Protease Calpain2a จำกัดภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดโดยกำหนดเป้าหมาย TRAF6 ในปลา Teleost

ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับ TNF 6 (TRAF6) มีบทบาทในการส่งสัญญาณสำคัญในเส้นทางการส่งสัญญาณต้านเชื้อแบคทีเรียและไวรัส อย่างไรก็ตาม มีการรายงานกลไกการกำกับดูแลของ TRAF6 ในสัตว์มีกระดูกสันหลังตอนล่างน้อยกว่า ในการศึกษานี้ เราระบุ calpain2a ในฐานะสมาชิกของตระกูลโปรตีเอสที่ขึ้นกับแคลเซียมซึ่งมีการทำงานของเอนไซม์ไฮโดรไลติกที่เป็นเอกลักษณ์ และทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมหลักสำหรับภูมิคุ้มกันต้านเชื้อแบคทีเรียและไวรัสในปลาเทเลออส จากการกระตุ้น lipopolysaccharide (LPS) การล้มลงของ Calpain2a จะส่งเสริมการควบคุมไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ ในทางกลไก Calpain2a ทำปฏิกิริยากับ TRAF6 และลดระดับโปรตีนของ TRAF6 โดยการไฮโดรไลซ์ หลังจากสูญเสียการทำงานของเอนไซม์ calpain2a กลายพันธุ์สามารถยับยั้งการสร้างไดเมอร์และการแพร่กระจายของ TRAF6 โดยอัตโนมัติ การล้มลงของ calpain2a ยังส่งเสริมการตอบสนองของยาต้านไวรัสในเซลล์ calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสจะยับยั้งการแพร่กระจายของปัจจัยกำกับดูแล IFN (IRF) 3/7 จาก TRAF6 เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบเหล่านี้จัดประเภท calpain2a ว่าเป็นตัวควบคุมเชิงลบของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติโดยการกำหนดเป้าหมาย TRAF6 ในปลาเทเลออส

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

ภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติมีบทบาทสำคัญในการปกป้องร่างกายจากการบุกรุกของแบคทีเรียและการติดเชื้อไวรัส เนื่องจากเป็นด่านแรกในการป้องกันเชื้อโรคที่บุกรุก ตัวรับการจดจำรูปแบบ (PRRs) บนเมมเบรนจะจดจำรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMPs) ได้ทันที PRR ที่มีการศึกษากันอย่างแพร่หลายมากที่สุด 3 ชนิดในด้านภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ ได้แก่ Toll-like receptors (TLRs), RIG-I-like receptors (RLRs) และ NOD-like receptors (NLRs) ซึ่งจดจำ PAMP ที่แตกต่างกันและกระตุ้นสัญญาณลดหลั่นเพื่อกระตุ้นการทำงานของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบและ ปัจจัยต้านไวรัส4–6 ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับ TNF (TRAF) 6 เป็นส่วนที่ขาดไม่ได้ในการต่อสู้กับการบุกรุกของแบคทีเรียและการติดเชื้อไวรัส เนื่องจากเส้นทางสัญญาณที่สำคัญถูกกระตุ้นโดยไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS) ทางเดินปัจจัยการถอดรหัสนิวเคลียร์-κB (NF-κB) จึงได้รับการแมปโดยละเอียด ฟังก์ชั่นโปรตีนส่วนใหญ่ในเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κBได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวาง Myeloid differentiation factor 88 (MyD88) ถูกเปิดใช้งานครั้งแรกโดย TLR เพื่อตอบสนองต่อ LPS และ IRAK4 ทำหน้าที่เป็นสื่อกลางโดยเปิดใช้งาน IRAK1 และ IRAK2 ซึ่งเชื่อมโยง MyD88 กับ TRAF68–11 Ubc13 และ Uev1A กระตุ้นการแพร่ขยายที่เชื่อมโยง K 63- ของ TRAF6 ซึ่งถ่ายโอนสายโซ่ ubiquitin K63 ไปยัง TAB2 และ TAB3 ซึ่งนำไปสู่การเปิดใช้งาน TAK112–16 TRAF6-ตัวกระตุ้น IKK 2 (TRIKA2) ที่ได้รับการควบคุม ซึ่งประกอบด้วย TAK1, TAB1 และ TAB2, กระตุ้นการทำงานของตัวยับยั้งของ IκB ไคเนส (IKK) / ฟอสโฟรีเลชั่น17–19 ปัจจัยการถอดรหัส NF- κBเข้าสู่นิวเคลียสและส่งเสริมการผลิตไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ เมื่อ TLR7/9 จดจำไวรัสได้ กลุ่ม MyD88- IRAKs-TRAF6 จะส่งสัญญาณไปยังปัจจัยควบคุม IFN (IRF) 7 ส่งเสริมการแพร่กระจายของ IRF7 และกระตุ้นการทำงานของฟอสโฟรีเลชั่นในนิวเคลียส21,22 ในเส้นทางการส่งสัญญาณ RLR นั้น RIG I และยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างความแตกต่างของมะเร็งผิวหนัง 5 (MDA5) เปิดใช้งานโปรตีนส่งสัญญาณต้านไวรัสไมโตคอนเดรีย (MAVS) 23,24 การรวม MAVS เป็นคุณลักษณะสำคัญของการเริ่มต้นการส่งสัญญาณ RLR23,25,26 TRAF2/3/6 เป็นปัจจัยแรกที่เปิดใช้งานโดย MAVS27,28 TRAF3 จะเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ TBK1-IRF3 และคอมเพล็กซ์ MAVS-TRAF6 จะเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ NF-κB ซึ่งส่งเสริมการแสดงออก IFN-127,29

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

กลไกระดับโมเลกุลของการกระตุ้น TRAF6 ได้แสดงให้เห็นแล้ว TRAF6 ในรูปแบบไดเมอร์ผ่านการสะสมอัตโนมัติภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของ Ubc13 และ Uev1A ซึ่งเกี่ยวข้องกับโดเมนนิ้วนางและโดเมนนิ้ว ZF แบบจำลองของ TRAF6 / Ubc13 ~ UB ยืนยันบทบาทที่สำคัญของ TRAF6 dimer ในการรวมตัวและการส่งผ่านของ K63 ubiquitin chain30 นอกจากนี้ มีรายงานว่าโดเมนนิ้วนางและนิ้ว ZF รับสมัครคอนจูเกต E2~ub ในแบบจำลองคริสตัล zebrafish TRAF6 และพบว่า TRAF6 สามารถสร้างเฮเทอโรไดเมอร์ด้วย TRAF5 จากตระกูล TRAF เดียวกันเป็นครั้งแรก โปรตีนตระกูล deubiquitination: A20, CYLD, USP2a, USP4 และ USP20 กำหนดเป้าหมาย TRAF6 เพื่อลบ K 63- ubiquitination ที่เชื่อมโยงและลดการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม ระบบไฮบริดสองตัวของยีสต์คัดกรองการทำงานร่วมกันระหว่าง UBE2O และ TRAF6 และยืนยันว่าปฏิสัมพันธ์นี้ส่งผลโดยตรงต่อการเปิดใช้งาน TRAF6 โดย MyD8836 ในกระบวนการถ่ายโอนสัญญาณดาวน์สตรีมของ TRAF6 นั้น ECSIT ในฐานะโปรตีนระดับกลางจะมีปฏิกิริยากับ TRAF6 และ TAK1 ตามลำดับ และปฏิกิริยานี้จะเพิ่มความแข็งแกร่งให้กับการจับของ TRAF6 และ TAK137 ในการส่งสัญญาณ TLR4 ที่เกิดจาก LPS นั้น PRDX จะป้องกัน TRAF6 จากการสรรหา ECSIT เพื่อส่งห่วงโซ่ K63 ubiquitin และยังยับยั้ง BECN1 ที่เปิดใช้งานโดย TRAF6 ในวิถีทาง autophagy MST4 เปิดใช้งาน TRAF6 phosphorylation ที่ Thr463 และ Thr486 และยับยั้ง TRAF6 dimerization และ ubiquitination ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม กลไกการควบคุมโปรตีนของ TRAF6 ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางในด้านภูมิคุ้มกันต้านเชื้อแบคทีเรียและไวรัส อย่างไรก็ตาม การวิจัยของ TRAF6 ในสัตว์มีกระดูกสันหลังตอนล่างยังมีการศึกษาน้อย การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในปลาเทเลออสส่วนใหญ่อาศัยวิถีทาง TLR และ RLR เพื่อดำเนินการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันหลังการติดเชื้อจากเชื้อโรค ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องสำรวจกลไกการกำกับดูแลของ6-เส้นทางการส่งสัญญาณที่ใช้สื่อกลางของ TRAF คาลเพน2 (m-คาลเพน) เป็นตระกูลของโปรตีเอสที่ขึ้นกับแคลเซียม ซึ่งประกอบด้วยสมาชิกมากกว่า 16 ตัวในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ อีกมากมาย40 การศึกษาแรกสุดของกลุ่มโปรตีนคาลเพนเกี่ยวข้องกับการเคลื่อนไหวของเซลล์ คาลเพนส่งเสริมการย้ายเซลล์และพบว่ายับยั้งการย้ายถิ่นของนิวโทรฟิลและการกระตุ้น p38 MAPK และ ERK MAPK42 กิจกรรมของไฮโดรเลสเป็นหนึ่งในหน้าที่สำคัญของคาลเพน ในการควบคุมระบบภูมิคุ้มกัน คาลเพน-2 ส่งเสริมการปล่อย NF-κB โดยการไฮโดรไลซ์ IkB และกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณ43 ในการศึกษานี้ เราได้พิจารณาแล้วว่า calpain2a ทำปฏิกิริยากับ TRAF6 และทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบในการตอบสนองของแบคทีเรียและไวรัสในปลา teleost, miiuy croaker (Miichthys miiuy) Calpain2a ส่งเสริมการย่อยสลายระดับโปรตีน TRAF6 ผ่านกิจกรรมไฮโดรเลส ในขณะเดียวกัน calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสจะยับยั้งการก่อตัวของสายโซ่ ubiquitin K63 โดยการยับยั้ง dimer ของ TRAF6 สะท้อนให้เห็นว่าทั้ง calpain2a และ calpain2a กลายพันธุ์ยุติการแพร่กระจายของ TRAF6 ไปยัง ECSIT/ BENC1/ IRF3/ IRF7 calpain2a หยุดกระบวนการส่งสัญญาณ NF-κBและ IFN โดยกำหนดเป้าหมาย TRAF6 ผลลัพธ์ของเรามีโมเลกุลสำหรับการศึกษาการควบคุมระบบภูมิคุ้มกันโดยอาศัย TRAF6- ในสัตว์มีกระดูกสันหลังตอนล่าง

