RNA M6 A Reader YTHDF2 ควบคุม NK Cell Antitumor และ Antiviral Immunity ตอนที่ 6

แบบจำลองมะเร็งผิวหนังระยะลุกลามและการท้าทาย MCMV

เซลล์ B16F10 (105) ถูกฉีด iv เข้าไปในหนู 14 วันหลังการฉีด หนูเมาส์ถูกการุณยฆาตเพื่อการวิเคราะห์หลังชันสูตร เนื้องอกที่แพร่กระจายในปอดได้รับการวิเคราะห์ด้วยตาเปล่าและนับ เซลล์ B16F10 จัดหาโดย Hua Yu (เมืองแห่งความหวัง ลอสแองเจลิส แคลิฟอร์เนีย) หนู Ythdf2ΔNK และ Ythdf2WT ติดเชื้อด้วยการฉีด ip ของ MCMV สายพันธุ์ Smith (2.5 × 104 PFU) ซึ่งซื้อจาก American Type Culture Collection (VR-1399) เก็บตัวอย่างเลือดจากการเจาะใต้ขากรรไกรล่างในวันที่ 0, 4 และ 7 หลังการติดเชื้อ

ก้อนเนื้อที่แพร่กระจายในปอดหมายถึงก้อนที่เกิดจากเซลล์เนื้องอกเนื้อร้ายจากตำแหน่งอื่นที่อพยพไปยังปอดผ่านทางเลือดหรือระบบน้ำเหลือง สำหรับผู้ป่วยจำนวนมาก นี่เป็นอาการที่พบบ่อยของโรคมะเร็งปอด

อย่างไรก็ตาม แม้ว่าก้อนเนื้อที่แพร่กระจายในปอดจะเป็นภัยคุกคามต่อสุขภาพกายของผู้ป่วย แต่ก็ไม่มีความสัมพันธ์โดยตรงระหว่างก้อนเนื้อกับความทรงจำ ดังนั้นเราจึงควรเผชิญกับความท้าทายของโรคมะเร็งปอดและก้อนเนื้อที่ลุกลามของปอด และอย่าปล่อยให้อารมณ์และความวิตกกังวลด้านลบส่งผลต่อสุขภาพร่างกายและจิตใจของเรา

ในเวลาเดียวกัน เราสามารถรักษาและปรับปรุงหน่วยความจำด้วยวิธีการเชิงบวกบางอย่างได้ เช่น ฝึกความจำบางอย่าง เช่น คำนวณทางคณิตศาสตร์ อ่านหนังสือ ฟังเพลง เล่นเกม เป็นต้น นอกจากนี้ การปฏิบัติตามนิสัยการใช้ชีวิตที่ดี เช่น การออกกำลังกายเป็นประจำ การนอนหลับให้เพียงพอ การรับประทานอาหารเพื่อสุขภาพ เป็นต้น ยังสามารถ ปรับปรุงความจำของเรา

สิ่งที่สำคัญที่สุดคือการรักษาทัศนคติเชิงบวก ไม่ว่าคุณจะเผชิญความยากลำบากอะไร คุณต้องเชื่อในความแข็งแกร่งและความยืดหยุ่นของระบบประสาทของคุณ และด้วยการปรับเปลี่ยนและการตอบสนองเชิงบวก คุณจะเอาชนะความยากลำบากได้ในที่สุด

กล่าวโดยสรุป แม้ว่าก้อนเนื้อร้ายที่ลุกลามในปอดอาจเป็นภัยคุกคามต่อสุขภาพกาย แต่ก็ไม่ได้เกี่ยวข้องโดยตรงกับความทรงจำ เราควรเผชิญมันในเชิงบวกและรักษาและปรับปรุงความทรงจำของเราโดยการปรับวิถีชีวิตของเราและรักษาทัศนคติที่ดี จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche Deserticola สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมาก เนื่องจาก Cistanche Deserticola ยังสามารถควบคุมความสมดุลของสารสื่อประสาท เช่น การเพิ่มระดับของอะเซทิลโคลีนและปัจจัยการเจริญเติบโต สารเหล่านี้มีความสำคัญมากต่อความจำและการเรียนรู้ นอกจากนี้ Cistanche Deserticola ยังช่วยเพิ่มการไหลเวียนของเลือดและส่งเสริมการส่งออกซิเจน ซึ่งช่วยให้สมองได้รับสารอาหารและพลังงานที่เพียงพอ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความมีชีวิตชีวาและความอดทนของสมอง จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche Deserticola สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมาก เนื่องจาก Cistanche Deserticola ยังสามารถควบคุมความสมดุลของสารสื่อประสาท เช่น การเพิ่มระดับของอะเซทิลโคลีนและปัจจัยการเจริญเติบโต สารเหล่านี้มีความสำคัญมากต่อความจำและการเรียนรู้ นอกจากนี้ Cistanche Deserticola ยังช่วยเพิ่มการไหลเวียนของเลือดและส่งเสริมการส่งออกซิเจน ซึ่งช่วยให้สมองได้รับสารอาหารและพลังงานที่เพียงพอ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความมีชีวิตชีวาและความอดทนของสมอง

