การแปรผันของการแสดงออกของยีนระหว่างเส้นสองสีข้าวฟ่างสองเส้นที่แตกต่างกันในการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ

เชิงนามธรรม:

รูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ (MAMPs) กระตุ้นภูมิคุ้มกัน (MTI) เป็นองค์ประกอบสำคัญของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของพืชต่อการจดจำจุลินทรีย์ อย่างไรก็ตาม ความรู้ส่วนใหญ่ในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับ MTI มาจากพืชต้นแบบ (เช่น อะราบิดอพซิส ธาเลียนา) ซึ่งมีการทำงานน้อยกว่าโดยใช้พืชเพาะปลูก ในงานนี้ เราศึกษาการระเบิดออกซิเดชั่น (ROS) ที่กระตุ้นด้วย MAMP และการตอบสนองการถอดเสียงในจีโนไทป์สองสีของข้าวฟ่าง BTx623 และ SC155-14E SC155-14E คือเส้นที่แสดงความต้านทานโรคแอนแทรกโนสสูง และเส้น BTx623 นั้นไวต่อโรคแอนแทรกโนส ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็นความผันแปรที่ชัดเจนในการแสดงออกของยีนและ ROS ในการตอบสนองต่อแฟลเจลลิน (flg22) หรือการกระตุ้นไคตินระหว่างสองบรรทัด แม้ว่าการตอบสนองของการถอดเสียงไปยัง MAMP แต่ละรายการและในแต่ละบรรทัดจะไม่ซ้ำกัน แต่ก็มีระดับการทับซ้อนกันพอสมควร และเราสามารถกำหนดชุดหลักของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองการถอดเสียง MAMP ของข้าวฟ่างได้ การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าเส้นทาง GO และ KEGG ค้นพบภูมิคุ้มกันและ DEG ที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยาของเชื้อโรคในตัวอย่าง SC ที่บำบัดด้วย MAMP155-14E มากกว่าใน BTx623 ด้วยการบำบัดแบบเดียวกัน ผลลัพธ์ที่ได้เป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาในอนาคตเพื่อตรวจสอบเส้นทางภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดในข้าวฟ่าง รวมถึงความพยายามในการเพิ่มความต้านทานโรค

คลิกเพื่อซื้อผลิตภัณฑ์ภูมิคุ้มกันที่ดีขึ้น

    For more information:1950477648nn@gmail.com

คำสำคัญ:

ข้าวฟ่างสองสี; กุหลาบ; ภูมิคุ้มกัน; MAMP; RNA-seq; การแสดงออกของยีน

1. บทนำ

พืชต้องเผชิญกับความเครียดต่างๆ ตามธรรมชาติ รวมทั้งเชื้อโรคจากแบคทีเรีย เชื้อรา และไวรัสจำนวนมาก [1] พืชป้องกันตัวเองจากเชื้อโรคโดยใช้โครงสร้างและสารเคมีที่สร้างไว้ล่วงหน้า และการตอบสนองที่เกิดจากการติดเชื้อของระบบภูมิคุ้มกัน ระบบภูมิคุ้มกันของพืชใช้ระบบการรับรู้สองชั้นที่มีตัวรับสองชั้นที่เชื่อมต่อถึงกัน

ระดับแรกถูกเปิดใช้งานโดยตัวรับการจดจำรูปแบบที่มีการแปลพื้นผิว (PRRs) ซึ่งรับรู้โมเลกุลภายนอกเซลล์โดยการจดจำเชื้อโรคที่บุกรุกผ่านการตรวจหาลวดลายโครงสร้างที่อนุรักษ์ไว้ ซึ่งเรียกว่ารูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ (MAMPs) ซึ่งกระตุ้นระดับปานกลาง แต่ตอบสนองเชิงป้องกันในวงกว้าง [2] แฟลกเจลลิน ไคติน ลิโพโพลีแซคคาไรด์ เพปทิโดไกลแคน (PGNs) และปัจจัยการยืดตัว Tu เป็นตัวอย่างของ MAMPs ที่ได้รับการศึกษาอย่างดี [3–5] การตอบสนองการป้องกันนี้เรียกว่าภูมิคุ้มกันแบบ MAMPtrigged (MTI) [6] การป้องกันระดับที่สองที่เรียกว่าภูมิคุ้มกันกระตุ้นเอฟเฟกเตอร์ (ETI) เกิดขึ้นจากการตอบสนองต่อโปรตีนเอฟเฟคเตอร์ที่ได้มาจากเชื้อโรคซึ่งพืชรู้จักผ่านการกระทำของโปรตีนต้านทาน ส่งผลให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งแต่มีความจำเพาะสูง ETI มักจะรับรู้ได้จากการเหนี่ยวนำการตายของเซลล์เฉพาะที่ซึ่งเรียกว่าการตอบสนองไวเกิน (HR) [7] ทั้งระบบ MTI และ ETI จะตรวจจับเชื้อโรคและตอบสนองด้วยการเปิดใช้งานการป้องกันยาต้านจุลชีพในเซลล์ที่ติดเชื้อและเซลล์ข้างเคียง [3,8] พืชยังมีตัวรับภูมิคุ้มกันที่จดจำปัจจัยก่อโรคที่มีความแปรผันสูง ซึ่งรวมถึงโปรตีนประเภท NBS-LRR [9]

นอกจากนี้ การดื้อยาที่ได้รับอย่างเป็นระบบ (SAR) คือการตอบสนองการดื้อยา "ทั้งต้น" ที่เกิดขึ้นหลังจากการสัมผัสกับเชื้อโรคที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นก่อนหน้านี้ SAR เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำของยีนที่หลากหลาย (ยีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรค) และการกระตุ้น SAR จำเป็นต้องมีการสะสมของกรดซาลิไซลิกภายในร่างกาย (SA) [10]

การศึกษาที่ทำโดยใช้อาราบิดอพซิสเป็นหลักแสดงให้เห็นว่า MTI สามารถทำให้เกิดการตอบสนองที่หลากหลาย รวมถึงการเปลี่ยนแปลงในการผลิตสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) การผลิตสายพันธุ์ไนโตรเจนปฏิกิริยา เช่น ไนตริกออกไซด์ (NO) การสะสมของแคลโลส ระดับแคลเซียมภายในเซลล์ ไอออนฟลักซ์ทั่วพลาสมา เยื่อหุ้มเซลล์ การเหนี่ยวนำหรือการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันพืชหลายชนิด การเปลี่ยนแปลงในผนังเซลล์ของพืช การเหนี่ยวนำของสารต้านจุลชีพ และการสังเคราะห์โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรค (PR) [3,11]

แม้ว่าการตอบสนองของ MTI หลายอย่างอาจถือเป็นการตอบสนองของพืชโดยทั่วไป แต่ขนาดของพวกมันสามารถเป็นพันธุ์พืชเฉพาะและแม้แต่พันธุ์เฉพาะ [12–17] วิธีการได้รับการพัฒนาเพื่อหาปริมาณการตอบสนอง MTI ของพืช วิธีการเหล่านี้รวมถึงการวัดการผลิต ROS หรือ NO, ไมโทเจนที่กระตุ้นโปรตีนไคเนสฟอสโฟรีเลชั่น, การแสดงออกของยีน MAMP ที่เฉพาะเจาะจง, การยับยั้งการเจริญเติบโตของต้นอ่อน, ลิกนินและฟีนอลที่จับกับผนังเซลล์ และการดื้อต่อแบคทีเรียและเชื้อราที่เหนี่ยวนำโดย MAMP [18–20]

Sorghum bicolor (L.) Moench เป็นพืชธัญญาหารที่สำคัญของโลกซึ่งได้รับการปรับให้เข้ากับแหล่งที่อยู่อาศัยและขยายพันธุ์เพื่อวัตถุประสงค์ที่หลากหลาย [21] การเพาะปลูกข้าวฟ่างคาดว่าจะเพิ่มขึ้นอย่างมากทั่วโลกในฐานะหนึ่งในพืชหลักสำหรับการผลิตอาหารและชีวมวล [22]

เมื่อการปฏิบัติและพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ภายใต้การปลูกข้าวฟ่างเพิ่มขึ้น ความดันโรคจะเพิ่มขึ้นอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ ข้าวฟ่างมีความโดดเด่นเหนือธัญพืชอื่นๆ ด้วยโรคที่หลากหลายผิดปกติ ซึ่งเป็นหนึ่งในข้อจำกัดที่สำคัญที่สุดในการผลิตข้าวฟ่าง โรคจากเชื้อราที่แพร่หลายทั่วโลกเป็นโรคที่ทำลายข้าวฟ่างมากที่สุดซึ่งส่งผลให้ผลผลิตเสียหายอย่างมาก ทั้งในแง่ของปริมาณและคุณภาพของเมล็ดข้าว [23] โรคแอนแทรคโนสเป็นโรคที่เกิดจากเชื้อราที่รุนแรงที่สุดชนิดหนึ่งที่ส่งผลกระทบต่อผลผลิตข้าวฟ่างและการผลิตชีวมวล การสูญเสียผลผลิตเนื่องจากเชื้อโรคนี้สามารถมีได้ 50 ถึง 70 เปอร์เซ็นต์ในพันธุ์ที่อ่อนแอ [24,25] พืชได้พัฒนากลยุทธ์การป้องกันที่หลากหลายเพื่อต่อสู้กับการบุกรุกของเชื้อโรค ในข้าวฟ่าง กลยุทธ์เหล่านี้รวมถึงการกระตุ้นโปรตีน PR [26] การสะสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ [27] และการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟลาโวนอยด์ไฟโตอเลกซิน [28] วิธีการต่างๆ ถูกนำมาใช้ในการศึกษาการตอบสนองการดื้อยาของข้าวฟ่าง ระบุสารป้องกัน และระบุอุปสรรคทางกายภาพต่อโรคแอนแทรคโนส (ดูข้อมูลอ้างอิง [29,30] สำหรับการทบทวน) การศึกษาการแสดงออกของยีนถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายเพื่อระบุยีนต้านทานของผู้สมัครในพืช โดยพิจารณาจากการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างพันธุ์ที่ต้านทานและอ่อนแอ หรือพืชที่ไม่ปลูกเชื้อและพืชที่ปลูกเชื้อก่อโรค (เช่น ข้อมูลอ้างอิง [31–37]) Wang et al., [37] ทำการวิเคราะห์การถอดรหัสเพื่อศึกษาการตอบสนองของพันธุ์ข้าวฟ่าง BTx623 ต่อ C. subline-ola พวกเขารายงานว่ายีนที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมของฟีนิลโพรพานอยด์และการสังเคราะห์ทางชีวภาพของสารทุติยภูมิถูกระบุว่าแสดงออกแตกต่างกันในการตอบสนองต่อการติดเชื้อของเชื้อโรคเมื่อเทียบกับพืชควบคุมที่ไม่ได้ฉีดวัคซีน

