การอภิปราย

ประชากรสูงอายุยังคงเติบโตในอัตราที่ไม่เคยมีมาก่อนทั่วโลก อายุที่มากขึ้นเกี่ยวข้องกับการลดลงของการทำงานของเซลล์ ความเสียหายสะสม และความน่าจะเป็นที่เพิ่มขึ้นของโรคเรื้อรังที่นำไปสู่การล่มสลายของระบบและการเสียชีวิตในที่สุด [3–7] ความชุกของโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุในช่วงปลายชีวิตมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อคุณภาพชีวิตและค่ารักษาพยาบาล ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับการแทรกแซงด้วยกิจกรรมต่อต้านความชราที่มีประสิทธิผล ซึ่งสามารถใช้เป็นเครื่องป้องกันวัยทองเพื่อชะลอความชราและยืดอายุขัย

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และมีความสามารถในการกำจัดชนิดของออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาและป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกเพื่อรับผลิตภัณฑ์ Cistanche สำหรับการขายปลีก

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

การแก่ของเซลล์ถูกควบคุมโดยเครือข่ายของกระบวนการทางชีววิทยาที่ซับซ้อนที่เชื่อมต่อถึงกัน [8, 9] การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าการแทรกแซงกระบวนการทางชีววิทยาที่แก่ชราสามารถเพิ่มอายุขัยที่ดีต่อสุขภาพของสิ่งมีชีวิตจำลอง รวมทั้งสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [10, 14] การแก่ตามลำดับเวลาในยีสต์รุ่น Saccharomyces cerevisiae เป็นระบบแบบจำลองที่ได้รับการยอมรับอย่างดีสำหรับการพิจารณาการแทรกแซงของการแก่ของเซลล์หลังไมโทติคของมนุษย์ [16–19]

เราได้พัฒนาวิธีการเชิงปริมาณแบบใหม่ รวดเร็ว และราคาถูกที่เรียกว่า PICLS สำหรับการวัด CLS โดยใช้ (1) เซลล์ยีสต์ที่บ่มด้วยตัวกลางและสารประกอบทดสอบบนจานใส 96-หลุม; (2) โพรพิเดียมไอโอไดด์สีย้อมเรืองแสง (PI) ซึ่งเป็นสารแทรกซึมของเซลล์ที่เข้าสู่เซลล์ที่ตายแล้วเท่านั้น [23–25]; และ (3) เครื่องอ่านไมโครเพลทสำหรับการอ่านค่าการอยู่รอดของเซลล์เชิงปริมาณ โปรดทราบว่า การวัดความหนาแน่นของเซลล์ (และการเติบโตของเซลล์) ที่ OD600nm สามารถทำได้จากเพลตเดียวกัน สำหรับเซลล์ยีสต์ที่ตายแล้วบนแผ่นหลุม 96- เราพบความสัมพันธ์เชิงเส้นสูงระหว่างการเรืองแสง PI และค่าการดูดกลืนแสง OD600nm ภายในช่วงความหนาแน่นของเซลล์ที่เหมาะสมซึ่งสอดคล้องกับ 0.05–12 OD วิธีการที่มีระเบียบแบบแผนนี้สามารถใช้สำหรับการวัดปริมาณความมีชีวิตของเซลล์ในการทดสอบปริมาณงานสูง

มีนวัตกรรมที่สำคัญหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับ PICLS: (i) PICLS เป็นวิธีเดียวที่ปราศจากผลพลอยได้ในปัจจุบันสำหรับการหาปริมาณ CLS ขั้นตอนสำคัญที่ต้องใช้เวลาและทรัพยากรถูกตัดออกจากโปรโตคอล ดังนั้น PICLS จึงเป็นการคัดกรองปริมาณงานสูงที่แท้จริง (HTS) ครั้งแรกสำหรับสารเคมีและสภาวะการเพาะเลี้ยงสำหรับการวัด CLS (ii) แนวคิดเชิงระเบียบวิธีเบื้องหลัง PICLS โดยทั่วไปสามารถกำหนดเป็นวิธีการแบบเพลต โดยที่ (a) เศษส่วนของเซลล์ที่ตายแล้ว/เซลล์ที่รอดชีวิต และ (b) จำนวนเซลล์ทั้งหมดจะถูกกำหนดโดยตรงพร้อมกันจากเพลตเดียวกันด้วยความเข้มของแสง อุปกรณ์วัด (เครื่องอ่านจานที่มีจำหน่ายทั่วไป) ในงานนี้ เราใช้ 96-เพลตหลุม แต่ 384-เพลตหลุมก็ใช้งานได้เช่นกัน (โดยอาจมีความไวลดลงเนื่องจากจำนวนเพาะเชื้อที่น้อยกว่า) สารแต่งสีใดๆ ที่แยกแยะเซลล์ที่ตายแล้วและเซลล์ที่รอด และมีการเรืองแสงหรือการดูดกลืนในช่องที่ไม่รบกวนการวัดความหนาแน่นของเซลล์โดยทั่วไป (เช่น ผ่านการดูดกลืนที่ OD600nm) สามารถนำมาใช้ได้ เราใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์ที่เลือกทำเครื่องหมายเซลล์ที่ตายแล้ว แต่สิ่งนี้ไม่สำคัญสำหรับ PICLS

