โปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง Zika Virus 4B โต้ตอบกับ DHCR7 เพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัส

เชิงนามธรรม

ไวรัสซิกา (ZIKV) พัฒนาโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างเพื่อหลีกเลี่ยงการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน และรับประกันการจำลองแบบที่มีประสิทธิภาพในเซลล์เจ้าบ้าน เอนไซม์เมตาบอลิซึมของโคเลสเตอรอล 7-ดีไฮโดรโคเลสเตอรอล รีดักเตส (DHCR7) มีรายงานว่าส่งผลต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติในการติดเชื้อ ZIKV อย่างไรก็ตาม โปรตีนและกลไกที่ไม่ใช่โครงสร้างที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการหลีกเลี่ยงไวรัสที่ใช้สื่อกลาง DHCR7- นั้นไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าการติดเชื้อ ZIKV เอื้อต่อการแสดงออกของ DHCR7 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง DHCR7 ที่ได้รับการควบคุมในทางกลับกันอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ ZIKV และการบล็อก DHCR7 ระงับการติดเชื้อ ZIKV โดยกลไกแล้ว โปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง ZIKV 4B (NS4B) ทำปฏิกิริยากับ DHCR7 เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ DHCR7 นอกจากนี้ DHCR7 ยังยับยั้ง TANK-binding kinase 1 (TBK1) และ interferon regulatory factor 3 (IRF3) phosphorylation ซึ่งส่งผลให้ลดการผลิต interferon-beta (IFN-) และ interferon-stimulated genes (ISGs) ดังนั้นเราจึงเสนอให้ ZIKV NS4B ผูกกับ DHCR7 เพื่อระงับการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 ซึ่งจะยับยั้ง IFN- และ ISG ตามลำดับ ซึ่งจะช่วยอำนวยความสะดวกในการหลีกเลี่ยง ZIKV การศึกษานี้ขยายข้อมูลเชิงลึกว่าโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างของไวรัสเป็นปฏิปักษ์กับภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัสผ่านเอนไซม์และตัวกลางในการเผาผลาญคอเลสเตอรอลได้อย่างไร

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

1. บทนำ

เนื่องจากไวรัส flavivirus ที่มียุงเป็นพาหะ ไวรัสซิก้า (ZIKV) ถูกระบุครั้งแรกจากลิงแสมชนิดหนึ่งในยูกันดาในปี 1947 จากการระบาดหลายครั้งทั่วโลก การแพร่ระบาดของ ZIKV กลายเป็นภัยคุกคามด้านสุขภาพสะสมทั่วโลก เนื่องมาจากการขยายตัวอย่างรวดเร็วผ่านเส้นทางยุง การเดินทางทั่วโลกของ ผู้ขนส่งที่ไม่มีอาการและการแพร่เชื้อทางเพศ การติดเชื้อ ZIKV ส่วนใหญ่ในโรคระบาดที่ผ่านมาไม่มีอาการหรือไม่รุนแรง (Wang et al., 2016) อย่างไรก็ตาม ในการแพร่ระบาดหลายครั้งที่ผ่านมา การติดเชื้อ ZIKV ได้นำไปสู่โรคร้ายแรง รวมถึงผลที่ตามมาทางระบบประสาทในระหว่างตั้งครรภ์ (ศีรษะเล็กและการตายของทารกในครรภ์) และความผิดปกติทางระบบประสาท (Guillain-Barre syndrome) ในผู้ใหญ่ (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson and Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016) ระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเป็นแนวแรกและสำคัญอย่างยิ่งในการป้องกันระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อการติดเชื้อไวรัส หลังจากการติดเชื้อ ZIKV RNA ของไวรัสได้รับการยอมรับโดยยีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดกรดเรติโนอิกในเซลล์ I (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006) ซึ่งริเริ่มภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติขั้นปลายน้ำ การตอบสนองรวมถึงการเปิดใช้งาน TANK kinase 1 (TBK1) ของ TANK, ฟอสโฟรีเลชั่นของปัจจัยกำกับดูแล interferon 3 (IRF3) จากนั้นนำไปสู่การผลิต interferons ประเภทที่ 1 (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) และการแสดงออกของยีนกระตุ้นอินเตอร์เฟอรอน (ISGs) หลายสิบตัวที่มีฤทธิ์ต้านไวรัสต่างๆ (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014) ระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์สร้าง IFN และ ISG เพื่อจำกัดการติดเชื้อไวรัส อย่างไรก็ตาม ZIKV เองก็ได้พัฒนากลไกการหลบหนีหลายอย่างเพื่อให้แน่ใจว่าการอยู่รอดและการจำลองแบบในเซลล์โฮสต์นั้นประสบความสำเร็จ เช่น การเข้ารหัสโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง (NS) ที่จำเพาะ ZIKV จีโนม RNA สร้างโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างเจ็ดชนิด รวมถึง NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B และ NS5 (Berthoux, 2020) ZIKV NS1 รับสมัครโฮสต์ deubiquitinase USP8 เพื่อรักษาเสถียรภาพของแคสเปส -1 และลดทอนการส่งสัญญาณ IFN ประเภทที่ 1 เพื่อให้เป็นประโยชน์ต่อการติดเชื้อ ZIKV (Zheng et al., 2018) มีรายงานว่า NS1 กลายพันธุ์จับกับ TBK1 และลดฟอสโฟรีเลชั่นของ TBK1 ส่งผลให้การผลิต IFN ลดลง (Xia et al., 2018) ZIKV NS3 จับและแยกโปรตีนโครงนั่งร้านของมนุษย์ (14-3-3ε และ 14-3-3η) (Riedl et al., 2019) ในขณะที่ NS4A โต้ตอบกับ MAVS เพื่อลดทอน RIG-I- และ MDA{{50} }การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติโดยอาศัยสื่อกลาง (Ma et al., 2018) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ZIKV NS5 ผูกและลดระดับตัวแปลงสัญญาณและตัวกระตุ้นของการถอดรหัส 2 (STAT2) เพื่อลดทอนการส่งสัญญาณ IFN ประเภทที่ 1 (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016) ยิ่งไปกว่านั้น NS5 ยังได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีปฏิสัมพันธ์กับ RIG-I และยับยั้ง K63- polyubiquitination ที่เชื่อมโยงของ RIG-I ดังนั้นจึงระงับการผลิต IFN (Li et al., 2020) นอกจากนี้ ZIKV NS2A, NS2B, NS4A และ NS4B ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถเอาชนะการผลิต IFN โดยการกำหนดเป้าหมายองค์ประกอบที่ไม่ต่อเนื่องในเส้นทาง RIG-I (Xia et al., 2018) เพื่อให้การจำลองแบบมีประสิทธิภาพในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ZIKV ยังอาศัยส่วนประกอบการเผาผลาญไขมันของเซลล์โฮสต์เพื่อสร้างซองจดหมายและการประกอบอนุภาคไวรัสที่สมบูรณ์ (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020) คอเลสเตอรอลเป็นหนึ่งในองค์ประกอบไขมันของเยื่อหุ้มเซลล์และมีส่วนร่วมในการทำงานทางชีววิทยาหลายอย่าง (Ikonen, 2008). สภาวะสมดุลของคอเลสเตอรอลในเซลล์ถูกปรับอย่างใกล้ชิดโดยการสังเคราะห์คอเลสเตอรอล ซึ่งรวมถึงการดูดซึมจากอนุภาคไลโปโปรตีนและปล่อยไปยังตัวรับนอกเซลล์ เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเกือบทั้งหมดขึ้นอยู่กับเมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล (Luo et al., 2020) หลักฐานที่สะสมแสดงให้เห็นว่าเมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอลมีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อการติดเชื้อไวรัส (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015) จากการติดเชื้อไวรัส การสังเคราะห์โคเลสเตอรอลเปลี่ยนไปอย่างเห็นได้ชัดและมาพร้อมกับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ IFN-I และ ISGs ในแมคโครฟาจ (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015) ในฐานะเอนไซม์สำคัญในการเผาผลาญคอเลสเตอรอล คอเลสเตอรอล-25-ไฮดรอกซีเลส (CH25H) จะเปลี่ยนคอเลสเตอรอลให้เป็น 25-ไฮดรอกซีโคเลสเตอรอล (25HC) ซึ่งได้รับการระบุว่าเป็นผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพที่มีส่วนในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อคนส่วนใหญ่ ของไวรัส รวมถึงไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ 1 (HIV-1) ไวรัสปากอักเสบตุ่มพอง (VSV) ไวรัสเริมชนิดซิมเพล็กซ์ 1 (HSV{88}}) ไวรัสอีโบลา (EBOV) ZIKV ไวรัสเริมแกมมาของหนู ( MHV68), ไวรัสไข้ริฟต์แวลลีย์ (RVFV) และไวรัสไข้สมองอักเสบฤดูใบไม้ผลิ-ฤดูร้อนของรัสเซีย (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013) การศึกษาในปัจจุบันมีข้อจำกัดในการตรวจสอบว่าผลิตภัณฑ์จากการเผาผลาญคอเลสเตอรอล (เช่น 25HC) สามารถจัดการกับการส่งสัญญาณและมีส่วนร่วมในภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติได้อย่างไร จนถึงปัจจุบัน เอนไซม์หรือตัวกลางที่อยู่ต้นทางของการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลยังไม่ชัดเจนนัก เนื่องจากเป็นเอนไซม์เมตาบอลิซึมของโคเลสเตอรอลที่สำคัญ 7-ดีไฮโดรโคเลสเตอรอล รีดักเตส (DHCR7) สามารถลบพันธะคู่ C (7–8) ในวงแหวน B ของสเตอรอล และกระตุ้นโคเลสเตอรอลจาก 7-ดีไฮโดรโคเลสเตอรอล ({{100} }DHC) (Luu และคณะ 2015) 7-DHC ยังเป็นผู้บุกเบิกของวิตามินดีด้วย และการกลายพันธุ์ของ DHCR7 นั้นเชื่อมโยงกับวิตามินดีที่สูงกว่า โดยบอกว่า DHCR7 แสดงผลทางชีวภาพที่ซับซ้อนในการเปลี่ยนคอเลสเตอรอลและวิตามินดี (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016ก) การศึกษาที่นำเสนออย่างดีแสดงให้เห็นว่าความเงียบของ DHCR7 สามารถกระตุ้นทางเดิน PI3K-AKT3 ซึ่งนำไปสู่ ​​IRF3 Ser385 phosphorylation และส่งเสริมการผลิต IFN เพื่อยับยั้งการติดเชื้อไวรัสหลายชนิด ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย (Xiao et al., 2020) อย่างไรก็ตาม ความเข้าใจเกี่ยวกับเมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล7-ที่เป็นสื่อกลางของ DHCR ในการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกันที่ใช้โปรตีนเป็นสื่อกลางของ ZIKV NS นั้นยังไม่ค่อยชัดเจนนัก ที่นี่ เราอธิบายกลไกที่ชัดเจนที่ ZIKV NS4B กำหนดเป้าหมายไปที่ DHCR7 ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญในการสังเคราะห์คอเลสเตอรอล เพื่อลดการตอบสนองของ IFN-I และอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ ZIKV เราพบว่าการติดเชื้อ ZIKV เพิ่มการแสดงออกของ DHCR7 สิ่งที่น่าสนใจคือ DHCR7 ที่ปรับปรุงแล้วส่งเสริมการติดเชื้อ ZIKV ในขณะที่การทำให้ล้มลงหรือกำหนดเป้าหมาย DHCR7 ด้วยสารยับยั้งสามารถระงับการติดเชื้อ ZIKV ได้ ยิ่งไปกว่านั้น ZIKV NS4B สามารถผูก DHCR7 และทำให้เกิดการแสดงออกของ DHCR7 ซึ่งยับยั้งการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 และนำไปสู่การลดการผลิต IFN- และ ISG ดังนั้นเราจึงเสนอว่า ZIKV NS4B เชื่อมโยงกับ DHCR7 จะลดการเปิดใช้งาน IRF3 ซึ่งจะยับยั้ง IFN- และ ISG เพื่ออำนวยความสะดวกในการหลีกเลี่ยง ZIKV การศึกษานี้ขยายข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับวิธีการที่โปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง ZIKV ยกเลิกภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัสผ่านการโต้ตอบกับเอนไซม์เมตาบอลิซึมของคอเลสเตอรอล