ผลลัพธ์

Calpain2a โต้ตอบกับ TRAF6 และควบคุมการส่งสัญญาณ NF- κBในทางลบ

เพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ TRAF6- ในการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติในปลาเทเลออส เราได้แสดงลักษณะปฏิสัมพันธ์ของ miiuy croaker TRAF6 โดยใช้การทำให้บริสุทธิ์โดยอาศัยความสัมพันธ์และแมสสเปกโตรเมทรี จัดเรียงตามความเข้มของปริมาณที่ไม่มีป้ายกำกับ (LFQ) เราดักจับข้อมูลบางส่วนแล้วแสดงมัน (รูปที่ 1a) ในบรรดาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ TRAF6- Calpain2a อาจควบคุมการทำงานของ TRAF6 และส่งผลต่อวิถีการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางของ TRAF6- ประการแรก ควรตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง calpain2a และ TRAF6 ที่ระดับโปรตีน เราตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ของ calpain2a กับ TRAF6 ใน Miiuy croaker เซลล์ไต (MKC) การทดลองการตกตะกอนร่วมกันภายนอกระบุว่า calpain2a ทำปฏิกิริยากับ TRAF6 (รูปที่ 1b, c) ดังที่แสดงโดยการทดลองการเปลี่ยนถ่ายชั่วคราวและการตกตะกอนร่วมกัน calpain2a และ TRAF6 ที่แสดงออกมากเกินไปมีปฏิสัมพันธ์ซึ่งกันและกัน (รูปที่ 1d, e) ทั้งหมดนี้บ่งชี้ว่า calpain2a มีปฏิกิริยากับ TRAF6 และจำเป็นต้องมีการทดลองเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบกลไกการออกฤทธิ์ ด้วยการจัดลำดับหลายลำดับของมนุษย์, หนู, เซบาริช และโปรตีน calpain2a ของ croaker ทำให้ calpain2a ได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการระหว่างปลาและสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (รูปที่ 1f) เพื่อตรวจสอบการทำงานของ calpain2a ในภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ เราได้ตรวจสอบว่า calpain2a เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นการทำงานของ NF-κBที่เกิดจากการกระตุ้น LPS หรือไม่ เราแปลงเซลล์ epithelioma papulosum cyprinid (EPC) ด้วยนักข่าว NF-κB luciferase, นักข่าว renilla luciferase การควบคุมภายใน และการเข้ารหัสเวกเตอร์ calpain2a หรือเวกเตอร์เปล่า Calpain2a ลดกิจกรรมนักข่าว NF-κBลงอย่างมากจากการกระตุ้น LPS ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 1 กรัม) ยิ่งไปกว่านั้น ไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ เช่น IL -1 และ IL -8 โปรโมเตอร์ที่ตอบสนองต่อการกระตุ้น LPS นั้นลดลงอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ EPC ที่แสดงออกมากเกินไปของ calpain2a (รูปที่ 1 ชม., i) ซึ่งบ่งบอกถึงบทบาทที่เป็นไปได้ของ calpain2a ในการส่งสัญญาณการอักเสบ วิถีทางที่เกิดจากการกระตุ้น LPS

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

กฎระเบียบเชิงลบของการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS โดย calpain2a

เพื่อตรวจสอบบทบาทที่เป็นไปได้ของ calpain2a ในการส่งสัญญาณ NF-κB เราได้แปลง calpain2a ใน MKC ด้วยการไล่ระดับเวลาของ LPS และประเมินไซโตไคน์ที่ตอบสนองต่อการอักเสบที่ตอบสนองต่อ LPS การแสดงออกมากเกินไปของ calpain2a ส่งผลให้การแสดงออกของ IL -1 , IL -8 และ IL -6 ลดลง (รูปที่ 2a) ต่อไปเราได้ออกแบบ RNA ขนาดเล็กเฉพาะเจาะจง calpain2a สองตัว (siRNAs) ที่ควบคุม calpain2a ที่ควบคุมได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2b, d) การล้มลงของ calpain2a ช่วยเพิ่มไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบของ LPS อย่างมีนัยสำคัญรวมถึง IL -1 และ IL -8 ใน MKC และ Miiuy croaker เซลล์ลำไส้ (MIC) (รูปที่ 2c, e) ในกลุ่มของเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS การล้มลงของ Calpain2a จะช่วยเพิ่มการเพิ่มจำนวนเซลล์ ในทำนองเดียวกัน ในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นใด ๆ เราพบว่าการล้มลงของ calpain2a ยังช่วยเพิ่มการเพิ่มจำนวนเซลล์ด้วย (รูปที่ 2f) เพื่อตรวจสอบว่า calpain2a ยับยั้งโปรตีนในการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS หรือไม่ calpain2a ยับยั้งระดับโปรตีนภายนอกของ TRAF6 อย่างชัดเจน แต่ไม่ใช่ MyD88, IRAK4 หรือ TAK1 (รูปที่ 2g) โดยสรุปจลนพลศาสตร์ของ calpain2a และการแสดงออกของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบเสนอแนะการมีส่วนร่วมในการทำงานของ calpain2a ในการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS

รูปที่ 1 calpain2a โต้ตอบกับ TRAF6 และยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB รายการโต้ตอบของ TRAF6 ตามความเข้มของปริมาณที่ไม่มีฉลาก (ส่วน) b, c เซลล์ MKC เพาะในจานขนาด 6 ซม. 2 หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์ไลซีนจะถูกกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (IP) ด้วยเจลที่มีฤทธิ์ต้าน TRAF6 หรือแอนติ-คาลเพน2เอ จากนั้นวิเคราะห์อิมมูโนเพรซิพิเตตและไลเซทของเซลล์โดย IB ด้วย anti-TRAF6 และ anti-calpain2a Abs ตามลำดับ d, เซลล์ e HEK 293 ที่เพาะในจานขนาด 6 ซม.2 ได้รับการถ่ายด้วยพลาสมิด calpain2a-Flag และ TRAF6-Myc (อย่างละ 2 ไมโครกรัม) หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์ไลซีนจะถูกทำให้ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน (IP) ด้วยแอนติ-Myc d หรือแอนติ-แฟลก อี อัฟฟินิตีเจล จากนั้นวิเคราะห์อิมมูโนเพรซิพิเตตและไลเซทของเซลล์โดย IB ด้วย anti-Myc และ anti-Flag Abs ตามลำดับ f กรดอะมิโนชนิดเดียวกันใน calpain2a ของมนุษย์ (Hu-calpain2), mouse calpain2a (Mu-calpain2), zebrafish calpain2a (ZF-calpain2a) และ miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) ถูกเน้นด้วยพื้นหลังสีดำ เซลล์ g – I EPC ได้รับการแปลงสภาพด้วย calpain2a-Flag หรือเวกเตอร์เปล่าพร้อมกับ NF-κB, IL -1 และ IL -8 นักข่าวลูซิเฟอร์เรส ที่ 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์ไม่ได้รับการรักษา (จำลอง) หรือบำบัดด้วย LPS เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ค่าแอคทิวิตีของลูซิเฟอเรสบรรลุผลสำเร็จเทียบกับแอคติวิตีของเรนิลลา ลูซิเฟอเรส (n=3 ต่อกลุ่ม) การวิเคราะห์ Western blot ใช้เพื่อวัดการแสดงออกของธง calpain2a ที่แปลงสภาพชั่วคราว การแสดงออกของ Tubulin ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (g, h, i) **พี < 0.01. การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

ปฏิสัมพันธ์ของ calpain2a กับ TRAF6

การวิเคราะห์โดเมนเสร็จสิ้นโดยใช้ฐานข้อมูลโดเมนอนุรักษ์ (CDD) NCBI คาลเพน2a ประกอบรวมด้วยสามโดเมน: โดเมนซิสเตอีนโปรตีเอสในตระกูลคาลแปง (CysPc) (aa 46-339), โดเมนหน่วยย่อยขนาดใหญ่ของคาลเพนกลาง III (aa 360-499) และโดเมนมือ Penta-EF ที่ปลาย C ( เออ 500-697) ในการพิจารณาว่าโดเมนใดของ calpain2a ที่จำเป็นสำหรับการโต้ตอบกับ TRAF6 เราได้สร้างการกลายพันธุ์ที่ถูกตัดทอนสามแบบ: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) และ calpain (500-697) (รูปที่ 3a) เซลล์ HEK293 ได้รับการทรานส์เฟกด้วยชนิดไวด์ของ calpain2a-Flag (WT), การกลายพันธุ์ของการตัดทอน calpain2a-Flag หรือเวกเตอร์ TRAF6- HA เราพบว่าทั้ง calpain2a แบบเต็มความยาวและการกลายพันธุ์ที่ถูกตัดทอนสามตัวสามารถโต้ตอบกับ TRAF6 (รูปที่ 3c) TRAF6 ประกอบด้วยโดเมน TRAF ที่ปลาย C, โดเมนขดขด, โดเมนซิงค์ฟิงเกอร์ และโดเมนริงฟิงเกอร์ เพื่อตรวจสอบว่าโดเมนใดของ TRAF6 ที่จำเป็นสำหรับการโต้ตอบกับ calpain2a เราได้สร้างชุดของ TRAF6 ตัดทอนการกลายพันธุ์ รวมถึง TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) และ TRAF6 (400-574) ในขณะเดียวกัน เราสร้างโดเมนกลายพันธุ์: TRAF6ΔRing (ซึ่งโดเมน Ring Finger ถูกลบ), TRAF6ΔZF (ซึ่งโดเมน Zinc Fingers ถูกลบ), TRAF6ΔCC (ซึ่งโดเมนขดขดถูกลบ) และ TRAF6ΔTRAF-C ( ซึ่งโดเมน TRAF ของ C-terminal ถูกลบ) (รูปที่ 3b) calpain2a โต้ตอบกับ TRAF6 ความยาวเต็มรวมถึงการตัดทอนของ TRAF6 ที่มีโดเมน C-terminal TRAF, โดเมนขดขด, โดเมนนิ้วสังกะสี (รูปที่ 3 มิติ, f) แต่ไม่ใช่กับโดเมนนิ้วก้อย (รูปที่ 3e) . การตรวจวิเคราะห์ของลูซิเฟอเรสแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของคาลเพน2a และการกลายพันธุ์ของการตัดปลายเหล่านี้ยับยั้งการทำงานของรีพอร์เตอร์ NF-κB และ IL-1 ในเซลล์ EPC อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3 ชม.) นอกจากนี้ยังทำการตรวจสอบการรวมตัวกันของเซลล์ย่อยของ calpain2a กับ TRAF6 เราแปลงเซลล์ EPC ด้วย TRAF6-GFP และเวกเตอร์เปล่าหรือ calpain2a-mCherry การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ Confocal แสดงให้เห็นว่าสัญญาณสีเขียวของ TRAF6 ทับซ้อนกับสัญญาณสีแดงของ calpain2a ซึ่งบ่งชี้ว่า calpain2a ร่วมกับ TRAF6 ในเซลล์ EPC (รูปที่ 3i, j) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าพื้นฐานโครงสร้างของหลายโดเมนของ TRAF6 (โดเมน C-terminal TRAF, โดเมนขดม้วน, โดเมนนิ้วสังกะสี) แต่ไม่ใช่โดเมนนิ้วก้อยเป็นตัวกำหนดสำหรับการเชื่อมโยงกับ calpain2a (รูปที่ 3g)