รูปที่ 7 การทดสอบผลของ 2,5-anhydro-D-mannitol analogs ต่ออายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์ ยีสต์สายพันธุ์โปรโตโทรฟิก (CEN.PK113-7D) ถูกเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ที่กำหนดโดยมีความเข้มข้นต่างกันที่ 25-แอนไฮดรัส-ดีแมนนิทอล (25-AM), D-ฟรุคโตส , ดี-แมนนิทอล, ดี-มอลโทส และดี-ซอร์บิทอลใน 96-จานหลุมที่อุณหภูมิ 30 องศา การเจริญเติบโตของเซลล์ OD600nm ถูกวัดที่จุดเวลาต่างๆ กัน 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมง โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทและเขียนกราฟเทียบกับความเข้มข้นต่างๆ ของ 25-AM ฟรุกโตส แมนนิทอล มอลโตส และซอร์บิทอล B อายุการใช้งานตามลำดับเวลา (CLS) ของความเข้มข้นต่างๆ กันของ 2,5-AM, ฟรุกโตส, แมนนิทอล, มอลโตส และซอร์บิทอลบ่มเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้วิธีโพรพิเดียมไอโอไดด์ฟลูออเรสเซนซ์ การอยู่รอดของเซลล์ที่จุดอายุตามลำดับเวลาที่แตกต่างกันนั้นถูกหาปริมาณและจุดเวลาการเติบโต 72 ชั่วโมงถือเป็นวันที่ 1 C CLS ของเซลล์ที่มีอายุถูกกำหนดโดยวิธีการเจริญเติบโตในอาหารเหลว YPD จุดเวลาการเติบโต 72 ชั่วโมงถือเป็นวันที่ 1 ที่ช่วงอายุต่างๆ ตามลำดับเวลา การเพาะเชื้อ 3-μL ถูกถ่ายโอนไปยังจาน 96- หลุมที่สองที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ YPD 200μL ผลพลอยได้ OD600nm ในอาหารเหลว YPD ถูกวัดหลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 30 องศาโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท กราฟถูกลงจุดโดยเทียบกับวันที่ 1 D ผลพลอยได้ในตัวกลางที่เป็นของเหลว YPD ของจานหลุมถูกถ่ายภาพหลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 30 องศา E ที่ช่วงอายุต่างๆ ตามลำดับเวลา 3-มีการพบเชื้อ μL บนจานวุ้น YPD การเจริญเติบโตถูกถ่ายภาพหลังจากการบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 30 องศา ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD.; * พี<0.05, **P<0.01, and  ****P<0.0001 based on two-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons tests (B and C). n.s, non-significant 

เราทราบว่าโดยทั่วไปแล้วแนะนำให้ใช้ไมโครเพลทสีดำสำหรับการทดสอบการเรืองแสง เนื่องจากวัสดุนี้ดับการเรืองแสงอัตโนมัติบางส่วน อย่างไรก็ตาม เราได้ประเมินวิธีการนี้ด้วยไมโครเพลทแบบใสและพบประสิทธิภาพที่คล้ายคลึงกันกับไมโครเพลทสีดำ เนื่องจากไมโครเพลทสีดำเกี่ยวข้องกับต้นทุนที่สูง นี่เป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญสำหรับโครงการคัดกรองปริมาณงานสูงขนาดใหญ่

เราตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการที่พัฒนาขึ้นด้วยวิธีการต่อต้านความชราที่เป็นที่รู้จัก เช่น การให้ยาราปาไมซินและการจำกัดแคลอรี่ [10–16] โดยจำลองผลกระทบต่อ CLS ของยีสต์ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าวิธีการของเรามีประสิทธิภาพในการระบุวิธีการต่อต้านริ้วรอยใหม่ๆ เราได้ใช้ประโยชน์จากโปรโตคอลที่พัฒนาขึ้นใหม่ของเราในการคัดกรองสารเคมีเพื่อระบุสารประกอบต่อต้านริ้วรอยใหม่ (รูปที่ 8) เราตรวจพบ 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) ที่ขยาย CLS ของยีสต์ จากผลลัพธ์ของเรา เราแนะนำให้ใช้ 2,{13}}AM แยกกันหรือใช้ร่วมกับวิธีการต่อต้านริ้วรอยอื่นๆ

2,5-AM เป็นสารคล้ายคลึงของฟรุกโตส และน้ำตาลทั้งสองชนิดสามารถเข้าสู่วิถีไกลโคไลติกได้ ไกลโคไลซิสเป็นกระบวนการเมแทบอลิซึมที่กลูโคสถูกฟอสโฟรีเลตเป็นครั้งแรกโดยเฮกโซไคเนสเพื่อสร้างกลูโคส-6-ฟอสเฟต (G6P) ฟอสโฟกลูโคไอโซเมอเรสเปลี่ยน G6P เป็นฟรุกโตส-6-ฟอสเฟต (F6P) ที่ถูกเมตาบอลิซึมต่อไปเป็นสารมัธยันตร์ไกลโคไลติกขั้นปลายที่แตกต่างกัน รวมถึงไพรูเวตที่เข้าสู่วงจร TCA ของไมโทคอนเดรีย เช่นเดียวกับกลูโคส ฟรุกโตสยังถูก phosphorylated โดย hexokinase เพื่อสร้าง F6P ฟอสโฟฟรุกโตไคเนสเปลี่ยน F6P เป็นฟรุกโตส-1,6-บิสฟอสเฟต (FBP) ซึ่งจะถูกเผาผลาญต่อไปเป็นสารมัธยันตร์ไกลโคไลติกปลายน้ำที่แตกต่างกัน 2,5-AM ยังสามารถถูกสร้างฟอสโฟรีเลตโดยเฮกโซไคเนสในรูปแบบ 2,5-AM- 6-ฟอสเฟต (2,5-AM6P) [39–41] นอกจากนี้ phosphofructokinase ยังเปลี่ยน 2,5-AM6P เป็น 2,5-AM- 1,6-bisphosphate (2,5-AMBP) อย่างไรก็ตาม 2,5-AMBP ไม่สามารถถูกเมแทบอลิซึมเพิ่มเติมไปเป็นสารมัธยันตร์ไกลโคไลติกขั้นปลาย [39–41]

