ผลการป้องกันของ Quercetin ต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ได้รับบาดเจ็บจากภาวะขาดออกซิเจนและออกซิเจนในเลือด

ติดต่อสอบถามข้อมูลเพิ่มเติมtina.xiang@wecistanche.com

พื้นหลัง: โรคหลอดเลือดขนาดเล็กในสมอง (CSVD) เป็นกลุ่มอาการทางคลินิกที่ครอบคลุมกระบวนการทางพยาธิวิทยาทั้งหมดของหลอดเลือดขนาดเล็กในสมอง ซึ่งอาจทำให้เกิดโรคหลอดเลือดสมองและภาวะสมองเสื่อมอย่างรุนแรง อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการเกิดโรคของ CSVD ไม่ชัดเจน การรักษาจึงมีจำกัด ความผิดปกติของเซลล์บุผนังหลอดเลือดเกิดขึ้นเร็วกว่าอาการทางคลินิก เช่น ความดันโลหิตสูงและมะเร็งเม็ดเลือดขาว ดังนั้นการรักษาเซลล์บุผนังหลอดเลือดจึงคาดว่าจะเป็นความก้าวหน้าครั้งใหม่เควอซิทินฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่ในพืชหลายชนิด มีหน้าที่ต่อต้านการอักเสบและต่อต้านอนุมูลอิสระ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลการป้องกันของเควอซิทินต่อการบาดเจ็บของเซลล์บุผนังหลอดเลือด และจัดทำทฤษฎีพื้นฐานสำหรับการประยุกต์ใช้ในภายหลังในคลินิก

วิธีการ: เซลล์บุผนังหลอดเลือดขนาดเล็กในสมองของมนุษย์ (HBMEC) ได้รับการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง และแบบจำลองการบาดเจ็บของเซลล์บุผนังหลอดเลือดถูกสร้างขึ้นโดยภาวะขาดออกซิเจนและออกซิเจนในเลือด (H/R) การศึกษาผลการป้องกันของ quercetin ต่อ HBMECs จากมุมมองของความมีชีวิตของเซลล์ การย้ายเซลล์ การสร้างเส้นเลือดใหม่ และการตายของเซลล์ เพื่อศึกษากลไกของเควอซิทินต่อไปความเครียดออกซิเดชันและวิเคราะห์ความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม นอกจากนี้ยังมีการศึกษาความสมบูรณ์ของสิ่งกีดขวางเลือดและสมอง (BBB)

ผลลัพธ์: เควอซิทินสามารถส่งเสริมการมีชีวิต การย้ายถิ่น และการสร้างเส้นเลือดใหม่ของ HBMEC และยับยั้งการตายของเซลล์ นอกจากนี้ เควอซิทินยังสามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ Keap1/Nrf2 ลดการแสดงออกของโปรตีน ATF6/GRP78 การศึกษาเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าเควอซิทินสามารถเพิ่มการแสดงออกของ Claudin-5 และ Zonula occludens-1

บทสรุป: การทดลองของเราแสดงให้เห็นว่าเควอซิทินสามารถปกป้อง HBMEC จาก H/R ซึ่งประกอบด้วยการส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ การย้ายเซลล์ และการสร้างเส้นเลือดใหม่ ซึ่งช่วยลดความเสียหายที่อาจเกิดขึ้นกับเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและยับยั้งการตายของเซลล์ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการต้านอนุมูลอิสระและการยับยั้งความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม ในเวลาเดียวกัน quercetin สามารถเพิ่มระดับของ BBB connexin ซึ่งบ่งชี้ว่า quercetin สามารถรักษาความสมบูรณ์ของ BBB ได้

คีย์เวิร์ด: โรคหลอดเลือดขนาดเล็กในสมอง, เซลล์บุผนังหลอดเลือด, เควอซิทิน, ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน, ความเครียดจากเอ็นโดพลาสมิกเรติคิวลัม, สิ่งกีดขวางเลือดและสมอง

การแนะนำ

โรคหลอดเลือดสมองเล็ก(CSVD) เป็นศัพท์เฉพาะที่ครอบคลุมกระบวนการทางพยาธิวิทยาทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับหลอดเลือดขนาดเล็กในสมองและหมายถึงกลุ่มอาการทางคลินิก การถ่ายภาพ และพยาธิสภาพที่มีสาเหตุต่างๆ ที่มีหลอดเลือดแดงในกะโหลกศีรษะถึง venules (เส้นผ่านศูนย์กลาง)<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