รูปที่ 2 calpain2a เชิงลบควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS IL-1 , IL-8 และ IL-6 mRNA ใน MKC ที่แปลงด้วย calpain2a-Flag หรือเวกเตอร์เปล่าและบำบัดด้วยน้ำเกลือ (0) หรือท้าทายด้วย LPS สำหรับต่างๆ ครั้ง (2 ชั่วโมง, 4 ชั่วโมง, 6 ชั่วโมง, 8 ชั่วโมง, 10 ชั่วโมง) (n=3 ต่อกลุ่ม) b, d เซลล์ MKC และเซลล์ MIC ได้รับการถ่ายด้วย si-calpain2a #1 และ si-calpain2a #2 (100 nM) หรือ si-ctrl (100 nM) ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย การแสดงออกของ Calpain2a ถูกวัดโดย qRT PCR (n=3 ต่อกลุ่ม) ระดับของโปรตีน calpain2a ถูกกำหนดโดยการซับแบบตะวันตก c, e IL-1 , IL-8 mRNA ใน MKC และ MIC แปลงได้อย่างเสถียรด้วย si-calpain2a #1 หรือ si-ctrl (เวกเตอร์ควบคุม) และบำบัดด้วยน้ำเกลือ (0) หรือท้าทายด้วย LPS สำหรับต่างๆ ครั้ง (4 ชั่วโมง 8 ชั่วโมง) (n=3 ต่อกลุ่ม) เซลล์ f MKC ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วย si-ctrl หรือ si-calpain2a #1 ที่ 36 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย LPS เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้นการสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัด (n=3 ต่อกลุ่ม) สเกลบาร์ 100 μm g calpain2a-Flag ถูกแปลงร่างเป็นเซลล์ MKC ซึ่งถูกท้าทายด้วย LPS ในเวลาต่างๆ (3 ชั่วโมง, 6 ชั่วโมง, 9 ชั่วโมง) การวิเคราะห์ Immunoblot ของเซลล์ lysates ด้วย Abs ที่ระบุ ระดับ mRNA สัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามการแสดงออกของยีนที่เข้ารหัส -actin ในแต่ละตัวอย่าง การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (a, c, e, f) หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (b, d) *พี < 0.05, **พี < 0.01

รูปที่ 3 ปฏิสัมพันธ์ของ calpain2a กับ TRAF6 a, b แผนผังไดอะแกรมของการจัดระเบียบโดเมนใน miiuy croaker calpain2a, TRAF6 และสายพันธุ์กลายถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ "+" หมายถึงการโต้ตอบกับ TRAF6 หรือ calpain2a, "-" หมายถึงไม่มีการโต้ตอบ เซลล์ c HEK293 ได้รับการแปลงสภาพด้วยการจำลอง calpain2a-Flag wild type (WT) และการกลายพันธุ์ที่ถูกตัดทอนของ calpain2a-Flag หรือ TRAF 6- HA ตามที่ระบุ ที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ที่ถูกเปลี่ยนสถานะจะถูกสกัดและไลซีนของเซลล์จะถูกกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HA ตามด้วย IB โดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน HA หรือต่อต้านแฟล็ก เซลล์ d–f HEK293 ได้รับการแปลงสภาพด้วยการจำลอง TRAF{21}}HA wild type (WT) และ TRAF6-HA กลายพันธุ์ที่ถูกตัดทอน หรือ calpain2a-Flag ตามที่ระบุไว้ ที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ที่ถูกเปลี่ยนสถานะจะถูกสกัดและไลซีนของเซลล์จะถูกกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HA d, f หรือแอนติบอดีต่อต้านแฟล็ก e ตามด้วย IB โดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน HA หรือต่อต้านแฟล็ก g ไซต์ปฏิสัมพันธ์ของ TRAF6 และ calpain2a เซลล์ h EPC ถูกแปลงสภาพด้วย TRAF 6- HA, calpain2a-Flag หรือ calpain2a-Flag ที่ถูกตัดทอนการกลายพันธุ์พร้อมกับ NF-κBและ IL -1 นักข่าว luciferase หลังจากผ่านไป 36 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน ค่าแอคทิวิตีของลูซิเฟอเรสบรรลุผลเทียบกับแอคทิวิตีของเรนิลลา ลูซิเฟอเรส (n=3 ต่อกลุ่ม) เซลล์ I j EPC ได้รับการแปลงสภาพด้วย mock, calpain2a-mCherry และ TRAF6-GFP นิวเคลียสที่ย้อมด้วย DAPI จะแสดงเป็นสีน้ำเงิน ตรวจพบ calpain2a ด้วยเรืองแสงสีแดง และตรวจพบ TRAF6 ด้วยเรืองแสงสีเขียว สเกลบาร์ 10 μm การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (h) **พี < 0.01

calpain2a ยับยั้งระดับการแสดงออกของโปรตีน TRAF6 โดยกิจกรรมโปรตีโอไลติก

ในการสำรวจกลไกการกำกับดูแลของ calpain2a บน TRAF6 เราตรวจสอบก่อนว่า calpain2a มีผลต่อ TRAF6 ในระดับโปรตีนหรือไม่ calpain2a-Myc และ TRAF6-แฟล็กถูกแปลงสภาพร่วมกันในเซลล์ EPC ระดับโปรตีนของ TRAF6 ลดลงบางส่วนที่ 30 ชั่วโมง (รูปที่ 4a) ดังที่แสดงในรูปที่ 4b calpain2a ส่งเสริมการสลายตัวของ TRAF6 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ในการมีอยู่ของ calpain2a มันไม่ส่งผลกระทบต่อระดับ mRNA ของ TRAF6 ซึ่งบ่งชี้ว่า calpain2a ส่งผลต่อระดับโปรตีนของ TRAF6 เท่านั้น ในขณะเดียวกันการทดสอบสารยับยั้งไซโคลเฮกซิไมด์ (CHX) แสดงให้เห็นว่า calpain2a สามารถเร่งครึ่งชีวิตของโปรตีน TRAF6 (รูปที่ 4c) การแสดงออกมากเกินไปของ calpain2a ในเซลล์ MKC ส่งผลให้ TRAF6 ภายนอกไม่เสถียร (รูปที่ 4d) เพื่อตรวจสอบว่าการสลายตัวของ TRAF6 ที่เป็นสื่อกลางโดย calpain2a นั้นขึ้นอยู่กับ ubiquitin-proteasome, autophagosome, lysosomal path หรืออื่น ๆ หรือไม่ เซลล์ EPC ได้รับการบำบัดด้วยรีเอเจนต์ที่ยับยั้งวิถีเหล่านี้: MG132, 3-MA และ NH4Cl อย่างไรก็ตาม การทำให้เสถียรโดยอาศัยสื่อกลาง calpain2a ของ TRAF6 ไม่ได้ถูกย้อนกลับโดยตัวยับยั้ง proteasomal MG132, ตัวยับยั้ง autophagic 3- MA หรือตัวยับยั้ง lysosomal NH4Cl (รูปที่ 4e) ต่อไป เซลล์ EPC ได้รับการบำบัดด้วยรีเอเจนต์: E-64 (ตัวยับยั้งคาลเพนซึ่งยับยั้งการทำงานของคาลเพน ไฮโดรเลส) และ PMSF (ตัวยับยั้งซีรีนโปรตีเอสที่ไม่จำเพาะ) เราพบว่าตัวยับยั้งคาลเพน E-64 ป้องกันการย่อยสลายที่ระดับโปรตีน TRAF6 (รูปที่ 4f) ดังที่แสดงในรูปที่ 4g E -64 ยังกลับการเสื่อมสลายของระดับโปรตีน TRAF6 ภายนอกโดย calpain2a

รูปที่ 4 calpain2a ยับยั้งการแสดงออกของโปรตีน TRAF6 a การทดลองไล่ระดับเวลาของเวกเตอร์เปล่าหรือพลาสมิด calpain2a-Myc ร่วมกับแฟล็ก TRAF 6- ดำเนินการในเซลล์ EPC เซลล์ไลซีนอยู่ภายใต้ IB พร้อมด้วย anti-Myc, anti-Flag และ anti–Tubulin Abs RNA ถูกสกัดจากเซลล์และคัดลอกแบบย้อนกลับ จากนั้น TRAF6 และแอคตินถูกขยายโดยไพรเมอร์ PCR เซลล์ b EPC ถูกเพาะในเพลตหลุม 12- ข้ามคืนและเปลี่ยนถ่ายร่วมกับ TRAF 6- Flag และ calpain2a-Myc (0.3, 0.6 หรือ {{ 18}}.9 ส.ค.) เป็นเวลา 48 ชม. การแสดงออกของ TRAF6-Flag และโปรตีน calpain2a-Myc ถูกตรวจพบโดย Western blotting RNA ถูกสกัดจากเซลล์และคัดลอกแบบย้อนกลับ จากนั้น TRAF6 และแอคตินถูกขยายโดยไพรเมอร์ PCR c calpain2a-Myc หรือเวกเตอร์เปล่าถูกทรานส์เฟกร่วมกับ TRAF6-แฟล็กลงในเซลล์ EPC ที่ 36 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกบำบัดด้วยไซโคลเฮกซิไมด์ (CHX) เป็นเวลา 2 หรือ 4 ชั่วโมง เซลล์ d MKC ได้รับการถ่ายด้วย calpain2a-Flag หรือเวกเตอร์เปล่า ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ไลซีนจะถูกควบคุมโดย IB พร้อมด้วย anti-TRAF6, anti-Flag และ anti-Tubulin Abs e, f เซลล์ EPC ได้รับการถ่ายด้วยพลาสมิดที่ระบุเมื่อมีหรือไม่มี MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (5 0 หรือ 75 μM) หรือ PMSF เป็นเวลา 6 h ก่อนที่จะทำการวิเคราะห์อิมมูโนล็อต เซลล์ g MKC ได้รับการถ่ายด้วย calpain2a-Flag เมื่อมีหรือไม่มี E {{5 0}} (50 หรือ 75 μM) เป็นเวลา 6 ชั่วโมงก่อนทำการวิเคราะห์อิมมูโนล็อต h calpain2a-Flag และ calpain2a-ΔCysPc-Flag ได้รับการแปลงร่วมกับ TRAF 6- HA ลงในเซลล์ EPC ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ไลซีนจะถูกนำส่ง IB โดยมี Abs ที่ระบุ ฉัน calpain2a-Flag และ calpain2a-ΔCysPc-Flag ถูก cotransfected ในเซลล์ MKC ที่ 48 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ไลซีนจะถูกควบคุมด้วย IB พร้อมด้วย anti-TRAF6, anti-Flag และ anti-Tubulin Abs j IL -1 , IL -8 mRNA ใน MKC แปลงได้อย่างเสถียรด้วย calpain2a-Flag และ calpain2a-ΔCysPc-Flag และบำบัดด้วยน้ำเกลือ (0) หรือท้าทายด้วย LPS เป็นเวลา 4 ชั่วโมง (n=3 ต่อกลุ่ม) ระดับ mRNA สัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามการแสดงออกของยีนที่เข้ารหัส -actin ในแต่ละตัวอย่าง การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (j) **พี < 0.01