เนื่องจาก 25-AM เป็นสารอะนาล็อกของฟรุกโตส เราจึงได้ตรวจสอบว่าฟรุกโตสสามารถยืดอายุของยีสต์ได้หรือไม่ อย่างไรก็ตาม เราไม่ได้สังเกตฤทธิ์ต้านความชราของฟรุคโตสในการขยาย CLS ของยีสต์ แมนนิทอลและมอลโตสยังสามารถเข้าสู่ไกลโคไลซิสและเมแทบอลิซึมเป็นตัวกลางไกลโคไลติกที่ปลายน้ำ นอกจากนี้เรายังตรวจสอบผลของแมนนิทอลและมอลโตสต่ออายุขัยของยีสต์ ฟรุกโตส แมนนิทอล และมอลโตสไม่สามารถขยาย CLS ของยีสต์ได้

ในฐานะที่เป็นซอร์บิทอล ก่อนหน้านี้มีรายงานว่ามีน้ำตาลอีกชนิดหนึ่งที่ยังไม่ผ่านการเผาผลาญซึ่งส่งผลต่อ CLS ที่ความเข้มข้นสูงมาก (18 เปอร์เซ็นต์เทียบเท่ากับ 1 M) [20, 45] เราต้องการที่จะชี้แจงว่ากิจกรรมต่อต้านความชราของ 2,{{7 }}AM อาจเป็นเพราะออสโมลาริตีที่เพิ่มขึ้นของอาหารเลี้ยงเชื้อ การทดลองของเราแสดงให้เห็นว่าซอร์บิทอลไม่สามารถเพิ่ม CLS ของยีสต์ที่ความเข้มข้นต่ำกว่าซึ่งมีประสิทธิภาพในกรณีของ 2,5- AM เนื่องจากซอร์บิทอลต้องการความเข้มข้นที่สูงขึ้นเพื่อเพิ่ม CLS ของยีสต์ กลไกการต่อต้านความชราของ 2,5-AM จึงไม่ขึ้นกับผลของออสโมลาริตี การค้นพบนี้เผยให้เห็นว่ากิจกรรมต่อต้านความชราของ 2,5-AM นั้นมีความเฉพาะเจาะจงและไม่ถูกขนานไปกับสารอะนาล็อกอื่นๆ ที่มีโครงสร้างทางเคมีคล้ายคลึงกัน

อย่างไรก็ตาม วิธีที่ 25-AM ยืดอายุการใช้งานยังคงต้องตรวจสอบ เป็นเรื่องน่าสนใจที่จะตรวจสอบว่า 25-AM ปรับเปลี่ยนเครื่องหมายแสดงอายุโดยตรงหรือไม่ [8] TORC1 และ AMPK เป็นคอมเพล็กซ์ตรวจจับกลูโคสที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการชราภาพ [32, 43] อย่างไรก็ตาม อายุขัยตามลำดับเวลาที่ขยายโดยการยับยั้ง TORC1 จะลดลงเมื่อ AMPK ถูกยับยั้ง ตัวกลางกลูโคสและไกลโคไลติกควบคุมกิจกรรมของ TORC1 และ AMPK [34, 46, 47] 2,5-AMBP แสดงให้เห็นว่ายับยั้งการทำงานของอัลโดเลสที่กระตุ้นการเปลี่ยน FBP เป็นกลีเซอรอลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต (G3P) และไดไฮดรอกซีอะซีโตนฟอสเฟต (DHAP) [39, 40] DHAP ถูกแปลงเป็น G3P โดย triosephosphate isomerase หลักฐานล่าสุดบ่งชี้ว่า DHAP เป็นโมเลกุลสัญญาณกลูโคสสำคัญที่กระตุ้น TORC1 [48]

Glycolytic fux ถูกทำลายเมื่อการสังเคราะห์ G3P และ DHAP ได้รับผลกระทบ ส่งผลให้มีการผลิต ATP น้อยลง สิ่งที่น่าสนใจคือ AMPK จะทำงานเมื่อสถานะพลังงานของเซลล์ถูกทำลายและยับยั้งการเติบโตของเซลล์โดยการยับยั้ง TORC1 [46, 47] ดังนั้นความสัมพันธ์ที่เป็นปรปักษ์กันของ AMPK และ TORC1 จึงเป็นการปรับเมตาบอลิซึมที่มีประสิทธิภาพเพื่อให้แน่ใจว่าสภาวะสมดุลของเซลล์ในสภาวะสมดุลสำหรับเซลล์ที่แข็งแรง แม้ว่าเราไม่ได้สังเกตเห็นผลกระทบของ 2,5-AM ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ (รูปที่ 6 และ 7) การค้นพบนี้ตัดผลของการจำกัดกลูโคสที่ส่งผลต่อการเติบโตของเซลล์ (รูปที่ 5) อย่างไรก็ตาม ยืดอายุขัยด้วยฟีโนไทป์ที่เติบโตช้า [49] อย่างไรก็ตาม การยืดอายุของยาราปาไมซินไม่จำเป็นต้องใช้ขนาดยาที่สูงกว่าการลดการเติบโตของเซลล์ (รูปที่ 4) ดังนั้นเราจึงไม่สามารถแยกความเป็นไปได้ของกิจกรรมต่อต้านความชราของ 25-AM ผ่าน TORC1/AMPK หรือเป็นอิสระจาก TORC1/AMPK