เควอซิทินเป็นฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่ในพืชหลายชนิด เช่น Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc มีสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการอักเสบที่แข็งแกร่ง และสามารถออกแรงป้องกันในสภาวะทางพยาธิวิทยาต่างๆ รวมถึงโรคหลอดเลือดหัวใจ ความผิดปกติของการเผาผลาญ โรคทางระบบประสาท เบาหวาน มะเร็ง และโรคอ้วน (Dok-Go et al,2003; Comalada et al,2005; โช et al,2006). การปรับสภาพด้วย quercetin ช่วยเพิ่มระดับการแสดงออกของเอ็นไซม์สารต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ประสาทแบบเสี้ยมของ hippocampal CA1 ของสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจากการขาดเลือด ซึ่งแสดงสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งและผลกระทบต่อระบบประสาท(Chen et al,2017) การศึกษาล่าสุดยังพบว่าเควอซิทินมีผลป้องกันระบบประสาทต่อการบาดเจ็บจากการขาดเลือดในขณะที่ยังคงความสมบูรณ์ของ BBB (Jin et al, 2019) อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการศึกษาผลกระทบต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดขนาดเล็กในสมอง (BMECs) ภายใต้การบาดเจ็บจากการขาดออกซิเจนและออกซิเจนในเลือด (H/R) และไม่มีรายงานการศึกษาโปรตีนเป้าหมายของ quercetin ที่ปกป้อง BMECs

ในการศึกษาของเรา เราได้สำรวจผลการป้องกันของเควอซิทินต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดขนาดเล็กในสมองของมนุษย์ (HBMECs) ที่ได้รับบาดเจ็บจาก H/R ในวัฒนธรรม ในเวลาเดียวกัน เราได้ศึกษากลไกที่เป็นไปได้ของผลการป้องกันของมันเพิ่มเติม เพื่อให้เป็นพื้นฐานทางทฤษฎีมากขึ้นสำหรับการส่งเสริมเคอร์ซิตินทางคลินิก และให้แนวคิดใหม่ในการรักษา CSVD

วัสดุและวิธีการ

สื่อ รีเอเจนต์ และแอนติบอดี

เควอซิทิน(purity>ร้อยละ 98 ได้มาจาก Best Biological Technology Co, Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) HBMEC ซื้อมาจาก Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) เซรั่มโคของทารกในครรภ์ (FBS) ได้มาจากอุตสาหกรรมชีวภาพ (Kibbutz Beit Haemek, Israel) ซื้อ Penicillin/streptomycin และ Dulbecco's modified eagle (DMEM) จาก Hyclone (GA, United States) ชุดทดสอบศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (JC-1), ชุดทดสอบโปรตีน BCA, 2,7-ไดคลอไรด์-ไฮโดรฟลูออเรสซินไดอะซิเตต (DCFH-DA) และไลเสต NP40 ถูกซื้อมาจากเทคโนโลยีชีวภาพบีโยไทม์ (เซียงไฮ้ประเทศจีน). ซื้อการเตรียมฟอสฟาเตสและสารยับยั้งโปรตีเอสที่สมบูรณ์จากโรช (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) Apoptosis Kit ซื้อมาจาก BD Biosciences (Sparks, MD, United States) Malondialdehyde (MDA), Superoxide dismutase (SOD), โมเลกุลการยึดเกาะของเซลล์ระหว่างเซลล์-1 (ICAM-1), โมเลกุลการยึดเกาะของเซลล์หลอดเลือด-1 (VCAM{{10}} )enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) คือ (Cambridge, Abcam ซื้อบริษัท dfrom1" 一United Kingdom) แอนติบอดีต่อ Nuclear factor E2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2(Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), การเปิดใช้งานปัจจัยการถอดรหัส 6(ATF6), โปรตีนควบคุมกลูโคส 78(GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology (Danvers, United States) Horseradish peroxidase (HRP) - conjugated anti-rabbit IgG ได้รับจากบริษัท Jackson (เพนซิลเวเนีย ประเทศสหรัฐอเมริกา) ชุดจ่ายอย่างรวดเร็ว SDS-PAGE และสารละลาย ECL chromogenic ถูกซื้อจาก EpiZyme Biotechnology (Shanghai, China) การเพาะเลี้ยงเซลล์และแบบจำลองการบาดเจ็บ HBMECs เพาะเลี้ยงใน DMEM ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ และ penicillin-streptomycin 1 เปอร์เซ็นต์ ที่ 37Cincubator ด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เพื่อทำให้เกิด endothel ความเสียหายของเซลล์ ial, HBMECs ได้รับการรักษาด้วยการขาดออกซิเจน 12 ชั่วโมง ตามด้วยการให้ออกซิเจนอีกครั้ง 8 ชั่วโมง, และขั้นตอนเฉพาะมีดังนี้ (Warpsinski et al.,2020): HBMECs ถูกฟักครั้งแรกด้วยสื่อที่ปราศจากซีรัมในตู้ฟักไข่ (1 เปอร์เซ็นต์) O,5 เปอร์เซ็นต์ CO.94 เปอร์เซ็นต์ N) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้นสื่อถูกเปลี่ยนเป็นอาหารปกติที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่พวกมันถูกบ่มในตู้ฟักไข่นอร์ม็อกเซีย (95 เปอร์เซ็นต์ O2,5 เปอร์เซ็นต์ CO2) เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การบำบัดด้วยเควอซิทิน 2 มก. เควอซิทินถูกละลายใน 331μL DMSO เพื่อสร้างสารละลายสต็อกที่มีความเข้มข้น 1 มิลลิโมล/ลิตร และเก็บไว้ที่-20 องศาดีกรี สารละลายทำงานถูกเจือจางเป็น 0.1,0.5,1,2,5,10umol/L ด้วย DMEM ซึ่งเปอร์เซ็นต์ของ DMSO ต่ำกว่า 0.1 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเซลล์ได้รับการเกาะติดกันแล้ว เควอซิทินที่มีตัวกลางที่ปราศจากซีรัมก็ถูกเติม และต่อมาก็นำเพลตไปใส่ในตู้ฟักตัวที่ขาดออกซิเจน หลังจากผ่านไป 12 ชั่วโมง เซลล์จะถูกลบออก เปลี่ยนเป็นเควอซิตินที่มีสื่อในซีรัม และใส่ในตู้ฟักไข่นอร์ม็อกเซียเป็นเวลา 8 ชั่วโมง