เพื่อตรวจสอบว่าการสลายตัวของ TRAF6 ขึ้นอยู่กับกิจกรรมไฮโดรเลสของ calpain2a หรือไม่ การใช้ประโยชน์จากการศึกษาโครงสร้างและชีวเคมีก่อนหน้าของ calpain2a ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เราได้กลายพันธุ์ซีสเตอีน ฮิสติดีน และแอสพาราจีนที่ตกค้างของ calpain2a ไปเป็นอะลานีน (calpain2a C105A, H262A, N286A และ 3 A) ซึ่งสูญเสียการประสานงานของตัวเร่งปฏิกิริยา - ไตรแอด เราสังเกตว่าการสลายตัวของ TRAF6 ไม่ได้รับผลกระทบจากการกลายพันธุ์นี้ (รูปที่ 1a เพิ่มเติม) ดังนั้นเราจึงกลายพันธุ์โดเมนโปรตีเอสซึ่งเป็นโดเมนซีสเตอีนโปรตีเอส (CysPc) ของตระกูล Calpain ของ calpain2a (กำหนดเป็น calpain2a-ΔCysPc) ทั้ง TRAF6 ที่แสดงออกมากเกินไปหรือ TRAF6 ภายนอกไม่ได้รับผลกระทบจาก calpain2a-ΔCysPc (รูปที่ 4 ชม., i) อย่างไรก็ตาม proflammation cytokines IL -1 และ IL -8 ได้รับผลกระทบพร้อมกันจาก calpain2a ชนิดไวด์หรือกลายพันธุ์ตามการกระตุ้น LPS (รูปที่ 4j) Calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสไม่ส่งผลกระทบต่อระดับโปรตีนของ TRAF6 แต่ Calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสยังคงส่งผลต่อการแสดงออกของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบปลายน้ำ สิ่งนี้กระตุ้นให้เราตรวจสอบกลไกที่อาจเกิดขึ้นซึ่ง calpain2a ควบคุม TRAF6 เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้เผยให้เห็นว่า calpain2a ควบคุมการส่งสัญญาณ NF-κB โดยการยับยั้งการแสดงออกของระดับโปรตีน TRAF6 ผ่านกิจกรรมของ Calpain hydrolase

Calpain2a ยับยั้งการทำงานของ TRAF6 ubiquitin-ligase

ต่อไป เราได้สำรวจกลไกระดับโมเลกุลโดยที่ calpain2a ควบคุมการส่งสัญญาณ NF-κB ที่กระตุ้นการทำงานของ TRAF6- ในเชิงลบ และปฏิสัมพันธ์ของ calpain2a กับ TRAF6 เมื่อสูญเสียการทำงานของเอนไซม์จะปรับการทำงานของ ubiquitin ligase ของมันหรือไม่ เราทำการรักษาเซลล์ MKC ด้วย LPS จากนั้นจึงทำให้ TRAF6 มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง การทดสอบการแพร่กระจายด้วยโปรตีนรีคอมบิแนนท์บริสุทธิ์ยืนยันว่า calpain2a และ calpain2a-ΔCysPc ลดการแพร่กระจายของ TRAF6 (รูปที่ 5a) ดังที่แสดงในรูปที่ 5b, c ทั้ง calpain2a และ calpain2a-ΔCysPc ลดโปรตีน WT และ K63 ubiquitinated ของ TRAF6 ลงอย่างมีนัยสำคัญ การไล่ระดับความเข้มข้นของ calpain2a และ calpain2a-ΔCysPc ลด WT และ K63 โปรตีนที่แพร่หลายของ TRAF6 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา calpain2a-ΔCysPc ยังคงป้องกันการรวมตัวของสายโซ่ K63 ubiquitin ของ TRAF6 โดยไม่ส่งผลกระทบต่อระดับโปรตีน TRAF6 (รูปที่ 5d, e) จากนั้นเราแปลงเซลล์ MKC เพื่อแสดง TRAF6 ที่ติดแท็ก Myc เมื่อมีหรือไม่มี calpain2a-ΔCysPc ที่ติดแท็ก Flag จากนั้นทำการทดลองการกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Myc และวิเคราะห์โดยอิมมูโนล็อตด้วยต่อต้าน UB การแพร่หลายของ TRAF6 ดังกล่าวถูกลดทอนลงอย่างมากโดย calpain2a- ΔCysPc (รูปที่ 5f) กระตุ้นโดย LPS, TRAF6 ส่งสายยูบิควิตินที่เชื่อมโยง K63- ไปยัง TAK1 ซึ่งกระตุ้น TAK1 ออโตฟอสโฟรีเลชั่นและกระตุ้น NF-κB18 โปรตีน ubiquitin ของ WT และ K63 ของ TAK1 ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมี TRAF6 ในขณะที่ TAK 1- การแพร่กระจายที่เชื่อมโยงถูกยับยั้งเมื่อมี calpain2a-ΔCysPc (รูปที่ 5g, h) ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนว่า calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสจะยับยั้งกิจกรรม TRAF6 ubiquitin ligase ในทำนองเดียวกันโดยไม่ส่งผลกระทบต่อระดับโปรตีน TRAF6

ประโยชน์ของ Cistanche Tubulosa-เสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

Calpain2a ยับยั้ง TRAF6 homo-oligomerization

สายโซ่ Lys63 ubiquitin สังเคราะห์โดย TRAF6 มีบทบาทสำคัญในการถ่ายโอนสัญญาณ มีรายงานว่าการลดขนาดของ TRAF6 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์สายโซ่ ubiquitin แบบจำลองการลดขนาดมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการรวมกันของ Ubc13 เพื่อสร้างการแพร่กระจายของ K63 เพื่อตรวจสอบว่าปลา TRAF6 สามารถสร้างไดเมอร์ได้หรือไม่ เราใช้พลาสมิดของ TRAF6 ที่มีแท็กที่แตกต่างกัน: Myc-tagged TRAF6 และ HA-tagged TRAF6 สำหรับการทดลอง co-IP การทดสอบ IP ดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน HA, HATRAF6 โต้ตอบกับ Myc-TRAF6 (รูปที่ 6a) เพื่อสำรวจผลการยับยั้งของ calpain2a ในการโต้ตอบแบบไดเมอร์ของ TRAF 6- calpain2a ที่ติดแท็กแฟล็ก, TRAF6 ที่ติดแท็ก HA และ TRAF6 ที่ติดแท็ก Myc ถูกแสดงออกชั่วคราวในเซลล์ HEK293 ตามที่คาดไว้ การกระทำระหว่างกันของไดเมอร์ TRAF{6- ลดลงเมื่อมีคาลเพน2a (รูปที่ 6b) ในเวลาเดียวกัน เพื่อหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพของ TRAF6 โดย calpain2a เราแปลง calpain2a-ΔCysPc ที่ติดแท็กแฟล็ก และพบว่าปฏิกิริยาระหว่างไดเมอร์ของ TRAF 6- ลดลงทีละน้อยเมื่อมี calpain2a- ΔCysPc (รูปที่ 6c) ดังที่แสดงในรูปที่ 6d, e เราพบว่า HA-TRAF6 ปรับปรุง WT และ K63 การแพร่กระจายของ Myc-TRAF6 ในขณะที่เซลล์ HEK293 ได้รับการถ่ายร่วมกับ calpain2a และ calpain2a- ΔCysPc การแพร่หลายที่เพิ่มขึ้นจะถูกระงับ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าทั้ง calpain2a ชนิด wild และ calpain2a กลายพันธุ์ที่ไม่มีกิจกรรมไฮโดรเลสยับยั้ง TRAF6 homooligomerization และการแพร่กระจายอัตโนมัติ

calpain2a ยับยั้งการส่ง TRAF6 ubiquitination ไปยัง ECSIT และ BECN1

ดังที่ปรากฎในรูปที่ 5d เราพบว่า calpain2a แทรกแซงกระบวนการแพร่หลายจาก TRAF6 ถึง TAK1 มีรายงานว่า ECSIT ทำหน้าที่เป็นอะแดปเตอร์โปรตีนของ TAK1 และ TRAF6 เพื่อส่งเสริมการส่งสัญญาณ NF-κBโดยการกระตุ้น LPS เพื่อตรวจสอบว่า ECSIT มีฟังก์ชั่นที่กล่าวถึงในปลา teleost หรือไม่ เราได้ทำการจัดตำแหน่งโปรตีน ECSIT หลายลำดับในมนุษย์ หนู และอาจ croaker (รูปที่ 1b เพิ่มเติม) เราแปลงเซลล์ EPC ด้วยนักข่าว NF-κB luciferase, ECSIT ปรับปรุงกิจกรรมนักข่าว NF-κBอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการกระตุ้น LPS (รูปที่ 1c เพิ่มเติม) การแสดงออกของ ECSIT ในเซลล์ MKC มากเกินไปนำไปสู่การควบคุมระดับ mRNA ของ TNF- (รูปที่ 1 เพิ่มเติม) หลังจากแปลงปลา ECSIT และ TRAF6 ในเซลล์ HEK293 เราพบว่า TRAF6 โต้ตอบกับ ECIST (รูปที่ 7a) ในทำนองเดียวกัน ECSIT และ TAK1 ได้รับการแปลงสภาพร่วมกัน และโปรตีนทั้งสองยังคงรักษาปฏิสัมพันธ์ไว้ (รูปที่ 7b) ต่อมา เพื่อตรวจสอบว่า calpain2a-ΔCysPc ยับยั้งการก่อตัวของสารเชิงซ้อน TRAF6- ECSIT หรือไม่ เราได้แปลงพลาสมิดทั้งสามไปเป็นเซลล์ HEK293 และพบว่า calpain2a-ΔCysPc ป้องกันสารเชิงซ้อน TRAF6- ECSIT (รูปที่ 7c) ). เพื่อตรวจสอบกระบวนการส่งสัญญาณของสายโซ่ ubiquitin ในการส่งสัญญาณ NF-κB ดังที่แสดงในรูปที่ 7d TRAF6 สามารถส่งเสริมการแพร่หลายของ ECSIT; ตามที่คาดไว้ calpain2a-ΔCysPc ยับยั้งกระบวนการที่ TRAF6 ส่งสายโซ่ ubiquitin ไปยัง ECSIT BECN1 เป็นโปรตีนที่สำคัญในการกินอัตโนมัติที่เกิดจาก LPS ได้รับการยืนยันแล้วว่าการแพร่กระจายของ K63 สามารถแก้ไขและเปิดใช้งาน BECN1 ได้ เอนไซม์ Deubiquitinating A20 จะกำจัดการแพร่กระจายของ BECN1 และยับยั้ง autophagy ที่เกิดจาก LPS และ TRAF6 คือ E3 ligase ที่รับผิดชอบในการแพร่หลายของ BECN1 ในสัญญาณนี้ ดังที่แสดงในรูปที่ 7e TRAF6 โต้ตอบกับ BECN1 และส่งเสริมการแพร่หลายของ BECN1 จากนั้นเราแปลง BECN1, TRAF6, calpain2a และ calpain2a-ΔCysPc ลงในเซลล์ HEK293, TRAF6 ส่งเสริมการแพร่หลายของ BECN1 calpain2a-ΔCysPc ยับยั้งกระบวนการที่ TRAF6 ส่งสายโซ่ ubiquitin ไปยัง BECN1 (รูปที่ 7f) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า calpain2a แบบไวด์และ calpain2a กลายพันธุ์ที่ไม่มีกิจกรรมไฮโดรเลสยับยั้งความสามารถในการแพร่กระจายของ TRAF6 ใน autophagy ที่เกิดจาก LPS และการส่งสัญญาณ NF-κB