ซึ่งแตกต่างจากผลการยับยั้งของ 25-AMBP ต่ออัลโดเลส มีรายงานว่ากระตุ้นไพรูเวตไคเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ไกลโคไลซิสตัวสุดท้าย [39–41] Pyruvate kinase กระตุ้นการเปลี่ยน phosphoenolpyruvate เป็น pyruvate ซึ่งเป็นหนึ่งในแหล่งที่มาสำหรับการสร้าง NAD plus (nicotinamide adenine dinucleotide) NAD plus เป็นสารสำคัญที่ควบคุมกระบวนการต่างๆ ของเซลล์และการทำงานที่สำคัญต่อการรักษาเซลล์ให้แข็งแรงและยืดอายุขัย [50, 51] ไพรูเวตยังเป็นสารตั้งต้นหลักสำหรับปฏิกิริยาไมโทคอนเดรียเพื่อสร้างเมตาบอไลต์แบบสร้างส่วนประกอบต่าง ๆ เพื่อสังเคราะห์องค์ประกอบที่สำคัญ รวมถึงกรดอะมิโน กรดนิวคลีอิก และ ATP ซึ่งจำเป็นต่อการอยู่รอดของเซลล์และการแก่ชราอย่างมีสุขภาพดี [52–55] แท้จริงแล้ว การลดลงของกิจกรรมของไมโตคอนเดรียนั้นสัมพันธ์กับความชราและโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ [53–56] เมื่อเร็วๆ นี้ 25-AM ได้รับการเสนอว่าเป็นวิธีการรักษาที่มีศักยภาพในการรักษามะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันแบบมัยอีลอยด์ (AML) [57]

เราตั้งชื่อเมธอดใหม่ว่า PICLS (เมธอด CLS ที่ใช้ PI) โดยคำนึงถึงการเล่นคำว่า "ผักดอง" ในขณะที่องค์ประกอบทั้งหมดของโปรโตคอลใหม่ของเราได้รับการอธิบายโดยอิสระในที่อื่นๆ แล้ว การผสมผสานที่ "หมัก" ขององค์ประกอบเหล่านี้ทำให้การวัดทำได้ง่ายและราคาถูก และสุดท้ายก็พร้อมสำหรับปริมาณงานสูง

โดยสรุป เราได้พัฒนาวิธีการเชิงปริมาณสำหรับการวัดอายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์ และระบุว่า 2,5-AM เป็นสารประกอบต่อต้านการเสื่อมสภาพแบบใหม่ ขณะนี้การศึกษากำลังดำเนินการเพื่อตรวจสอบกลไกการต่อต้านวัยของ 2,5-AM

วัสดุและวิธีการ

สายพันธุ์ยีสต์ อาหารเลี้ยงเชื้อ และสารเคมี

การศึกษานี้ใช้ภูมิหลังทางพันธุกรรมของสายพันธุ์ดี CEN.PK113-7prototrophic [35, 36] อาหารเลี้ยงเชื้อที่อุดมด้วยมาตรฐาน YPD (สารสกัดจากยีสต์ Bacto 1 เปอร์เซ็นต์, Bacto peptone 2 เปอร์เซ็นต์ และกลูโคส 2 เปอร์เซ็นต์), YPD agar (วุ้น Bacto 2.5 เปอร์เซ็นต์) และอาหารเลี้ยงเชื้อสังเคราะห์ที่กำหนด (SD) ที่มียีสต์เบสไนโตรเจน 6.7 กรัม/ลิตร พร้อมแอมโมเนียมซัลเฟต ปราศจากกรดอะมิโน (DIFCO) และกลูโคส 2 เปอร์เซ็นต์ สารละลายสต็อคของราปาไมซิน (เอ็นโซ) ถูกเตรียมในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (ซิกมา) ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ไม่เกิน 1 เปอร์เซ็นต์ในการทดสอบใดๆ 2,5-Anhydro-D-mannitol (Santa Cruz), D-fructose (Sigma), D-mannitol (Sigma), D-maltose (Sigma) และ D-sorbitol (Sigma) ความเข้มข้นในการทำงานที่เตรียมขึ้นใหม่โดย ละลายผงโดยตรงในตัวกลางและกรองฆ่าเชื้อ

สภาวะการเจริญเติบโตของยีสต์

สายพันธุ์ยีสต์ได้รับการกู้คืนจากสต็อกกลีเซอรอลแช่แข็งบนอาหารเลี้ยงเชื้อ YPD ที่ 30 องศา ยีสต์ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD ค้างคืนที่อุณหภูมิ 30 องศา เขย่าที่ความเร็ว 220 รอบต่อนาที เซลล์ที่เติบโตในชั่วข้ามคืนถูกเจือจางเป็น OD600nm~0.2 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD ที่สดใหม่เพื่อเริ่มต้นการทดลองอายุขัยตามลำดับเวลา