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ผลกระทบของเควอซิทินเกี่ยวกับความมีชีวิตของ HBMEC ถูกตรวจสอบโดย Cell Counting Kit-8 ตามคู่มือของผู้ปฏิบัติงาน ปริมาณ quercetin ที่ปลอดภัยต่อเซลล์ในกรณีที่ไม่มีความเสียหายต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้รับการประเมินก่อน จากนั้นจึงทดสอบผลการป้องกันของเคอร์ซิตินในสภาพของความเสียหายของเซลล์ ผลการทดลองทั้งหมดถูกทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง

การทดสอบการย้ายถิ่นโดยวิธีรักษาการขีดข่วนและการสร้างหลอดได้ดำเนินการโดยใช้วิธีการขูดเซลล์ ก่อนการบำบัดด้วยเควอซิทิน เส้นตั้งฉากตรงถูกวาดที่ด้านล่างของจานเพาะเชื้อและถ่ายภาพเพื่อบันทึกเป็นเวลา 0 ชั่วโมง และต่อมาเซลล์ได้รับการบำบัดด้วยเควอซิทินและการสร้างแบบจำลองก่อนที่จะถ่ายภาพเพื่อบันทึก บริเวณด้านหน้าและด้านหลังถูกเปรียบเทียบสองครั้ง

การก่อรูปหลอดซึ่งเลียนแบบความสามารถในการสร้างเส้นเลือดใหม่ของเซลล์ Matrigel (9-12มก./มล.) ถูกวางไว้ที่ด้านล่างของจานเพาะเชื้อ จากนั้นเควอซิทินและเซลล์ที่บำบัดด้วยการสร้างแบบจำลองถูกเคลือบไว้ด้านบน หลังจาก 8 ชั่วโมง ถ่ายภาพ วิเคราะห์การสร้างเส้นเลือดแตกแขนงและเปรียบเทียบโดยใช้ ImageJ

ศักยภาพของเมมเบรนยลและการทดสอบการตายของเซลล์

การเปลี่ยนแปลงศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและชุดอะพอพโทซิสถูกใช้เพื่อตรวจหาการตายของเซลล์ ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงของศักย์ของเยื่อไมโทคอนเดรียโดยการย้อม HBMEC ด้วยโพรบฟลูออเรสเซนต์ JC-1 JC-1(1×)staining working solution ถูกเติมและบ่มในเครื่องบ่มเพาะ 37 องศาเป็นเวลา 20 นาทีก่อนที่จะถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์การย้อมสี JC-1(1×) และสุดท้ายเพิ่มในแต่ละหลุมสำหรับ PBS . จากนั้นจึงใช้อิมเมจเซลล์ที่มีเนื้อหาสูงสำหรับการวิเคราะห์

HBMEC ถูกเก็บรวบรวมจากเพลต 6-หลุม, หมุนเหวี่ยงเพื่อขจัดส่วนลอยเหนือตะกอน, ต่อมาเพิ่ม 1 × สารละลายยึดเกาะ Annexin V เพื่อเป่าและผสมเซลล์, จากนั้นจึงเติมสีย้อม FITC Annexin V เพื่อฟักตัวในความมืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที เติมสารละลายการย้อมสีโพรพิเดียม ไอโอไดด์ (PI) ก่อนเครื่อง 5 นาที และใช้เครื่องวัดการไหลของเบ็คแมนในการตรวจจับ

ELISA

หลังจากที่เซลล์ถูกบำบัดด้วย H/R หรือเควอซิทิน ส่วนที่ลอยอยู่เหนือตะกอนถูกรวบรวม ตรวจพบ ICAM-1, VCAM-1, SOD และ MDA โดยใช้ชุดอุปกรณ์ ELSA ตามคู่มือการใช้งาน