การควบคุมเชิงลบของการตอบสนองของไวรัสโดย calpain2a

ในเส้นทาง RLR นั้น TRAF6 ทำหน้าที่เป็น E3 ligase ที่ MAVS คัดเลือกเพื่อเปิดใช้งาน NF-κB การผลิต IFN และไซโตไคน์ ต่อไปเราจะตรวจสอบว่า calpain2a มีบทบาทในการป้องกัน TRAF6 ในกระบวนการต้านไวรัสที่ใช้ IFN หรือไม่ ในเซลล์ EPC มีการแสดงออกถึงผู้รายงานลูซิเฟอเรสที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์ IFN-1, ISRE และ IRF3 เราพบว่า calpain2a ลดกิจกรรมลูซิเฟอเรสที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์ลงอย่างมากในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อกระตุ้นพลอย (I: C) และการติดเชื้อ Siniperca cheats rhabdovirus (SCRV) (รูปที่ 8a, b) การล้มลงของ calpain2a ช่วยเพิ่มการแสดงออกของยีน Ploy (I: C) และ SCRV ที่กระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญรวมถึง Viperin, Mx1 และ ISG15 (รูปที่ 8c, d) การล้มลงของ calpain2a ส่งผลให้การแสดงออกของความมีชีวิตของเซลล์สูงขึ้นจากการติดเชื้อ SCRV ในเซลล์ MKC (รูปที่ 8e) ดังที่แสดงในรูปที่ 8f การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์เปิดเผยว่าการล้มลงของ calpain2a ช่วยเพิ่มการเพิ่มจำนวนเซลล์จากการติดเชื้อ SCRV การแสดงออกที่มากเกินไปของ calpain2a ส่งเสริมการแพร่กระจายของไวรัสอย่างรวดเร็ว ซึ่งสะท้อนได้จากการจำลองแบบของไวรัสหลังการติดเชื้อ SCRV (รูปที่ 8 กรัม) calpain2a และ calpain2a-ΔCysPc ลด IFN -1, ISRE และ IRF3 ที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์นักข่าว liferase ที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์จากการกระตุ้น Ploy (I: C) และการติดเชื้อ SCRV (รูปที่ 2a, b เสริม) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า calpain2a อาจควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ RLR ในทางลบผ่านการยับยั้ง TRAF6 ซึ่งจะยับยั้งการกระตุ้น IFN

รูปที่ 5 calpain2a ยับยั้งการทำงานของ TRAF6 ubiquitin-ligase การแพร่หลายของ TRAF6 ภายนอกในเซลล์ MKC ที่แปลงด้วย calpain2a-Flag และ calpain2a-ΔCysPc-Flag และไม่มีใครทักท้วง (-) หรือท้าทายด้วย LPS (+) ประเมินโดยการวิเคราะห์อิมมูโนลอตด้วยแอนตี้ - ยูบิควิตินหลังการกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วย anti-TRAF6 และการวิเคราะห์อิมมูโนลอตอินพุต พร้อมระบุ Abs b, เซลล์ c HEK293 ได้รับการ cotransfected ด้วย TRAF 6- HA และ WT-ubiquitin-His หรือ K63O ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะไลซีน 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose d, เซลล์ e HEK293 ถูก cotransfected ด้วย TRAF{{30}}HA และ WT-ubiquitin-His หรือ K63O-ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะไลซีน 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag ({{45 }}.5 ส.ค., 1 ส.ค.), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0.5 ส.ค., 1 ส.ค.) หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose f การแพร่หลายของ TRAF6 ที่แสดงออกมากเกินไปในเซลล์ MKC ที่แปลงด้วย calpain2a-ΔCysPc-Flag ประเมินโดยการวิเคราะห์อิมมูโนลอตด้วยแอนตี้ - ยูบิควิตินหลังจากการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันด้วยแอนตี้ - Myc และการวิเคราะห์อิมมูโนลอตอินพุตด้วย Abs ที่ระบุ เซลล์ g, h HEK293 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายร่วมด้วย TAK1-Myc, TRAF6-HA และ WT-ubiquitin-His หรือ K63O-ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะไลซีน 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์ว่าง หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose อิมมูโนเพรซิพิเทตทั้งหมดและการวิเคราะห์อิมมูโนลอตอินพุตด้วย anti-Myc, anti-Flag, anti-HA และ anti-Tubulin Abs การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

Calpain2a ยับยั้งการแพร่กระจายของ IRF3 และ IRF7 จาก TRAF6

มีรายงานว่าในสัญญาณไวรัสที่ถูกกระตุ้นโดย MAVS-TRAF3/6 คอมเพล็กซ์ กิจกรรมของ TRAF6 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเปิดใช้งาน IRF3 และ NF-κB48 ดังที่แสดงในรูปที่ 9a, b, TRAF6 ส่งเสริม WT และ K 63- การแพร่กระจายที่เชื่อมโยงของ IRF3 และการปรับปรุงนี้ถูกยับยั้งโดยการแสดงออกของ calpain2a- ΔCysPc ในขณะเดียวกัน เมื่อไวรัสกระตุ้นสัญญาณการส่งสัญญาณที่ขึ้นกับ TLR TRAF6 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับ IRF7 และส่งเสริมการแพร่กระจายของ IRF7 พร้อมกับปัจจัยต้านไวรัสที่เปิดใช้งาน22,49,50 TRAF6 ส่งเสริม WT และ K 63- การแพร่กระจายที่เชื่อมโยงของ IRF7 และการปรับปรุงนี้ถูกยับยั้งโดยการแสดงออกของ calpain2a-ΔCysPc (รูปที่ 9c, d) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า calpain2a ชนิดพันธุ์ป่าและ calpain2a กลายพันธุ์ที่ไม่มีฤทธิ์ของไฮโดรเลสยับยั้งการแพร่กระจายโดยอาศัยสื่อกลางของ TRAF6- ของ IRF3 และ IRF7

การอภิปราย

TRAF6 เป็นหนึ่งในเจ็ดสมาชิกของตระกูลปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับ (TRAF) ของเนื้องอกเนื้อร้าย (TNF) ซึ่งได้รับการระบุว่าเป็นอะแดปเตอร์สัญญาณและออกแรงส่งสัญญาณ ตระกูล TRAF มีโดเมน Ring finger ซึ่งเป็นเจ้าของกิจกรรม E3 ligase ligases E3 ที่มีโดเมน HECT ส่งเสริมการเกิด polyubiquitination ของสารตั้งต้น และ E3s ที่มีโดเมน Ring ต้องการ E2 ~ ub เพื่อส่ง polyubiquitination เอนไซม์ Ub-binding dimer Ubc13 / Uev1A ได้รับการยืนยันว่ามีส่วนร่วมในการรวมตัวของ TRAF6 polyubiquitination ในขณะที่ K124 ของเมาส์ TRAF6 ถูกทำให้ล้มลง TRAF6 จะสูญเสียกิจกรรมของการแพร่กระจายอัตโนมัติของ K63 และการกลายพันธุ์ที่ไซต์นี้จะกำจัดการแพร่กระจายของ TRAF6- NEMO ที่เป็นสื่อกลาง และการเปิดใช้งาน TAK1, IKK และ NF-κB55 . มีความแม่นยำเนื่องจาก PRDX1 เชื่อมโยงกับโดเมน TRAF6 Ring Finger ที่มีอยู่ใน K124 และกำจัดการแพร่กระจายของ TRAF638 มีรายงานว่าการแพร่หลายของ TRAF6 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการลดขนาดของโดเมน N-terminal (โดเมนนิ้วนางและนิ้ว ZF) ไซต์การโต้ตอบเทอร์มินัล N หลายไซต์ที่มี Ubc13 ถูกกลายพันธุ์ และ Ubc13 ไม่สามารถส่ง poly~ub ไปยัง TRAF616 ได้ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างการกลายพันธุ์ของ calpain2a และ TRAF6 แสดงให้เห็นว่าโดเมนส่วนใหญ่ของ TRAF6 มีปฏิสัมพันธ์กับ calpain2a ยกเว้นโดเมนนิ้วนาง เนื่องจากการทำงานร่วมกันระหว่าง calpain2a และโดเมน ZF fingers ของ TRAF6 เราคาดการณ์ว่า calpain2a อาจยับยั้งการแพร่กระจายอัตโนมัติโดยการปิดกั้นการลดขนาดของ TRAF6 ต่อมา เราได้ตรวจสอบการโต้ตอบของแท็กต่างๆ ของ TRAF6 เมื่อการแสดงออกของ calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสเพิ่มขึ้น ปฏิสัมพันธ์ของแท็กต่าง ๆ ของ TRAF6 ก็ลดลง TRAF6 ที่ติดแท็ก HA ส่งเสริมการแพร่กระจายของ TRAF6 ที่ติดแท็ก Myc และ calpain2a กลายพันธุ์ยับยั้งการแพร่กระจายที่เพิ่มขึ้นโดย TRAF6 ที่ติดแท็ก HA ในฐานะตัวกลางในกระบวนการส่งสัญญาณ TRAF6-TAK1 ECSIT ผูกกับโดเมนปลาย C ของ TRAF6 (โดเมน CC และโดเมน TRAF-C) และได้รับการยืนยันว่าเกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณ NF-κB37 การแสดงออกของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบลดลงในเซลล์ ECSITKD THP -1 อย่างไรก็ตาม หลังจากการแสดงออกมากเกินไปของ ECSIT ในเซลล์ ECSITKD THP-1 ยีน เช่น IRF7, IL-1 และ CD44 ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ PRDX1 ผูกกับโดเมนนิ้วก้อยของ TRAF6 และยับยั้งการแพร่กระจายของ ECSIT และ BECN1 ใน NF-κBและสัญญาณ autophagy โดยการยับยั้งการก่อตัวของ TRAF6 polyubiquitination ในปลา teleost เรายืนยันว่า ECSIT เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB โต้ตอบกับ TRAF6 และ TAK1 ตามลำดับ และส่งสายโซ่โพลียูบิควิตินที่ผลิตโดย TRAF6 คาลเพน2a จับกับโดเมน ZF, โดเมน CC และโดเมน TRAF-C ของ TRAF6 ซึ่งยับยั้งอันตรกิริยาของ TRAF6-ECSIT เรายืนยันว่า calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสทำให้โซ่โพลียูบิควิตินจาก TRAF6 ถึง ECSIT และ BECN1