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เส้นเซลล์

ซื้อเซลล์ U251 จากศูนย์รวบรวมวัฒนธรรมประเภทจีน (CCTCC) (หวู่ฮั่น จีน) เซลล์ Cercopithecus aethiops ไต (Vero) เซลล์ไตตัวอ่อนของมนุษย์ (HEK 293T) และเซลล์มะเร็งของต่อมในปอดของมนุษย์ (A549) ถูกซื้อจาก American Tissue Culture Collection (ATCC) เซลล์ได้รับการบำรุงรักษาใน Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) ของ Dulbecco ที่เสริมด้วย 10% ของซีรั่มของวัวในครรภ์ (FBS) (Gibco), เพนิซิลิน (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และสเตรปโตมัยซิน ซัลเฟต (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ที่ 37 C และ 5 % คาร์บอนไดออกไซด์ เซลล์ยุงลายอัลโบพิคตัส (C6/36) ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อจำเป็นขั้นต่ำ (MEM) ที่เสริมด้วย 10% FBS, เพนิซิลิน (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และสเตรปโตมัยซิน ซัลเฟต (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ที่ 28 C พร้อมด้วย 5% CO2

2.2. การขยาย ZIKV การไตเตรท และการติดเชื้อ

ZIKV ที่แยกเดี่ยว z16006 (หมายเลขภาคยานุวัติของ GenBank, KU955589.1) ได้รับการเพาะเลี้ยงในเซลล์ C6/36 และ ZIKV ถูกแบ่งส่วนในขวดแช่แข็งและเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียส ไทเตอร์ของ ZIKV ถูกวัดโดยการสอบวิเคราะห์ด้วยคราบจุลินทรีย์ เซลล์ติดเชื้อ ZIKV ที่การติดเชื้อหลายหลาก (MOI) ที่ระบุเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วยการล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) จากนั้นเพาะเลี้ยง เก็บเกี่ยว และตรวจสอบ

2.3. พลาสมิดและรีเอเจนต์

Expression plasmid pcDNA3.1(þ)-3 แฟล็กถูกใช้เพื่อโคลนยีน ZIKV แต่ละตัวจากแฟรกเมนต์ที่สอดคล้องกันของ ZIKV cDNA ในการสร้าง pGEX6p-1-NS4B นั้น ZIKV NS4B ได้รับการโคลนย่อยเป็นเวกเตอร์ pGEX6p-1 โดยใช้ ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, หนานจิง, จีน) cDNA ที่เข้ารหัส DHCR7, RIG-I, TBK1 และ IRF3 ของมนุษย์ที่ถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ pCAGGS-HA หรือเวกเตอร์แฟล็ก pcDNA3.1 (þ)-3 ถูกสร้างขึ้นโดยวิธีการโคลนโมเลกุลมาตรฐาน การกลายพันธุ์แบบ missense G410S ของ DHCR7 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ ซื้อซองจดหมายต่อต้าน ZIKV กระต่ายโมโนโคลนอล (GTX133314) จาก GeneTex (Irvine, CA, USA) แรบบิทโพลีโคลนอลต้าน DHCR7 (A8049), แรบบิทโมโนโคลนอลต้าน ISG15 (A2416), แรบบิทโมโนโคลนอลต้าน TBK1 (A3458), แรบบิทโมโนโคลนอลต้าน P-TBK1 ที่ Ser172 (AP1026), แรบบิทโพลีโคลนอลต้าน IRF3 (A11118), ต้าน -rabbit IgG (ac005) และ IgG ต่อต้านเมาส์ (ac011) ถูกซื้อจาก ABclonal Technology (หวู่ฮั่น ประเทศจีน) Antimouse FITC และแอนติบอดีรอง Cy3 ต่อต้านกระต่ายถูกซื้อจาก Abbkine (หวู่ฮั่น, จีน) Rabbit monoclonal anti-P-IRF3 ที่ Ser396 (29047S) และ rabbit monoclonal anti-ISG56 (14769S) ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, USA) Mouse monoclonal anti-Flag (F3165), rabbit monoclonal anti-HA (H6908) และ mouse monoclonal anti-GAPDH (G9295) ถูกซื้อจาก Sigma (St Louis, MO, USA) Mouse monoclonal antiFlavivirus group antigen-antibody (MAB10216) ซื้อจาก Millipore (Mass, USA) Lipofectamine 2000 (11668-027) และ Trizol (15596018) ถูกซื้อจาก Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA) ซื้อโพลี (I: C) จาก InvivoGen (ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

2.4. การทดสอบคราบจุลินทรีย์

ส่วนลอยเหนือตะกอนที่มี ZIKV ถูกเจือจางด้วย DMEM ที่ปราศจากซีรั่มและเซลล์ Vero ที่ติดเชื้อในจานหลุม 12- เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วยการล้างด้วย 1 มิลลิลิตร PBS สองครั้ง DMEM ซึ่งมี 2% FBS และอะกาโรสที่มีจุดหลอมเหลวต่ำ 2% ถูกผสมให้เข้ากันตามอัตราส่วนปริมาตร 1:1 และของผสม 1 มิลลิลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพาะเลี้ยงเซลล์ที่ติดเชื้อที่อุณหภูมิ 37 C โดยมี CO2 5% เป็นเวลา 5-7 วัน เซลล์ได้รับการแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและย้อมด้วยคริสตัลไวโอเล็ต 0.5% เป็นเวลา 30 นาที 12-ล้างจานหลุมด้วยน้ำ และคำนวณแผ่นป้าย

2.5. การผลิตและการติดเชื้อ Lentivirus

ลำดับการกำหนดเป้าหมายของ shRNA สำหรับ DHCR7 ของมนุษย์มีดังต่อไปนี้: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}} เวกเตอร์ pLKO.1 ซึ่งมี shRNA แบบกวนสำหรับการควบคุมเชิงลบ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) หรือลำดับเป้าหมายเฉพาะถูกแปลงร่างเป็นเซลล์ HEK293T ร่วมกับ psPAX2 และ pMD2.G พร้อมด้วย Lipofectamine 2{{19} }00. อนุภาคไวรัสที่มีส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บเกี่ยวที่ 36 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน และจากนั้นจึงปั่นแยกที่ 210 กรัมเป็นเวลา 10 นาที เฟสส่วนลอยเหนือตะกอนที่ปราศจากเซลล์ถูกกรองผ่านตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตร เพื่อกำจัดเศษเซลล์ออก เซลล์ U251 ติดเชื้ออนุภาคเลนติไวรัสโดยมีโพลีเบรน 8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร หลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ U251 ถูกเลือกด้วยพิวโรมัยซิน (2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, ซิกมา) ประสิทธิภาพการล้มลงของ sh-DHCR7 ถูกกำหนดโดย RT-PCR และการวิเคราะห์ Western blot