Reactive Oxygen Species (ROS) Assay ความสามารถในการสร้าง ROS ถูกตรวจพบโดยโพรบ DCFH-DA ซึ่งได้รับการประเมินโดยตัวสร้างภาพเซลล์ที่มีเนื้อหาสูง และวิเคราะห์โดยการเรืองแสงโดยใช้ ImageJ ซับตะวันตก

HBMEC ถูกรวบรวมจากเพลตเพาะเลี้ยง NP40 lysate ที่เติมการเตรียมฟอสฟาเตสและตัวยับยั้งโปรตีเอสที่สมบูรณ์ถูกใช้เพื่อแยกโปรตีนออกจากเซลล์ ปริมาณโปรตีนถูกกำหนดหาและนำโปรตีน 30ug ไปใช้เพื่อการทดลองสร้างภูมิคุ้มกัน เจล SDS-PAGE ใช้สำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส โดยปิดกั้นด้วยนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ หลังจากผ่านกระบวนการอิเล็กโทรดไปยังเมมเบรน PVDF เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนตี้-Nrf2(rabbit, 1:1,000),anti-Keapl(rabbit,1:1,000),anti-ATF6(rabbit,1:1,000 ), แอนตี้-GRP78(กระต่าย,1:1,000), แอนตี้-ZO-1(กระต่าย,1:1,000), แอนตี้-Claudin-5( กระต่าย,1:1,000) แอนติบอดีถูกบ่มข้ามคืนที่ 4C หลังจากล้างในวันถัดไป แอนติบอดีทุติยภูมิของ Goat ที่ต่อต้านกระต่ายที่เจือจางแล้ว (IgG HRP, 1:10,000) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในที่สุด การตรวจจับได้รับการพัฒนาหลังจากล้างสามครั้งใน TBST

การวิเคราะห์โปรตีน

HBMEC ถูกบำบัดด้วย H/R ต่อหน้าเคอร์ซิติน (l umol/L) ต่อจากนั้น เซลล์ถูกขูดเบาๆ จากจานเพาะเชื้อด้วยเครื่องขูดเซลล์ รวบรวมในตู้แช่เยือกแข็ง วางอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ -80 องศาเป็นเวลา 5 นาที เทคโนโลยี iTRAQ ถูกนำมาใช้เพื่อทำการวิเคราะห์โปรตีโอมิก โปรตีนที่มีค่า p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 หรือ<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลพอดีกับการกระจายตัวแบบปกติ และค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานถูกใช้เพื่อแสดงข้อมูล GraphPad Prism 8 ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ ตัวอย่างอิสระสองตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดย t-test และข้อมูลการวัดถูกอธิบายโดยค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มดำเนินการโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) p-value<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

ผลลัพธ์

ผลลัพธ์

ผลของเควอซิทินต่อความมีชีวิตของเซลล์

เพื่อทดสอบผลของ quercetin ต่อความมีชีวิตของเซลล์ ก่อนอื่นเราได้ตรวจสอบขนาดยาที่ปลอดภัยของ quercetin ในเซลล์ ดังแสดงในรูปที่ 1A ซึ่งไม่มีผลกระทบต่อความมีชีวิตของเซลล์ที่ 01-10 umol/L . ต่อไป สำหรับการค้นหาขนาดยาที่มีประสิทธิภาพโดยพิจารณาจากความเสียหายของเซลล์บุผนังหลอดเลือด เราพบว่าเควอซิตินที่ 01-1 ไมโครโมล/ลิตรสามารถส่งเสริมความมีชีวิตของเซลล์ใน H/R-HBMEC ดังแสดงในรูป 1ข. การทดลองที่ตามมาได้ดำเนินการในช่วงความเข้มข้นนี้ เป็นที่น่าสังเกตว่าเมื่อความเข้มข้นของยาถึง 10 ไมโครโมล/ลิตร จะมีความเป็นพิษต่อเซลล์ เราคิดว่าเมื่อ HBMEC เสียหายจาก H/R ความคลาดเคลื่อนจะลดลง ดังนั้นเมื่อความเข้มข้นของยาสูงขึ้นเล็กน้อย ความเสียหายต่อเซลล์ก็เพิ่มขึ้น ดังนั้น ความเป็นพิษต่อเซลล์จึงเกิดขึ้นเมื่อความเข้มข้นของยาเท่ากับ 10 ไมโครโมล/ลิตร