อย่างไรก็ตาม การทดลองเหล่านี้ดำเนินการกับต้นกล้าของพันธุ์ที่อ่อนแอต่อ BTx623 การศึกษาทรานสคริปโตมิกส์เพิ่มเติมเพื่อเปรียบเทียบการตอบสนองการแสดงออกของยีนต่อเชื้อโรคในพันธุ์ข้าวฟ่างที่อ่อนแอและต้านทานจะมีค่า ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเข้าใจสถาปัตยกรรมทางพันธุกรรมที่ควบคุมการต้านทานโรคพื้นฐานของข้าวฟ่างและความเชื่อมโยงกับความต้านทานโรคเชิงปริมาณ

ในขั้นเริ่มต้นในทิศทางนี้ เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้คัดกรองชุดของเชื้อจุลินทรีย์ข้าวฟ่างที่หลากหลายสำหรับการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองต่อ flg22 และการกระตุ้นไคติน รวมทั้งความต้านทานโรคของเชื้อรา [38] ในกรณีนี้ MTI ถูกวัดปริมาณโดยการวัดการผลิต ROS จากการกระตุ้นด้วย MAMP ในผลลัพธ์ของการศึกษาก่อนหน้านี้ คือการระบุจีโนไทป์ของข้าวฟ่างที่แสดงการตอบสนองที่รุนแรงหรืออ่อนแอต่อการกระตุ้นด้วย MAMP

การจัดลำดับปริมาณงานสูงรุ่นต่อไปและการศึกษาทรานสคริปโตมสามารถช่วยชี้แจงการตอบสนองของการติดเชื้อราในพืช และเพิ่มความเข้าใจเกี่ยวกับการตอบสนองของโฮสต์ การวิเคราะห์ถอดความถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางเพื่อศึกษาการตอบสนองของพืชต่อการติดเชื้อราในพืชหลายชนิดรวมถึงพืชตระกูลธัญพืช (เช่น เอกสารอ้างอิง [31–37])

อย่างไรก็ตาม ข้อมูลที่เผยแพร่เกี่ยวกับการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมเปรียบเทียบของพืชธัญพืชได้มุ่งเน้นไปที่การตอบสนองต่อเชื้อโรคต่างๆ เป็นหลัก ในข้าวฟ่าง สิ่งพิมพ์หลายฉบับมุ่งเน้นไปที่การเปรียบเทียบทรานสคริปโทมของพืชที่รักษาด้วยเชื้อโรคต่างๆ รวมถึงโรคแอนแทรคโนส [35,37] สิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้บางฉบับแนะนำว่าไม่มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างการตอบสนองต่อ MAMPs และโรคเชื้อรา ตัวอย่างเช่น Zhang et al. [17] รายงานความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างการตอบสนองต่อ MAMPs flg22 สองตัวและไคตินในประชากรที่ทำแผนที่ข้าวโพด แต่ไม่มีความสอดคล้องกับการตอบสนองต่อโรคเชื้อรา คิมบอลล์ และคณะ [38] ยังรายงานความสัมพันธ์ต่ำระหว่าง flg22-คะแนนการตอบสนอง ROS ที่เหนี่ยวนำและคะแนนต้านทานโรคใบจุดเป้าหมายในประชากร RIL ข้าวฟ่างสองกลุ่มซึ่งรวมถึงประชากร BTx623/SC{8}}E ดังนั้น เนื่องจากข้อมูลไม่เพียงพอ เราจึงรู้สึกว่าเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องบันทึกรายละเอียดการตอบสนองของข้าวฟ่างต่อการรักษาด้วย MAMP

ในรายงานฉบับปัจจุบันนี้ เราได้ขยายการวิเคราะห์ก่อนหน้านี้ของเราโดยวัดผลการตอบสนองจากการถอดเสียงทั่วโลกต่อการล้วงข้อมูล MAMP เราใช้การวิเคราะห์ลำดับอาร์เอ็นเอตามอิลลูมินาเพื่อสำรวจการเปลี่ยนแปลงการถอดความในการตอบสนองต่อการบำบัดด้วย flg22 หรือไคตินในจีโนไทป์ข้าวฟ่าง BTx623 และ SC155-14E ซึ่งก่อนหน้านี้เราระบุว่าเป็นผู้ตอบสนอง MTI ที่อ่อนแอและแข็งแกร่งตามลำดับ BTx623 คือเส้นอ้างอิงจีโนมข้าวฟ่างสองสี [22] และ SC155-14E คือเส้นที่แสดงการต้านทานโรคแอนแทรกโนสในระดับสูง [39] พาทิล และคณะ [39] รายงานว่า SC155-14E แสดงความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสที่เสถียรในระดับสูง (เกือบปราศจากโรค) ในทุกสภาพแวดล้อมที่ทดสอบ ในขณะที่ BTx623 ไวต่อโรคเชื้อรานี้ การวิเคราะห์ RNA-seq ของเราระบุ 5252 และ 8085 Differentially Expressed Genes (DEGs) ใน BTx623 ที่บำบัดด้วย flg22 และไคติน ตามลำดับ และ 3849 และ 5786 DEG ใน flg22 และไคตินที่บำบัดด้วย SC155-14E ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมจำลองที่ไม่ได้รับการบำบัด ของจีโนไทป์ทั้งสองนี้

นอกจากนี้ การเปรียบเทียบ DEG ที่เลือกโดยใช้ไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศสองแบบที่ต่างกันแสดงผลลัพธ์ที่คล้ายกันมาก โปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของยีน ontology (GO) และการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าเส้นทาง KEGG แสดงให้เห็นความแปรผันตามจีโนไทป์ที่ชัดเจนในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ MTI คำศัพท์ GO และผลการเพิ่มความสมบูรณ์ของเส้นทาง KEGG เผยให้เห็น DEG ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันและการต่อต้านเชื้อโรค (ยีน PR, การตอบสนองของยีนต่อไคติน, การตอบสนองของยีนต่อกรดซาลิไซลิก, การตอบสนองของยีนต่อความเครียด ฯลฯ) ที่นำเสนอใน SC ที่บำบัดด้วย MAMP{{4} }ตัวอย่าง E ที่สัมพันธ์กับ BTx623 ที่บำบัดด้วย MAMP ผลลัพธ์จัดเตรียมพื้นฐานสำหรับการระบุส่วนประกอบต่างๆ ของการตอบสนอง MTI ข้าวฟ่าง

2. ผลลัพธ์และการอภิปราย

2.1. การเปลี่ยนแปลงของ Oxidative Burst ในใบข้าวฟ่างชนิดต่างๆ

การวิเคราะห์ก่อนหน้าของเราเกี่ยวกับการตอบสนอง MTI ของจีโนไทป์ข้าวฟ่างที่หลากหลายเผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการระเบิดออกซิเดชันที่กระตุ้นด้วย MAMP ระหว่างจีโนไทป์ BTx623 และ SC155-14E [38] ยิ่งไปกว่านั้น SC155-14E เป็นสายพันธุ์ที่แสดงความต้านทานโรคแอนแทรกโนสสูง ในขณะที่สายพันธุ์ BTx623 นั้นไวต่อโรคแอนแทรกโนส [39] ด้วยเหตุผลเหล่านี้ จีโนไทป์ทั้งสองนี้จึงถูกเลือกสำหรับการเปรียบเทียบโดยใช้ RNA-seq

ขณะทำการวัด ROS ก่อนหน้านี้ เราพบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญแม้ในโรงงานเดียวกัน ซึ่งทำให้เราต้องตรวจสอบแหล่งที่มาของความแปรปรวนนี้อย่างรอบคอบมากขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราทดสอบการผลิต ROS โดยใช้ใบไม้สามชุด ไล่จากล่างขึ้นบนของต้น BTx623 และ SC155-14E อายุสิบห้าวัน ใบไม้ถูกทำเครื่องหมายเป็น #1, #2 และ #3 จากล่างขึ้นบน ดังรูปที่ 1A ผลการทดสอบ ROS (รูปที่ 1B) เปิดเผยว่า (1) ระดับการผลิต ROS ต่ำกว่าในใบไม้ที่มีอายุมาก (ใบไม้ #1) ในขณะที่ระดับการผลิต ROS สูงสุดเพื่อตอบสนองต่อ flg22 หรือไคตินนั้นมาจากใบไม้ที่อายุน้อยที่สุด ( ใบไม้ #3) (2) ทั้งใบที่อายุน้อยที่สุดที่บำบัดด้วย MAMP และไม่ถูกบำบัด623 2ใบที่อายุน้อยที่สุด (ใบ #2) สร้างระดับการผลิต ROS ที่ต่ำโดยเปรียบเทียบ