การวิเคราะห์อายุขัยตามลำดับเวลา

การทดลองตามลำดับอายุ (CLS) ดำเนินการใน {{0}}จานหลุมที่มีการเพาะเลี้ยงยีสต์ทั้งหมด 20{{10}} µL ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [58] หัวเชื้อของเซลล์ถูกถ่ายโอนเข้าไปใน 96-แผ่นหลุมที่มีราปามัยซินที่ความเข้มข้นสองเท่าที่เจือจาง (0–10 นาโนโมลาร์) สำหรับการทดสอบการจำกัดแคลอรีนั้น หัวเชื้อของเซลล์ถูกเตรียมในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD ที่มีน้ำตาลกลูโคส 2 เปอร์เซ็นต์ 0.5 เปอร์เซ็นต์ และ 0.25 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยัง 96-จานหลุม ในทำนองเดียวกัน หัวเซลล์ถูกถ่ายโอนเข้าไปใน 96-เพลตหลุมที่มีความเข้มข้นที่เจือจางสองครั้งตามลำดับ (0–8 มิลลิโมลาร์) ของ 2,5-แอนไฮโดร-ดี-แมนนิทอล, ดี-ฟรุคโตส, ดี-แมนนิทอล ดี-มอลโทส และดี-ซอร์บิทอล เซลล์ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา และวัดการเติบโตที่จุดเวลาต่างๆ จุดเวลาการเติบโต 72 ชั่วโมงถือเป็นวันที่ 1 สำหรับการทดสอบ CLS การอยู่รอดของเซลล์ถูกวัดปริมาณที่จุดอายุต่างๆ โดยวิธีที่แตกต่างกันสามวิธี: (i) วิธีที่ใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์ฟลูออเรสเซนซ์ (ii) ผลพลอยได้ในตัวกลางที่เป็นของเหลว YPD และ (iii) การทดสอบการจำ

(i) วิธีที่ใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์ฟลูออเรสเซนต์:ขั้นตอนโดยละเอียดสำหรับการพัฒนาวิธีที่ใช้ฟลูออเรสเซนซ์ propidium iodide (PI) นั้นถูกกล่าวถึงในส่วนผลลัพธ์ สำหรับการทดสอบ CLS นั้น เซลล์ยีสต์ {{0}}µl ในช่วงเวลาต่างๆ ของอายุถูกย้ายไปยังจานหลุมที่สอง 96- เซลล์ถูกล้างและบ่มใน 100 µl 1×PBS ด้วย PI (5 µg/ml) เป็นเวลา 15 นาทีในที่มืด รวมการควบคุมตัวอย่างที่เป็นบวกและลบสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ การควบคุมเชิงบวก (เซลล์ที่ต้มที่อุณหภูมิ 100 องศาเป็นเวลา 15 นาที) ถูกย้อมด้วย PI และผ่านกระบวนการในจานหลุมเดียวกัน 96- ตัวอย่างที่ไม่มีเซลล์ย้อมสี PI ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ หลังจากการบ่ม เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยใหม่ใน 100 µl PBS การอ่านค่าการเรืองแสงของตัวอย่าง (การกระตุ้นที่ 535 นาโนเมตร การแผ่รังสีที่ 617 นาโนเมตร) และ OD600nm ถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek) ความเข้มของการเรืองแสงของแต่ละตัวอย่างถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย OD600nm ความเข้มของการเรืองแสงปกติของแต่ละตัวอย่างถูกลบออกจากสัญญาณพื้นหลังของตัวอย่างเชิงลบที่ไม่มีสี ความเข้มของการเรืองแสงที่ได้รับของตัวอย่างควบคุมที่เป็นบวก (เซลล์ที่ตายแล้วที่ต้ม) ถือว่าเซลล์รอดชีวิต 0 เปอร์เซ็นต์ เรายืนยันการตายของเซลล์โดยปล่อยให้มันเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อ การอยู่รอดของเซลล์ o ตัวอย่างจุดเวลาอายุที่แตกต่างกันถูกคำนวณ b ทำให้ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์เป็นปกติด้วยตัวอย่างควบคุมที่เป็นบวก (เซลล์ต้ม)

โดยที่ Iij(535nm∕617nm) คือความเข้มของฟลูออเรสเซนต์ที่วัดที่หลุมด้วยพิกัดจาน i และ j โดยมีการกระตุ้นที่ 535 nm และการปล่อยที่ 617 nm, ID(535nm∕617nm) คือความเข้มของฟลูออเรสเซนต์ที่วัดได้สำหรับเซลล์ที่ตายแล้ว 100 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ที่ย้อมด้วย PI, IC (535nm∕617nm) คือความเข้มของฟลูออเรสเซนต์ที่วัดได้สำหรับเซลล์ที่ไม่มี PI และค่า OD ตามลำดับคือค่าการดูดกลืนแสงที่วัดได้สำหรับเซลล์ตามลำดับที่ 600 นาโนเมตรที่ทำให้จำนวนเซลล์เป็นปกติ

(ii) ผลพลอยได้ในตัวกลางที่เป็นของเหลว YPD:การเพาะเลี้ยงยีสต์ที่อยู่นิ่ง (3-μL) ของจุดอายุที่แตกต่างกันถูกถ่ายโอนไปยัง 96-หลุมที่สองที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ YPD 200μL และบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 30 องศา ผลพลอยได้ (OD600nm) ของเซลล์แก่ถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท ปริมาณของการอยู่รอดของเซลล์สำหรับแต่ละช่วงอายุถูกกำหนดโดยเทียบกับวันที่ 1 (คิดเป็นการอยู่รอดของเซลล์ 100 เปอร์เซ็นต์) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [19, 20, 58]

(iii) การทดสอบการจำ:เพาะเลี้ยงยีสต์ที่อยู่นิ่ง (3 ไมโครลิตร) ของจุดอายุที่แตกต่างกันถูกพบบนแผ่นวุ้น YPD และบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 30 องศา การเจริญเติบโตของเซลล์ที่แก่บนแผ่นวุ้น YPD ถูกถ่ายภาพโดยใช้ระบบภาพ BioRad GelDoc

การวิเคราะห์ข้อมูล

การวิเคราะห์ทางสถิติของผลลัพธ์ทั้งหมด เช่น ค่าเฉลี่ย ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ความสัมพันธ์ (R2) นัยสำคัญ และการสร้างกราฟดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism v.9.3.1 ผลลัพธ์ถูกเปรียบเทียบทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวแบบปกติและการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางตามด้วยการเปรียบเทียบแบบทวีคูณโดยการทดสอบแบบเฉพาะกิจของ Dunnett หรือการทดสอบแบบเฉพาะกิจของ Sidak ในแผนภาพกราฟทั้งหมด ค่า P จะแสดงเป็น *P<0.05,  **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001 were considered significant. n.s, non-significant.