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

2.6. รอยเปื้อนแบบตะวันตก

เซลล์ถูกสลายโดยบัฟเฟอร์ RIPA ที่เสริมด้วยตัวยับยั้งโปรตีเอสและตัวยับยั้งฟอสฟาเตสบนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นปั่นแยกที่ 4 C, 13,000 กรัม เป็นเวลา 1{{10}} นาทีเพื่อรวบรวมเซลล์ ไลเซท ความเข้มข้นของโปรตีนในเซลล์ไลเซตถูกวัดโดยการทดสอบโปรตีนของกรดไบซินโคนิก (BCA) โปรตีนถูกแยกโดย SDS-PAGE จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิล ไดฟลูออไรด์ (PVDF) เมมเบรน PVDF ถูกปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์การขัดขวางอิมมูโนลอตต์ TBST (10 มิลลิโมล/ลิตร Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 โมล/ลิตร NaCl และ 0.05% ทวีน-20) ที่มี 5% BSA เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการล้างด้วย TBST เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิและแอนติบอดีที่สอง และต่อมาตรวจพบโดยใช้ระบบสร้างภาพเคมีบำบัด (Bio-Rad)

2.7. การทดสอบคอเลสเตอรอลรวม

ตรวจพบโคเลสเตอรอลทั้งหมดในเซลล์โดยใช้ชุดตรวจวัดโคเลสเตอรอลรวมในเนื้อเยื่อจาก Applygen Technologies Inc. (ปักกิ่ง, จีน) คอเลสเตอรอลมาตรฐาน 5 มิลลิโมล/ลิตรต้องเจือจางแบบอนุกรมด้วยเอทานอลแบบแอนไฮดรัสเพื่อวาดเส้นโค้งมาตรฐาน และปริมาณของคอเลสเตอรอลรวมของเซลล์ถูกคำนวณตามเส้นโค้งมาตรฐาน การทดลองดำเนินการตามขั้นตอนที่ผู้ผลิตกำหนด

2.8. การตรวจการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันร่วม

เซลล์ HEK293T ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วยพลาสมิดที่ระบุ เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและ lysed ด้วยบัฟเฟอร์ RIPA lysis ที่เสริมด้วยสารยับยั้งโปรตีเอส หลังจากการปั่นแยกที่ 18, 000 กรัม เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 C เซลล์ lysates จะถูกรวบรวมและกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดย Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 4 C โปรตีนที่ถูกผูกไว้ ถูกชะด้วยบัฟเฟอร์การโหลด 2 ตัว และวิเคราะห์โดยอิมมูโนล็อตติง

2.9. PCR แบบเรียลไทม์

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์โดยใช้ TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies) และ cDNA ถูกผลิตด้วยชุด M-MLV Reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA) RT-PCR ดำเนินการโดยใช้ชุด SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) บน Roche LC480 mRNA ของกลีเซอรอลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) ถูกตั้งค่าเป็นการอ้างอิงภายนอกเพื่อทำให้ mRNA เป็นมาตรฐาน และระดับการแสดงออกของยีนถูกคำนวณโดยใช้วิธี 2 ΔΔCT ลำดับของไพรเมอร์ RT-PCR แสดงในตารางเสริม S1 2.10. กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

เซลล์ U251 ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 30 ชั่วโมง จากนั้นล้างสามครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 15 นาทีและแทรกซึมด้วย PBS ที่มี 0.1% ไทรทันX-100 เป็นเวลา 5 นาที หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์ถูกปิดผนึกด้วย PBS ที่มี BSA 5% เป็นเวลา 30 นาที เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS และบ่มด้วยแอนติ-HA, แอนติ-FLAG และแอนติ-ฟลาวีไวรัส จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต้านหนูเมาส์ FITC และแอนติบอดีรอง Cy3 ต้านกระต่าย เซลล์ถูกย้อมด้วย 40,6-Diamidino-2-ฟีนิลินโดล ไดไฮโดรคลอไรด์ (DAPI) และดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของ Olympus

2.11. การทดสอบแบบดึงลง GST

พลาสมิด pGEX6p-1-NS4B ถูกแปลงร่างไปเป็น Escherichia coli (E. coli) สายพันธุ์ BL21 GST และ GST-NS4B ถูกชักนำโดย IPTG ด้วยความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.5 mmol/L และเพาะเลี้ยงต่อไปอีก 6–8 ชั่วโมงที่ 37 C จากนั้นโปรตีน GST และ GST- โปรตีน NS4B ถูกทำให้บริสุทธิ์จากแบคทีเรีย E. coli โปรตีน GST หรือ GST-NS4B ถูกบ่มด้วยเม็ดกลูตาไธโอน Sepharose (โนวาเจน) และล้างสามครั้งด้วย PBS โปรตีน GST และ GST-NS4B ถูกบ่มด้วยโปรตีนฟิวชันยูคาริโอต HA-DHCR7 ซึ่งมีต้นกำเนิดจากพลาสมิดที่เข้ารหัส HA-DHCR7-แสดงไลเซตเซลล์ HEK293T เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 4 C ตะกอนถูกล้างห้าครั้ง ต้มใน บัฟเฟอร์การโหลด SDS 2 ตัว และตรวจพบโดย Western blot ที่มีแอนติบอดีต่อต้าน GST และต่อต้าน HA

2.12. HA-DHCR7 การกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์

ไพรเมอร์ก่อกลายพันธุ์คู่ที่เหมาะสม (ตารางเสริม S1) ถูกสังเคราะห์และใช้เพื่อสร้างโครงสร้างที่กลายพันธุ์โดย PCR HA-DHCR7 ถูกใช้เป็นเทมเพลตสำหรับ PrimeSTAR® HS Premix (Takara) หลังจาก PCR พลาสมิดชนิดไวด์ที่เหลืออยู่ในผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกย่อยแบบคัดเลือกโดย DpnI (New England Biolabs) ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกย่อยถูกทรานส์เฟกไปเป็น เชื้อ E. coli สายพันธุ์ DH5 พันธุ์กลายที่ต้องการได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ลำดับแซงเจอร์

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

2.13. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองทั้งหมดทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเฉลี่ย (SD) ความสำคัญของความแปรปรวนถูกกำหนดโดยการทดสอบ t-test แบบสองด้านของนักเรียนสำหรับการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองกลุ่มหรือทางเดียวด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak สำหรับการเปรียบเทียบหลายกลุ่มโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 8.0.1) ค่า P < 0.{{10}}5 ถูกพิจารณาว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ และ P > 0.05 ถูกระบุว่าไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับข้อมูลทั้งหมด มีการนำเสนอนัยสำคัญเป็น *P < 0.05, **P < 0.01 และ ***P < 0.001

3. ผลลัพธ์

3.1. การติดเชื้อ ZIKV ทำให้เกิดการแสดงออกของ DHCR7

หลักฐานที่สะสมได้แสดงให้เห็นว่าเมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอลมีอิทธิพลต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของโฮสต์ต่อการติดเชื้อไวรัสฟลาวิไวรัส เช่น ZIKV และไวรัสไข้เลือดออก (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018) DHCR7 เข้ารหัสเอนไซม์ที่เปลี่ยน 7-DHC ให้เป็นคอเลสเตอรอล ซึ่งเป็นขั้นตอนสุดท้ายในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของคอเลสเตอรอล (Moebius et al., 1998) ก่อนอื่นเราตรวจพบการแสดงออกของ DHCR7 จากการติดเชื้อ ZIKV astrocyte U251 ของมนุษย์ติดเชื้อ ZIKV ซึ่งเพิ่มการแสดงออกของ DHCR7 ขึ้นอยู่กับขนาดยาที่ทั้ง mRNA และโปรตีน (รูปที่ 1A – C) เพื่อยืนยันปรากฏการณ์นี้ เราได้ตรวจสอบการแสดงออกของ DHCR7 ในเซลล์ Vero ต่อไป และพบว่าการติดเชื้อ ZIKV ทำให้เกิดการแสดงออกของ DHCR7 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1D-F) ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ในเซลล์ U251