ในทางตรงกันข้าม ใบที่อายุน้อยที่สุดอันดับ 2 ของ SC ที่บำบัดด้วย MAMP155-14E สร้างระดับการผลิต ROS ในระดับที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (ที่ระดับ 0.01) มากกว่าจำลองที่ไม่ได้รับการบำบัด รวมทั้งการบำบัดหรือการเยาะเย้ยของ BTx{ {5}}ใบที่อายุน้อยที่สุด (3) การระเบิดออกซิเดชันที่กระตุ้นโดยการใช้ flg22 หรือไคตินถูกตรวจพบใน leaf disc จากใบที่อายุน้อยที่สุด (leaf #3) ของทั้งสองจีโนไทป์ แม้ว่าตามที่สังเกตก่อนหน้านี้ ระดับของการผลิต ROS จะสูงกว่าใน SC ที่บำบัดด้วย MAMP 155-14E เทียบกับ BTx623 ระยะเวลาของ flg22-ที่ทริกเกอร์และไคตินที่ทริกเกอร์การผลิต ROS ใน SC155-14E 2nd leaf ที่อายุน้อยที่สุดเปิดเผยว่าการผลิต ROS ที่ทริกเกอร์ไคตินเกิดขึ้นเร็วกว่า flg22- ที่ทริกเกอร์การผลิต ROS (รูปที่ 1C ). Zhang et al รายงานผลลัพธ์ที่คล้ายกัน [17] โดยที่การผลิต ROS ที่กระตุ้นไคตินปรากฏเร็วกว่า flg22-ที่กระตุ้นการผลิต ROS ใน flg22 และต้นอ่อนข้าวโพดที่บำบัดด้วยไคติน มีรายงาน [40] ว่าการผลิต ROS เพื่อตอบสนองต่อ flg22 แสดงการผลิต ROS สูงสุดประมาณ 12 นาที และต่ำสุดที่ 30 นาทีใน Arabidopsis ผลการทดสอบ ROS ของเราในข้าวฟ่างแสดงให้เห็นการผลิต ROS สูงสุดประมาณ 13 นาที และต่ำสุดที่ 30 นาทีหลังการบำบัดด้วย flg22 ซึ่งคล้ายกับผลลัพธ์ใน Arabidopsis เนื่องจากเป้าหมายของเราคือการค้นหาสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเปรียบเทียบการตอบสนองของ MTI ของจีโนไทป์ทั้งสอง เราจึงเลือกใบที่อายุน้อยที่สุดใบที่ 2 ของพืชอายุ 15-วัน สำหรับการสกัด RNA และการวิเคราะห์การถอดรหัสในภายหลัง การเปลี่ยนแปลงระหว่างใบของต้นข้าวฟ่างเดี่ยวเป็นเครื่องเตือนใจว่าผลลัพธ์อาจแตกต่างกันไประหว่างการทดลอง ขึ้นอยู่กับแหล่งที่มา เวลา และคุณลักษณะอื่นๆ ของการทดลองหนึ่งๆ และด้วยเหตุนี้ พารามิเตอร์การทดลองจึงต้องมีการควบคุมอย่างระมัดระวัง

การระเบิดออกซิเดชันซึ่งเป็นการผลิตอย่างรวดเร็วและชั่วคราวของสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เป็นหนึ่งในลักษณะที่สังเกตได้เร็วที่สุดของการตอบสนองการป้องกันของพืช [41] เมื่อพิจารณาว่าการระเบิดของ ROS เป็นการตอบสนองในทันที จึงคาดว่าจะมีการตอบสนองการถอดรหัสของยีนที่เกี่ยวข้องกับ MTI ในภายหลังเล็กน้อย เราเก็บตัวอย่าง 60 นาทีหลังจากการรักษา MAMPs สำหรับการวิเคราะห์ RNA-Seq

2.2. ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEGs) ของ BTx623 และ SC155-14E ในการตอบสนองต่อการรักษา MAMP

ในการประเมินระดับการแสดงออกของยีนเข้ารหัสโปรตีน Sorghum bicolor ที่มีคำอธิบายประกอบสำหรับแต่ละตัวอย่าง จำนวนของการอ่านสะอาดของ RNA-seq ที่แมปกับแต่ละยีนถูกคำนวณแล้วทำให้เป็นมาตรฐานใน FPKM (แฟรกเมนต์ต่อโมเดล kb exon ต่อล้านแฟรกเมนต์ที่แมป) การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนแต่ละตัวใน leaf disc ที่บำบัดด้วย MAMP ของ BTx623 และ SC155-14E เมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดจำลอง (น้ำ) ถูกตรวจสอบ ยีนที่แสดงออกทั้งหมดมีความคล้ายคลึงกันในการบำบัดทั้งหมดของทั้งสองจีโนไทป์: ยีน 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512 และ 27,175 แสดงออกในรูปจำลองของ BTx623, flg22-ที่บำบัดด้วย BTx623, BTx623 ที่บำบัดด้วยไคติน, จำลองของ SC{ {22}}E, flg22-ที่บำบัดด้วย SC155-14E และ SC ที่บำบัดด้วยไคติน155-14E ตามลำดับ เราใช้จีโนมอ้างอิง BTx623 สำหรับการอ่านแผนที่ในทั้งสองบรรทัด เนื่องจากไม่มีข้อมูลอ้างอิงเฉพาะสำหรับ SC155-14E จำนวนยีนที่แสดงออกซึ่งดึงมาจาก BTx623 และ SC{{30}}E ด้วยเงื่อนไขทั้งหมดข้างต้นเผยให้เห็นว่าทั้งสองสายมียีนที่แสดงออกในจำนวนที่ใกล้เคียงกัน อัตราการอ่านแผนที่โดยรวมของตัวอย่าง SC155- 14E ม็อค (3 ซ้ำ), SC155-14E บำบัดด้วย flg22 (3 ซ้ำ), SC155-14E บำบัดด้วยไคติน (3 ซ้ำ) , BTx623 จำลอง (3 ซ้ำ), BTx623 ที่บำบัดด้วย flg22 (3 ซ้ำ), BTx623 บำบัดด้วยไคติน (3 ซ้ำ) คือ: 93.6 เปอร์เซ็นต์ , 93.9 เปอร์เซ็นต์ , 93.9 เปอร์เซ็นต์ , 93.8 เปอร์เซ็นต์ , 93.9 เปอร์เซ็นต์ , 93.6 เปอร์เซ็นต์ , 93.5 เปอร์เซ็นต์ , 93.5 เปอร์เซ็นต์ , 93.1 เปอร์เซ็นต์ , 96.9 เปอร์เซ็นต์ , 97.0 เปอร์เซ็นต์ , 97.0 เปอร์เซ็นต์ , 97.2 เปอร์เซ็นต์ , 96.8 เปอร์เซ็นต์ , 97.0 เปอร์เซ็นต์ , 96.9 เปอร์เซ็นต์ , 97.0 ร้อยละ 97.0 ตามลำดับ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลที่แตกต่างกันของการรักษาด้วย MAMPs ต่อทรานสคริปโตมของ BTx623 และ SC155-14E ไม่ได้เกิดจากความแตกต่างของลำดับจีโนมระหว่างจีโนไทป์ทั้งสอง

พล็อต PCA ของการแสดงออกของยีนให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างตัวอย่าง เพื่อสำรวจความคล้ายคลึงกันของตัวอย่างของเรา เราได้ทำการวิเคราะห์ PCA การลงจุดตัวอย่างบน PC1 และ PC2 (รูปที่ 2) แสดงให้เห็นว่าเงื่อนไขการทดลองสี่เงื่อนไข (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_ไคติน และ SC{ {10}}อี_ไคติน) ถูกแยกออกจากกันอย่างกว้างขวาง ในทางตรงกันข้าม การจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบของแต่ละสายพันธุ์ข้าวฟ่างและการบำบัดด้วย MAMP แต่ละครั้ง รวมทั้งการบำบัดจำลอง ถูกจัดกลุ่มเข้าด้วยกันอย่างใกล้ชิดตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ความสามารถในการทำซ้ำที่ดีระหว่างการจำลองแบบทางชีวภาพ (รูปที่ 2)

แปลงภูเขาไฟในรูปที่ 3 แสดงการแสดงออกของยีนในข้าวฟ่างสองสายพันธุ์ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคติน แผนภาพภูเขาไฟเป็นแผนภาพกระจายประเภทหนึ่งที่แสดงนัยสำคัญทางสถิติ (p-value) เทียบกับขนาดของการเปลี่ยนแปลง (การเปลี่ยนแปลงเท่า) ช่วยให้สามารถระบุยีนได้อย่างรวดเร็วด้วยการเปลี่ยนแปลงจำนวนมากที่มีนัยสำคัญทางสถิติเช่นกัน เหล่านี้อาจเป็นยีนที่มีนัยสำคัญทางชีววิทยามากที่สุด ในรูปที่ 3 ยีนที่มี −log10 (p-value) เท่ากับหรือมากกว่า 3 ถือว่าเป็น DEG จุดสีแดงแสดงถึง DEG และจุดสีดำแสดงถึงที่ไม่ใช่ DEG ในแต่ละโครงเรื่อง ยีนที่มี log2 (fold_change) มากกว่า 0 จะเป็นยีนที่มีการควบคุมแบบ up-regulated มิฉะนั้นจะเป็นยีนแบบ down-regulated ยีนที่ถูกควบคุมมากที่สุดจะอยู่ทางด้านขวา ยีนที่ถูกควบคุมมากที่สุดจะอยู่ทางด้านซ้าย และยีนที่มีนัยสำคัญทางสถิติมากที่สุดจะอยู่ทางด้านบน

ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ถูกเลือกจากการรักษาแต่ละครั้งตามความสำคัญของการแสดงออก (p-value 0.001) ควรสังเกตว่าเราใช้ค่า p เป็น 0.001 เป็นเกณฑ์ แต่ไม่ใช่ FDR (ค่า q) เพื่อเลือก DEG ในรายงานนี้ FDR (ค่า q) ก็มีความสำคัญในระดับนี้เช่นกัน (ตารางที่ S2–S5) ที่ค่า p ที่ 0.001 FDR คือ 0.0039, 0.0051, 0.0025 และ 0.0035 สำหรับ BTx623 ที่มีการบำบัดด้วย flg22, SC155-14E ด้วยการบำบัดด้วย flg22, BTx623 ด้วยการบำบัดด้วยไคตินและ SC{{ 26}}E ด้วยการบำบัดด้วยไคติน ตามลำดับ ค่า p และค่า q ของยีนของ BTx623 และ SC155-14E ในทุกสภาวะแสดงอยู่ในตาราง S2–S5 ด้วยการวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีนเหล่านี้ในใบของ BTx623 และ SC ที่ได้รับการรักษาด้วย MAMP{35}}E เราสังเกตเห็นยีนจำนวนมาก (14–30 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่แสดงออกทั้งหมด) ซึ่งแสดงความแตกต่างอย่างมากหลังจาก flg22 หรือไคติน การบำบัดในข้าวฟ่างทั้งสองสายพันธุ์ จำนวน DEG ทั้งหมดของ BTx623 ที่บำบัดด้วยไคติน (8085) นั้นใกล้เคียงกับที่รายงานในการศึกษาการถอดรหัสก่อนหน้านี้ใน BTx623 ที่ติดเชื้อโดยเชื้อก่อโรคแอนแทรกโนส C. subline-ola (8078) [37] จำนวนของ DEG สูงกว่าใน flg22 (19 เปอร์เซ็นต์ ) หรือไคติน (30 เปอร์เซ็นต์ ) ที่ถูกทรีทด้วย BTx623 leaf ที่สัมพันธ์กับ SC155-14E (14 เปอร์เซ็นต์ และ 21 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ)