กิตติกรรมประกาศMA และ FE ของผู้เขียนเป็นผู้ประดิษฐ์คำขอรับสิทธิบัตรสองรายการ (10202201534P และ 10202201536U) ซึ่งรวมถึงส่วนหนึ่งของงานที่อธิบายไว้ในบทความนี้

ผลงานผู้เขียนแมสซาชูเซตส์คิดโครงการ ทำการทดลอง และวิเคราะห์ข้อมูล FE ร่วมคิดโครงการ ประเมินข้อมูล และวางแผนกลยุทธ์ MA และ FE เป็นผู้เขียนบทความนี้ และผู้เขียนทั้งหมดได้ตรวจทานบทความและตกลงที่จะเป็นฉบับสุดท้าย

เงินทุนงานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย Bioinformatics Institute (BII), A*STAR Career Development Fund (C210112008) และรางวัล Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758–00)

ประกาศ

การแข่งขันความสนใจผู้เขียนประกาศไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

เปิดการเข้าถึงบทความนี้ได้รับอนุญาตภายใต้ Creative Commons Attribution 4.0 International License ซึ่งอนุญาตให้ใช้ แบ่งปัน ดัดแปลง แจกจ่าย และทำซ้ำในสื่อหรือรูปแบบใดๆ ตราบใดที่คุณให้เครดิตที่เหมาะสมแก่ผู้เขียนต้นฉบับ ) และแหล่งที่มา ระบุลิงก์ไปยังใบอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ และระบุว่ามีการเปลี่ยนแปลงหรือไม่ รูปภาพหรือเนื้อหาของบุคคลที่สามอื่นๆ ในบทความนี้รวมอยู่ในสัญญาอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ของบทความ เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นในบรรทัดเครดิตของเนื้อหา หากเนื้อหาไม่รวมอยู่ในสัญญาอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ของบทความ และการใช้งานตามวัตถุประสงค์ของคุณไม่ได้รับอนุญาตตามข้อบังคับทางกฎหมายหรือใช้เกินกว่าที่อนุญาต คุณจะต้องได้รับอนุญาตโดยตรงจากเจ้าของลิขสิทธิ์

อ้างอิง

1. das nações Unidas, O. United Nations, Department of Economic and Social Afairs, Population Division (2019). อนาคตของประชากรโลก เรื่องเด่น (ST/ESA/ SER.A/423) 2019.

2. Robine J. ประชากรสูงอายุ: เรามีชีวิตที่ยืนยาวขึ้น แต่เรามีสุขภาพดีขึ้นหรือไม่? องค์การสหประชาชาติ กรมเศรษฐกิจและสังคม กองประชากร UN DESA/ POP/2021/TP/NO 2. (2564).

3. Niccoli T, Partridge L. อายุเป็นปัจจัยเสี่ยงของโรค Curr Biol. 2555.

4. Hou Y และคณะ อายุที่มากขึ้นเป็นปัจจัยเสี่ยงของโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท แนท เรฟ นิวรอล. 2019.

5. Harman D. กระบวนการชรา: ปัจจัยเสี่ยงสำคัญของโรคและการเสียชีวิต. Proc Natl Acad Sci US A. 1991.

6. นกกระทา L, Deelen J, Slagboom PE เผชิญกับความท้าทายระดับโลกของการสูงวัย ธรรมชาติ. 2561.

7. Fontana L, Kennedy BK, Longo VD. การวิจัยทางการแพทย์: รักษาความชรา ธรรมชาติ. 2557.

8. López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, Serrano M, Kroemer G. จุดเด่นของวัย เซลล์ 2556.

9. เคนเนดี บีเค และคณะ Geroscience: การเชื่อมโยงความชรากับโรคเรื้อรัง เซลล์ 2557.

10. Partridge L, Fuentealba M, Kennedy BK. ภารกิจชะลอความแก่ด้วยการค้นพบยา การค้นพบยา Nat Rev 2563.

11. แมทธิสัน เจเอ และคณะ การจำกัดแคลอรี่ช่วยปรับปรุงสุขภาพและการอยู่รอดของลิงจำพวกลิง นัทคอมมูน.

12. บิตโต เอ และคณะ การรักษาด้วยราปาไมซินแบบชั่วคราวสามารถเพิ่มอายุขัยและอายุขัยของหนูวัยกลางคนได้ อีไลฟ์. 2559.

13. Fontana L, Partridge L. การส่งเสริมสุขภาพและอายุยืนด้วยอาหาร: จากสิ่งมีชีวิตจำลองสู่มนุษย์ เซลล์ 2558.

14. Zhang Y, Zhang J, Wang S. บทบาทของ rapamycin ในการขยายช่วงสุขภาพผ่านความล่าช้าของการแก่ตัวของอวัยวะ Aging Rev. 2021.

15. Selvarani R, Mohammed S, Richardson A. ผลของราปามัยซินต่อความชราและโรคที่เกี่ยวกับอายุ—ทั้งในอดีตและอนาคต จีโรไซเอนซ์. 2021.