ประโยชน์ของ cistanche - เสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

3.2. การกำหนดเป้าหมาย DHCR7 ทำให้เกิดกิจกรรมต่อต้าน ZIKV ที่สำคัญ

เพื่อประเมินผลกระทบของ DHCR7 ต่อการติดเชื้อ ZIKV เซลล์ U251 และ A549 ได้รับการถ่ายด้วยพลาสมิดที่เข้ารหัส HA-DHCR7 จากนั้นติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ DHCR7 เพิ่มการแสดงออกของ ZIKV mRNA อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2A และ B) โดยเฉพาะอย่างยิ่งด้วยการสะสมของโปรตีน DHCR7 การแสดงออกของโปรตีนโครงสร้าง ZIKV E ก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน (รูปที่ 2C และ D) นอกจากนี้ เรายังทำการทดสอบคราบจุลินทรีย์เพิ่มเติมโดยใช้ส่วนลอยเหนือตะกอนจากรูปที่ 2C และพบว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ DHCR7 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหน่วยการขึ้นรูปของคราบจุลินทรีย์ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2E และ F) มีการรายงานการกลายพันธุ์แบบ missense G410S ของ DHCR7 เพื่อยกเลิกกิจกรรมของเอนไซม์ (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000) เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ DHCR7 ต่อการติดเชื้อ ZIKV เพิ่มเติม เราได้สร้างการกลายพันธุ์ที่ไม่ใช้งานของ DHCR7 (G410S) ต่อไป เมื่อเปรียบเทียบกับ DHCR7 แบบไวด์ การกลายพันธุ์ G410S สามารถยับยั้งการติดเชื้อ ZIKV ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2G) นอกจากนี้เรายังทำการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพื่อยืนยันการสังเกต ดังที่แสดงในรูปที่ 2H การแสดงออกมากเกินไปของ DHCR7 เพิ่มการติดเชื้อ ZIKV เพื่อตรวจสอบว่าการทำงานของเอนไซม์ DHCR7 ภายนอกมีความสำคัญต่อการติดเชื้อ ZIKV หรือไม่ เราได้ออกแบบ RNA แบบกิ๊บสั้น 2 ตัว (shDHCR7-1 และ sh-DHCR7-2) ที่กำหนดเป้าหมาย DHCR7 โดยเฉพาะ และสร้างเซลล์ U251 ที่เก็บเสียง DHCR7- เส้นที่มีระบบ shRNA (รูปที่ 3A) สุดท้าย เราเลือก sh-DHCR7-1 เพื่อประสิทธิภาพในการปิดเสียงที่สูงขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมการถ่ายโอนเซลล์ shRNA เซลล์ล้มลง DHCR7 เหล่านี้แสดงความไวต่อการติดเชื้อ ZIKV ต่ำกว่า (รูปที่ 3B และ C) ต่อไปเราใช้ตัวยับยั้ง DHCR7 แบบคัดเลือก AY9944 ซึ่งป้องกัน 7-การเปลี่ยน DHC ไปเป็นคอเลสเตอรอล (Xu et al., 2011) ซึ่งได้รับการแสดงให้เห็นว่ายับยั้งการทำงานของเอนไซม์ DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998) เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม การบริหาร AY9944 ขึ้นอยู่กับขนาดยายับยั้งการติดเชื้อ ZIKV ในเซลล์ U251 (รูปที่ 3D-F) การทดสอบคราบจุลินทรีย์ยังดำเนินการในเซลล์ Vero เพื่อประเมินผลกระทบของ DHCR7 เพิ่มเติม และแสดงให้เห็นว่า AY9944 สามารถระงับการติดเชื้อ ZIKV ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3G และ H) โดยเฉพาะอย่างยิ่งกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแสดงให้เห็นว่าโปรตีน ZIKV E ลดลงอย่างมากเมื่อมี AY9944 (รูปที่ 3I) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมาย DHCR7 สามารถยับยั้งการติดเชื้อ ZIKV ได้

รูปที่ 1 การติดเชื้อ ZIKV ทำให้เกิดการแสดงออกของ DHCR7 เซลล์ A – F U251 และ Vero ติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 0, 1 และ 2) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และระดับ RNA ในเซลล์ของ ZIKV (A, D) และ DHCR7 (B, E) ถูกกำหนดโดย RT-PCR โดยมี GAPDH เป็นตัวควบคุมภายใน ระดับโปรตีนสัมพัทธ์ของซองจดหมาย DHCR7 และ ZIKV ถูกตรวจพบโดย Western blot (C, F) ข้อมูลมาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง (ค่าเฉลี่ย SD) หรือข้อมูลตัวแทน (C, F) นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวกับการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett (A, B, D, E) **P < 0.01, ***P < 0.001 SD ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน

3.3. DHCR7 ยับยั้งการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 เพื่อลดการผลิต IFN- และ ISG

เนื่องจาก DHCR7 เป็นเอนไซม์สำคัญในการแปลง 7-DHC ไปเป็นคอเลสเตอรอล (Moebius et al., 1998) และการติดเชื้อ ZIKV สามารถเพิ่มการแสดงออกของ DHCR7 เราจึงวัดระดับคอเลสเตอรอลจากการติดเชื้อ ZIKV เราเปิดเผยว่าการติดเชื้อ ZIKV มีผลเพียงเล็กน้อยต่อการสังเคราะห์คอเลสเตอรอลในเซลล์ U251 และ Vero (รูปที่ 4A และ B) แม้ว่า DHCR7 จะเพิ่มขึ้น (รูปที่ 1A – D) เมื่อพิจารณาจากการปรับปรุง DHCR7 จากการติดเชื้อ ZIKV และบทบาทสำคัญของ IFN ในการเผชิญหน้ากับการติดเชื้อ ZIKV ต่อไปเราจะพิจารณาผลกระทบของ DHCR7 บนเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN-I เซลล์ U251 ที่ควบคุมและปิดเสียง DHCR{11}} ติดเชื้อ ZIKV หรือทรานส์เฟกด้วยโพลี (I: C) และมีการสำรวจการแสดงออกของ IFN เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การติดเชื้อ ZIKV หรือการรักษาด้วยโพลี (I: C) ช่วยเพิ่มการแสดงออกของ IFN อย่างเห็นได้ชัดใน DHCR 7- ที่ทำให้เซลล์ U251 เงียบลง (รูปที่ 4C และ D) ISG เป็นเอฟเฟกต์ของการกระทำของอินเตอร์เฟอรอน และมีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อการติดเชื้อ ZIKV นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่าการบล็อก DHCR7 สามารถเสริมการแสดงออกของ ISG15 และ ISG56 อย่างมีนัยสำคัญทั้งในระดับ mRNA และโปรตีน (รูปที่ 4E – J) การรักษา DHCR7 inhibitor AY9944 อย่างต่อเนื่องสามารถกระตุ้นการแสดงออกของ IFN-, ISG15 และ ISG56 (รูปที่ 4K, L) ที่สำคัญ G410S กลายพันธุ์ที่ไม่ได้ใช้งานสามารถย้อนกลับผลการยับยั้งของ DHCR7 บางส่วนต่อการแสดงออกของ IFN- และ ISG (รูปที่ 4M, N) การเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำ IFNs-ISGs ดังนั้นเราจึงตรวจสอบผลของ DHCR7 ต่อการแสดงออกและการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 ต่อไป เราแสดงให้เห็นว่า DHCR7 ไม่เพียงแต่ยับยั้งระดับโปรตีนขึ้นอยู่กับขนาดยาเท่านั้น แต่ยังยับยั้งระดับของ TBK1 และ IRF3 phosphorylation (รูปที่ 5A – C) ยิ่งไปกว่านั้น G410S กลายพันธุ์ที่ไม่ได้ใช้งานกลับผลการยับยั้งของ DHCR7 ต่อ IRF3 และ TBK1 phosphorylation ได้ไม่สมบูรณ์ (รูปที่ 5D) ไม่สอดคล้องกับการค้นพบของการแสดงออกมากเกินไปของ DHCR7 การรักษา AY9944 สามารถกระตุ้นการกระตุ้น IRF3 และ TBK1 ในเซลล์ U251 (รูปที่ 5E)