แม้ว่าจำนวน DEG ที่สูงกว่าใน BTx623 ที่บำบัดด้วย MAMP เมื่อเทียบกับ SC155-14E นั้นตรงกันข้ามกับการตอบสนอง ROS ของจีโนไทป์ทั้งสองนี้ แต่อาจไม่น่าแปลกใจเนื่องจากการตอบสนองของ ROS และการตอบสนองการแสดงออกของยีนต่อการรักษา MAMP เกิดขึ้นที่ เวลาที่ต่างกัน เป็นอิสระจากกันเป็นส่วนใหญ่ และถูกไกล่เกลี่ยโดยกลไกที่ต่างกัน [42,43] คำศัพท์ GO และการเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG เผยให้เห็น DEG ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันและการต่อต้านเชื้อโรคที่นำเสนอในตัวอย่าง SC155-14E ที่บำบัดด้วย MAMP มากขึ้น ยิ่งไปกว่านั้น ความจริงที่ว่าจำนวน DEG นั้นสูงกว่าในตัวอย่างที่ได้รับการรักษาด้วยไคตินเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ได้รับ flg22 ซึ่งเข้ากันได้ดีกับการทดสอบการตอบสนองของ ROS (รูปที่ 1B) ซึ่งเราเห็นการตอบสนองของ ROS ที่แข็งแกร่งขึ้นจากการรักษาด้วยไคติน

เพื่อตรวจสอบว่ายีนและกระบวนการทางชีววิทยามีขอบเขตเพียงใดที่ใช้ร่วมกันระหว่าง flg22 และการบำบัดด้วยไคตินใน BTx623 และ SC155-14E เราได้เปรียบเทียบ DEG ของพวกมันในรายละเอียดเพิ่มเติม แผนภาพเวนน์ในรูปที่ 4A แสดงการทับซ้อนกันใน DEG ในผลรวม ยีนควบคุมขึ้นและลงตั้งค่าที่ p-value 0.001 จากทั้งหมด 10,535 DEGs ชุดแกนของยีน 2272 ตัวตอบสนองต่อทั้ง flg22 และการบำบัดด้วยไคตินในข้าวฟ่างทั้งสองสายพันธุ์ ในทำนองเดียวกัน จากทั้งหมด 5410 ยีนที่ควบคุมไม่ได้ ชุดแกนของยีน 1,778 ยีนถูกควบคุมในทั้งสองจีโนไทป์ ในขณะที่จากทั้งหมด 5125 ยีนที่ควบคุมไม่ได้ ชุดหลักที่ 474 ถูกควบคุมไม่ได้ในทั้งสอง จีโนไทป์

ข้อมูล RNA seq ที่แสดงในที่นี้ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศพร้อมเครื่องมือ Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 และ Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) พร้อมพารามิเตอร์เริ่มต้น (ไปป์ไลน์ #1) เพื่อยืนยันผลการทดสอบเพิ่มเติม เราใช้ไปป์ไลน์อื่น (ไปป์ไลน์ #2) กับ HiSat2, HTSeq และ edgeR เพื่อทำการวิเคราะห์ HiSat2 คือการพัฒนาครั้งต่อไปของ TopHat2 เราเปรียบเทียบ DEG ของแต่ละเงื่อนไข (เช่น สองจีโนไทป์ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคติน ทั้งหมด DEG ที่ควบคุมขึ้นหรือลง) ที่เลือกโดยใช้ทั้งสองไปป์ไลน์ ผลลัพธ์ (รูปที่ 5) แสดงให้เห็นว่าหมายเลข DEG ที่เลือกโดยใช้ไปป์ไลน์ทั้งสองนั้นใกล้เคียงกันมาก

DEG ทั้งหมดที่เลือกด้วยไปป์ไลน์ #1 เทียบกับไปป์ไลน์ #2 คือ BTx623_flg22: 5241 เทียบกับ 5413; SC155-14E_flg22: 3849 เทียบกับ 3476; BTx623_ไคติน: 8085 เทียบกับ 8320; SC155-14E_ไคติน: 5786 เทียบกับ 5383 DEG ที่ควบคุมขึ้นซึ่งเลือกด้วยไปป์ไลน์ #1 เทียบกับไปป์ไลน์ #2 คือ BTx623_flg22: 3074 เทียบกับ 3076; SC155-14E_flg22: 2591 เทียบกับ 2483; BTx623_ไคติน: 4156 เทียบกับ 4583; SC155-14E_ไคติน: 3486 เทียบกับ 3346 DEG แบบควบคุมลงที่เลือกด้วยไปป์ไลน์ #1 เทียบกับไปป์ไลน์ #2 คือ BTx623_flg22: 2152 เทียบกับ 2237; SC155-14E_flg22: 1257 เทียบกับ 993; BTx623_ไคติน: 3919 เทียบกับ 3757; SC155-14E_ไคติน: 2296 เทียบกับ 2037 นอกจากนี้ ผลลัพธ์ในรูปที่ 5 ยังเผยให้เห็นว่ามีเปอร์เซ็นต์สูงของ DEG ที่เลือกโดยใช้ไปป์ไลน์สองท่อที่ทับซ้อนกันในทุกสภาวะ เปอร์เซ็นต์ของหมายเลข DEG/หมายเลข DEG ที่ทับซ้อนกันที่เลือกโดยใช้ไปป์ไลน์#1 คือ 79.6 เปอร์เซ็นต์ และ 73.7 เปอร์เซ็นต์ 80.8 เปอร์เซ็นต์และ 74.4 เปอร์เซ็นต์ของ DEG ทั้งหมดของ BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_ไคตินและ SC155-14E{{73} }ไคติน ตามลำดับ; 83 เปอร์เซ็นต์ , 80.6 เปอร์เซ็นต์ , 85.3 เปอร์เซ็นต์ และ 81.1 เปอร์เซ็นต์ของ DEG ที่ควบคุมขึ้นของ BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_ไคตินและ SC{{ 88}}อี_ไคติน ตามลำดับ; 75.1 เปอร์เซ็นต์ , 59.5 เปอร์เซ็นต์ , 75.8 เปอร์เซ็นต์ และ 67.4 เปอร์เซ็นต์ของ DEG ที่ควบคุมลงของ BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_ไคตินและ SC{{ 105}}อี{106}}ไคติน ตามลำดับ ดังนั้น ผลการเปรียบเทียบเหล่านี้พิสูจน์ว่าข้อมูล RNA seq ที่นำเสนอนั้นถูกต้องไม่ว่าจะใช้วิธีใดในสองวิธีในการวิเคราะห์

แผนผังความหนาแน่นของโปรไฟล์การแสดงออกแบบคลัสเตอร์ของ DEG ของ BTx623 และ SC155-14E ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคตินสำหรับการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบแสดงในรูปที่ 6 ค่าการแสดงออกของยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยคะแนน z สีจะเปลี่ยนจากสีม่วงเป็นสีแดงเมื่อค่าเพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการแสดงออกของยีนจากต่ำไปสูง แผนที่ความร้อนนี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการควบคุมที่แตกต่างกันของยีนใน BTx623 และ SC155-14E ในการตอบสนองต่อ flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน นอกจากนี้ ผลลัพธ์ยังแสดงแผนที่ความร้อนของการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบในแต่ละสภาวะซึ่งใกล้เคียงกันมาก ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีระหว่างการจำลองแบบทางชีวภาพ

นอกจากนี้ การเปรียบเทียบแบบคู่ (รูปที่ 7A) ระหว่าง DEG ที่ควบคุมขึ้นและลงจาก flg22 และการบำบัดด้วยไคตินแสดงให้เห็นว่ามีการทับซ้อนกันมากระหว่าง BTx623 และ SC155-14E ในบรรดายีนที่เหนี่ยวนำ 3074 flg22-ใน BTx623 นั้น 83.8 เปอร์เซ็นต์ยังถูกเหนี่ยวนำใน BTx623 ในการตอบสนองต่อการบำบัดด้วยไคติน ในขณะที่ยีนที่เหนี่ยวนำ 2591 flg22-ใน SC155-14E, {{ 16}}.6 เปอร์เซ็นต์ยังตอบสนองต่อ SC ที่ได้รับไคติน155-14E นี่อาจไม่น่าแปลกใจเนื่องจากผลงานก่อนหน้านี้ใน Arabidopsis thaliana แสดงให้เห็นการซ้อนทับกันอย่างมีนัยสำคัญในยีนที่ตอบสนองต่อ MAMPs ที่แตกต่างกันซึ่งกำหนดเส้นทาง MTI ทั่วไป [44–46]

นอกจากนี้ Zhang et al. [17] ยังรายงานความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่าง flg22 และการตอบสนองของไคตินในข้าวโพด สังเกตเห็นการเหลื่อมกันน้อยลงระหว่าง BTx623 และ SC155-14E leaf disc ที่ใช้ MAMP เดียวกัน (รูปที่ 7A) 64.3 เปอร์เซ็นต์ของ flg22-ยีนที่เหนี่ยวนำใน BTx623 ถูกเหนี่ยวนำใน flg22-ที่บำบัดด้วย SC155-14E และยีนที่เหนี่ยวนำด้วยไคติน 68.3 เปอร์เซ็นต์ใน BTx623 ถูกเหนี่ยวนำใน SC ที่บำบัดด้วยไคติน155-14 อี ในทำนองเดียวกัน จากยีน 2152 ยีนที่ถูกควบคุมโดย flg22 ของ BTx623 เปอร์เซ็นต์ที่สูง (75.9 เปอร์เซ็นต์ ) ยังถูกควบคุมโดยไคตินใน BTx623 จากยีน 1,257 ยีนที่ถูกลดการควบคุมโดย flg22 ใน SC155-14E, 70.8 เปอร์เซ็นต์ถูกควบคุมโดยไคตินใน SC155-14E อย่างไรก็ตาม มีเพียง 29 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่ควบคุมไม่ได้ flg22 ใน BTx623 เท่านั้นที่ถูกควบคุมเช่นกันใน flg22-SC ที่บำบัดแล้ว155-14E และ 45 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่ควบคุมดาวน์ไคตินใน BTx623 ถูกควบคุมดาวน์ ใน SC ที่บำบัดด้วยไคติน155-14E (รูปที่ 7A) ดังนั้น ในขณะที่มีการบรรจบกันอย่างมีนัยสำคัญในเส้นทาง MTI ไปยัง flg22 และไคตินในจีโนไทป์ทั้งสองเมื่อเปรียบเทียบกัน ข้อมูลยังบอกใบ้ถึงความซับซ้อนที่น่าสนใจเกี่ยวกับวิธีที่จีโนไทป์ทั้งสองนี้ตอบสนองต่อ MAMP ที่แตกต่างกัน