คลิกรู้อาหารเสริมเพื่อเพิ่มความจำ

วัดปริมาณไวรัสในเลือดส่วนปลาย ม้าม และตับ และ DNA ถูกแยกออกโดยใช้ชุดเลือดและเนื้อเยื่อของ QIAGEN DNeasy สำหรับการวิเคราะห์ qPCR มีการใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (ไปข้างหน้า) และ MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (ย้อนกลับ)

การบำบัดด้วยเมาส์ ในสิ่งมีชีวิต ด้วย IL-15

สำหรับการรักษาด้วยเมาส์ ในร่างกาย ด้วย IL -15, Ythdf2ΔNK และ Ythdf2WTmice ถูกฉีดด้วย 2 µg ip recombinant human IL -15 (cat.no. 745101; National Cancer Institute) เป็นเวลา 5 วัน จากนั้นหนูเมาส์กลุ่มควบคุมและที่ถูกทรีทถูกการุณยฆาตสำหรับการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริก

โฟลว์ไซโตเมทรี

สารแขวนลอยเซลล์เดียวถูกเตรียมจาก BM เลือด ม้าม ตับ และปอดของหนู Ythdf2ΔNK และ Ythdf2WT ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Wang et al., 2018b) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีและการเรียงลำดับเซลล์ถูกดำเนินการบน LSRFortessa X-20 และ FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences) ตามลำดับ

วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ NovoExpress (Agilent Technologies)

แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงต่อไปนี้จาก BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen หรือเทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์ถูกนำมาใช้: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70),CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1),KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), แกรนไซม์ B (QA16A02), เพอร์ฟอริน(S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), แอนเนกซิน V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) และ Eomes(WD1928), phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101),ฟอสโฟ-Akt (Ser473, #5315), โปรตีนไรโบโซมฟอสโฟ-S6 ,ฟอสโฟ-Stat3 (Tyr705, #9145) และฟอสโฟ-Stat5 (Tyr694,#9539)

สำหรับการประเมินการเพิ่มจำนวนเซลล์ NK เซลล์จะถูกติดฉลากด้วย CTV 5 µM (Invitrogen) ตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิตก่อนที่จะถ่ายโอนไปยังหนูผู้รับ การย้อมสีในเซลล์ของ Ki67, Tbet และ Eomes ดำเนินการโดยการแก้ไขและการซึมผ่านด้วย Foxp3 / Transcription Factor Staining Kit (eBioscience)

สำหรับการตรวจหาโปรตีนฟอสโฟรีเลต เซลล์ NK ม้ามบริสุทธิ์ถูกเตรียมล่วงหน้าด้วย IL ของมนุษย์ชนิดรีคอมบิแนนท์ -15 (50 ng/ml) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นแก้ไขด้วย Phosflow Fix Buffer I ตามด้วยการซึมผ่านด้วย Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) และการย้อมสีด้วย แอนติบอดี

การถ่ายโอนเซลล์แบบรับเลี้ยง

สำหรับการประเมินผลกระทบของการขาด Ythdf2 ต่อการสุกของเซลล์ NK ส่วนผสมของเซลล์ 5 × 106 BM ที่อัตราส่วน 1: 1 จาก CD45.1 หรือ Ythdf2ΔNK CD45.2 หนูถูกถ่ายโอนไปยัง Rag2 − / − Il2rg − / − หนู การสร้างผู้รับใหม่ได้รับการประเมินโดย flow cytometry8 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย

สำหรับการทดลองการแพร่กระจายของเม็ดเลือดขาวที่เกิดจาก lymphopenia จำนวนเซลล์ splenicNK บริสุทธิ์ที่เท่ากันจาก CD45.1 หรือ Ythdf2ΔNK CD45.2 หนูถูกถ่ายโอนไปยัง Rag2 - / - Il2rg - / - หนูตามด้วยการประเมินเปอร์เซ็นต์สัมพัทธ์ของ WT และ Ythdf2ΔNK NKcells ที่ถูกถ่ายโอนในม้าม ของผู้รับ Rag2 − / − Il2rg − /− โดย flow cytometry ณ จุดเวลาที่ระบุ

สำหรับมะเร็งผิวหนังระยะลุกลาม 106 IL -2 – เซลล์ NK ที่ขยายจาก Ythdf2ΔNK หรือ Ythdf2WTmice ถูกฉีด iv เข้าไปใน Rag2−/−Il2rg−/− หนู 1 วันต่อมา B16F10เซลล์ (105) ถูกฉีด iv เข้าไปในหนู 14 วันหลังการฉีด หนูเมาส์จะถูกการุณยฆาตสำหรับการวิเคราะห์หลังชันสูตร ในการทดลองบางอย่าง เซลล์ถูกติดฉลากด้วย CTV (5 ไมโครโมลาร์, อินไวโตรเจน) เพื่อติดตามการเพิ่มจำนวนเซลล์ก่อนถ่ายโอน

การทดสอบการค้ามนุษย์ ใน ร่างกาย

สำหรับการตรวจจับการค้าเซลล์ NK จาก BM ไปยังเลือดรอบข้าง แอนติบอดีต้าน CD45 ที่มีฉลาก APC 1 ไมโครกรัม iv ถูกฉีดเข้าไปในหนู C57BL/6 สองนาทีหลังจากการฉีดแอนติบอดี ธีมิซถูกการุณยฆาตทันที และเซลล์ BM ถูกรวบรวมสำหรับโฟลว์ไซโตเมทรีหลังจากเซลล์ถูกย้อมด้วยแอนติบอดี CD3 และ NK1.1 เซลล์ NK ในพาเรนไคม์ถูกระบุโดยการไม่มีการย้อมสี CD45 ในขณะที่เซลล์ NK ไซน์ซอยด์ถูกระบุโดยการมีอยู่ของการติดฉลาก CD45 ดังนั้น อัตราส่วนของ NKcells ในไซนัสอยด์ (CD45+) ต่ออัตราส่วนของบริเวณเนื้อเยื่อ (CD45−) บ่งชี้ว่ามีการค้าเซลล์ NK จากเลือด BM toperipheral ภายใต้สภาวะคงที่

RT-qPCR แบบเรียลไทม์และอิมมูโนล็อตติง

RNA ถูกแยกได้โดยใช้ RNeasy Mini Kit (QIAGEN) จากนั้นคัดลอกกลับเป็น cDNA ด้วย PrimeScript RT Reagent Kit พร้อมด้วย gDNA Eraser (Takara Bio) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ระดับการแสดงออก mRNA ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ SYBRGreen PCR Master Mix และระบบ QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (ทั้งคู่จาก Thermo Fisher Scientific) ลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตาราง S1

ดำเนินการ Immunoblotting ตามขั้นตอนมาตรฐานตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (Denget al., 2015; Yu et al., 2006) แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกใช้:METTL3 (cat. no. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (cat. no.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (cat. no. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (cat. no. RN123PW; MBL), YTHDF3 (cat. no.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (cat. no. ab195377; Abcam),FTO (cat. no. ab124892; Abcam), MDM2 (cat. no. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (cat. no. PA5-29949; Invitrogen) และ -actin(cat. no. {{20 }}Ig; โปรตีนเทค)

การทดสอบการน็อคดาวน์ของ siRNA

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90% วัดโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ประสิทธิภาพ Geneknockdown ถูกกำหนดโดย qPCR และ immunoblotting 3 วันหลังจากการทรานส์เฟกชัน การตายของเซลล์ และการแพร่กระจายถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

