพิ่มขึ้นเหล่านี้กลับสู่ระดับพื้นฐาน (เทียบกับกลุ่ม NR) ที่ 15 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่ (รูปที่ 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, p . 0.05; mPFC, F(3,23)=0.683, p . 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, p . 0.05) นอกจากนี้ สอดคล้องกับการค้นพบที่แสดงในรูปที่ 2-4 พบเซลล์ประสาท pERK1 มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน amygdala, mPFC และ hippocampus ที่ 30 นาทีหลังจากเซสชันการเปิดใช้งานใหม่เฉพาะในกลุ่ม Ext (รูปที่ 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; ฮิปโปแคมปัส, F( 3,23)=6.206, p=0.003) ดังนั้น ระยะการรวมบัญชีและการเปลี่ยนแปลงจะแสดงการเปิดใช้งานชั่วคราวของ ERK เฉพาะที่จุดเวลาเริ่มต้น (5 นาที) ในขณะที่ระยะการสูญพันธุ์จะแสดงการเปิดใช้งาน ERK แบบสองเฟสที่จุดเวลาต้น (5 นาที) และปลาย (30 นาที) หลังการเปิดใช้งานใหม่ การประชุม. การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่ากลไกสำหรับการควบคุมการเปิดใช้งาน ERK นั้นแตกต่างกันในระยะการรวมบัญชี/การเปลี่ยนแปลงและการสูญพันธุ์ โดยรวมแล้ว การสังเกตของเราแสดงให้เห็นว่าระยะการรวมตัว การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์แสดงให้เห็นลายเซ็นของโมเลกุลที่แตกต่างกัน

บทบาทของการเปิดใช้งาน ERK ในขั้นตอนการรวมและการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA

เฟสการรวมบัญชี/การเปลี่ยนสภาพและการสูญพันธุ์แสดงการกระตุ้น ERK แบบโมโนฟาซิกและไบเฟส ตามลำดับ ต่อไปเราจะตรวจสอบและเปรียบเทียบบทบาทของการเปิดใช้งาน ERK ในช่วงต้น (5 นาที) และช่วงปลาย (30 นาที) ใน mPFC ในขั้นตอนการรวมบัญชีและการสูญพันธุ์โดยการตรวจสอบผลของการยับยั้ง ERK (รูปที่ 6)

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบกลไกสำหรับการเปลี่ยนหน่วยความจำจากระยะการรวมเป็นช่วงการสูญพันธุ์หลังจากการดึงหน่วยความจำ IA อันดับแรก เราระบุลักษณะลายเซ็นพฤติกรรมของเฟสหน่วยความจำ IA หลังจากการดึงข้อมูล สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา (Fukushima et al., 2014), การรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ที่เกิดจากการดึงหน่วยความจำ IA โดยการเปิดรับแสงอีกครั้ง (0 นาทีในห้องมืด) และความมืด ( 3 หรือ 10 นาที) ตามลำดับ ที่น่าสนใจ หน่วยความจำ IA ไม่ได้เพิ่มขึ้นหรือดับลง และแสดงความต้านทานต่อการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนเมื่อหนูถูกเปิดโปงอีกครั้งไปยังช่องมืดเป็นเวลาเพียง 1 นาที ดังนั้น การสังเกตเหล่านี้แนะนำว่าการเปิดรับแสงซ้ำอีก 1- นาทีไปยังส่วนที่มืดจะยกเลิกการเหนี่ยวนำการรวมใหม่ แต่ไม่เพียงพอที่จะดับหน่วยความจำ IA นอกจากนี้ เราพบว่า ERK ถูกเปิดใช้งานในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และ mPFC ที่จุดเวลาแรก (5 นาที) หลังจากสัมผัสซ้ำในช่องมืดเป็นเวลา 0, 1 หรือ 10 นาที อย่างต่อเนื่อง การยับยั้ง ERK ในบริเวณสมองเหล่านี้ขัดขวางการรวมตัวใหม่/การปรับปรุงและการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA สิ่งสำคัญที่สุดคือ การยับยั้ง ERK ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และ mPFC หลังจากการเปิดรับแสงซ้ำอีก 1- นาทีไปยังส่วนที่มืดไม่ได้ยับยั้งการเพิ่มประสิทธิภาพของหน่วยความจำ IA ที่อาศัยการรวมตัวใหม่ ซึ่งบ่งชี้ว่าการเปิดใช้งาน ERK หลังจากการเปิดรับแสงอีกครั้งในช่วงสั้นๆ (1 นาที) จำเป็นต้องมีช่องมืดเพื่อยับยั้งการรวมหน่วยความจำ IA อีกครั้ง ในทางกลับกัน 1- นาทีที่เปิดรับแสงในห้องมืดอีกครั้งไม่เพียงพอที่จะดับหน่วยความจำ IA แม้ว่าการเปิดรับแสงซ้ำไปยังส่วนมืด (3 หรือ 10 นาที) จะทำให้หน่วยความจำนี้ดับลง ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงแนะนำว่า 1-นาทีที่เปิดรับส่วนมืดอีกครั้งจะทำให้เกิดกระบวนการเปลี่ยนความทรงจำที่ยกเลิกการรวบรวมใหม่/ปรับปรุงแต่ไม่เริ่มต้นการเรียนรู้การสูญพันธุ์ โดยรวมแล้ว เราขอแนะนำว่ากระบวนการเปลี่ยนหน่วยความจำมีส่วนช่วยในการเปลี่ยนเฟสหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์ผ่านการป้องกันการรวมบัญชีใหม่โดยใช้ ERK