16. Fontana L, Partridge L, Longo VD. ยืดอายุขัยที่ดีต่อสุขภาพจากยีสต์สู่มนุษย์ ศาสตร์. 2553.

17. ซิมเมอร์มันน์ เอ และคณะ ยีสต์เป็นเครื่องมือในการระบุสารต่อต้านริ้วรอย FEMS ยีสต์ Res. 2561.

18. Longo VD, Shadel GS, Kaeberlein M, Kennedy B. การแก่ชราซ้ำและตามลำดับเวลาใน Saccharomyces cerevisiae เซลล์ Metab 2555.

19. เพิ่มพลังให้กับ RW, Kaeberlein M, Caldwell SD, Kennedy BK, Fields S. การขยายอายุขัยตามลำดับเวลาในยีสต์โดยการส่งสัญญาณทางเดิน TOR ที่ลดลง ยีนเดฟ 2549.

20. Murakami CJ, Burtner CR, Kennedy BK, Kaeberlein M. วิธีการสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณปริมาณงานสูงของช่วงอายุตามลำดับเหตุการณ์ของยีสต์ เจ เกรอนตอล. เซอร์ เอ ไบโอล. วิทย์ ยา วิทย์ (2551).

21. เต็ง X, Hardwick JM. ปริมาณการตายของเซลล์ที่ควบคุมโดยพันธุกรรมในยีสต์รุ่น วิธี Mol Biol 2556.

22. กาเรย์ อี และคณะ การทำโปรไฟล์ที่มีความละเอียดสูงของการอยู่รอดระยะคงที่เผยให้เห็นปัจจัยอายุยืนของยีสต์และปฏิสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของพวกมัน PLoS ยีน 2557.

23. อัลฟาตาห์ เอ็ม และคณะ Hypoculoside ซึ่งเป็นสารประกอบคล้ายสฟิงอยด์เบสจาก Acremonium ขัดขวางความสมบูรณ์ของเมมเบรนของเซลล์ยีสต์ ตัวแทนวิทย์ 2019.

24. อัลฟาตาห์ เอ็ม และคณะ ภูมิปฏิสัมพันธ์ทางเคมีและพันธุกรรมของโมโน-(2-เอทิลเฮกซิล)-พทาเลตโดยใช้การสร้างโปรไฟล์ทางเคมีในยีสต์ เคโมสเฟียร์ 2019.

25. Kwolek-Mirek M, Zadrag-Tecza R. การเปรียบเทียบวิธีการที่ใช้ในการประเมินความมีชีวิตและความมีชีวิตชีวาของเซลล์ยีสต์ FEMS ยีสต์ Res. 2557.

26. Chadwick SR และคณะ กล่องเครื่องมือสำหรับการประเมินเชิงปริมาณอย่างรวดเร็วของอายุขัยตามลำดับเวลาและการอยู่รอดของ Saccharomyces cerevisiae การจราจร 2559.

27. Pereira C, Saraiva L. การแทรกแซงของสารสื่อความแก่ในการประเมินอายุขัยตามลำดับของยีสต์โดยการย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ โฟเลียไมโครไบโอล. (พราหะ). (2556).

28. Lamming DW, Ye L, Sabatini DM, Baur JA Rapalogs และสารยับยั้ง mTOR เป็นยาอายุวัฒนะ J Clin สืบสวน 2556.

29. Arriola Apelo SI, ลำมิง DW ราปามัยซิน: สารยับยั้งความชราที่โผล่ขึ้นมาจากดินของเกาะอีสเตอร์ Journals of Gerontology - Series A วิทยาศาสตร์ชีวภาพและวิทยาศาสตร์การแพทย์ 2559.

30. วิลคินสัน เจอี และคณะ ราปาไมซินชะลอความชราในหนู เอจจิ้งเซลล์. 2555.

31. แซกซ์ตัน RA, Sabatini DM สัญญาณ mTOR ในการเจริญเติบโต เมแทบอลิซึม และโรค เซลล์ 2017;168:960–76.

32. Johnson SC, Rabinovitch PS, Kaeberlein M. MTOR เป็นตัวดัดแปลงหลักของความชราและโรคที่เกี่ยวกับอายุ ธรรมชาติ. 2556.

33. กอนซาเลซ เอ ฮอลล์ มินนิโซตา การตรวจจับสารอาหารและการส่งสัญญาณ TOR ในยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม EMBO J. 2017;36:397–408.

34. อัลฟาตาห์ เอ็ม และคณะ TORC1 ควบคุมการตอบสนองของการถอดรหัสต่อกลูโคสและวงจรการพัฒนาผ่านทาง Tap42- Sit4-Rrd1/2 pathway ใน Saccharomyces cerevisiae บีเอ็มซี ไบโอล. 2021.

35. ฟาน ไดจ์เก้น เจพี และคณะ การเปรียบเทียบคุณสมบัติทางสรีรวิทยาและพันธุกรรมระหว่างห้องปฏิบัติการของ Saccharomyces cerevisiae สี่สายพันธุ์ เอ็นไซม์ไมโครบเทคโนโลย. 2543.

36. Mülleder M, et al. การรวบรวมการกลายพันธุ์ของการลบโปรโตโทรฟิกสำหรับเมตาบอลิซึมของยีสต์และชีววิทยาของระบบ แนท ไบโอเทคอล. 2555.