การทดสอบนักข่าวของลูซิเฟอเรส

ภูมิภาคโปรโมเตอร์ Ythdf2 มีตั้งแต่ –2,000 bp ถึง +100 bp ของ TSS ถูกขยายจากเซลล์ NK ของหนูและโคลนเป็น apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) เพื่อสร้าง apGL{ {5}}พลาสมิดของนักข่าว Ythdf2 เซลล์ HEK293T ที่ซื้อจาก ATCC ได้รับการ cotransfected ด้วยพลาสมิดของนักข่าว pGL 4- Ythdf2 รวมถึงพลาสมิดที่มีการแสดงออกมากเกินไปของ STAT5a หรือ STAT5b หรือเวกเตอร์ anempty ร่วมกับพลาสมิดของนักข่าว pRL-TK Renilla (Promega) เพื่อทำให้ประสิทธิภาพการแปลงสภาพเป็นมาตรฐาน เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวเพื่อการสลายเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟคชัน และลูซิเฟอร์เนสแอกติวิตีถูกหาปริมาณฟลูออริเมทริกด้วย Dual-LuciferaseSystem (Promega) ลำดับไพรเมอร์สำหรับการโคลน Ythdf2promoter และพลาสมิดที่แสดงออกมากเกินไปของ STAT5a และ STAT5b แสดงอยู่ในตาราง S1

การตรวจ ChIP

การตรวจวิเคราะห์ ChIP ดำเนินการโดยใช้ชุด Pierce Magnetic ChIP (cat. no. 26157; Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสังเขป ananti – anti-phospho-Stat5 (Tyr694, cat. No. 9351; Cell Signaling Technologies) จำนวนเท่ากันหรือการควบคุม IgG กระต่ายปกติที่เกี่ยวข้องนั้นถูกใช้แยกกันเพื่อตกตะกอน DNA ที่เชื่อมโยงข้าม - คอมเพล็กซ์โปรตีนที่ได้มาจาก 5 × เซลล์ NK ปฐมภูมิของหนูเมาส์บริสุทธิ์ 106 เซลล์ซึ่งถูกบำบัดล่วงหน้าด้วย IL-15 (50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการกลับตัวของการเชื่อมขวาง DNA อิมมูโนพรีซิเพตโดยแอนติบอดีที่ระบุถูกทดสอบโดย qPCR ลำดับของไพรเมอร์ทั้งหมดแสดงอยู่ในตาราง S1

การสอบวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ภายนอกร่างกาย

ความเป็นพิษต่อเซลล์ภายนอกร่างกายของเซลล์ NK ได้รับการประเมินโดยการสอบวิเคราะห์ 51Crrelease มาตรฐาน เซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของเมาส์มีเซลล์ RMA-S (MHC class Ideficient) และเซลล์ RMA (MHC class I เพียงพอ) ซึ่งเป็นของขวัญจาก Andre´Veillette (McGill University, Montreal, Canada) ถูกนำมาใช้เซลล์ astarget หนูได้รับการรักษาด้วยการฉีด ip ของ polyinosinic: polycytidylic acid [poly (I: C); 200 ไมโครกรัม/หนู] เป็นเวลา 18 ชั่วโมง เซลล์ NK ที่ถูกกระตุ้นโพลี (I: C) ถูกแยกออกจากม้ามโดยใช้ชุดการแยกเซลล์ EasySepMouse NK (เทคโนโลยี STEMCELL) เซลล์ PurifiedNK ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์เป้าหมายที่อัตราส่วน 5:1, 2.5:1 และ 1.25:1 โดยมี IL-2 (50 U/มล.)

m6A-seq

เซลล์ม้ามโตที่บริสุทธิ์ถูกขยายโดย IL-2 (1,000 U/ml,cat. no. Bulk Ro 23-6019; สถาบันมะเร็งแห่งชาติ) ในหลอดทดลอง เป็นเวลา 7 วัน RNA ทั้งหมดถูกแยกได้โดยรีเอเจนต์ TRIzol (เทอร์โมฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์) จากเซลล์ NK ที่ขยาย 50 ล้าน IL -2 Polyadenylated RNA ได้รับการเสริมประสิทธิภาพเพิ่มเติมจาก RNA ทั้งหมดโดยใช้Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen) ตัวอย่าง mRNA ถูกแยกส่วนออกเป็น 100- ส่วนยาวที่มีรีเอเจนต์การแตกแฟรกเมนต์ RNA (Invitrogen)

mRNA แบบแยกส่วน (5 µgmRNA) ถูกใช้สำหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน m6A โดยใช้ m6Aantibody (202003; Synaptic) ตามเกณฑ์วิธีมาตรฐานของ Magna MeRIP m6A Kit (เมอร์ค มิลลิพอร์) RNA ได้รับการเสริมประสิทธิภาพด้วย RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) สำหรับการสร้างห้องสมุดด้วย KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) การหาลำดับถูกดำเนินการที่ศูนย์จีโนมิกส์ของเมืองแห่งโฮปบนเครื่อง Illumina HiSeq 2500 พร้อมโหมดอ่านเดี่ยว 50-bp การอ่านลำดับถูกแมปกับ mousegenome โดยใช้ซอฟต์แวร์ HISAT2 v101 (Kim et al., 2015)