คล้ายกับข้อสังเกตในปัจจุบันของเรา การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยใช้เงื่อนไขความกลัวในการได้ยิน แสดงให้เห็นว่าการนำเสนอ CS เดี่ยว (1) หรือเป็นเวลานาน (10) ทำให้เกิดการรวมหน่วยความจำและการสูญพันธุ์ตามลำดับโดยการเพิ่มระดับ pERK ในบริเวณ basolateral ของ amygdala ในทางตรงกันข้าม การนำเสนอ CS ระดับกลาง (4–7) จะไม่เปลี่ยนระดับ pERK ในบริเวณ basolateral ของ amygdala ที่สำคัญ การยับยั้ง ERK ในการนำเสนอ CS ระดับกลางไม่ส่งผลต่อความจำที่น่ากลัว การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่ามีช่วงการเปลี่ยนผ่านของระยะความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์หลังจากการดึงความทรงจำด้วยความกลัว (Merlo et al., 2018) ในการศึกษานี้ เราได้ขยายการค้นพบนี้และแนะนำว่าเฟสการเปลี่ยนแปลงจะสลับเฟสหน่วยความจำจากการรวมใหม่เป็นการสูญพันธุ์ผ่านการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ ERK ตรงกันข้ามกับการค้นพบก่อนหน้านี้ (Merlo et al., 2018) เราพบว่าระยะการเปลี่ยนแปลงเกี่ยวข้องกับ ERK phosphorylation ในต่อมทอนซิล ฮิปโปแคมปัส และ mPFC ความคลาดเคลื่อนเหล่านี้อาจเป็นเพราะความแตกต่างของจุดเวลาในการตรวจสอบฟอสโฟรีเลชันของ ERK การศึกษาก่อนหน้านี้วัดระดับ pERK ที่ 12 นาทีหลังจากการนำเสนอ CS (Merlo et al., 2018) ในขณะที่การศึกษาของเราพบว่าระดับ pERK ที่เพิ่มขึ้นกลับสู่ระดับพื้นฐานในช่วงเวลานี้ (15 นาทีหลังจากการเปิดรับซ้ำ) นอกจากนี้ สิ่งสำคัญที่ควรทราบคืองาน IA ช่วยให้สามารถสังเกตการเพิ่มประสิทธิภาพหน่วยความจำ IA ผ่านการรวมบัญชีใหม่ได้ ซึ่งนำไปสู่การค้นพบของเราว่าการยับยั้ง ERK ในระยะการเปลี่ยนผ่านจะยับยั้งการเพิ่มประสิทธิภาพหน่วยความจำ IA

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า ERK phosphorylation เพิ่มขึ้นในบริเวณ basolateral ของ amygdala ที่ 20-60 นาทีหลังจากการเรียนรู้การสูญพันธุ์ของหน่วยความจำความกลัวที่ชี้นำ (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018) ในขณะที่ฮิปโปแคมปัสแสดงให้เห็น การเปิดใช้งานนี้ที่ 1 ชั่วโมงหลังจากการเรียนรู้การสูญพันธุ์ของหน่วยความจำความกลัวตามบริบท (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009) ในการศึกษานี้ เราได้รับข้อสังเกตที่คล้ายกันว่า pERK เพิ่มขึ้นที่ 30 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่ในระยะการสูญพันธุ์ การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า ERK phosphorylation เป็นลายเซ็นระดับโมเลกุลทั่วไปของระยะการสูญพันธุ์ปลาย (20–60 นาที)