รูปที่ 6 calpain2a ลดทอนการแพร่กระจายอัตโนมัติของ TRAF6 เซลล์ HEK293 ได้รับการทรานส์เฟกด้วย TRAF6-Myc, TRAF6-HA หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วยแอนติบอดี HA เซลล์ b HEK293 ได้รับการทรานส์เฟกด้วย TRAF6-Myc, TRAF6-HA, เวกเตอร์เปล่า หรือ calpain2a-Flag หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วยแอนติบอดี HA เซลล์ c HEK293 ได้รับการถ่ายด้วย TRAF 6- Myc, TRAF 6- HA, เวกเตอร์เปล่า หรือความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ calpain2a-ΔCysPc-Flag หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วยแอนติบอดี HA d, เซลล์ e HEK293 ถูก cotransfected ด้วย TRAF6-Myc, TRAF6-HA และ WT-ubiquitin-His หรือ K63O-ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะ lysine 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์ว่าง หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose การกระตุ้นภูมิคุ้มกันและการวิเคราะห์อิมมูโนลอตอินพุตด้วย anti-Myc, anti-Flag, anti-HA และ anti-Tubulin Abs การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

รูปที่ 7 calpain2a ยับยั้ง6-การแพร่กระจายโดยอาศัยสื่อกลางของ ECSIT และ BECN1 เซลล์ HEK293 ได้รับการทรานส์เฟกด้วย ECSIT-Myc, TRAF6-Flag หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และวิเคราะห์ IP ด้วยแฟล็กแอนติบอดี เซลล์ b HEK293 ได้รับการแปลงสภาพด้วย TAK 1-Flag, ECSIT-Myc หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วย Myc แอนติบอดี เซลล์ c HEK293 ได้รับการถ่ายด้วย TRAF 6- Myc, ECSIT-HA, เวกเตอร์เปล่า หรือความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ calpain2a-ΔCysPc-Flag หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วย Myc แอนติบอดี เซลล์ d HEK293 ได้รับการ cotransfected ด้วย ECSIT-Myc, TRAF 6- HA, WT-ubiquitin-His ร่วมกับ calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose เซลล์ e HEK293 ได้รับการแปลงสภาพด้วย BECN1-Flag, TRAF6-Myc หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูกสลายและวิเคราะห์ IP ด้วย Myc แอนติบอดี เซลล์ f HEK293 ได้รับการ cotransfected ด้วย BECN 1- HA, TRAF 6- Myc, WT-ubiquitin-His ร่วมกับ calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์เปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose การกระตุ้นภูมิคุ้มกันและการป้อนข้อมูลด้วย anti-Myc, anti-Flag, anti-HA และ anti-Tubulin Abs การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

เราสังเกตเห็นว่า calpain2a มีฤทธิ์ของไฮโดรเลสในฐานะหนึ่งในตระกูลโปรตีเอสที่ขึ้นกับแคลเซียม m-calpain (calpain-2) มีบทบาทควบคุมเชิงบวกในเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB ของเซลล์ตับ HepG2 เป็นอิสระจากแนวทางโปรตีโอโซม 26 วินาที calpain2a ไฮโดรไลซ์ IkB เพื่อปล่อยปัจจัยการถอดรหัส NF-κB สารยับยั้งเฉพาะของโปรตีนคาลเพนช่วยป้องกันการเสื่อมของ IkB 56 อย่างไรก็ตาม สำหรับคาลเพน มีการศึกษาเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของปลา ในเซลล์ MKC การแสดงออกมากเกินไปของ calpain2a ยับยั้งไซโตไคน์โปรอักเสบดาวน์สตรีม NF-κBที่เกิดจาก LPS ปรากฏการณ์นี้ขัดแย้งกับผลลัพธ์ในเซลล์ตับ HepG2 อาจเป็นไปได้ว่าความจำเพาะของสายพันธุ์ของกลุ่มโปรตีนคาลแปงทำให้เกิดผลที่แตกต่างกัน ในทำนองเดียวกัน เราใช้ตัวยับยั้งจำเพาะของโปรตีนคาลเพน E-64 เพื่อป้องกันไม่ให้คาลเพน2a ไฮโดรไลซ์ TRAF6 calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดกิจกรรมไฮโดรเลสจะยับยั้งกิจกรรม TRAF6 ubiquitin ligase โดยไม่ส่งผลกระทบต่อระดับโปรตีน เราไม่พบตำแหน่งที่ออกฤทธิ์ของเอนไซม์สำหรับ calpain2a จากการศึกษาก่อนหน้านี้ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม พบว่ามีสามตำแหน่ง: คือซิสเทอีน (C105A), ฮิสทิดีน (H262A) และสารตกค้างของแอสพาราจีน (N286A) อย่างไรก็ตาม การทดลองของเรายืนยันว่าไซต์ที่ใช้งานอยู่สามแห่งของ miiuy croaker calpain2a ไม่ส่งผลกระทบต่อการแสดงออกของระดับโปรตีน TRAF6 แต่ calpain2a กลายพันธุ์ที่ขาดโดเมนไฮโดรเลสจะมีผล ดังนั้นเราจึงเลือกที่จะกลายพันธุ์โดเมนโครงสร้างที่กระตุ้นเอนไซม์ทั้งหมด แม้ว่าโปรตีน calpain2a จะได้รับการอนุรักษ์ไว้ค่อนข้างมากในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและสัตว์มีกระดูกสันหลังส่วนล่าง แต่บริเวณที่มีฤทธิ์ของเอนไซม์จำเพาะสมควรได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

โดยสรุป เราระบุว่า calpain2a เป็นตัวควบคุมเชิงลบของการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS และการเปิดใช้งาน IFN ที่เกิดจากไวรัส (รูปที่ 9e) ในแมสสเปกโตรมิเตอร์ Calpain2a อาจโต้ตอบกับ TRAF6 และเราสาธิตปรากฏการณ์นี้โดยการทดลองการตกตะกอนร่วมกันภายนอก เราพบว่า calpain2a มีส่วนร่วมในการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κBที่เกิดจาก LPS นอกจากนี้ TRAF6 ยังมีบทบาทสำคัญในเส้นทางการส่งสัญญาณของไวรัสอีกด้วย เราใช้ SCRV และพลอย (I: C) เพื่อกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ IFN และพบว่า calpain2a อาจยับยั้งการส่งสัญญาณ IFN ด้วยการควบคุมระดับโปรตีนและการแพร่กระจายอัตโนมัติของ TRAF6 เนื่องจาก TLR3 สามารถจดจำโครงสร้าง RNA (dsRNA) แบบเกลียวคู่ที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสได้ เรามีความสนใจในการชี้แจงกฎข้อบังคับของ calpain2a ของวิถีการส่งสัญญาณ IFN ที่เป็นสื่อกลางของ TRAF{16} มากกว่า แต่ไม่ได้แยกความสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ระหว่าง calpain2a และวิถีการส่งสัญญาณ TLR3 Calpain2a ส่งเสริมการสลายตัวของ TRAF6 ในลักษณะไฮโดรไลติกและมีปฏิกิริยากับ TRAF6 เพื่อยับยั้งการก่อตัวของไดเมอร์และการแพร่กระจายอัตโนมัติ การยับยั้งนี้ป้องกันปฏิสัมพันธ์ของ TRAF6 และ ECSIT และกระบวนการถ่ายโอนการแพร่กระจายจาก TRAF6 ไปยัง ECSIT, BECN1, IRF3 และ IRF7 ผลลัพธ์ในปัจจุบันของเราจะช่วยให้เข้าใจกลไกการควบคุมเชิงลบโดยการกำหนดเป้าหมาย TRAF6 ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ นอกจากนี้ งานวิจัยนี้ยังชี้ให้เห็นถึงบทบาทสำคัญของ TRAF6 homooligomerization และการแพร่กระจายโดยอัตโนมัติในกระบวนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของปลา พร้อมกันนั้น calpain2a ถูกเสนอให้เป็นโปรตีนกลไกการควบคุมเพื่อยับยั้งการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ TRAF6 และป้องกันเส้นทางสัญญาณปกติและเป็นระเบียบ ข้อมูลเชิงลึกมีประโยชน์ในการทำความเข้าใจวิทยาภูมิคุ้มกันของสัตว์มีกระดูกสันหลังและวิวัฒนาการของระบบภูมิคุ้มกันของสัตว์มีกระดูกสันหลัง