Mappedreads ของ immunoprecipitation และไลบรารีอินพุตจัดทำขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ R exomePeak (Meng et al., 2014) m6Apeaks ถูกมองเห็นโดยใช้ซอฟต์แวร์ Integrative Genomics Viewer (//www.igv.org) แม่ลายที่มีผลผูกพัน m6A ได้รับการวิเคราะห์โดย MEME (https://meme-suite.org) และ HOMER (//homer.ucsd.edu/homer/motif) ยอดเขาที่เรียกว่าถูกใส่คำอธิบายประกอบโดยจุดตัดกับสถาปัตยกรรมของยีนโดยใช้ Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015)

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (เปลี่ยนพับ)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

เซลล์ NK ที่ถูกขยาย 50 ล้าน IL-2 ถูกเก็บเกี่ยวและล้างสองครั้งด้วย PBS เย็น และเม็ดเซลล์ถูกสลายด้วยบัฟเฟอร์ออฟไลซิส 2 ปริมาตร (เฮปส์ 10 มิลลิโมลาร์, pH 7.6, 150 mM KCl, EDTA 2 มิลลิโมลาร์, NP 0.5% -40, ไดไทโอไทรอิทอล 0.5 มิลลิโมลาร์, สารยับยั้งโปรตีเอส 1:100 ค็อกเทล [Thermo Fisher Scientific] และ 400 U/ml SUPERase-In RNase Inhibitor [Thermo Fisher Scientific])

ไลเซตถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีและปั่นแยกเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อเคลียร์เทไลเซต บันทึกปริมาตรเซลล์ lysate หนึ่งในสิบเป็นอินพุต ส่วนที่เหลือของเซลล์ไลเซตถูกบ่มด้วยแอนติ-YTHDF2 5 ไมโครกรัม (cat.no. RN123PW; MBL) ที่ควบคู่กับเม็ดบีดแม่เหล็กโปรตีน A (cat. no. 10001D; Invitrogen) ที่ 4 องศา เป็นเวลา 2 ชั่วโมง โดยหมุนเบาๆ หลังจากนั้น เม็ดบีดถูกล้างห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์ล้างน้ำแข็ง 1 มิลลิลิตร (HEPES 50 มิลลิโมลาร์, pH 7.6,200 มิลลิโมลาร์ NaCl, EDTA 2 มิลลิโมลาร์, 0.05% NP-40, ไดไทโอไทรทอล 0.5 มิลลิโมลาร์ และ RNase 200 U/มิลลิลิตร สารยับยั้ง)

ตัวอย่างที่มีการตกตะกอนโดยภูมิคุ้มกันจะถูกย่อยด้วยโปรตีน Proteinase K ในบัฟเฟอร์ล้างที่เสริมด้วย 1% SDS และ 2 มก./มล. Proteinase K (ThermoFisher Scientific) บ่มด้วยการเขย่าที่ 1,200 รอบต่อนาทีที่ 55 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากทั้งอินพุตและ RNA ที่ถูกกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยการเติมรีเอเจนต์ TRIzol 5 ปริมาตร ตามด้วย Direct-zol RNA Miniprep (การวิจัยของ Zymo)

ไลบรารี cDNA ถูกสร้างขึ้นด้วย KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) และจัดลำดับบนแพลตฟอร์ม Illumina HiSeq 2500 ผลลัพธ์การโทรสูงสุดที่มีการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันและไลบรารีอินพุตถูกสร้างขึ้นโดยแพ็คเกจ R RIPSeeker (Li et al., 2013) โฮเมอร์ถูกใช้เพื่อค้นหาลวดลายของการกระจายข้อมูลในพื้นที่พีค พีคที่ถูกเรียกว่านั้นถูกใส่คำอธิบายประกอบโดยจุดตัดกับสถาปัตยกรรมยีนและการถอดเสียงโดยใช้ ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010)