ผลของ Quercetin ต่อการย้ายเซลล์และการสร้างเส้นเลือดใหม่

เพื่อตรวจสอบผลของ quercetin ต่อความสามารถในการเคลื่อนย้ายและการสร้างเส้นเลือดใหม่ของเซลล์บุผนังหลอดเลือด HBMECs ต้องได้รับการรักษาด้วย H/R ในขณะที่ให้ quercetin เราทำการทดสอบรอยขีดข่วนเพื่อทดสอบความสามารถในการย้ายเซลล์ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย H/R ทำให้ความสามารถในการย้ายของ H/R-HBMEC ลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และเควอซิทินสามารถส่งเสริมการย้ายเซลล์อย่างมีนัยสำคัญที่ความเข้มข้น 0 .1-1 ไมโครโมล/ลิตร Tubulogenesis ใช้เพื่อเลียนแบบการสร้างเส้นเลือดใหม่ ในหลอดทดลอง และความยาวของกิ่งก้านแสดงถึงความสามารถในการสร้างเส้นเลือดใหม่ ผลการศึกษาพบว่าการบำบัดด้วย H/R ส่งผลให้ความสามารถในการสร้างเส้นเลือดใหม่ลดลง แต่เควอซิติน 0.1-1 ไมโครโมล/ลิตรสามารถย้อนกลับอาการบาดเจ็บนี้ได้ ดังแสดงในรูปที่ 2

ผลของ Quercetin ต่อการตายของเซลล์

เพื่อทดสอบศักยภาพของเควอซิทินในการยับยั้งการตายของเซลล์บุผนังหลอดเลือด เราใช้ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและการตายของเซลล์ในการประเมิน เมื่อเซลล์ได้รับบาดเจ็บจากการเกิด apoptotic ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียลดลง การเรืองแสงสีแดงของไซโตพลาสซึมลดลงอย่างมีนัยสำคัญ การเรืองแสงสีเขียวเพิ่มขึ้น และในที่สุดก็นำสีแดง/สีเขียว (R/G) มาใช้เพื่อแสดงการเปลี่ยนแปลงศักยภาพของเมมเบรนของยล จะลดลงเมื่อศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียลดลง ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าหลังการรักษาด้วย H/R ศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ของไมโตคอนเดรียลดลง ตามที่ระบุโดยการเรืองแสงสีเขียวที่เพิ่มขึ้น ด้วยปริมาณที่เพิ่มขึ้นของเควอซิทิน การเรืองแสงสีแดงได้รับการปรับปรุงอย่างต่อเนื่อง ซึ่งบ่งชี้ว่าเควอซิทินสามารถยกระดับศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียขึ้นกับขนาดยาได้ (รูปที่ 3A, C) นอกจากนี้ Flow cytometry ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการตายของเซลล์โดยตรง ผลการศึกษาพบว่า HBMEC มีอัตราการตายแบบอะพอพโทซิสที่สูงขึ้นหลังการบำบัดด้วย H/R ในขณะที่เควอซิทินที่ 01-1 umol/L แสดงความสามารถที่ชัดเจนในการยับยั้งการตายของเซลล์ (รูปที่ 3B, D)

ผลของเควอซิทินต่อการยึดเกาะของเซลล์

เมื่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้รับความเสียหาย จะมีการผลิตโมเลกุลยึดเกาะบางอย่าง เช่น ICAM{0}} และ VCAM-1 ดูดซับสารพิษเข้าสู่ BBB และทำให้เนื้อเยื่อสมองเสียหาย (Hauptmann et al,2020 ) เพื่อตรวจสอบผลของเควอซิทินต่อความสามารถของ H/R-HBMEC ในการผลิตโมเลกุลการยึดเกาะ ICAM-1 และ VCAM-1 ถูกวัดโดยใช้ ELISA ในการศึกษาของเรา H/R ส่งผลให้ระดับ ICAM-1 และ VCAM-1 เพิ่มขึ้น แต่การเพิ่ม quercetin ภายใต้ความเข้มข้น 01-1 umol/L ลดผลกระทบนี้ (รูปที่ 4).

เควอซิทินสามารถยับยั้งความเครียดออกซิเดชันได้

เควอซิทินเป็นฟลาโวนอยด์ที่มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระสูง ดังนั้นเราจึงใช้หัววัด DCFH-DA เพื่อตรวจจับ ROS เราสังเกต

การสร้าง ROS เพิ่มขึ้นใน HBMEC ที่สัมผัสกับ H/R ซึ่งลดลงอย่างเห็นได้ชัดโดยการรักษาด้วย quercetin ที่ความเข้มข้น {{0}}1-1 umol/L ในขณะเดียวกัน เราตรวจพบการเปลี่ยนแปลงระดับของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ผลิตภัณฑ์ SOD และ MDA ด้วย ELISA และผลการศึกษาพบว่า quercetin ที่ความเข้มข้น 0.1-1 μmol/L สามารถลด SOD และ MDA ที่เพิ่มโดย H/R ได้ ซึ่งบ่งชี้ว่า quercetin สามารถลด ความเสียหายของ HBMEC จากความเครียดออกซิเดชัน (รูปที่ 5)