นอกจากนี้ เราสังเกตเห็นว่าการเปิดใช้งาน ERK เกิดขึ้นแบบสองเฟสที่จุดเวลาต้นและช่วงปลาย (5 และ 30 นาที) หลังจากเซสชันการเปิดใช้งานใหม่ในระยะการสูญพันธุ์ ในขณะที่การเปิดใช้งานนี้เกิดขึ้นแบบโมโนในระยะเริ่มต้นในระยะการรวมบัญชีใหม่ (รูปที่ 5) . อย่างต่อเนื่อง การยับยั้ง ERK ในบริเวณสมอง ณ จุดเวลาเหล่านี้ของระยะการรวมตัวและการสูญพันธุ์จะบล็อกการรวมบัญชีใหม่/การปรับปรุงและการสูญพันธุ์ในระยะยาว ตามลำดับ (รูปที่ 6A, C–H) การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าจำเป็นต้องมีการเปิดใช้งาน ERK แบบโมโนฟาซิกและไบเฟสิกสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพและการสูญเสียหน่วยความจำ IA ที่อาศัยการรวมบัญชีใหม่ ตามลำดับ สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่า ERK ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมต้นน้ำของ CREB phosphorylation ดังนั้นการเปิดใช้งาน ERK ชั่วคราวในระยะแรกของหน่วยความจำอาจมีส่วนทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ CREB ซึ่งกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่จำเป็นสำหรับการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ในระยะยาว

คล้ายกับการค้นพบครั้งก่อนของเราโดยใช้การปรับสภาพความกลัวตามบริบท (Mamiya et al., 2009) CREB ถูกเปิดใช้งานในการรวมบัญชีใหม่ (amygdala/hippocampus/mPFC) และการสูญพันธุ์ (amygdala/mPFC) ในขณะที่ ERK ถูกเปิดใช้งานเฉพาะในระยะการสูญพันธุ์เท่านั้น ที่ 30 นาทีหลังจากช่วงการเปิดใช้งานใหม่ อย่างต่อเนื่อง มีเพียงประชากรเดียวของ pCREB1/pERK– เซลล์ประสาทที่ถูกสังเกตในระยะการรวมตัวใหม่ ในขณะที่พบประชากรเซลล์ประสาทที่แตกต่างกันในระยะการสูญพันธุ์: pCREB1/pERK– และเซลล์ประสาท pCREB1/pERK1 ในต่อมทอนซิล (รูปที่ 2); pCREB– /pERK1 เซลล์ประสาทในฮิปโปแคมปัส (รูปที่ 3); และเซลล์ประสาท pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 และเซลล์ประสาท pCREB1/pERK1 ใน mPFC (รูปที่ 4) การสังเกตเหล่านี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งการสังเกตที่ตัดกันของเซลล์ประสาท pCREB–/ pERK1 และ pCREB1/pERK– ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้น CREB และ ERK นั้นถูกควบคุมแตกต่างกันไปในแต่ละพื้นที่ของสมองเมื่อหน่วยความจำดับลง และการเปิดใช้งานระยะท้ายของ ERK นั้นมีความเฉพาะเจาะจงและชัดเจน บทบาทในการสูญพันธุ์ของความทรงจำแห่งความกลัวเมื่อเปรียบเทียบกับกระบวนการความจำอื่นๆ เช่น การรวมและการรวมใหม่ดังที่กล่าวไว้ด้านล่าง ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตว่าเซลล์ประสาท pERK1 มีปริมาณมากใน mPFC มากกว่าเมื่อเทียบกับฮิบโปแคมปัสและอะมิกดาลา เนื่องจาก mPFC แสดงอัตราส่วนของเซลล์ประสาท pERK1 ที่สูงขึ้น (ระยะการสูญพันธุ์) และเซลล์ประสาท pCREB1 (ระยะการรวมตัวใหม่) เมื่อเทียบกับฮิบโปแคมปัสและต่อมทอนซิล ซึ่งแนะนำว่า การเปิดใช้งาน ERK ใน mPFC มีบทบาทที่เฉพาะเจาะจงมากขึ้นในการสูญเสียหน่วยความจำ