3.4. ZIKV NS4B โต้ตอบกับ DHCR7 เพื่อยับยั้ง TBK1 และ IRF3 phosphorylation

หลักฐานการติดตั้งเผยให้เห็นว่า ZIKV พัฒนาโปรตีน NS จำเพาะเพื่ออำนวยความสะดวกในการจำลองแบบที่มีประสิทธิภาพในเซลล์โฮสต์โดยการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของโฮสต์และการปรับตัวโดยตรงผ่านกลไกที่ไม่ต่อเนื่องมากมายเหลือเฟือ เราทำการทดสอบ co-IP เพื่อคัดกรองโปรตีน ZIKV NS แต่ละตัวที่สามารถโต้ตอบกับ DHCR7 เซลล์ HEK293T ได้รับการถ่ายร่วมด้วย pCMV-DHCR 7- HA และพลาสมิดที่แสดงโปรตีน NS แต่ละตัวที่หลอมรวมด้วย Flag-tag ดังที่แสดงในรูปที่ 6A DHCR7 จับกับ NS4B เท่านั้น แต่ไม่สามารถโต้ตอบกับโปรตีน NS อื่น ๆ ได้ การทดสอบ co-IP ซึ่งกันและกันได้ดำเนินการเพิ่มเติมและแสดงให้เห็นว่าโปรตีน NS4B มีปฏิกิริยากับ DHCR7 ในเซลล์ HEK293T (รูปที่ 6B และ C) เพื่อยืนยันการทำงานร่วมกันของ NS4B และ DHCR7 เราทำการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลต่อไปและพบว่าโปรตีน NS4B และโปรตีน DHCR7 ถูก colocalized ในไซโตพลาสซึม (รูปที่ 6D) การทดสอบแบบดึงลง GST แสดงให้เห็นเพิ่มเติมถึงปฏิสัมพันธ์ของ NS4B และ DHCR7 (รูปที่ 6E) ยิ่งไปกว่านั้น การถ่ายชั่วคราวของ NS4B ในเซลล์ U251 สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ DHCR7 ได้อย่างมาก (รูปที่ 6F) ที่สำคัญ NS4B สามารถบล็อกฟอสโฟรีเลชั่นของทั้ง TBK1 และ IRF3 ขึ้นอยู่กับปริมาณซึ่งมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการกระตุ้นการทำงานของ TBK1 และ IRF3 ที่ปรับปรุงแล้วเพื่อตอบสนองต่อ DHCR7 (รูปที่ 6G และ H) อย่างไรก็ตามการแสดงออกมากเกินไปของ NS4B ในเซลล์ HEK293T ทำให้ระดับโปรตีนของ TBK1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ แต่มีผลเพียงเล็กน้อยต่อโปรตีน IRF3 (รูปที่ 6G และ H) เพื่อยืนยันการสังเกตเหล่านี้เพิ่มเติม NS4B ถูกแปลงร่างเป็นเซลล์ U251 ที่ล้มลงของ DHCR7 และแสดงผลการยับยั้งต่อโปรตีนภายนอกและระดับฟอสโฟรีเลชั่นของ TBK1 และ IRF3 (รูปที่ 6I) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า ZIKV NS4B โต้ตอบกับ DHCR7 และนิพจน์ DHCR7 ที่ปรับปรุงแล้วเพื่อบล็อกการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 จากนั้นอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ ZIKV

รูปที่ 2 การแสดงออกมากเกินไปของ DHCR7 ส่งเสริมการจำลองแบบ ZIKV เซลล์ A – D U251 และ A549 ได้รับการถ่ายด้วย HA-vector หรือ HA-DHCR7 ที่ความเข้มข้นที่ระบุเป็นเวลา 12 ชั่วโมงจากนั้นติดเชื้อ ZIKV ต่อไปอีก 36 ชั่วโมง ระดับ ZIKV RNA ถูกตรวจพบโดย RT-PCR โดยมี GAPDH เป็นการควบคุมภายใน (A, B) และระดับโปรตีนของซอง ZIKV, HA-DHCR7 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot (C, D) เซลล์ E, F Vero ติดเชื้อส่วนเหนือตะกอนที่มี ZIKV จากรูปที่ 2C เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อตรวจสอบสำเนา ZIKV โดยการตรวจคราบจุลินทรีย์ เซลล์ G U251 ได้รับการถ่ายด้วย HA-vector, HA-DHCR7 หรือ HA-DHCR7 (G410S) เป็นเวลา 12 ชั่วโมงและติดเชื้อ ZIKV เป็นเวลา 36 ชั่วโมง และระดับโปรตีนของซองจดหมาย ZIKV, HA-DHCR7 และ ตรวจพบ GAPDH โดย Western blot เซลล์ H U251 ได้รับการถ่ายด้วย HA-vector หรือ HA-DHCR7 (1 ug) เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ติดเชื้อ ZIKV เป็นเวลา 36 ชั่วโมงและต่อมาบ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน flavivirus ของเมาส์และแอนติบอดีต่อต้าน HA ของกระต่ายตามด้วยการย้อมด้วย FITC-conjugated antimouse และ แอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตต้านกระต่ายด้วย Cy3- นิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI ภาพถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล สเกลบาร์ ¼ 100 μm ข้อมูลมาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง (ค่าเฉลี่ย SD) หรือข้อมูลตัวแทน (C, D, E, G, H) นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยใช้การทดสอบแบบสองด้านแบบไม่จับคู่ (F) ของนักเรียนหรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Dunnett (A, B) *พี < 0.05, ***พี < 0.001 SD ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน

4. การอภิปราย

IFN ประเภท 1 และ ISG ปลายน้ำของพวกเขาเผชิญกับเชื้อโรคจำนวนมากและมีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันของโฮสต์จาก ZIKV (Lazear et al., 2016) เพื่อหลีกเลี่ยงการเฝ้าระวังที่ใช้สื่อกลาง IFN และบรรลุการจำลองแบบที่เพียงพอ ZIKV พัฒนาโปรตีน NS โดยกำหนดเป้าหมายไปยังจุดต่าง ๆ ของเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN เพื่อหนีจากระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของเซลล์ (Lee et al., 2021) การศึกษาที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่า ZIKV NS1, NS3, NS4A และ NS5 ยับยั้งโมดูลที่แตกต่างกันของเส้นทาง RIG-I / IFN-I และอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัสโดยใช้กลไกอิสระและหลากหลาย (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma และคณะ, 2018; Riedl และคณะ, 2019; Xia และคณะ, 2018; Zheng และคณะ, 2018) อย่างไรก็ตาม กลไกเฉพาะของ ZIKV NS4B ที่ต่อต้านการจำกัดภูมิคุ้มกันนั้นมีการกำหนดไว้ไม่ดี ZIKV NS4B เป็นโปรตีนที่ไม่ชอบน้ำอย่างยิ่ง ประกอบด้วยกรดอะมิโน 251 ตัว และอยู่ในเยื่อหุ้มเซลล์เอนโดพลาสมิกที่มีปลาย N (Zou et al., 2014) การยับยั้ง NS4B ของเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN-I ได้รับการระบุใน flaviviruses ที่แตกต่างกัน (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. อัล., 2021). การศึกษาล่าสุดรายงานว่าสายพันธุ์ ZIKV INMI1 ที่แยกได้ในบราซิลใช้ NS4B เพื่อเป็นศัตรูกับเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN-I โดยการบดขยี้ฟอสโฟรีเลชั่นของ STAT1 และขัดขวางการขนส่งนิวเคลียร์ของ STAT1 (Fanunza et al., 2021) ในการศึกษานี้ เราพบกลไกที่ชัดเจนซึ่ง ZIKV NS4B ยกเลิกการผลิต IFN โดยการยับยั้ง TBK1 และ IRF3 phosphorylation ซึ่งเป็นองค์ประกอบต้นน้ำของเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN-I โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีการค้นพบการทดแทนกรดอะมิโน (G18R) ใน ZIKV NS4B ซึ่งส่งผลให้การผลิต IFN ลดลงและการแสดงออกของ ISG ที่อ่อนแอลง และส่งผลให้การติดเชื้อไวรัสในหนูสะดวกขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงความสำคัญของ NS4B ในฐานะปัจจัยกำหนดของการเกิดโรค (Gorman et al ., 2561). หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่บ่งชี้ถึงความสำคัญที่สำคัญของการเผาผลาญคอเลสเตอรอลที่มีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015) แม้ว่าตัวกลางหลายชนิดในการเผาผลาญคอเลสเตอรอลได้รับการบันทึกไว้ว่ามีฤทธิ์ต้านไวรัสในวงกว้าง (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020) การศึกษาของเราแสดงให้เห็นถึงกลไกใหม่ เอนไซม์เมตาบอลิซึมของโคเลสเตอรอล DHCR7 เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ ZIKV โดยลดการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 เพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัส เนื่องจากเป็นเอนไซม์สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญเดสโมสเตอรอลและคอเลสเตอรอล DHCR7 จึงเป็นสวิตช์ของการเปลี่ยน 7-DHC ไปเป็นวิตามินดีในเซลล์ผิวหนังที่สัมผัสกับ UVB (Prabhu et al., 2016b) ยิ่งไปกว่านั้น DHCR7 ไม่เพียงวางตำแหน่งที่เกตเวย์ของทางเดิน Bloch เท่านั้น แต่ยังอยู่ที่ส่วนท้ายของทางเดิน Kandutsch-Russell (Prabhu et al., 2016a, 2016b) ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสังเคราะห์คอเลสเตอรอล crosstalk ของ DHCR7 และอันตรกิริยาของมันกับเอนไซม์อื่นๆ ในหลายวิถีทางอาจเสริมศักยภาพการทำงานหลายอย่างในเซลล์หรืออวัยวะประเภทต่างๆ การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่าการปิดกั้น DHCR7 อาจลดเดสโมสเตอรอลซึ่งเป็นสารตั้งต้นของการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลในทันที ดังนั้นจึงให้การป้องกันการติดเชื้อไวรัสตับอักเสบซีอย่างเพียงพอ (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012) ที่สำคัญเสี่ยวและคณะ ได้แสดงให้เห็นว่าการติดเชื้อ VSV ลดการแสดงออกของ DHCR7 ส่งผลให้คอเลสเตอรอลลดลง แต่มีการสะสม 7-DHC ในมาโครฟาจและตับมากขึ้น (Xiao et al., 2020) มาโครฟาจที่รักษาด้วย 7-DHC แสดงผลการตอบสนองของไวรัสที่ดีขึ้น ในขณะที่การเติมคอเลสเตอรอลแสดงให้เห็นการป้องกันเล็กน้อย สารยับยั้ง DHCR7 และการบริหารให้ 7-DHC อาจเป็นวิธีที่มีประโยชน์ในการต่อสู้กับการติดเชื้อไวรัส เช่น HIN1, HSV และ VSV ในการศึกษานี้ เราพบว่าตัวยับยั้ง DHCR7 AY9944 สามารถยับยั้งการติดเชื้อ ZIKV ได้ อย่างไรก็ตาม การศึกษาของเราเปิดเผยว่าการติดเชื้อ ZIKV ทำให้เกิดการแสดงออกของ DHCR7 แต่มีผลเพียงเล็กน้อยต่อการสังเคราะห์คอเลสเตอรอลในเซลล์ glial เราไม่ได้ตรวจสอบระดับของการแสดงออกของ 7-DHC หลังการติดเชื้อ ZIKV อย่างไรก็ตาม ก็คุ้มค่าที่จะตรวจสอบเพิ่มเติมว่า 7-DHC และ AY9944 มีประสิทธิภาพการรักษาแบบเสริมฤทธิ์กันในการรักษาผู้ป่วยที่ติดเชื้อ ZIKV หรือไม่ การติดเชื้อในสมอง การแสดงออกมากเกินไปของ DHCR7 ส่งเสริมการติดเชื้อ ZIKV ในขณะที่การรักษาแบบเลือกยับยั้ง DHCR7 (AY9944) เพิ่มการผลิต IFN อย่างมากต่อการติดเชื้อ ZIKV การเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 มีความสำคัญสำหรับการส่งสัญญาณ IFN-I การตรวจสอบก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการปิดเสียง DHCR7 หรือ 7- การรักษา DHC เปิดใช้งานเส้นทาง PI3K-AKT3 ไปยัง phosphorylate IRF3 แต่ไม่ใช่ TBK1 ในแมคโครฟาจ (Xiao et al., 2020) อย่างไรก็ตามการค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่า DHCR7 ขึ้นอยู่กับปริมาณลดลงทั้งการแสดงออกของ IRF3 และ TBK1 รวมถึง IRF3 และ TBK1 phosphorylation การตรวจสอบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DHCR7 อาจมีส่วนทำให้เกิดการติดเชื้อ ZIKV ในกลไกที่ไม่ขึ้นกับการเผาผลาญคอเลสเตอรอลในสมอง มีการอธิบายอย่างดีว่า ZIKV ใช้โปรตีน NS เพื่อโต้ตอบโดยตรงกับส่วนประกอบต่าง ๆ ของเส้นทาง RIG-I / IFN-I เพื่อหลบเลี่ยงการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันและอำนวยความสะดวกในการจำลองแบบของไวรัส ก่อนหน้านี้เรารายงานการทำงานร่วมกันของ ZIKV NS5 กับ RIG-I เพื่อลดการผลิต IFN- (Li et al., 2020) คนอื่นๆ แสดงให้เห็นว่า ZIKV NS1 และ NS2B กำหนดเป้าหมายไปที่ TBK1, NS3 กำหนดเป้าหมายบน RIG-I และ MDA5 เพื่อลดการผลิต IFN-I และ ISG (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019) อย่างไรก็ตามการทำงานของโปรตีน ZIKV NS ที่กำหนดเป้าหมายการเผาผลาญคอเลสเตอรอลยังคงเข้าใจยากเป็นส่วนใหญ่ ในการศึกษานี้ เรายังแสดงให้เห็นปฏิสัมพันธ์ที่ไม่ได้รายงานระหว่างเอนไซม์เมตาบอลิซึมของคอเลสเตอรอล DHCR7 และโปรตีน ZIKV NS เราแสดงให้เห็นว่า DHCR7 จับกับ NS4B โดยเฉพาะ ไม่ใช่กับโปรตีน NS อื่น ๆ เราจัดเตรียมหลักฐานที่สำคัญว่า ZIKV NS4B โต้ตอบกับ DHCR7 และกระตุ้นการแสดงออกของมันอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ในเซลล์ U251 จากการติดเชื้อ ZIKV ที่สำคัญ นอกเหนือจากการสาธิตการมีส่วนร่วมของ DHCR7 และ ZIKV NS4B โดยตรงแล้ว เรายังพบว่า ZIKV NS4B เพิ่มการแสดงออกของ DHCR7 เพื่อยับยั้ง TBK1 และ IRF3 phosphorylation และอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ ZIKV ตามข้อตกลงกับผลลัพธ์ของเรา การศึกษาล่าสุดเปิดเผยว่าการขาด DHCR7 สามารถกระตุ้นการส่งสัญญาณ IRF3 และ IFN เพื่อยับยั้ง VSV และไวรัสอื่น ๆ ในแมคโครฟาจ