เควอซิทินสามารถควบคุมโปรตีน Keap1/Nrf2 และ ATF6/GRP78 ได้

เพื่อสำรวจกลไกการป้องกันของเควอซิทินใน HBMEC เพิ่มเติม เราได้วิเคราะห์ระดับการแสดงออกของความเครียดออกซิเดชันและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม Keap1/Nrf2 เป็นที่รู้จักกันในการควบคุมการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระในร่างกาย การบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันบังคับให้เซลล์บุผนังหลอดเลือดได้รับการตอบสนองต่อความเครียด ส่งผลให้ระดับ Keapl/Nrf2 เพิ่มขึ้น (Warpsinski et al, 2020) ในการศึกษานี้ H/R ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นกลไกการตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระในเซลล์และเพิ่มระดับของ Keapl และ Nrf2 ซึ่งสามารถเสริมให้เควอซิทินได้ที่ 0 5-1 umol/L เพื่อเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของ HBMEC .ATF6/GRP78 เป็นหนึ่งในวิถีทางที่ควบคุมสภาวะสมดุลของเอนโดพลาสมิก เรติคิวลัม (ER) ความเครียด ER สามารถทำให้เซลล์บุผนังหลอดเลือดบาดเจ็บรุนแรงขึ้นได้ (Nie et al, 2020) ในการศึกษาของเรา ความเครียด ER ถูกกระตุ้นโดย H/R และระดับของ ATF6 และ GRP78 เพิ่มขึ้น เควอซิทินที่ l umol/L สามารถลดระดับโปรตีนของทั้งสองอย่างมีนัยสำคัญ ยับยั้งความเครียดของ ER และปกป้อง HBMEC จากการบาดเจ็บของ H/R (รูปที่ 6)

เควอซิทินสามารถรักษาความสมบูรณ์ของ BBB ได้

BMEC เป็นกระดูกสันหลังของโครงสร้าง BBB และการเสียชีวิตหรือการตายของเซลล์หลังจากการบาดเจ็บของ H/R ส่งผลต่อความสมบูรณ์และการทำงานของ BBB (Ding et al,2019) ในบทความนี้ หน้าที่ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดสะท้อนให้เห็นโดยการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงในนิพจน์ ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ BBB ZO-1 และ Claudin-5 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม นิพจน์ของ ZO-1 และ Claudin-5 คือ

การบาดเจ็บ H/R ลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่า BBB ได้รับความเสียหายและความเสียหายนี้สามารถย้อนกลับได้โดย quercetin ที่ความเข้มข้น 05-1 μmol/L ซึ่งบ่งชี้ว่า quercetin สามารถรักษาการทำงานของเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้ (รูปที่ 7)

การวิเคราะห์โปรตีน

เพื่อค้นหาโปรตีนการแสดงออกที่แตกต่างกัน (DEPs) ของ H/R ที่ได้รับบาดเจ็บ HBMECs เมื่อมี quercetin หรือไม่ ITRAO ถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ โปรตีนแสดงap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 หรือ<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

อภิปรายผล

CSVD เป็นภาระทางการแพทย์และเศรษฐกิจและสังคมที่เพิ่มขึ้น ได้รับความสนใจอย่างรวดเร็ว แต่น่าประหลาดใจที่การเกิดโรคของ CSVD ยังคงคลุมเครืออยู่ในปัจจุบัน ทำให้ไม่มีแผนงานที่ชัดเจนสำหรับการรักษาเช่นกัน เนื่องจากระยะหลังของ CSVD สามารถพัฒนาไปสู่ผลลัพธ์ที่รุนแรง เช่น โรคหลอดเลือดสมองและภาวะสมองเสื่อม การกำหนดเป้าหมายที่รอยโรคในระยะเริ่มต้นสำหรับการรักษาสามารถชะลอการลุกลามของ CSVD ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (Cannistraro et al,2019) มีการแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาในช่วงต้นของ CSVD อยู่ในความผิดปกติของเซลล์บุผนังหลอดเลือดและยาที่ทำให้ความผิดปกติของมันคงที่อาจช่วยปรับปรุงช่องโหว่ของสารสีขาวในสมองในแผล CSVD(Rajani et al,2018) เมื่อพิจารณาถึงบทบาทของเซลล์บุผนังหลอดเลือดใน CSVD เราจึงเริ่มศึกษาผลการป้องกันของยาจีนโบราณที่มีต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยใช้ HBMEC

เควอซิทินเป็นฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่ในพืชหลายชนิด(Nawrot-Hadzik et al,2019). มีสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการอักเสบที่แข็งแกร่ง และสามารถออกแรงป้องกันในสภาวะทางพยาธิวิทยาต่างๆ ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่า quercetin สามารถทำให้อาการบาดเจ็บ H/R ดีขึ้นได้ และข้อมูลการทดลองหลายฉบับยืนยันข้อสรุปของเราว่า quercetin สามารถส่งเสริมความมีชีวิตของเซลล์ การย้ายเซลล์ การสร้างเส้นเลือดใหม่ เพิ่มศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรีย และยับยั้งการตายของเซลล์