การทดสอบความเสถียรของ mRNA

เซลล์ม้ามโตที่บริสุทธิ์จากหนู Ythdf2ΔNK และ Ythdf2WT ได้รับการเพาะเลี้ยงด้วย IL-15 (50 ng/ml) หลังจากการเพาะเลี้ยง 3 วัน เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยแอคติโนมัยซิน D (5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, cat. no. A9415; Sigma) ตามเวลาที่ระบุ เซลล์ที่ไม่มีการบำบัดถูกใช้ที่ 0 ชั่วโมง เซลล์ถูกรวบรวมตามเวลาที่ระบุ และ RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์สำหรับ qPCR ครึ่งชีวิต mRNA คำนวณโดยใช้วิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Weng และคณะ (2018) ลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตาราง S1

การวิเคราะห์ฐานข้อมูลออนไลน์

เราใช้ทรัพยากรออนไลน์ BioGPS (//biogps.org) เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกเฉพาะเนื้อเยื่อของ Ythdf2 ชุด RNA-seqdata มาจาก GEO ภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติ GSE106138,GSE113214 และ GSE25672 ข้อมูลที่ทำให้เป็นมาตรฐานจากการวิเคราะห์ RNA-seq ถูกส่งออก และการแสดงออกของยีน z-score ถูกแสดงเป็นภาพด้วยฟังก์ชัน Heatmap.2 ภายใน gplots Rlibrary

สถิติ

การทดสอบทีของนักเรียนที่ไม่ได้จับคู่ (แบบสองด้าน) ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวหรือสองทางดำเนินการเมื่อมีการเปรียบเทียบกลุ่มอิสระสามกลุ่มขึ้นไป ค่า P ได้รับการปรับสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการโดยใช้ขั้นตอน Holm-Sˇ´ıdak P < 0.05 ได้รับการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญ *, P < {{10}}.05; **, พี < 0.01; และ ***, P < 0.001

วัสดุเสริมออนไลน์

รูปที่ S1 แสดงระดับโปรตีนของ YTHDF2 ในเซลล์ภูมิคุ้มกัน ซึ่งรวมถึงเซลล์ NK เพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้น IL-15 การติดเชื้อ MCMV และการลุกลามของเนื้องอก การสร้างหนูที่มีการลบเฉพาะ NKcell ของ Ythdf2 รูปที่ S2 แสดงระดับของไวรัสในม้ามและตับจากหนูที่ติดเชื้อ MCMV และเปอร์เซ็นต์และจำนวนสัมบูรณ์ของ Ly49H+ และ/หรือ Ly49D+ NKcells ในหนูที่ติดเชื้อ MCMV รูปที่ S3 แสดงการแพร่กระจาย การอยู่รอด การสุกแก่ และการแสดงออกของตัวรับการเปิดใช้งานและการยับยั้งของเซลล์ NK จากหนู Ythdf2WT และ Ythdf2ΔNK รูปที่ S4 แสดงการควบคุมการแสดงออกของ YTHDF2 โดยการส่งสัญญาณ IL-15-STAT5 และการแสดงออกของส่วนประกอบของตัวรับ IL-15, วิถีทาง PI3K–AKT และวิถีทาง MEK–ERK ในเซลล์ NK จาก Ythdf2WT และ Ythdf2ΔNK หนู รูปที่ S5 แสดงชุดตรวจ RNA-seq, m6A-seq และ RIP-seq ทั่วทั้งสคริปต์ในเซลล์ NK ตารางที่ S1 แสดงรายการไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา

ความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูล RNA-seq, m6A-seq และ RIP-seq ถูกฝากไว้ในศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ GEO ภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติ GSE174027. ข้อมูลที่เหลือที่สนับสนุนการค้นพบของการศึกษานี้มีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องเมื่อมีการร้องขอ

รับทราบ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 และ CA210087), สมาคมมะเร็งเม็ดเลือดขาวและมะเร็งต่อมน้ำเหลือง (1364-19), สถาบันเวชศาสตร์ฟื้นฟูแห่งแคลิฟอร์เนีย (DISC2COVID{{ 9}}) และรางวัลโครงการยอดเยี่ยมประจำปี 2021 ของ Breast Cancer Alliance งานนี้ยังได้รับการสนับสนุนบางส่วนจาก USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843)