รูปที่ 8 calpain2a ยับยั้งการกระตุ้น IFN ที่เกิดจาก SCRV- หรือ Poly (I: C) เซลล์ ab EPC ได้รับการทรานส์เฟกด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ calpain2a-Flag หรือเวกเตอร์เปล่าร่วมกับ IFN-1, ISRE และ IRF3-โปรลูซิเฟอร์เรสรีพอร์เตอร์ ที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์จะติดเชื้อจำลองหรือติดเชื้อ SCRV หรือ Poly (I: C) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง (n=3 ต่อกลุ่ม) การวิเคราะห์แบบ Western blot ใช้เพื่อวัดการแสดงออกของ calpain2a-Flag ที่ถูกทรานส์เฟกชั่วคราว การแสดงออกของ Tubulin ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA ใน MKC แปลงได้อย่างเสถียรด้วย si-calpain2a #1 หรือ si-ctrl (เวกเตอร์ควบคุม) และบำบัดด้วยน้ำเกลือ (0) หรือท้าทายด้วย SCRV หรือ Poly (I: C) สำหรับ 24 ชม. ระดับ mRNA สัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับการแสดงออกของยีนที่เข้ารหัส -แอกตินในแต่ละตัวอย่าง (n=3 ต่อกลุ่ม) e, f เซลล์ MKC ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วย si-ctrl หรือ si-calpain2a #1 ที่ 24 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย SCRV เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นการสอบวิเคราะห์ความอยู่รอดของเซลล์และการสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัด (n=3 ต่อกลุ่ม) สเกลบาร์ 100 μm เซลล์ MKC ได้รับการถ่ายด้วย calpain2a-Flag หรือ pcDNA3.1 จากนั้นติดเชื้อ SCRV เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (n=3 ต่อกลุ่ม) การวิเคราะห์ qRT-PCR ดำเนินการสำหรับการแสดงออก SCRV RNA ในเซลล์และเหนือตะกอน การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง ข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (a, b), การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (c, d, e, f) หรือการทดสอบทีของนักเรียนแบบสองด้าน (g) *พี < 0.05, **พี < 0.01

วิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ (HEK) 293 เส้นและเซลล์ Epithelioma papulosum cyprini (EPC) ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection และเก็บไว้ในห้องปฏิบัติการของเรา Miiuy croaker (M. miiuy) เซลล์ไต (MKC) และ Miiuy croakerลำไส้เซลล์ไลน์ (MIC) ได้รับการเพาะเลี้ยงจากไตและเนื้อเยื่อลำไส้ของ miiuy croaker57,58 เพาะเลี้ยงเซลล์ไตของ Miiuy croaker และเซลล์ของลำไส้ของ Miiuy croaker ที่ 26 องศาในตู้ฟักที่มีความชื้นซึ่งมี 0.5% CO2 ในตัวกลาง L-15 (HyClone สหรัฐอเมริกา) เสริมด้วย 15% FBS (Gibco , สหรัฐอเมริกา), เพนิซิลิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Gibco, สหรัฐอเมริกา), สเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Gibco, สหรัฐอเมริกา) และเฮปาริน 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (โซลาร์ไบโอ, จีน) เซลล์ Epithelioma papulosum cyprini ถูกเลี้ยงที่ 26 องศาในตู้ฟักที่มีความชื้นซึ่งมี 5% CO2 ในตัวกลาง 199 (ไฮโคลน) เสริมด้วย 10% FBS, L-กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์, เพนิซิลลิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และสเตรปโตมัยซิน 100 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร เซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ 293 เซลล์ถูกเลี้ยงที่ 37 องศาในตู้ฟักที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5% ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's (DMEM) (Invitrogen) ดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วย 10% FBS, แอล-กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์, เพนิซิลิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ 100 มิลลิกรัม /มล. สเตรปโตมัยซิน

รูปที่ 9 calpain2a ยับยั้ง6-การแพร่กระจายโดยอาศัยสื่อกลางของ IRF7 และ IRF3 เซลล์ b HEK293 ได้รับการ cotransfected ด้วย IRF 3- Myc, TRAF 6- HA และ WTubiquitin-His หรือ K63O-ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะไลซีน 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -ธงหรือเวกเตอร์ว่างเปล่า หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose เซลล์ c, d HEK293 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายร่วมด้วย IRF7-Myc, TRAF6-HA และ WT-ubiquitinHis หรือ K63O-ubiquitin-His (ซึ่งเก็บเฉพาะไลซีน 63 เท่านั้น) ร่วมกับ calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag หรือเวกเตอร์ว่าง หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย เซลล์จะถูก lysed และทำให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose สารกระตุ้นภูมิคุ้มกันทั้งหมดและการป้อนข้อมูลด้วย anti-Myc, anti-Flag, anti-HA และ anti Tubulin Abs การทดลองทั้งหมดดำเนินการในการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง e แบบจำลองที่ให้รายละเอียดบทบาทของ calpain2a ในเส้นทางการส่งสัญญาณที่ใช้สื่อกลาง TRAF6- สำหรับ LPS และไวรัส TRAF6 สามารถเปิดใช้งานได้, โฮโมโอลิโกเมอไรเซชันและการแพร่กระจายอัตโนมัติ BECN1, ECSIT, IRF7 และ IRF3 ได้รับการเผยแพร่โดย TRAF6 และกระตุ้นการเปิดใช้งานสัญญาณดาวน์สตรีม calpain2a ในฐานะตัวควบคุมเชิงลบมุ่งเป้าไปที่ TRAF6 เพื่อยับยั้ง6-เส้นทางการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางของ TRAF

อ้างอิง

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. การรับรู้เชื้อโรคและภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ เซลล์ 124, 783–801 (2549)

2. Takeuchi, O. & Akira, S. ตัวรับการรับรู้รูปแบบและการอักเสบ เซลล์ 140, 805–820 (2010)

3. Wu, J. & Chen, ZJ การตรวจจับภูมิคุ้มกันและการส่งสัญญาณของกรดนิวคลีอิกของไซโตซิลิก แอนนู. สาธุคุณอิมมูนอล. 32, 461–488 (2014)

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. ตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง สกุลเงิน ไบโอล 21, R488–R493 (2011)

5. Schlee, M. เซ็นเซอร์หลักของ RNA ที่ทำให้เกิดโรค - RIG-I เช่นตัวรับ วิทยาภูมิคุ้มกัน 218, 1322–1335 (2013)

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR โปรตีน: สมาชิกสำคัญของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและผู้ไกล่เกลี่ยของโรคอักเสบ เจ. ลอยค. ไบโอล 83, 13–30 (2551)

7. Akira, S. & Hemmi, H. การรับรู้รูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคโดยตระกูล TLR อิมมูนอล. เล็ตต์ 85, 85–95 (2546)

8. Kawai, T. & Akira, S. บทบาทของตัวรับการรับรู้รูปแบบในภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ: อัปเดตเกี่ยวกับตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง แนท. อิมมูนอล. 11, 373–384 (2010)

9. ต.คาวาโกเอะ และคณะ การควบคุมตามลำดับของการตอบสนองที่ขึ้นอยู่กับตัวรับแบบ Toll-like โดย IRAK1 และ IRAK2 แนท. อิมมูนอล. 9, 684–691 (2551)

10. Suzuki, N. และ Saito, T. IRAK-4−ตัวกระตุ้น NF-kappaB ที่ใช้ร่วมกันในภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและได้รับภูมิคุ้มกัน เทรนด์อิมมูนอล 27, 566–572 (2549)

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR การส่งสัญญาณ การตายของเซลล์แตกต่างกัน 13, 816–825 (2549)

12. เติ้ง แอล. และคณะ การเปิดใช้งาน IkappaB kinase complex โดย TRAF6 ต้องใช้เอนไซม์เชิงซ้อนที่ผันยูบิควิตินแบบไดเมอริกและสายโซ่โพลียูบิควิตินที่มีเอกลักษณ์เฉพาะ เซลล์ 103, 351–361 (2000)

13. เจ. นิโนะมิยะ-สึจิ และคณะ kinase TAK1 สามารถกระตุ้น NIK-I kappaB เช่นเดียวกับ MAP kinase cascade ในวิถีการส่งสัญญาณ IL-1 ธรรมชาติ 398, 252–256 (1999)

14. ทาเคสุ จี. และคณะ TAB2 ซึ่งเป็นโปรตีนตัวปรับรูปแบบใหม่ เป็นสื่อกลางในการกระตุ้น TAK1 MAPKKK โดยการเชื่อมโยง TAK1 กับ TRAF6 ในวิถีการถ่ายโอนสัญญาณ IL-1 โมล เซลล์ 5, 649–658 (2000)

15. Qian, Y., Comane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm เป็นสื่อกลางในการโยกย้ายของ TRAF6 และ TAB2 ในการกระตุ้น interleukin-1- ของ NF-kappa BJ ไบโอล เคมี. 276, 41661–41667 (2001)

16. หยิน คิว และคณะ ปฏิกิริยา E2 และการลดขนาดในโครงสร้างผลึกของ TRAF6 แนท. โครงสร้าง โมล ไบโอล 16, 658–666 (2552)

17. หวัง ซี. และคณะ TAK1 เป็นไคเนสที่ขึ้นกับ ubiquitin ของ MKK และ IKK ธรรมชาติ 412, 346–351 (2001)

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF การทำงานเฉพาะประเภทเซลล์ของ TAK1 ในการส่งสัญญาณภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ เทรนด์อิมมูนอล 34, 307–316 (2013)

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. การพลิกผันที่ไม่คาดคิดในการเปิดใช้งาน IKKbeta: TAK1 จะทำให้ IKKbeta เป็นไพรม์สำหรับการเปิดใช้งานโดย autophosphorylation ไบโอเคม เจ. 461, 531–537 (2014)

20. เอ็มเมอริช CH และคณะ การกระตุ้นสารเชิงซ้อน IKK แบบโคโนนิคัลโดยสายยูบิควิตินแบบลูกผสมที่เชื่อมโยง K63/M1- โปรค Natl Acad. วิทย์ 110, 15247–15252 (2013)

21. คาวาอิ ต. และคณะ การเหนี่ยวนำอินเตอร์เฟอรอน-อัลฟาผ่านตัวรับที่คล้ายค่าผ่านทางเกี่ยวข้องกับการโต้ตอบโดยตรงของ IRF7 กับ MyD88 และ TRAF6 แนท. อิมมูนอล. 5, 1061–1068 (2004)

22. คิตะกาว่า วาย. และคณะ โปรตีน V ของไวรัสพาราอินฟลูเอนซาของมนุษย์ยับยั้งการแพร่กระจายโดยอาศัยสื่อกลางของ TRAF6- ของ IRF7 เพื่อป้องกัน TLR7- และ TLR9- การชักนำอินเตอร์เฟอรอนที่ขึ้นกับ TLR7- เจ. วิโรล. 87, 7966–7976 (2013)

23. คาวาอิ ต. และคณะ IPS-1 อะแดปเตอร์ที่ทริกเกอร์ RIG-I- และ Mda5- การเหนี่ยวนำอินเตอร์เฟอรอนชนิดที่ 1 ที่ใช้สื่อกลาง แนท. อิมมูนอล. 6, 981–988 (2548)

24. Zust, R. และคณะ Ribose 2'-O-เมทิลเลชันให้ลายเซ็นระดับโมเลกุลสำหรับการแยก mRNA ในตัวและไม่ใช่ตัวมันเอง ซึ่งขึ้นอยู่กับเซ็นเซอร์ RNA Mda5 แนท. อิมมูนอล. 12, 137–143 (2011)