เมื่อพิจารณาว่าเควอซิทินมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่รุนแรง เราจึงตรวจสอบกลไกที่เควอซิทินปกป้อง HBMEC ในแง่ของการต้านอนุมูลอิสระ ระดับ ROS สามารถเพิ่มขึ้นได้อย่างมีนัยสำคัญโดยความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Wu et al.,2018) และการสะสมของ ROS อาจทำให้เกิดโรคต่างๆ ได้ รวมถึงโรคหลอดเลือดหัวใจ ความผิดปกติของเยื่อบุผนังหลอดเลือดและโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ และโรคเกี่ยวกับระบบประสาท (Chen et al, 2015; Jakaria et al., 2018; Santos et al., 2018). นอกจากนี้ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันยังเกิดขึ้นในลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน ซึ่งทำให้เกิด MDA ซึ่งจะทำลายสมดุลของสารต้านอนุมูลอิสระออกซิเดชันของร่างกายและเพิ่มความเสียหายของเซลล์บุผนังหลอดเลือด (Yang et al, 2021)

Keapl/Nrf2 ถือเป็นวิถีทางความเครียดจากการต้านออกซิเดชันในตัวเองที่สำคัญที่สุดในปัจจุบัน และการกระตุ้นเส้นทางนี้สามารถปรับปรุงความผิดปกติของเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้อย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ROS ช่วยส่งเสริมการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2 (Selimoglu-Buet et al, 2017) เราได้แสดงให้เห็นว่า quercetin สามารถลดการสร้าง ROS และ MDA ในขณะที่เพิ่มการแสดงออกของโปรตีน Keapl และ Nrf2 ซึ่งบ่งชี้ว่า quercetin อาจลดการบาดเจ็บของเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยการลดการตอบสนองความเครียดออกซิเดชันผ่านการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ Keapl/Nrf2

ไม่เพียงเท่านั้น ความเครียด ER ที่คงอยู่จะกระตุ้นการตอบสนองของโปรตีนที่คลี่ออกและเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งนำไปสู่การตายของเซลล์บุผนังหลอดเลือด (Tang et al,2019) นอกจากนี้ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันยังสามารถทำให้เกิดการรบกวนของการพับโปรตีนใน ER กระตุ้นความเครียด ER และทำให้เซลล์บุผนังหลอดเลือดบาดเจ็บรุนแรงขึ้น (Hetz,2012) ความเครียด ER สามารถกระตุ้นได้ด้วยสามวิถีทางเหล่านี้: ER kinase(PERK) คล้าย PKR), อิโนซิทอลที่ต้องใช้เอนไซม์ 1 (IRE1) และ ATF-6 ที่กระตุ้น ซึ่งปกป้องเซลล์จากความเครียด ER ภายใต้สภาวะสภาวะสมดุล (Hetz et al ,2020). แต่เมื่อได้รับผลกระทบจากสิ่งเร้าภายนอก วิถีทั้งสามนี้จะกระตุ้นการตอบสนองความเครียดของ ER และกระตุ้นการตายของเซลล์ นอกจากนี้ จากการศึกษาพบว่าการยับยั้งการตอบสนองต่อความเครียดของ ER สามารถย้อนกลับการทำงานของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่เกิดจาก H/R ได้ (Chen et al,2020) ในการศึกษาของเรา quercetin สามารถลดเนื้อหา ATF6 / GRP78 ที่เพิ่มขึ้นที่เกิดจาก H / R ยับยั้ง การตอบสนองความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม และปกป้องเซลล์บุผนังหลอดเลือด

ในฐานะที่เป็นองค์ประกอบหลักของ BBB หน้าที่ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดรวมถึงการรักษาความสมบูรณ์ของเซลล์เหล่านั้น ความผิดปกติของ BBB ทำให้เกิดการรั่วไหลของของเหลว โปรตีน และส่วนประกอบอื่น ๆ ในพลาสมาในเนื้อเยื่อรอบ ๆ หลอดเลือด ทำให้การขยายหลอดเลือดในสมองลดลงและการขนส่งสารอาหาร (Wardlaw et al,2019) เมื่อเซลล์บุผนังหลอดเลือดเสียหายและความสมบูรณ์ของ BBB จะถูกทำลาย ดังนั้นการปกป้องเซลล์บุผนังหลอดเลือดจึงสามารถรักษาความสมบูรณ์ของ BBB ต่อไปได้ Claudin-5 แสดงออกอย่างมากใน BMEC และมีส่วนในการสร้างกระดูกสันหลังของสายเชื่อมต่อที่แน่นหนาเพื่อควบคุม การซึมผ่านของ BBB (Yang et al, 2020). เซลล์บุผนังหลอดเลือดถูกยึดกับโครงร่างโครงร่างของแอคตินโดยโปรตีนนั่งร้าน เช่น ZO-1 ทำให้เกิดรอยต่อที่แน่นหนาระหว่างเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่คงความหนาแน่นของ BBB (Zhang et al,2020) ในการศึกษาของเรา ใช้นิพจน์ของ claudin-5 และ ZO-1 เพื่อแสดงถึงความสมบูรณ์ของ BBB ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าระดับโปรตีนของ claudin-5 และ ZO-1 ลดลงใน HBMEC ที่ได้รับบาดเจ็บจาก H/R ซึ่งบ่งชี้ว่าความสมบูรณ์ของ BBB ถูกรบกวน และ quercetin สามารถลดการบาดเจ็บนี้ได้โดยการยก claudin{{ ระดับโปรตีน 9}} และ ZO 1