การมีส่วนร่วมของผู้เขียน: S. Ma, J. Yu และ MA Caligiuri คิดและออกแบบโครงการ S. Ma, J. Yan, J. Zhang และ J. หยูทำการทดลองและ/หรือวิเคราะห์ข้อมูล Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun และ J. Chen ให้การสนับสนุนรีเอเจนต์และวัสดุ S. Ma, J. Yu, J. Chen และ MA Caligiuri เขียน ทบทวน และ/หรือแก้ไขบทความนี้ ผู้เขียนทุกคนหารือเกี่ยวกับผลลัพธ์และแสดงความคิดเห็นเกี่ยวกับต้นฉบับ

การเปิดเผย: J. Chen รายงาน "อื่นๆ" จาก Genovel BiotechCorp นอกเหนือจากงานที่ส่งมาและเป็นผู้ก่อตั้งทางวิทยาศาสตร์ของ Genovel Biotech Corp. และเป็นที่ปรึกษาทางวิทยาศาสตร์ด้านเนื้องอกวิทยาทางเชื้อชาติ ไม่มีการรายงานการเปิดเผยอื่นๆ

อ้างอิง

1.Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill และ LL Lanier 2545 การจดจำโดยตรงของ cytomegalovirus โดยการเปิดใช้งานและยับยั้งตัวรับ NKcell ศาสตร์. 296:1323–1326.

2.Ayala, YM, T. Misteli และ FE Baralle 2008. TDP-43 ควบคุมฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีนเรติโนบลาสโตมา ผ่านการปราบปรามการแสดงออกของไคเนส 6 ที่ขึ้นกับไซคลิน โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา. 105:3785–3789.

3.บาร์บิเอรี, ไอ., เค. ทเซเลปิส, แอล. ปานโดลฟินี, เจ. ชิ, ก. มิลลาน-แซมบราโน, เอสซี ร็อบสัน, 'ดี. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han และคณะ 2017 METTL3 ที่มีขอบเขตโปรโมเตอร์รักษามะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดไมอีลอยด์โดยการควบคุมการแปลที่ขึ้นกับ m6A ธรรมชาติ. 552:126–131.

4.เบ็คเนลล์ บี. และแมสซาชูเซตส์ คาลิจิอูรี 2005. อินเตอร์ลิวคิน-2 อินเตอร์ลิวคิน-15 และบทบาทในเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติของมนุษย์ โฆษณา อิมมูนอล. 86:209–239.

5.แบร์โตลี, ซี., เจเอ็ม สโกเธม และอาร์เอ เดอ บรูอิน 2013. การควบคุมการถอดรหัสวัฏจักรของเซลล์ระหว่างระยะ G1 และ S แนท. สาธุคุณโมล เซลล์ไบโอล 14:518–528.

6.เบซแมน, NA, ซีซี คิม, เจซี ซัน, จี. มิน-อู, DW เฮนดริกส์, วาย. คามิมูระ, JA Best, AW Goldrath และ LL Lanier สมาคมโครงการจีโนมภูมิคุ้มกัน 2555. คำจำกัดความระดับโมเลกุลของอัตลักษณ์และการกระตุ้นเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ. แนท. อิมมูนอล. 13:1000–1009.

7.คาร์สัน, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein และ MA Caligiuri 1994. Interleukin (IL) 15 เป็นไซโตไคน์ชนิดใหม่ที่กระตุ้นเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติของมนุษย์ผ่านส่วนประกอบของตัวรับ IL-2 เจ.ประสบการณ์ ยา 180:1395–1403.

8.คาร์สัน, วีอี, ทีเอ เฟห์นิเกอร์, เอส. ฮัลดาร์, เค. เอคเฮิร์ต, เอ็มเจ ลินเดมันน์, ซีเอฟ ไล, ซีเอ็ม โครเช, เอช. เบามันน์ และเอ็มเอ คาลิจิอูรี 1997. บทบาทที่เป็นไปได้ของอินเตอร์ลิวคิน-15 ในการควบคุมการอยู่รอดของเซลล์เพชฌฆาตตามธรรมชาติของมนุษย์ คลินิก. ลงทุน. 99:937–943.

9.ชาน, ซีเจ, เอ็มเจ สมิต และแอล. มาร์ติเน็ต 2557. กลไกระดับโมเลกุลของการกระตุ้นเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติเพื่อตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์. การตายของเซลล์แตกต่าง 21:5–14.

10.Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H.Wang, L. Yi, และคณะ 2559 การบำบัดแบบผสมผสานของเซลล์ EGFR-CAR NK และไวรัสเริม oncolytic 1 สำหรับการแพร่กระจายของสมองมะเร็งเต้านม Oncotarget 7:27764–27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com