25 Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ การระบุและลักษณะของ MAVS ซึ่งเป็นโปรตีนส่งสัญญาณต้านไวรัสแบบยลที่กระตุ้น NF kappaB และ IRF 3 เซลล์ 122, 669–682 (2548)

26. ซู แอลจี และคณะ VISA เป็นโปรตีนอะแดปเตอร์ที่จำเป็นสำหรับการส่งสัญญาณ IFN เบต้าที่กระตุ้นด้วยไวรัส โมล เซลล์ 19, 727–740 (2548)

27. โยชิดะ อาร์. และคณะ TRAF6 และ MEKK1 มีบทบาทสำคัญในเส้นทางต้านไวรัสของ RIG-I-like helicase เจ. ไบโอล. เคมี. 283, 36211–36220 (2008)

28. หลิว ส. และคณะ MAVS รับสมัคร ubiquitin E3 ligases หลายตัวเพื่อเปิดใช้งานการส่งสัญญาณต้านไวรัส เอไลฟ์ 2, e00785 (2013)

29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT กฎระเบียบของการตอบสนองอินเตอร์เฟอรอนประเภทที่ 1 แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 14, 36–49 (2014)

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. กลไกของการถ่ายโอน ubiquitin ที่ได้รับการส่งเสริมโดย TRAF6 โปรค Natl Acad. วิทยาศาสตร์ 115, 1783–1788 (2018)

31. บูน ดีแอล และคณะ เอนไซม์ A20 ที่ดัดแปลง ubiquitin เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการยุติการตอบสนองของตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง แนท. อิมมูนอล. 5, 1052–1060 (2004)

32. โควาเลนโก เอ. และคณะ ตัวยับยั้งเนื้องอก CYLD ควบคุมการส่งสัญญาณ NF kappaB ในทางลบโดย deubiquitination ธรรมชาติ 424, 801–805 (2003)

33. เขา เอ็กซ์ และคณะ USP2a ควบคุมการเปิดใช้งาน NF kappaB ของ IL -1 เบต้าและไวรัสในทางลบโดยการกำจัด TRAF6 เจ. โมล. เซลล์ไบโอล 5, 39–47 (2013)

34. เซียว เอ็น และคณะ โปรติเอสเฉพาะของ Ubiquitin 4 (USP4) กำหนดเป้าหมาย TRAF2 และ TRAF6 สำหรับการ deubiquitination และยับยั้งการย้ายถิ่นของเซลล์มะเร็งที่เกิดจาก TNFalpha ไบโอเคม เจ. 441, 979–986 (2012)

35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin เฉพาะ peptidase 20 กำหนดเป้าหมาย TRAF6 และภาษีมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด T เซลล์ของมนุษย์ประเภท 1 เพื่อควบคุมการส่งสัญญาณ NF-kappaB ในเชิงลบ เจ. วิโรล. 85, 6212–6219 (2011)

36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O ควบคุม TRAF6- การเปิดใช้งาน NF-kappaB ที่เป็นสื่อกลางในทางลบโดยการยับยั้ง TRAF6 polyubiquitination ความละเอียดของเซลล์ 23, 366–377 (2013)

37. Wi, SM และคณะ สารเชิงซ้อน ECSIT-TRAF6 ของ TAK1- มีบทบาทสำคัญในสัญญาณ TLR4 เพื่อกระตุ้น NF-kappaB เจ. ไบโอล. เคมี. 289, 35205–35214 (2014)

38 Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY การยับยั้งกิจกรรม TRAF6 ubiquitin-ligase โดย PRDX1 นำไปสู่การยับยั้งการเปิดใช้งาน NFKB และการเปิดใช้งาน autophagy การดูดกลืนอัตโนมัติ 14, 1347–1358 (2018)

39. เจียว ส. และคณะ ไคเนส MST4 จำกัดการตอบสนองการอักเสบผ่านฟอสโฟรีเลชั่นโดยตรงของอะแด็ปเตอร์ TRAF6 แนท. อิมมูนอล. 16, 246–257 (2015)

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 และ Calpain-2: หยินและหยางแห่ง Synaptic Plasticity และการเสื่อมของระบบประสาท เทรนด์ประสาทวิทยา 39, 235–245 (2016)

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. ควบคุมการย้ายเซลล์: calpains ทำการตัด เจ. เซลล์วิทย์. 118, 3829–3838 (2005)

42. คัตซึเบะ ม. และคณะ การควบคุมโดยอาศัย Calpain ของเส้นทางการส่งสัญญาณที่แตกต่างกันและการย้ายเซลล์ในนิวโทรฟิลของมนุษย์ เจ. ลอยค. ไบโอล 84, 255–263 (2551)

43 Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL ผลของการยับยั้ง Calpain ต่อการย่อยสลาย IkB alpha หลังจากเปิดใช้งาน PBMCs: การระบุตำแหน่งที่แตกแยกของ Calpain นิวโรเคม ความละเอียด 29, 1443–1451 (2004)

44. ทอมปา พี. และคณะ เกี่ยวกับปัจจัยกำหนดลำดับของความแตกแยกของคาลเพน เจ. ไบโอล. เคมี. 279, 20775–20785 (2004)

45 Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL การกำหนดความจำเพาะของสารตั้งต้นเปปไทด์สำหรับ mu-calpain โดยวิธีการที่ใช้ไลบรารีเปปไทด์: ความสำคัญของปฏิกิริยาระหว่างกันที่เตรียมไว้ เจ. ไบโอล. เคมี. 280, 40632–40641 (2005)

46 DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain การทำนายความแตกแยกโดยใช้การเรียนรู้เคอร์เนลหลายตัว กรุณาหนึ่ง 6,e19035 (2011)

47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 และ A20 ควบคุมไลซีน 63-การเชื่อมโยงการแพร่กระจายของ Beclin-1 เพื่อควบคุม TLR4- ที่เกิดจากการกินอัตโนมัติ วิทยาศาสตร์ สัญญาณ. 3, ra42 (2010)

48. Loo, YM & Gale, M. การส่งสัญญาณภูมิคุ้มกันโดยตัวรับ RIG-I-like ภูมิคุ้มกัน 34, 680–692 (2011)

49. หลิง ต. และคณะ TARBP2 ยับยั้งการเปิดใช้งาน IRF7 โดยการระงับ TRAF6- สื่อกลาง K 63- การแพร่หลายที่เชื่อมโยงของ IRF7 โมล อิมมูนอล. 109, 116–125 (2019)

50. โจว ซี และคณะ Zebrafish otud6b ควบคุมการตอบสนองของไวรัสในทางลบโดยการระงับ K 63- การแพร่หลายที่เชื่อมโยงของ irf3 และ irf7 เจ. อิมมูนอล. 207, 244–256 (2021)

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. บทบาทของ TRAF6 ในการส่งสัญญาณและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน จุลินทรีย์ติดเชื้อ 6, 1333–1338 (2004)

52 Wu, H. & Arron, JR TRAF6 สะพานโมเลกุลที่ขยายภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว ภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ และวิทยาภูมิคุ้มกันวิทยา เรียงความทางชีวภาพ 25, 1096–1105 (2003)

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: โครงสร้าง, หน้าที่, กลไก ไบโอชิม. ชีวฟิสิกส์ แอคต้า 1695, 55–72 (2004)

54. Pickart, CM & Fushman, D. โซ่ Polyubiquitin: สัญญาณโปรตีนโพลีเมอร์ สกุลเงิน ความคิดเห็น. เคมี. ไบโอล 8, 610–616 (2004)

55. ลามอธ บี. และคณะ Lys เฉพาะไซต์-63-ที่เชื่อมโยงตัวรับปัจจัยการตายของเนื้อร้ายที่เกี่ยวข้องกับปัจจัย 6 การแพร่กระจายโดยอัตโนมัติเป็นตัวกำหนดที่สำคัญของการกระตุ้นไคเนสของ I kappa B เจ. ไบโอล. เคมี. 282, 4102–4112 (2550)

56. Han, Y. , Weinman, S. , Boldogh, I. , Walker, RK & Brasier, AR Tumor necrosis factor-alpha-inducible IkappaBalpha proteolysis ไกล่เกลี่ยโดย cytosolic m-calpain กลไกที่ขนานกับวิถีทาง ubiquitin-proteasome สำหรับการกระตุ้นปัจจัยนิวเคลียร์-kappa B เจ. ไบโอล. เคมี. 274, 787–794 (1999)

57. ชู คิว และคณะ RNA circRasGEF1B แบบวงกลมที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันต้านไวรัสโดยการควบคุมทางเดิน miR-21-3p/MITA ในสัตว์มีกระดูกสันหลังตอนล่าง เจ. วิโรล. 95, e02145–20 (2021)

58 Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a กระตุ้นให้เกิด autophagy เพื่อปิดกั้นการส่งสัญญาณ NF-kappaB และการตายของเซลล์เพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อ Vibrio harveyi ไอไซแอนซ์ 26, 106105 (2023)

59. สุสาน ส.ส. และคณะ วิวัฒนาการของการรับรู้และการส่งสัญญาณ lipopolysaccharide (LPS): ปลา TLR4 ไม่รู้จัก LPS และควบคุมการเปิดใช้งาน NF kappaB ในเชิงลบ เจ. อิมมูนอล. 182, 1836–1845 (2009)

60 Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. RNA NARL ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาวจะควบคุมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันผ่านการลดระดับ NOD1 ที่ใช้สื่อกลาง microRNA ในปลาเทเลออส เจ. ไบโอล. เคมี. 296, 100414 (2021)

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNA circRNF217 ส่งเสริมภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและมีฤทธิ์ต้านแบคทีเรียในปลาเทเลออสโดยการลด miR-130-3p การทำงาน. เจ. อิมมูนอล. 208, 1099–1114 (2022)

62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovirus-inducible microRNA-210 ปรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของไวรัสผ่านการกำหนดเป้าหมาย STING/MITA ในปลา เจ. อิมมูนอล. 201, 982–994 (2018)

63. บิ ดี. และคณะ การรับรู้ของไลโปโพลีแซ็กคาไรด์และการเปิดใช้งาน NF-kappaB โดย Cytosolic Sensor NOD1 ในปลา Teleost ด้านหน้า. อิมมูนอล. 9 ต.ค. 1413 (2018)

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 และ IRF8 ควบคุมการส่งสัญญาณ NF-kappaB โดยการกำหนดเป้าหมาย MyD88 ใน Teleost Fish ด้านหน้า. อิมมูนอล. 11, 606 (2020)

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k ยับยั้งการส่งสัญญาณ NF-kappaB โดยการกำหนดเป้าหมาย MyD88 สำหรับการย่อยสลายอัตโนมัติของ ATG5-โดยอาศัยสื่อกลางในปลาเทเลออส เจ. ไบโอล. เคมี. 298, 101730 (2022)