2.3. การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าการทำงานของยีนโดยเปรียบเทียบการตอบสนอง MTI ของ BTx623 และ SC155-14E

เพื่อกำหนดประเภทการทำงานของยีนที่ควบคุมโดยตอบสนองต่อ flg22 หรือไคติน และการตอบสนองที่แตกต่างกันของข้าวฟ่างสองสายที่ทดสอบ เราใช้แพลตฟอร์ม PlantRegMap [47,48] เพื่อทำการวิเคราะห์การเพิ่มปริมาณชุดยีนตาม DEG ที่ตรวจพบในทางชีววิทยา หมวดกระบวนการ รูปที่ 8A และ B แสดงคำศัพท์ GO สูงสุดของยีนที่อุดมด้วยกระบวนการทางชีวภาพด้วย DEG ที่ควบคุมขึ้นและ DEG ที่ควบคุมลงจากทั้ง BTx623 และ SC155-14E รายการทั้งหมดของ DEG มีอยู่ในตาราง S6–S13 ยีนจำนวนมากเหล่านี้เกี่ยวข้องกับกระบวนการต่างๆ รวมถึงการตอบสนองต่อความเครียด การตอบสนองการป้องกันพืช การตอบสนองต่อสิ่งเร้า การตอบสนองต่อสิ่งเร้าทางชีวภาพ การตอบสนองต่อแบคทีเรีย การตอบสนองต่อสิ่งมีชีวิตอื่น การสื่อสารของเซลล์ กระบวนการเผาผลาญฟอสฟอรัส และโปรตีนฟอสโฟรีเลชั่น

ผลลัพธ์ในรูปที่ 8A และ B แสดงความแตกต่างอย่างชัดเจนในการแสดงออกของยีนที่ปกติเกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดระหว่างจีโนไทป์ข้าวฟ่างทั้งสอง ในเงื่อนไข GO ที่เสริมประสิทธิภาพเหล่านั้น พบ DEG ที่ไม่ซ้ำกันบางส่วนในแต่ละเงื่อนไขที่มีการทับซ้อนกัน ตัวอย่างเช่น การตอบสนองการป้องกันระยะ GO (GO 0006952): 91 และ 84 DEG ที่ควบคุมขึ้นได้รับการเสริมประสิทธิภาพใน BTx623 หรือ SC155-14E ที่บำบัดด้วย flg22 ตามลำดับ ภายใน DEG เหล่านั้น 24 DEG มีลักษณะเฉพาะใน BTx623 และ 15 DEG พบเฉพาะใน SC{11}}E เท่านั้น และพบค่าอื่นๆ ในจีโนไทป์ของข้าวฟ่างทั้งสอง ในทำนองเดียวกัน DEG ที่ควบคุมขึ้น 102 และ 93 ถูกทำให้อุดมใน BTx623 หรือ SC155-14E ที่บำบัดด้วยไคติน ตามลำดับ ภายใน DEG เหล่านั้น 20 DEG ไม่ซ้ำกันใน BTx623 และ 14 DEG ไม่ซ้ำกันใน SC{20}}E และค่าอื่นๆ แสดงให้เห็นในจีโนไทป์ของข้าวฟ่างทั้งสอง

ในคำว่า GO ของ "การตอบสนองต่อไคติน (GO: 0010200)" เราสังเกตเห็น DEG ที่ได้รับการควบคุม 18 ยีนจากทั้งหมด 779 ยีนในหมวดหมู่นี้ที่เสริมคุณค่าในตัวอย่าง SC ที่ผ่านการบำบัดด้วยไคติน155-14E (รูปที่ 8 ) ในขณะที่ไม่มียีนใดถูกทำให้สมบูรณ์ในตัวอย่าง BTx623 ที่ถูกบำบัดด้วยไคติน นอกจากนี้ DEG ที่ได้รับการควบคุมขึ้น 16 รายการได้รับการทำให้สมบูรณ์ใน flg22-ตัวอย่าง SC ที่บำบัดแล้ว155-14E และ DEG ที่ควบคุมขึ้น 12 รายการได้รับการทำให้สมบูรณ์ในตัวอย่าง BTx623 ที่บำบัดด้วย flg22- (รูปที่ 8) การเปรียบเทียบรายการ DEG ของคำศัพท์ GO "การตอบสนองต่อไคติน" ใน flg22 กับ BTX623 และ SC ที่บำบัดด้วยไคติน155-14E (ตารางที่ S9) เปิดเผยว่า DEG ที่อุดมด้วย flg22 หรือ SC ที่บำบัดด้วยไคติน155- 14 E เหมือนกัน ยกเว้นว่าไคตินเหนี่ยวนำ DEG มากกว่า flg22 สองตัว ในทางตรงกันข้าม DEG ทั้ง 12 ตัวที่ได้รับการปรับปรุงใน flg22-BTX623 ที่ผ่านการบำบัดนั้นแตกต่างจาก DEG ที่เกิดจาก MAMP ใน SC155-14E DEG ที่เกิดจาก MAMPs เหล่านั้นอาจนำไปสู่การตอบสนองต่อการดื้อยาของแอนแทรคโนสใน SC155-14E เนื่องจากไคตินเป็นโมเลกุล MAMP ทั่วไปจากผนังเซลล์ของเชื้อรา ซึ่งกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของพืช สตริงลิส และคณะ [49] ยังรายงานว่าชุดของ DEGs ที่มีการควบคุมเพิ่มขึ้นนั้นได้รับการเสริมคุณค่าในระยะ GO ของ "การตอบสนองต่อไคติน" จากไคติน, flg22 และ rhizobacteria Pseudomonas simiae WCS417 ที่เป็นประโยชน์กับพืชที่รักษาพืช Arabidopsis มาติชและคณะ [33] รายงานว่า 21 DEGs ได้รับการเสริมคุณค่าในคำศัพท์ GO ของ "การตอบสนองต่อไคติน" จากการวิเคราะห์ RNA-seq ใบข้าวของพันธุ์ต้านทาน แต่ไม่ใช่จากพันธุ์ที่อ่อนแอหลังจากการติดเชื้อเชื้อรา Fusarium fujikuroi

ยีน PR (ที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรค) เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของพืช [50] และมีฤทธิ์ต้านเชื้อราต่อเชื้อราที่ก่อโรคพืชหลายชนิด [51] โปรตีน PR-10 มีขนาดเล็ก ส่วนใหญ่เป็นกรด โปรตีนภายในเซลล์ที่มีคุณสมบัติต้านเชื้อราที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองการป้องกันในพืชหลายชนิด รวมทั้งข้าวฟ่าง [52] สมาชิกในครอบครัวของยีน PR-10 เกิดจากการโจมตีของเชื้อโรคในพืชหลากหลายชนิด [53] ในข้าวฟ่าง Lo et al. [26] รายงานว่าการแสดงออกของ PR-10 ถูกกระตุ้นโดยเป็นส่วนหนึ่งของการป้องกันโฮสต์ที่ใช้งานของข้าวฟ่างต่อเชื้อราก่อโรคทางใบ C. heterostrophus และ C. sublineolum เคธี่และคณะ [54] รายงานว่าข้าวฟ่างหลายสายพันธุ์แสดงการเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญของปริมาณสัมพัทธ์ปกติของ PR-10 หลังจากการฉีดวัคซีนด้วยสปอร์เชื้อราของ C. lunata และ F. capsicum ในการทดสอบภาคสนาม ในสภาพเรือนกระจก เปลือกตาของพืชที่ปลูกเชื้อแสดงการเหนี่ยวนำของ PR-10 mRNA และการตอบสนองนั้นสูงกว่าในการทดสอบพันธุ์ต้านทานสองพันธุ์เมื่อเทียบกับพันธุ์ที่อ่อนแอสองพันธุ์

ผลลัพธ์ของเราพบว่าในบรรดา DEG ที่ระบุ พบยีน PR-10 สี่ยีน (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). ใน SC155-14E ทั้งสี่ PR-10 DEG ได้รับการควบคุมโดย flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน ในทางตรงกันข้าม ใน BTx623 ไม่พบ SORBI_3001G401000 ใน DEG และ SORBI{{15} }G401300 (ควบคุมขึ้น) ถูกนำเสนอเฉพาะใน BTx623 ด้วยการบำบัดด้วยไคตินแต่ไม่ใช่ด้วยการบำบัดด้วย flg22 สิ่งนี้บ่งชี้ว่าการแสดงออกของยีน PR สามารถใช้เพื่อตอบสนองต่อระดับผลิตภัณฑ์ ROS ที่สูงขึ้นหลังการรักษา MAMPs และการต้านทานโรคแอนแทรกโนสใน SC155-14E

กรดซาลิไซลิก (SA) เป็นสัญญาณภูมิคุ้มกันของพืชที่จำเป็นสำหรับการตอบสนองการป้องกันเฉพาะที่และการต่อต้านที่ได้รับอย่างเป็นระบบ มีบทบาทสำคัญในการต่อต้านและป้องกันพืชจากการโจมตีของเชื้อโรค [55] ในข้าวฟ่าง, Tugizimana et al. [56] รายงานการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณในระดับของกรด jasmonic, salicylic acid conjugates และ abscisic-acid ในข้าวฟ่างที่ติดเชื้อ C. subline-ola C. subline-ola เป็นสาเหตุของโรคแอนแทรกโนส จีโนไทป์ของข้าวฟ่างที่มีระดับกรดอะมิโนที่เพิ่มขึ้น (ทริปโตเฟนและไทโรซีน) กรดแจสโมนิกและคอนจูเกตซาลิไซลิก และซีตินมีความทนทานต่อโรคแอนแทรคโนสมากกว่า ในการศึกษานี้ คำว่า GO 'การตอบสนองต่อกรดซาลิไซลิก' (GO:0009751) ซึ่งรวมถึง DEG ที่ควบคุมขึ้น 19 รายการได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างเฉพาะเจาะจงใน SC155-14E ที่บำบัดด้วยไคติน (ตารางที่ S9) ดังนั้น เส้นทางการส่งสัญญาณซาลิไซลิกจึงมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อระดับการผลิต ROS ที่สูงขึ้นหลังการบำบัดด้วย MAMP และการต้านทานโรคแอนแทรกโนสใน SC155-14E

นอกจากนี้ DEG ที่ได้รับการควบคุม 169 รายการได้รับการเสริมคุณค่าในการตอบสนองต่อคำ GO ต่อความเครียดเพียงอย่างเดียวใน SC155-14E ที่บำบัดด้วยไคติน (ตารางที่ S9) คำศัพท์ GO อื่นๆ ที่พบเฉพาะใน SC155-14E ที่บำบัดด้วย MAMPs แต่ไม่ใช่ใน BTx623 ที่มีการบำบัดแบบเดียวกันคือกระบวนการเมตาบอลิซึมทุติยภูมิ (GO:0019748), กระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟอสฟาติดิลโคลีน (GO:0006656) และกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไขมัน ( GO:0008610).