37. Alvers AL และอื่น ๆ การดูดเลือดอัตโนมัติเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการยืดอายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์โดยราปามัยซิน การตรวจร่างกาย 2552.

38. Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR. พารามิเตอร์ทางสถิติอย่างง่ายสำหรับใช้ในการประเมินและตรวจสอบความถูกต้องของชุดตรวจคัดกรองปริมาณงานสูง เจ ไบโอมอล สกรีน. 2542.

39. Riquelme PT, Wernette Hammond ME, Kneer NM, Lardy HA ควบคุมการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรตโดย 2,5-แอนไฮโดร-ดี-แมนนิทอล Proc Natl Acad Sci US A. 1983.

40. Riquelme PT, Wernette-Hammond ME, Kneer NM, Lardy HA กลไกการออกฤทธิ์ของ 2,5-แอนไฮโดร-ดี-แมนนิทอลในเซลล์ตับ ผลของเมแทบอไลต์ฟอสโฟรีเลตต่อเอ็นไซม์เมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต เจ. ไบโอล. เคมี (2527).

41. Riquelme PT, Kneer NM, Wernette-Hammond ME, Lardy HA การยับยั้งโดย 2,5-anhydromannitol ของ glycolysis ในเซลล์ตับของหนูที่แยกได้และเซลล์ Ehrlich ascites Proc Natl Acad Sci สหรัฐอ.

42. ฮาร์ดี้ DG. ไคเนสโปรตีนที่เปิดใช้งาน AMP/SNF1: ผู้พิทักษ์พลังงานเซลล์ที่อนุรักษ์ไว้ แนท เรฟ โมล เซลล์ ไบออล 2550.

43. Burkewitz K, Zhang Y, Mair WB. AMPK ที่เชื่อมต่อของความกระปรี้กระเปร่าและความชรา เซลล์ Metab 2557.

44. McCartney RR, Chandrashekarappa DG, Zhang BB, Schmidt MC การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมของการดื้อยาและความไวต่อ 2-deoxyglucose ใน Saccharomyces cerevisiae พันธุศาสตร์. 2557.

45. Burtner CR, Murakami CJ, Kennedy BK, Kaeberlein M. กลไกระดับโมเลกุลของการแก่ตามลำดับเวลาในยีสต์ วัฏจักรของเซลล์ 2552.

46. ​​Lin SC ฮาร์ดี้ DG. AMPK: ตรวจจับกลูโคสและสถานะพลังงานของเซลล์ เซลล์ Metab 2561.

47. González A, Hall MN, Lin SC, Hardie DG. AMPK และ TOR: หยินและหยางของการตรวจจับสารอาหารในเซลล์และการควบคุมการเจริญเติบโต เซลล์ Metab 2563.

48. Orozco JM และคณะ Dihydroxyacetone phosphate ส่งสัญญาณความพร้อมใช้งานของกลูโคสไปยัง mTORC1 ณัฐเมธา. 2563.

49. Aguiar-Oliveira MH, Bartke A. การขาดฮอร์โมนการเจริญเติบโต: สุขภาพและอายุยืน Endocr Rev. 2019.

50. Orlandi I, Alberghina L, Vai M. Nicotinamide, nicotinamide riboside และ nicotinic acid—มีบทบาทในการสืบพันธุ์และการแก่ตามลำดับเวลาในยีสต์ สารชีวโมเลกุล. 2563.

51. Covarrubias AJ, Perrone R, Grozio A, Verdin E. NAD รวมถึงเมแทบอลิซึมและบทบาทในกระบวนการของเซลล์ในช่วงอายุ แนท เรฟ โมล เซลล์ ไบออล 2021.

52. สปิเนลลี เจบี, Haigis MC การมีส่วนร่วมหลายแง่มุมของไมโทคอนเดรียต่อเมแทบอลิซึมของเซลล์ แนท เซลล์ ไบโอล. 2561.

53. Berry BJ, Kaeberlein M. มุมมองด้านพลังงานเกี่ยวกับวิทยาศาสตร์ชีวภาพ: แรงกระตุ้นของไมโทคอนเดรียลและอายุ เกโร-ไซแอนซ์. 2021.

54 Sun N, Youle RJ, Finkel T. พื้นฐานยลของอายุ โมลเซลล์. 2559.

55. คัปพิลา เทส, คัปพิลา เจเอชเค, ลาร์สสัน เอ็นจี ไมโตคอนเดรียของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและอายุ: การปรับปรุง เซลล์ Metab 2560.

56. แบรติก เอ, ลาร์สสัน เอ็นจี บทบาทของไมโทคอนเดรียต่อการแก่ชรา J Clin สืบสวน 2556.

57. เฉิน ดับเบิลยูแอล และคณะ การใช้ฟรุกโตสที่ปรับปรุงให้ดีขึ้นซึ่งใช้สื่อกลางโดย SLC2A5 เป็นคุณสมบัติเมตาบอลิซึมที่ไม่เหมือนใครของมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันแบบมัยอีลอยด์ที่มีศักยภาพในการรักษา เซลล์มะเร็ง. 2559.

58. Jing JL, Ning TCY, Natali F, Eisenhaber F, Alfatah M. การเสริมธาตุเหล็กช่วยชะลอความชราและยืดอายุเซลล์ผ่านการเพิ่มศักยภาพของการทำงานของไมโทคอนเดรีย เซลล์ 11, (2022).

หมายเหตุของสำนักพิมพ์Springer Nature ยังคงเป็นกลางในเรื่องการอ้างเขตอำนาจศาลในแผนที่ที่เผยแพร่และความเกี่ยวข้องของสถาบัน

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】