รูปที่ 3 การล้มลงของ DHCR7 ช่วยลดการติดเชื้อ ZIKV ในเซลล์ U251 เซลล์ U251 ได้รับการถ่ายทอดด้วยอนุภาคเลนติไวรัสที่มี shRNA เทียบกับ DHCR7 (shDHCR7-1 และ sh-DHCR7-2) หรือลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมาย (sh-NTC) ตามด้วยการเลือกพิวโรมัยซินเป็นเวลา 14 วัน ประสิทธิภาพการน็อคดาวน์ถูกกำหนดโดย RT-PCR B, C DHCR7-การปิดเสียงเซลล์ U251 (sh-DHCR7) และเซลล์ sh-NTC U251 ถูกจำลองการติดเชื้อหรือติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 36 ชั่วโมง ระดับ ZIKV RNA ในเซลล์ถูกตรวจพบโดย RT-PCR โดยมี GAPDH เป็นตัวควบคุมภายใน (B) และระดับโปรตีนของซอง ZIKV, DHCR7 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot (C) เซลล์ D, E U251 ได้รับการบำบัดด้วยสารยับยั้ง DHCR7 AY9944 ที่ความเข้มข้นที่ระบุเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นติดเชื้อด้วย ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ถูก RT-PCR เพื่อตรวจจับ ZIKV RNA (D) ระดับโปรตีนของซอง ZIKV, DHCR7 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot (E) เซลล์ F U251 ได้รับการบำบัดด้วยสารยับยั้ง DHCR7 AY9944 ที่ความเข้มข้นที่ระบุเป็นเวลา 36 ชั่วโมง และตรวจพบ DHCR7 และ GAPDH โดย Western blot เซลล์ G, H Vero ติดเชื้อส่วนเหนือตะกอนที่มี ZIKV จากรูปที่ 3E เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อตรวจสอบสำเนา ZIKV โดยการตรวจคราบจุลินทรีย์ เซลล์ I U251 ได้รับการรักษาด้วย AY9944 ที่ความเข้มข้นที่ระบุเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นติดเชื้อ ZIKV ที่ MOI ¼ 1 เป็นเวลา 36 ชั่วโมง ภาพถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล สเกลบาร์ ¼ 100 μm ข้อมูลมาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง (ค่าเฉลี่ย SD) หรือข้อมูลตัวแทน (C, E, F, G และ I) นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวกับการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett (A, D, H) หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak (B) ***พี < 0.001. SD ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน

รูปที่ 4 DHCR7 ยับยั้งการผลิต IFN- และ ISG เซลล์ A, B U251 และ Vero ติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 และ 1) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและวัดคอเลสเตอรอลในเซลล์โดยชุดทดสอบคอเลสเตอรอลรวมของเนื้อเยื่อ C–H DHCR7- การปิดเสียง U251 (sh-DHCR7) และเซลล์ sh-NTC U251 ติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) หรือรักษาด้วย Poly (I: C) (1 ug/mL) เป็นเวลา 6 ชั่วโมง RNA ของเซลล์ทั้งหมดถูกสกัดและอยู่ภายใต้ RT-PCR สำหรับการแสดงออก mRNA โดยมี GAPDH เป็นการควบคุมภายใน การแสดงออกสัมพัทธ์ของ IFN- และ ISG ถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับตัวอย่าง sh-NTC ในกลุ่มจำลอง และการเปลี่ยนแปลงการพับแสดงมากเกินไป IFN- (C, D), ISG15 (E, F) และ ISG56 (G, H) I, J DHCR7-การปิดเสียงเซลล์ U251 (sh-DHCR7) และเซลล์ sh-NTC U251 ติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) หรือทรานส์เฟกด้วยโพลี (I: C) (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และระดับโปรตีนของ ISG15, ISG56 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot เซลล์ K U251 ได้รับการรักษาด้วยขนาดที่ระบุ AY9944 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 6 ชั่วโมง RT-PCR ตรวจพบระดับ IFN-RNA โดยมี GAPDH เป็นตัวควบคุมภายใน เซลล์ L U251 ได้รับการรักษาด้วยขนาดที่ระบุคือ AY9944 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ระดับโปรตีนของ ISG15, ISG56 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot เซลล์ M U251 ได้รับการถ่ายด้วย HA-vector, HA-DHCR7 หรือ HA-DHCR7 (G410S) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 6 ชั่วโมง RT-PCR ตรวจพบระดับ IFN-RNA โดยมี GAPDH เป็นตัวควบคุมภายใน เซลล์ N U251 ได้รับการถ่ายด้วย HA-vector, HA-DHCR7 หรือ HA-DHCR7 (G410S) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ระดับโปรตีนของ ISG15, ISG56 และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot ข้อมูลมาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง (ค่าเฉลี่ย SD) หรือข้อมูลตัวแทน (I, J, L, N) นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวกับการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett (A, B, K, M) หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak (C–H) ns, P > 0.05, ***P < 0.001 SD ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน

มะเดื่อ 5. DHCR7 ยับยั้งการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 เซลล์ A, B HEK293T ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดเข้ารหัส TBK1- ร่วมกับ DHCR7- ซึ่งแสดงออกพลาสมิดหรือเวกเตอร์ว่าง (A) เซลล์ HEK293T ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดที่เข้ารหัส IRF3-, พลาสมิดที่เข้ารหัส RIG-I ร่วมกับ DHCR7-ซึ่งแสดงออกพลาสมิดหรือเวกเตอร์ว่าง (B) เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่ายและถูกเวสเทิร์นบล็อตด้วยแอนติบอดีที่ระบุ [แอนติ-TBK1, แอนติ-P-TBK1(S172), แอนติ-IRF3, แอนติ-PIRF3(S396), แอนติ-HA และแอนติ-GAPDH ] เซลล์ C U251 ได้รับการถ่ายด้วยขนาดที่ระบุของ DHCR7 ซึ่งแสดงพลาสมิดหรือเวกเตอร์เปล่าเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์จะติดเชื้อด้วย ZIKV (MOI ¼ 1) ที่เก็บเกี่ยวที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อและถูก Western blot ด้วยแอนติบอดีที่ระบุ [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), แอนติ-HA และแอนติ-GAPDH] เซลล์ D U251 ได้รับการแปลงสภาพด้วย HA-vector, HA-DHCR7 หรือ HA-DHCR7 (G410S) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์จะติดเชื้อด้วย ZIKV (MOI ¼ 1) ที่เก็บเกี่ยวที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อและถูก Western blot พร้อมแอนติบอดีที่ระบุ [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) , แอนติ-HA และแอนติ-GAPDH] เซลล์ E U251 ได้รับการรักษาด้วยขนาดที่ระบุของ AY9944 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและติดเชื้อ ZIKV (MOI ¼ 1) เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นจึงนำไปตรวจ Western blot พร้อมแอนติบอดีที่ระบุ [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-TBK1 (S172), anti-TBK1 (S172) -IRF3, ต่อต้าน P-IRF3 (S396) และต่อต้าน GAPDH] ข้อมูลมาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้งและแสดงเป็นข้อมูลตัวแทน (A–E)

ภาพที่ 6 ZIKV NS4B โต้ตอบกับ DHCR7 เพื่อยับยั้ง TBK1 และ IRF3 phosphorylation เซลล์ HEK293T ถูกทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดที่เข้ารหัส HA-DHCR7 และพลาสมิดที่เข้ารหัสโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง ZIKV (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B และ FLAG-NS5) หรือพลาสมิดควบคุมว่างเป็นเวลา 3 0 ชม. เซลล์ไลซีนถูกทำให้ตกตะกอนด้วยแอนติบอดีต้านแฟล็ก จากนั้นวิเคราะห์โดยอิมมูโนบลูตติงด้วยแอนติบอดีที่ระบุ เซลล์ B, C HEK293T ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดที่เข้ารหัส HA-DHCR7, พลาสมิดที่เข้ารหัส FLAG-NS4B หรือพลาสมิดควบคุมเปล่าเป็นเวลา 30 ชั่วโมง เซลล์ไลซีนได้รับการตกตะกอนด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HA (B) หรือแอนติบอดีต่อต้าน FLAG (C) จากนั้นวิเคราะห์โดยอิมมูโนล็อตติงด้วยแอนติบอดีที่ระบุ เซลล์ D U251 ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิด FLAG-NS4B ร่วมกับพลาสมิดที่เข้ารหัสด้วย HA-DHCR7 วิเคราะห์ตำแหน่งของ FLAG-NS4B (สีเขียว), HA-DHCR7 (สีแดง), เครื่องหมายนิวเคลียส DAPI (สีน้ำเงิน) และการผสานด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล สเกลบาร์ ¼ 10 μm E Cell lysates จากเซลล์ HEK293T ที่ถูกทรานส์เฟกด้วย HA-DHCR7 ถูกบ่มด้วยโปรตีน GST หรือโปรตีน GST-NS4B ซึ่งถูกบ่มด้วยเม็ดบีดกลูตาไธโอน-Sepharose ตรวจพบสารผสมโดย Western blot ที่มีแอนติบอดีต่อต้าน HA และต่อต้าน GST (บนสุด) ไลซีนจากเซลล์ HEK293T ที่ถูกแปลงสภาพและโปรตีนบริสุทธิ์ถูกตรวจพบโดย Western blot พร้อมแอนติบอดีต่อต้าน HA และต่อต้าน GST (ด้านล่าง) เซลล์ F U251 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วยการเข้ารหัสพลาสมิด FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug) ระดับโปรตีนสัมพัทธ์ของ DHCR7, FLAG-NS4B และ GAPDH ถูกตรวจพบโดย Western blot เซลล์ G, H HEK293T ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดที่แสดงออกถึง NS4B หรือเวกเตอร์เปล่า ร่วมกับพลาสมิดเข้ารหัส (F) ของ TBK{65}}, IRF3- ที่แสดงพลาสมิดและพลาสมิดที่เข้ารหัส RIG-I (G) . เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่ายและถูกเวสเทิร์นบล็อตด้วยแอนติบอดีที่ระบุ [แอนติ-TBK1, แอนติ-P-TBK1(S172), แอนติ-IRF3, แอนติ-P-IRF3(S396), แอนติ-FLAG และ antiGAPDH ] I DHCR7-การปิดเสียงเซลล์ U251 (sh-DHCR7) และเซลล์ sh-NTC U251 ได้รับการทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดที่แสดงออกถึง NS4B หรือเวกเตอร์เปล่า เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 6 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย และถูก Western blot ด้วยแอนติบอดีที่ระบุ [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG และ antiGAPDH ] ข้อมูลเป็นตัวแทนของการทดลองอิสระสามครั้ง

5. สรุปผลการวิจัย

โดยสรุป การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่าเอนไซม์เมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล DHCR7 เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อการติดเชื้อไวรัสต่างๆ การศึกษาของเราได้นำเสนอว่า ZIKV NS4B โต้ตอบกับ DHCR7 และกระตุ้นการแสดงออกของ DHCR7 DHCR7 ที่เพิ่มขึ้นยับยั้งการเปิดใช้งาน TBK1 และ IRF3 อย่างมาก และส่งผลให้การผลิต IFN- และ ISG ลดลง ซึ่งอำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ ZIKV ในเซลล์ glial การค้นพบเหล่านี้ได้เปิดเผยกลไกการหลบหนีภูมิคุ้มกันของไวรัสแบบใหม่ที่ ZIKV เอาชนะการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยการกำหนดเป้าหมาย DHCR7 โดยตรงด้วย NS4B

อ้างอิง

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., ฟอสเตอร์, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., ช่างไม้, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, ฟิตซ์เจอรัลด์, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. การควบคุมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติโดยวิถีเมวาโลเนต แนท. อิมมูนอล. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. ข้อจำกัดของไวรัสฟลาวิไวรัส วิโรล. บาป. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. ปัจจัยการถอดรหัส STAT-1 จับคู่การสังเคราะห์มาโครฟาจของ 25-ไฮดรอกซีโคเลสเตอรอล ต่อการตอบสนองของไวรัสอินเตอร์เฟอรอน ภูมิคุ้มกัน 38, 106–118

Cao-Lormeau, V.-M., เบลค, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E. , Mallet, H.-P. , Musso, D. , Fontanet, A. , Neil, J. , Ghawche, F. , 2016 การระบาดของโรค Guillain-Barre ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อไวรัส Zika ในเฟรนช์โปลินีเซีย: กรณี - การควบคุมการศึกษา มีดหมอ 387, 1531–1539

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I ตระหนักถึง 5' บริเวณจีโนมของไวรัสไข้เลือดออกและซิกา ตัวแทนเซลล์ 24, 320–328

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. เมแทบอลิซึม การเขียนโปรแกรมใหม่โดยไวรัส Zika กระตุ้นให้เกิดการอักเสบในรกของมนุษย์ แนท. ชุมชน 11 ต.ค. 2967 Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017 การยับยั้งการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลของ Oxysterol ช่วยป้องกันการกระตุ้นการอักเสบของ AIM2 เซลล์ 171, 1057–1071 e1011

Ding, Q. , Cao, X. , Lu, J. , Huang, B. , Liu, YJ, Kato, N. , Shu, HB, Zhong, J. , 2013 ไวรัสตับอักเสบซี NS4B บล็อกปฏิสัมพันธ์ของ STING และ TBK1 เพื่อหลบเลี่ยงภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของโฮสต์ เจ. เฮปาทอล. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 ไวรัส INMI1 Zika NS4B ต่อต้านการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนโดยการยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นของ STAT1 ไวรัส 13, 2448

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003 IKKε และ TBK1 เป็นองค์ประกอบสำคัญของการส่งสัญญาณ IRF3 ทางเดิน. แนท. อิมมูนอล. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. การกลายพันธุ์ใน Δ{{ 3}}ยีนสเตอรอล รีดักเตสในผู้ป่วยกลุ่มอาการ Smith–Lemli–Opitz โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 95, 8181–8186

กอร์แมน, เอ็มเจ, เคน, อีเอ, ไซเซฟ, เค., เบกลีย์, เอ็มซี, เวเกอร์-ลูคาเรลลี่, เจ., อุคเชลลินี, MB, ตรีปาธี, เอส., มอร์ริสัน, เจ., ยูนท์, บีแอล, ดินนอน 3, KH, รุคเคิร์ต, ซี ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. แบบจำลองเมาส์ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องของการติดเชื้อไวรัสซิกา จุลินทรีย์โฮสต์ของเซลล์ 23, 672–685.e6

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A. , 2016. ไวรัสซิกามุ่งเป้าไปที่มนุษย์ STAT2 เพื่อยับยั้งการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนประเภทที่ 1 จุลินทรีย์โฮสต์ของเซลล์ 19, 882–890

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A. , Rehwinkel, J. , 2018 การติดเชื้อไวรัส Zika ที่แยกได้ของบราซิลจะสร้าง RNA กระตุ้น RIG-I และโปรตีน NS5 ของไวรัสบล็อกประเภท I IFN การเหนี่ยวนำและการส่งสัญญาณ ยูโร เจ. อิมมูนอล. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. ผลของการยับยั้งการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลใหม่ (AY 9944) ต่อสเตอรอลในซีรั่มและเนื้อเยื่อในหนู เจ. ลิพิด เรส. 7, 116–121.