นอกจากนี้ DEG ที่ได้รับการควบคุม 169 รายการได้รับการเสริมคุณค่าในการตอบสนองต่อคำ GO ต่อความเครียดเพียงอย่างเดียวใน SC155-14E ที่บำบัดด้วยไคติน (ตารางที่ S9) คำศัพท์ GO อื่นๆ ที่พบเฉพาะใน SC155-14E ที่บำบัดด้วย MAMPs แต่ไม่ใช่ใน BTx623 ที่มีการบำบัดแบบเดียวกันคือกระบวนการเมตาบอลิซึมทุติยภูมิ (GO:0019748), กระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟอสฟาติดิลโคลีน (GO:0006656) และกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไขมัน ( GO:0008610).

นอกจากนี้เรายังตรวจสอบองค์ประกอบของยีนที่ควบคุมร่วมกันระหว่างสองจีโนไทป์หลังจากการบำบัดด้วย flg22 หรือไคตินรวมถึงชุดหลักของ DEGs ในการรักษาทั้งหมดและสองจีโนไทป์โดยการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า GO (รูปที่ 4B และ 7B) รายการทั้งหมดของ DEG มีอยู่ในตาราง S14 และ S15 รูปที่ 4B แสดงเงื่อนไข GO ที่สมบูรณ์ของชุดหลักของ DEGs ที่ควบคุมทั้งหมด ขึ้นและลดลงใน BTx623 และ SC155-14E พร้อมการบำบัดทั้งหมด ข้อกำหนด GO ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของ MAMPs และการป้องกันพืช (เช่น การจับไคติน, การตอบสนองการป้องกัน, กิจกรรมโปรตีนไคเนส, โปรตีนฟอสโฟรีเลชั่น, โปรตีนซีรีน/ทรีโอนีนไคเนสกิจกรรม) ได้รับการเสริมคุณค่าอย่างมีนัยสำคัญใน DEGs ที่ควบคุมขึ้น ในขณะที่เงื่อนไข GO ของกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิ การจับตัวกับไอออนของเหล็ก, กิจกรรมออกซิโดเรสดักเตสนั้นได้รับการเสริมสมรรถนะใน DEG ที่ควบคุมไม่ได้เท่านั้น ผลลัพธ์นี้คล้ายกับผลลัพธ์ใน Arabidopsis โดยที่คำศัพท์ GO ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อตัวกระตุ้น (เปปไทด์ flg22 จาก P. simile WCS417 และ P. aeruginosa PAO1, ไคตินและเซลล์แบคทีเรียของ P. simile WCS417) ได้รับการเสริมคุณค่าอย่างมีนัยสำคัญมากที่สุดในการควบคุมที่เพิ่มขึ้น ชุดหลักของ DEGs [49]

รูปที่ 7B แสดงเงื่อนไข GO ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของชุดของ DEG ที่ควบคุมร่วมกัน (กล่าวคือ เพิ่มขึ้นหรือลดลงในจีโนไทป์ทั้งสอง) ระหว่าง BTx623 และ SC155-14E หลังการบำบัดด้วย flg22 หรือไคติน ผลการวิจัยพบว่าคำศัพท์ GO ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนอง MAMPs และการป้องกันพืช (เช่น การตอบสนองการป้องกัน กิจกรรมโปรตีนไคเนส โปรตีนฟอสโฟรีเลชั่น โปรตีนซีรีน/ทรีโอนีนไคเนสกิจกรรม) ได้รับการเสริมคุณค่าเฉพาะใน flg22 หรือไคตินที่ควบคุม DEGs ในจีโนไทป์ทั้งสองในขณะที่เงื่อนไข GO ของกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิ, การจับ heme, การจับกับไอออนของเหล็ก, กิจกรรม oxidoreductase ของออกซิเจนหนึ่งอะตอมและกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ phosphatidylcholine

2.4. การวิเคราะห์การเพิ่มความสมบูรณ์ของเส้นทาง KEGG ของการตอบสนอง MTI ของ BTx623 และ SC155-14E

รูปที่ 9 แสดงการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าเส้นทาง KEGG ของ DEG ที่ควบคุมขึ้นซึ่งพบในตัวอย่าง BTx623 และ SC ที่บำบัดด้วย MAMP155-14E โดยใช้เครื่องมือออนไลน์ของ DAVID [57] รายการทั้งหมดของ DEG มีอยู่ในตาราง S16–S20 ผลลัพธ์ระบุเส้นทาง KEGG ด้านบนที่เฉพาะเจาะจงเหล่านั้นที่ได้รับการเสริมประสิทธิภาพอันเป็นผลมาจากการเปิดใช้งาน MTI ในจีโนไทป์ของข้าวฟ่างสองสายพันธุ์ ในวิถีทางของ KEGG "ปฏิกิริยาระหว่างพืชกับเชื้อโรค" เราสังเกตว่า DEG ที่ควบคุมแล้ว 24 รายการได้รับการเสริมคุณค่าในตัวอย่าง SC ที่บำบัดด้วยไคติน155-14E ในขณะที่ไม่มี DEG ใดที่ได้รับการเสริมสมรรถนะในตัวอย่าง BTx623 ที่บำบัดด้วยไคติน การตอบสนองของไคตินที่แรงขึ้นของยีน SC155-14E มีความสัมพันธ์กับความต้านทานที่มากขึ้นของยีนชนิดนี้ต่อโรคแอนแทรกโนสจากเชื้อรา [39] ยิ่งไปกว่านั้น การเพิ่มคุณค่าวิถีทางของ KEGG เผยให้เห็นยีน 28 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ฟีนิลโพรพานอยด์ระยะใน SC155-14E ที่บำบัดด้วย flg22 เส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟีนิลโพรพานอยด์เริ่มต้นด้วยฟีนิลอะลานีนซึ่งสามารถเปลี่ยนเป็นสารประกอบอะโรมาติก เช่น ฟลาโวนอยด์ เบนเซนอยด์ คูมาริน ไฮดรอกซีซินนาเมต และลิกนิน [58,59] ฟีนิลโพรพานอยด์และฟลาโวนอยด์จำนวนมากมีส่วนร่วมในการตอบสนองต่อการต้านทานโรค [28,60] การผลิตไฟโตอะเล็กซินเป็นการป้องกันที่สำคัญต่อเชื้อก่อโรคแอนแทรคโนส C. subline-ola [28] ในข้าวฟ่าง ดีออกซีแอนโทไซยานิดิน 3- เป็นกลุ่มของฟลาโวนอยด์ที่ผิดปกติซึ่งรู้จักกันในชื่อไฟโตอะเลกซินในข้าวฟ่าง Phytoalexins เป็นโมเลกุลขนาดเล็กที่มีฤทธิ์ต้านจุลชีพที่เกิดขึ้นหลังจากการติดเชื้อของเชื้อโรค [61] วังและคณะ [37] ยังพบว่าการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟีนิลโพรพานอยด์ของ KEGG นั้นได้รับการเสริมอย่างมีนัยสำคัญใน DEG ของพืชที่ติดเชื้อ C. subline-ola ในการศึกษาการถอดรหัสของข้าวฟ่าง เราควรสังเกตว่าผลลัพธ์การเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG (รูปที่ 9) ยังแสดงการตอบสนองที่สูงขึ้นของ BTx623 หลังการรักษาด้วย MAMPs ในบางวิถีทางซึ่งอาจมีบทบาทในปฏิกิริยาระหว่างพืชกับเชื้อโรค (เช่น ในวิถีทางของฟีนิลอะลานีนและการสังเคราะห์ทางชีวภาพของโพรไบโอติก การสังเคราะห์ทางชีวภาพของยาปฏิชีวนะ)

นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะเส้นทาง KEGG ของ DEG ที่ควบคุมไม่ได้เผยให้เห็นว่า DEG ที่ควบคุมไม่ได้ 10 รายการได้รับการทำหมายเหตุประกอบเป็น 'โปรตีนสังเคราะห์แสง-เสาอากาศ' และ 84 DEGs ได้รับการทำหมายเหตุประกอบเมื่อเข้าร่วมใน 'การสังเคราะห์ทางชีวภาพของสารทุติยภูมิ BTx623. อย่างไรก็ตาม การศึกษาการแสดงออกของยีนดังกล่าวสามารถระบุยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในการตอบสนองต่อการรักษาด้วย MAMPs หรือการติดเชื้อก่อโรค แต่ไม่จำเป็นต้องแสดงให้เห็นว่ายีนเหล่านี้มีความสำคัญต่อการต่อต้านเชื้อโรคที่เฉพาะเจาะจง ดังนั้น จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจความสัมพันธ์เชิงสาเหตุระหว่างการดื้อต่อเชื้อราและการกระตุ้นเส้นทาง KEGG เหล่านั้นในจีโนไทป์ทั้งสอง ตามที่เปิดเผยโดยการวิเคราะห์ RNA-Seq