ยังไม่ชัดเจนว่าเซลล์ประสาทที่เหมือนกันหรือต่างกันถูกกระตุ้นในขั้นตอนการรวมตัวใหม่ การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุการกระตุ้นของ "เซลล์ประสาทความกลัว" และ "เซลล์ประสาทที่สูญพันธุ์" ในต่อมทอนซิลเมื่อมีการกระตุ้นหรือดับหน่วยความจำที่บ่งบอกถึงความกลัว ตามลำดับ (Herry et al., 2008) ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ ERK และ CREB จะถูกกระตุ้นในเซลล์ประสาทที่แตกต่างกันซึ่งมีโปรไฟล์ชั่วคราวต่างกัน (กล่าวคือ "เซลล์ประสาทการรวมตัวใหม่" และเซลล์ประสาทที่สูญพันธุ์) ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น เซลล์ประสาท pCREB1 ซึ่งรวมถึงเซลล์ประสาท pCREB1/pERK1 อาจควบคุมการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA ในระยะยาวผ่านการกระตุ้นการแสดงออกของยีนเป็นการรวมตัวใหม่และการสูญพันธุ์ของเซลล์ประสาทตามลำดับ ในทางกลับกัน การเปิดใช้งาน ERK ในเซลล์ประสาท pCREB– /pERK1 อาจนำไปสู่การยกเลิกการเปิดใช้งานการถอดรหัสที่เป็นสื่อกลางของ CREB ซึ่งจำเป็นสำหรับการรวมบัญชีใหม่ เนื่องจากการเปิดใช้งาน ERK นี้พบได้เฉพาะในช่วงการสูญพันธุ์ระยะสุดท้าย ERK ได้เปิดใช้งานในเซลล์ประสาทการรวมตัวใหม่เพื่อยกเลิกการกระตุ้นการแสดงออกของยีนในระยะการสูญพันธุ์ ที่น่าสนใจคือการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น ERK ของฮิปโปแคมปัสขัดขวางการเหนี่ยวนำของ c-fos เมื่อหน่วยความจำความกลัวตามบริบทถูกระงับ (Guedea et al., 2011) ทำให้เกิดความเป็นไปได้ที่การเปิดใช้งาน ERK นี้เป็นปฏิปักษ์กับเส้นทางการส่งสัญญาณ CREB สิ่งสำคัญคือต้องระบุกลุ่มเซลล์ประสาทที่ควบคุมการรวมตัวใหม่ การเปลี่ยนแปลง และการสูญพันธุ์ และเพื่อตรวจสอบลายเซ็นระดับโมเลกุลและความสำคัญเชิงหน้าที่ของเซลล์ประสาทเหล่านั้น นอกจากนี้ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างประชากรประสาทที่ระบุในการศึกษานี้ยังไม่ทราบ เป็นไปได้ว่าเซลล์ประสาท "การสูญพันธุ์ (การเปลี่ยนผ่าน)" จะปรับการทำงานของเซลล์ประสาทการรวมตัวใหม่เพื่อยกเลิกการป้องกันการรวมตัวใหม่ผ่านปฏิสัมพันธ์ระหว่างพวกมัน (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014) ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องตรวจสอบปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ในและระหว่างต่อมทอนซิล mPFC และฮิปโปแคมปัส

ก่อนหน้านี้ เราแสดงให้เห็นว่าฮิปโปแคมปัสไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงของ CREB phosphorylation และการแสดงออกของอาร์คหลังจากการเรียนรู้การสูญพันธุ์ของความกลัวตามบริบท และการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนในฮิบโปแคมปัสในระยะการสูญพันธุ์อย่างต่อเนื่องล้มเหลวในการป้องกันการสูญพันธุ์ในระยะยาว (Mamiya et al. , 2552). ข้อสังเกตเหล่านี้ทำให้มีความเป็นไปได้ว่าฮิปโปแคมปัสไม่จำเป็นสำหรับการสูญพันธุ์ในระยะยาว อย่างไรก็ตาม เราแสดงให้เห็นว่า ERK ถูกเปิดใช้งานในฮิบโปหลังจากการเรียนรู้การสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ IA และการบล็อกการเปิดใช้งาน ERK ในฮิบโปแคมปัสอย่างต่อเนื่องทำให้การสูญพันธุ์ในระยะยาวลดลง ดังนั้น ข้อสังเกตในปัจจุบันของเราจึงบ่งชี้ถึงบทบาทที่จำเป็นสำหรับฮิปโปแคมปัสในการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ เมื่อนำมารวมกับการค้นพบครั้งก่อน เราแนะนำว่าฮิปโปแคมปัสเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสูญพันธุ์ของหน่วยความจำ แต่ไม่ใช่สำหรับกระบวนการที่เหมือนการรวมบัญชีเพื่อทำให้ "หน่วยความจำการสูญพันธุ์" เสถียรผ่านการกระตุ้นการแสดงออกของยีน