Ikonen, E. , 2008. การค้าโคเลสเตอรอลในเซลล์และการแบ่งส่วน แนท. สาธุคุณโมล เซลล์ไบโอล 9, 125–138.

คาโตะ, เอช., ทาเคอุจิ, โอ., ซาโต้, เอส., โยเนยามะ, เอ็ม., ยามาโมโตะ, เอ็ม., มัตสึอิ, เค., อูเอมัตสึ, เอส., จุง, เอ., คาวาอิ, ที., อิชิอิ, เคเจ, ยามากูจิ , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. บทบาทที่แตกต่างของ MDA5 และ RIG-I เฮลิเคสในการรับรู้ไวรัส RNA ธรรมชาติ 441, 101–105

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. การกลายพันธุ์ของ DHCR7 ที่เชื่อมโยงกับสถานะวิตามินดีที่สูงขึ้นทำให้มนุษย์อพยพเร็วไปยังละติจูดทางเหนือได้ บีเอ็มซี อีโวล ไบโอล 13, 144.

Kumar, A. , Hou, S. , Airo, AM, Limonta, D. , Mancinelli, V. , Branton, W. , Power, C. , Hobman, TC, 2016 ไวรัส Zika ยับยั้งการผลิตอินเตอร์เฟอรอนประเภท I และปลายน้ำ การส่งสัญญาณ ตัวแทน EMBO 17, 1766–1775

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016 แบบจำลองเมาส์ของการเกิดโรคไวรัสซิกา จุลินทรีย์โฮสต์ของเซลล์ 19, 720–730 Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. ซ่อนหา: การทำงานร่วมกันระหว่างไวรัส Zika และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ ด้านหน้า. อิมมูนอล. 12, 750365.

ไลเออร์, HC, ไวน์สไตน์, เจบี, ไคล์, JE, ลี, เจวาย, บราเมอร์, LM, สแตรทตัน, KG, เคมป์ธอร์น, ดี., นาฟราติล, AR, ทาเฟสส์, อีจี, ฮอร์นมันน์, ที., เมสเซอร์, WB, เดนนิส, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020 แผนที่ไขมันทั่วโลกกำหนดเครือข่ายที่จำเป็นสำหรับการจำลองแบบของไวรัสซิกา แนท. ชุมชน 11, 3652.

Li, A. , Wang, W. , Wang, Y. , Chen, K. , Xiao, F. , Hu, D. , Hui, L. , Liu, W. , Feng, Y. , Li, G. , Tan, Q. , Liu, Y. , Wu, K. , Wu, J. , 2020 ไวรัส Zika จำเป็นต้องมีไซต์อนุรักษ์นิยม NS5 เพื่อจำกัดการส่งสัญญาณ RIG-I ด้านหน้า. อิมมูนอล. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, วาตานาเบะ, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, เย่, คิว., เทียน, เอ็ม., ฮอง, เอส., ฟาน, เจ., จ้าว, เอช., ลี, แอล., วิชลากี, เอ็น., บุธ, JE, ออสเตรเลีย, ซี., หลิว, วาย., ลู , N. , Du, P. , Qin, FX, Zhang, B. , Gong, D. , Dai, X. , Sun, R. , Novitch, BG, Xu, Z. , Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- ไฮดรอกซีโคเลสเตอรอลช่วยปกป้องโฮสต์จากการติดเชื้อไวรัสซิกาและศีรษะเล็กที่เกี่ยวข้องในแบบจำลองเมาส์ ภูมิคุ้มกัน 46, 446–456

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. สารยับยั้งการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลจะขัดขวางความรุนแรงของเชื้อ Staphylococcus aureus . วิทยาศาสตร์ 319, 1391–1394

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. คอเลสเตอรอลที่เหนี่ยวนำด้วยอินเตอร์เฟอรอน-25-ไฮดรอกซีเลสยับยั้งการแพร่กระจายของไวรัสในวงกว้างโดยการผลิต 25- 25-ไฮดรอกซีโคเลสเตอรอล ภูมิคุ้มกัน 38, 92–105

Luo, J. , Yang, H. , Song, BL, 2020 กลไกและการควบคุมภาวะสมดุลของคอเลสเตอรอล แนท. สาธุคุณโมล เซลล์ไบโอล 21, 225–245.

Luu, W. , Hart-Smith, G. , Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015 เอนไซม์ปลายทางของการสังเคราะห์คอเลสเตอรอล DHCR24 และ DHCR7 มีปฏิสัมพันธ์ทั้งทางร่างกายและหน้าที่ เจ. ลิพิด เรส. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P. , 2018. โปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างไวรัสซิกา 4A บล็อกการส่งสัญญาณ RLR-MAVS ด้านหน้า. ไมโครไบโอล 9 ต.ค. 1350 Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998

การโคลนระดับโมเลกุลและการแสดงออกของเดลต้า7-สเตอรอล รีดักเตสของมนุษย์ โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. การยับยั้งการส่งสัญญาณ alpha/beta interferon โดยโปรตีน NS4B ของฟลาวิไวรัส เจ. วิโรล. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. การยับยั้งการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนโดยไวรัสไข้เลือดออก โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 100, 14333–14338

Petersen, J. , Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N. , ชาย, F. , Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S. , Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014 จำเป็นต้องมีแนวทางการควบคุมสเตอรอลในเซลล์ที่สำคัญสำหรับการติดเชื้อไวรัส Andes PLoS Pathog. 10, e1003911.

เพียร์สัน TC ไดมอนด์ MS 2020 ภัยคุกคามอย่างต่อเนื่องของไวรัสฟลาวิไวรัสที่เกิดขึ้นใหม่ แนท. ไมโครไบโอล 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, บราวน์, AJ, 2016a DHCR7: เอนไซม์สำคัญที่สลับระหว่างการผลิตคอเลสเตอรอลและวิตามินดี โครงการ ลิพิดเรส 64, 138–151.

ปราภู, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, บราวน์, AJ, 2016b การย่อยสลาย 7-ดีไฮโดรโคเลสเตอรอล รีดักเตสโดยอาศัยโคเลสเตอรอลเป็นสื่อกลางจะเปลี่ยนสมดุลจากการสังเคราะห์โคเลสเตอรอลเป็นการสังเคราะห์วิตามินดี เจ. ไบโอล. เคมี. 291, 8363–8373. Randall, G. , 2018. เมแทบอลิซึมของหยดไขมันระหว่างการติดเชื้อไวรัสไข้เลือดออก เทรนด์ไมโครไบโอล 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016 ไวรัสซิกาและข้อบกพร่องที่เกิด - การตรวจสอบหลักฐานเกี่ยวกับสาเหตุ น. ภาษาอังกฤษ เจ.เมด. 374, 1981–1987.

Reboldi, A. , Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G. , Russell, DW, Cyster, JG, 2014. การอักเสบ 25-ไฮดรอกซีโคเลสเตอรอลยับยั้ง-1-การอักเสบที่ขับเคลื่อนท้ายน้ำของอินเตอร์เฟอรอนประเภท 1 วิทยาศาสตร์ 345, 679–684

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019 ไวรัสซิกา NS3 เลียนแบบเซลล์ { {2}}แรงจูงใจในการจับเพื่อต่อต้าน RIG-I- และ MDA5- ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่มีสื่อกลาง จุลินทรีย์โฮสต์ของเซลล์ 26, 493–503 e496

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012 การทำโปรไฟล์เมตาโบไลต์ของไขมันระบุการเผาผลาญเดสโมสเตอรอลเป็นเป้าหมายต้านไวรัสใหม่สำหรับไวรัสตับอักเสบซี แยม. เคมี. สังคมสงเคราะห์ 134, 6896–6899. Savidis, G. , Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P. , Guo, Z. , Green, S. , Brass, AL, 2016 IFITM ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัส Zika ตัวแทนเซลล์ 15, 2323–2330

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014 ยีนที่กระตุ้นด้วย Interferon: เว็บที่ซับซ้อนของการป้องกันโฮสต์ แอนนู. สาธุคุณอิมมูนอล. 32, 513–545.