นอกจากนี้เรายังทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะเส้นทาง KEGG สำหรับชุดหลักของ DEG ในทุกสภาวะ (รูปที่ 4C) รวมถึง DEG ที่ควบคุมร่วมกันระหว่างสองจีโนไทป์หลังการบำบัดด้วย flg22 หรือไคติน (รูปที่ 7C) ผลการวิจัยพบว่าวิถีทางที่สำคัญ 6 เส้นทาง ซึ่งรวมถึงวิถีปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อโรคพืชกับพืช ได้รับการเสริมประสิทธิภาพเฉพาะในชุดแกนกลางของ DEG ที่มีการควบคุมขึ้น แต่ไม่ได้อยู่ในชุดแกนกลางของ DEG ที่มีการควบคุมลง ในทำนองเดียวกัน วิถีทางเจ็ดและสามวิถี ซึ่งรวมถึงวิถีอันตรกิริยาระหว่างกันของเชื้อโรคพืช ได้รับการเสริมอย่างมีนัยสำคัญใน DEG ที่ควบคุมด้วยไคตินและ FLG22 ที่ควบคุมด้วย DEG ใน BTx623 และ SC155-14E ตามลำดับ ในทางตรงกันข้าม มีเพียงไรโบโซมไบโอเจเนซิสในเส้นทางยูคาริโอตเท่านั้นที่อุดมไปด้วย DEGs ที่ควบคุมด้วยไคตินในจีโนไทป์ทั้งสอง

2.5. การตรวจสอบความถูกต้องของข้อมูล RNA-Seq โดยใช้ Quantitative RT-PCR ของ Select Genes

เพื่อยืนยันข้อมูลการทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่ได้รับจาก RNA-seq เราทำการวิเคราะห์ qRT-PCR เพื่อประเมินการแสดงออกของยีนที่เลือกไว้เก้าตัว ยีนทั้งเก้านั้นถูกเลือกตามการแสดงออกที่สังเกตโดย RNA-seq ในสามประเภท: (a) แสดงออกคล้ายกันใน BTx623 และ SC155-14E ด้วย flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน; (b) แสดงออกเฉพาะใน MAMPs ที่บำบัด SC155-14E แต่มีการแสดงออกที่ต่ำมากใน BTx623 ที่บำบัดแล้ว และ (c) แสดงออกสูงกว่า 2–21-ใน MAMPs ที่บำบัด SC155-14E เทียบกับ BTx623 . ผลการวิเคราะห์ qRT-PCR (ตารางที่ 1) เปิดเผยข้อตกลงเต็มรูปแบบกับระดับการแสดงออกที่กำหนดโดยการวิเคราะห์ RNA-seq สำหรับแต่ละยีนเก้าตัวที่ประเมิน ผลลัพธ์เหล่านี้ทำให้เรามั่นใจว่าการวัดที่ทำโดย RNA-seq นั้นสะท้อนถึงการตอบสนองของการถอดรหัสของเส้นข้าวฟ่างต่อการรักษา MAMP

2.6. ข้อสรุป

ในการศึกษานี้ อันดับแรก เราพบสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเปรียบเทียบการตอบสนองของ MTI ของจีโนไทป์ทั้งสองโดยการทดสอบการผลิต ROS โดยใช้ใบสามชุด และเลือกใบที่อายุน้อยที่สุดใบที่สองของพืชอายุสิบห้าวันสำหรับการสกัด RNA และการวิเคราะห์การถอดรหัสในภายหลัง ระยะเวลาของการผลิต ROS ที่กระตุ้นและกระตุ้นด้วยไคตินในสายการผลิตข้าวฟ่าง SC155-14E (รูปที่ 1C) เปิดเผยว่าการผลิต ROS ที่กระตุ้นด้วยไคตินเกิดขึ้นเร็วกว่าที่กระตุ้นโดยการบำบัดด้วย flg22 เราได้รับโปรไฟล์การแสดงออกของ Sorghum bicolor genotype SC ที่ต้านทานโรคแอนแทรคโนส155-14E พร้อมการตอบสนองสูงต่อการรักษา MAMPs ในการผลิต ROS และ BTx623 ที่ไวต่อการตอบสนองต่อผลิตภัณฑ์ ROS ต่อการรักษา MAMP ในระยะแรก ของการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด

ผลลัพธ์แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนของการแสดงออกของยีนในจีโนไทป์ข้าวฟ่าง BTx623 และ SC155-14E ในการตอบสนองต่อการรักษาด้วย MAMP ในขณะที่การตอบสนองต่อ MAMP ทั้งสองแสดงการทับซ้อนกันอย่างมากในแต่ละบรรทัด (86.6–70.8 เปอร์เซ็นต์ ) ทั้งสองมีความแตกต่างกัน แม้ว่าจะต่ำกว่า แต่มีการทับซ้อนกัน (68.3–29 เปอร์เซ็นต์ ) ระหว่างการตอบสนองของสองบรรทัดต่อ MAMP เดียวกัน DEG จำนวนมาก 2272 จาก 10,535 DEG ถูกระบุในเงื่อนไขทั้งสี่และกำหนดการตอบสนอง MAMP หลักอย่างไม่แน่นอน รายชื่อยีนนี้ควรเป็นประโยชน์ต่อห้องปฏิบัติการที่ต้องการทำโปรไฟล์การตอบสนองการแสดงออกของยีนต่อการรักษาด้วย MAMP การวิเคราะห์ RNA-seq ระบุชุดจำนวนมากของยีนที่แสดงออกแตกต่างกันใน BTx623 และ SC155-14E ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคตินเมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมจำลองของสองสายที่ไม่ได้รับการบำบัด นอกจากนี้ การเปรียบเทียบ DEG ที่เลือกโดยใช้ไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศสองแบบที่ต่างกันแสดงผลลัพธ์ที่คล้ายกันมาก การวิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกโดยละเอียดของ DEGs เหล่านี้ การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า GO และการวิเคราะห์เส้นทาง KEGG เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนในการตอบสนองการแสดงออกของยีนของทั้งสองจีโนไทป์ คำศัพท์ GO และการเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG ค้นพบ DEG ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันและการต่อต้านเชื้อโรค (ยีน PR, การตอบสนองของยีนต่อไคติน, การตอบสนองของยีนต่อกรดซาลิไซลิก, การตอบสนองต่อความเครียด, การสังเคราะห์ฟีนิลโพรพานอยด์ ฯลฯ) ใน SC ที่บำบัดด้วย MAMP{{18} }ตัวอย่าง E ที่สัมพันธ์กับ BTx623 ด้วยการบำบัดแบบเดียวกัน ข้อมูลนี้ให้ข้อมูลพื้นฐานที่สำคัญเกี่ยวกับวิธีที่ระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของพืชที่เพาะปลูกหลักนี้ตอบสนองต่อการกระตุ้น MAMP เนื่องจากขาดข้อมูลทั่วไปเกี่ยวกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของพืช เมื่อเทียบกับแบบจำลอง Arabidopsis รายการยีนและวิธีการที่อธิบายไว้เป็นแหล่งข้อมูลสำหรับการสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับการตอบสนองของข้าวฟ่างต่อเชื้อโรค และควรอำนวยความสะดวกในความพยายามในการปรับปรุงความต้านทานโรคในท้ายที่สุด อาหารและพืชชีวมวลที่สำคัญนี้

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. วัสดุปลูก

การศึกษานี้ใช้ข้าวฟ่างสองสายพันธุ์ที่จัดทำโดย Dr. William Rooney (Texas A&M University, College Station, USA) และ Dr. Stephen Kresovich (Clemson University, Clemson, USA) ในการศึกษานี้ BTx623 เป็นสายพันธุ์ข้าวฟ่างมาตรฐานที่มีลำดับจีโนมทั้งหมดที่มีอยู่ [22] และ SC155-14E เป็นสายพันธุ์ที่พัฒนาขึ้นสำหรับการต้านทานโรคแอนแทรกโนส [39]

3.2. การทดสอบ ROS

เมล็ดข้าวฟ่างของ BTx623 และ SC155-14E ผ่านการฆ่าเชื้อที่พื้นผิว (เอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นใช้สารฟอกขาว 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาที ล้างด้วยหม้อนึ่งความดัน ddH2O) และปลูกในหม้อผสมซันไชน์ที่นึ่งฆ่าเชื้อ และงอกในห้องการเจริญเติบโต ( 16 ชม./8 ชม. สว่าง/มืด, 28/26 ◦C, ความชื้น 60–70 เปอร์เซ็นต์) ใช้พืชอายุสิบห้าวันในการทดลอง

MAMPs สองตัว, flg22 (แค็ตตาล็อก Genscript # RP19986) และไคตินจากกระดองปู (Sigma-Aldrich, แค็ตตาล็อก # C3641) ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ Flg22 เป็นเปปไทด์ที่ได้มาจากปลายแฟลกเจลลิน N ของแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคในพืช และเป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดในพืชโดยเฉพาะ [62] ไคตินเป็นโมเลกุล MAMP ทั่วไปที่ได้จากผนังเซลล์ของเชื้อรา ซึ่งกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของพืช [3] การทดสอบ ROS ได้ดำเนินการตาม Kimball และคณะ [38]. ในการประเมินความแปรผันในการตอบสนองของ MAMP ภายในแต่ละจีโนไทป์ เช่นเดียวกับตำแหน่งของใบ ใบที่ขยายเต็มที่ทั้งสามใบของพืชในแต่ละจีโนไทป์ได้รับการประเมินแยกกัน ใบจากด้านล่างถึงด้านบนของต้นข้าวฟ่างอายุ 15 วันของแต่ละจีโนไทป์ถูกทำเครื่องหมายเป็นใบ #1, #2 และ #3 เราใช้เฉพาะส่วนตรงกลางของใบในการสุ่มตัวอย่างเพื่อวัดการผลิต ROS ทันทีหลังการรักษา สัญญาณเคมีเรืองแสงของแต่ละตัวอย่างถูกบันทึกเป็นเวลา 30 นาทีโดยใช้กล้อง Photek CCD (Photek Ltd., East Sussex UK) หลุมแปดแห่งประกอบด้วยการบำบัดจำลอง (ไม่มี MAMP) และหลุมแปดแห่งประกอบด้วยการบำบัด (ด้วย MAMP) ในทุกกรณี จะมีการเปรียบเทียบการจำลองแบบทางชีวภาพ 3 รายการซึ่งมีทั้งหมด 8 ตัวอย่างสำหรับการรักษาแต่ละครั้ง