นอกจากนี้ เพื่อค้นหาเป้าหมายที่เป็นไปได้ของ quercetin บน HBMECs นั้น i-TRAQ จะถูกติดฉลากไว้ในเซลล์ หลังจากการวิเคราะห์โปรตีโอมิก ได้ตรวจสอบ 20 อันดับแรกของโปรตีนที่แสดงออกถึงความแตกต่างทั่วไป ในหมู่พวกเขา INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI เกี่ยวข้องกับเซลล์บุผนังหลอดเลือด INSRR ถือเป็นตัวบ่งชี้ที่บุผนังหลอดเลือดของเนื้องอก และการแสดงออกที่มากเกินไปสามารถส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดใหม่ (Nowak-Sliwinska et al,2019) Recombinant ANXA2 สามารถลดความสามารถในการซึมผ่านของเยื่อบุผนังหลอดเลือดได้ภายใต้สภาวะการบาดเจ็บของปัจจัยขาดออกซิเจนและการอักเสบ ซึ่งบ่งชี้ว่า ANXA2 อาจเกี่ยวข้องกับการรักษาความหนาแน่นของเซลล์บุผนังหลอดเลือด (Li et al,2019) ในการย้อมสีบริเวณปากมดลูกของมนุษย์ พบการแสดงออกที่รุนแรงของ DUSP3 ในเซลล์บุผนังหลอดเลือด และการทดลองยังแสดงให้เห็นว่า DUSP3 มีความจำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของหลอดเลือดขนาดเล็กที่เกิดจากไฟโบรบลาสต์ขั้นพื้นฐาน (Amand et al. 2014) การแสดงออกของ HBAl ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้รับการแสดงเพื่อควบคุมเสียงและการทำงานของหลอดเลือด (Sangwung et al.,2017) PGK1 ยังคิดว่าจะลดการเกิดหลอดเลือด (Zhang et al,2020) ยิ่งไปกว่านั้น VTN ยังถือว่ามีความสำคัญต่อการเกิดลิ่มเลือดอุดตันในภาวะบาดเจ็บของหลอดเลือด (Bowley et al, 2017) GPI อุดมไปด้วยเซลล์บุผนังหลอดเลือด microvascular ของเนื้อเยื่อไขข้อจากผู้ป่วยโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ภายใต้สภาพแวดล้อมที่ขาดออกซิเจนและควบคุมการหลั่งของปัจจัยการเจริญเติบโตของบุผนังหลอดเลือดบุผนังหลอดเลือดจากไฟโบรบลาสต์ไขข้อข้ออักเสบรูมาตอยด์เพื่อกระตุ้นการสร้างเส้นเลือดใหม่ (Lu et al, 2017) นอกจากนี้ การศึกษายังแตกต่างกัน โปรตีนที่แสดงออกมาที่เกี่ยวข้องกับภาวะมีบุตรยากที่เป็นสื่อกลาง varicocele แสดงให้เห็นว่า Nrf2 เป็นตัวควบคุมต้นน้ำของ ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021) การยับยั้ง PGK1 สามารถกระตุ้นวิถี Keapl/Nrf2 และกระตุ้นการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระในการปกป้องเซลล์ (Bollong et al,2018) โปรตีนทั้งสองอาจเป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้ของเควอซิตินผ่านทางวิถี Keapl/Nrf2 การศึกษาเพิ่มเติมสามารถตรวจสอบบทบาทของโปรตีนเหล่านี้ต่อผลของเควอซิทินต่อ H/R-HBMEC

เป็นที่ยอมรับว่าเควอซิทินสามารถให้ผลในการป้องกันเซลล์บุผนังหลอดเลือดได้ แต่เป้าหมายเฉพาะของการดำเนินการยังคงต้องมีการสอบสวนเพิ่มเติม และไม่ทราบว่ามีแนวทางการดำเนินการเพิ่มเติมหรือไม่

โดยสรุป การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าเควอซิทินรักษาความสมบูรณ์ของสิ่งกีดขวางเลือดและสมองโดยการปกป้องเซลล์บุผนังหลอดเลือด ในระดับโมเลกุล เควอซิทินอาจมีบทบาทในการปกป้องเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยการป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านวิถี Keapl/Nrf2 และยับยั้งความเค้นของเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัมผ่านวิถี ATF6/GRP78 การศึกษานี้เป็นการวางรากฐานสำหรับ TCM ในการรักษา CSVD โดยการปกป้องเซลล์บุผนังหลอดเลือด