3.3. การรักษาตัวอย่างด้วย MAMPs

ใช้พืชอายุสิบห้าวันในการทดลอง การรักษา MAMPs ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน Valdes-Lopez และคณะ [12] ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สรุป ใบที่สอง (จากด้านบนสุด ใบที่อายุน้อยที่สุดใบที่สอง) จากต้นห้าต้นสำหรับข้าวฟ่างแต่ละสายพันธุ์ถูกแยกออก จากนั้นจึงกรองด้วยสุญญากาศด้วย ddH2O ที่นึ่งฆ่าเชื้อเป็นเวลา 2 นาที แผ่นใบขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 50 1 ซม. ถูกตัดออกจากใบที่แทรกซึมอยู่ในน้ำของแต่ละจีโนไทป์และรวมกัน แผ่นใบ 45 ใบจากแต่ละจีโนไทป์ถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเชื้อที่แตกต่างกัน 3 จาน (จานใบ 15 ใบในแต่ละจานเพาะเชื้อ) จากนั้นลอยข้ามคืนที่อุณหภูมิห้องบนหม้อนึ่งความดัน ddH2O โดยแผ่นปิดด้วยอลูมิเนียมฟอยล์ ในวันถัดไป น้ำถูกเอาออกจากจานเพาะเชื้อทั้งหมดและแทนที่ด้วย ddH2O (จำลอง) 10 มล., 1 µM flg22 10 มล. หรือสารละลายไคติน 20 มก./มล. 10 มล. หลังจากการบำบัดเป็นเวลา 60-นาที ชิ้นใบที่ผ่านการจำลองและ MAMP จะถูกเก็บเกี่ยวในหลอดต่างๆ และแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างชิ้นใบไม้ (สำหรับ 101quenced "ies ied-11272) ภูมิคุ้มกัน BTx623 และ SC155-14E ด้วยม็อค, flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน, การจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบ) ถูกเก็บไว้ที่ −80 ◦C สำหรับการสกัด RNA ทั้งหมด ขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้นดำเนินการภายใต้สภาวะที่มืดเพื่อขจัดผลกระทบจากการสังเคราะห์ด้วยแสงที่เป็นไปได้

3.4. การสกัด RNA การหาลำดับ และการสร้างไลบรารี

การสกัด RNA ดำเนินการโดยใช้ชุด Direct-zol RNA Miniprep Plus จาก Zymoresearch (แค็ตตาล็อก #R2071) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

การจัดลำดับความเร็วสูงได้ดำเนินการที่ University of Missouri DNA Core Facility ห้องสมุดสิบแปดแห่งถูกสร้างขึ้นตามโปรโตคอลของผู้ผลิตด้วยรีเอเจนต์ที่ให้มาในชุดเตรียมตัวอย่างที่ควั่น TruSeq mRNA ของ Illumina ความเข้มข้นของตัวอย่างถูกกำหนดโดย Qubit fluorometer (Invitrogen) โดยใช้ชุดทดสอบ Qubit HS RNA และตรวจสอบความสมบูรณ์ของ RNA โดยใช้ระบบอิเล็กโตรโฟรีซิสอัตโนมัติของ Fragment Analyzer โดยสังเขป poly-A ที่มี mRNA ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก RNA ทั้งหมด (1 µg), RNA ถูกแยกส่วน, cDNA แบบเกลียวคู่ถูกสร้างขึ้นจาก RNA ที่แยกส่วน และดัชนีที่มีอะแด็ปเตอร์ผูกมัดที่ปลาย โครงสร้าง cDNA ที่ขยายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการเติมเม็ดบีด Axyprep Mag PCR Clean-up โครงสร้างขั้นสุดท้ายของคลังบริสุทธิ์แต่ละรายการได้รับการประเมินโดยใช้ระบบอิเล็กโตรโฟรีซิสอัตโนมัติของ Fragment Analyzer หาปริมาณด้วย Qubit fluorometer โดยใช้ชุดทดสอบ Qubit HS dsDNA และเจือจางตามโปรโตคอลการหาลำดับมาตรฐานของ Illumina สำหรับการจัดลำดับใน NextSeq 500 ความยาวของการหาลำดับเป็นค่าเดียว อ่านได้ 75 ฐาน

3.5. การทำแผนที่และการประมวลผลการอ่าน RNA-Seq

ข้อมูลลำดับแสดงสภาวะที่ต่างกันหกสภาวะ: BTx623 ด้วยจำลอง, flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน และ SC155-14E ด้วยจำลอง, flg22 หรือการบำบัดด้วยไคติน แต่ละเงื่อนไขถูกแทนด้วยการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบ ทำให้ได้ตัวอย่างทั้งหมด 18 ตัวอย่าง ประการแรก ปลาย 30 ของการอ่านถูก "ตัดแต่ง" สำหรับอะแดปเตอร์ Illumina สำหรับนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ชัดเจน (N's) และ (เนื่องจากเทคโนโลยี NextSeq) สำหรับ poly-G เทียม (แสดงเป็น G{100}) โดยใช้ cutadapt เวอร์ชัน 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200 เข้าถึงได้เมื่อวันที่ 21 สิงหาคม 2019) สำหรับการอ่านที่มี 30 สิ้นสุดซ้อนทับกับอะแดปเตอร์อย่างน้อย 3 ฐานโดยมีเอกลักษณ์ 90 เปอร์เซ็นต์ หากหลังจากการตัดแต่งนี้ การอ่านที่มีฐานน้อยกว่าสิบฐานจะถูกยกเลิก (พร้อมกับการอ่านที่จับคู่ หากมี) คะแนนคุณภาพสำหรับข้อมูล RNA seq หลังจากการตัดแต่งถูกตรวจสอบโดยใช้ FASTQC (เวอร์ชัน 0.11.9) [63] สำหรับตำแหน่งทั้งหมดในการอ่าน คะแนนคุณภาพเฉลี่ยอยู่ที่ประมาณ 34 ซึ่งบ่งชี้ว่าความแม่นยำในการเรียกพื้นฐานนั้นสูงกว่า 99.9 เปอร์เซ็นต์ การอ่านสำหรับแต่ละตัวอย่างสอดคล้องกับจีโนมอ้างอิง (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) ด้วย Tophat 2.1.1 ไฟล์การจัดตำแหน่งที่เป็นผลลัพธ์ถูกจัดเตรียมให้กับ Cufflinks 2.2.1 เพื่อประกอบการถอดเสียงสำหรับแต่ละตัวอย่าง เวอร์ชันคำอธิบายประกอบที่ใช้ในการวิจัยนี้คือ Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3 ตัวอย่างจากเงื่อนไขเดียวกันถูกรวมเข้าด้วยกันโดยใช้ Cuffmerge จุดประสงค์คือเพื่อให้เป็นพื้นฐานที่สม่ำเสมอสำหรับการคำนวณการแสดงออกของยีนและการถอดเสียงในแต่ละเงื่อนไข

3.6. การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศของข้อมูล RNA-Seq

ข้อมูล RNA seq ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องมือชีวสารสนเทศ Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 และ Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) ด้วยพารามิเตอร์เริ่มต้น เราใช้ไปป์ไลน์เดียวกันกับเครื่องมือเหล่านี้ตามที่อธิบายไว้ใน Trapnell และคณะ [64]. เพื่อยืนยันผลการทดสอบเพิ่มเติม เราใช้ไปป์ไลน์อื่นกับ HiSat2 (เวอร์ชัน 2.1.0), HTSeq (เวอร์ชัน 0.12.4) และ EdgeR (เวอร์ชัน 3.26.8) เพื่อทำการวิเคราะห์ HiSat2 คือการพัฒนาครั้งต่อไปของ TopHat2 อันดับแรก เราใช้ HiSat2 เพื่อจัดตำแหน่งโดยใช้จีโนมอ้างอิงข้าวฟ่าง จากนั้นเราใช้ HTSeq เพื่อนับจำนวนการอ่านที่แมปกับแต่ละยีน สำหรับสิ่งนี้ เราต้องการไฟล์ bam ที่สร้างจากขั้นตอนก่อนหน้าและคำอธิบายประกอบจีโนม (ไฟล์ gif) โปรดทราบว่าจีโนมอ้างอิงและไฟล์คำอธิบายประกอบจะเหมือนกับที่เราใช้ในไปป์ไลน์ดั้งเดิม สุดท้าย เราใช้แพ็คเกจ R edgeR เพื่อกำหนดยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในแต่ละเงื่อนไข

3.7. การระบุยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน
ชุดประกอบที่ผสานถูกส่งไปยัง Cuffdiff ซึ่งจะคำนวณระดับการแสดงออกและทดสอบนัยสำคัญทางสถิติของการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้ระหว่างสองเงื่อนไข เราเปรียบเทียบเงื่อนไขระหว่างจำลองเทียบกับ flg22 และจำลองเทียบกับไคตินสำหรับ BTx623 และ SC155-14E ตามลำดับ ยีนที่แสดงออกแตกต่างกันถูกสกัดโดยใช้เกณฑ์ 0.001 p-value แปลงภูเขาไฟถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ R (ggplot2 V3.3.0) เพื่อแสดงความสำคัญของการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนในสภาวะ BTx623 ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคติน และ SC155- 14E ที่บำบัดด้วย flg22 หรือไคติน ตามลำดับ จุดยีนที่มี −log10 (p-value) เท่ากับหรือมากกว่า 3 จุดถือเป็น DEG ในแต่ละจุด จุดของยีนที่มี log2 (fold_change) มากกว่าศูนย์คือยีนที่มีการควบคุมแบบ up-regulated มิฉะนั้นจะเป็นยีนแบบ down-regulated

3.8. แปลง ส.ป.ก

ในการตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างค่าการแสดงออกของยีนของการจำลองแบบทางชีวภาพสามชุดของแต่ละสายพันธุ์ข้าวฟ่างและการบำบัดด้วย MAMP แต่ละครั้ง แผนการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). แต่ละจุดแสดงถึงเงื่อนไขหลังจากการแมปจากพื้นที่คุณลักษณะดั้งเดิม (การแสดงออกของยีน) ไปยังองค์ประกอบหลักสองส่วนแรก จุดที่อยู่ในเงื่อนไขเดียวกันมักจะรวมกลุ่มกัน

3.9. แผนที่ความร้อนของ DEG

1 แผนกวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีพืชและชีวเคมี, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (ปป); chendq@cau.edu.cn (กระแสตรง)

2 ภาควิชาวิศวกรรมไฟฟ้าและวิทยาการคอมพิวเตอร์ CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 หน่วยวิจัยพืชศาสตร์ USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu